Summary
In questa carta, discutiamo tre preparazioni di cervello usate per la registrazione di tutta la cella patch clamp per studiare il circuito retinotectal di girini di Xenopus laevis . Ogni preparazione, con i suoi specifici vantaggi, contribuisce alla trattabilità sperimentale il girino di Xenopus come modello per studiare la funzione del circuito neurale.
Abstract
Il circuito di retinotectal girino di Xenopus , comprende le cellule retiniche del ganglio (RGCs) nell'occhio che formano le sinapsi direttamente sui neuroni nel tectum ottica, è un modello popolare di studiare circuiti neurali come auto-assemblarsi. La capacità di svolgere tutta la cella le registrazioni del morsetto di patch da neuroni tectal e per registrare le risposte evocate RGC, entrambi in vivo o usando una preparazione di tutto il cervello, ha generato un grande corpo dei dati ad alta risoluzione circa i meccanismi di fondo normale e anormale, circuito formazione e funzione. Qui descriviamo come eseguire la preparazione in vivo , la preparazione originale di tutto il cervello, e più recentemente sviluppato preparazione di fetta di cervello orizzontale per ottenere le registrazioni a cellula intera patch clamp da neuroni tectal. Ogni preparazione ha vantaggi unici sperimentali. La preparazione in vivo permette di registrare la risposta diretta dei neuroni tectal agli stimoli visivi proiettato sull'occhio. Permette la preparazione di tutto il cervello per gli assoni RGC deve essere attivata in modo altamente controllato, e la preparazione di fetta di cervello orizzontale permette la registrazione da attraverso tutti gli strati del tectum.
Introduction
Il circuito di retinotectal è il componente principale del sistema visivo anfibio. Si compone di RGCs nell'occhio, che proiettano i loro assoni al tectum ottica dove formano connessioni sinaptiche con neuroni postsinaptici tectal. Il circuito di retinotectal girino Xenopus è un popolare modello di sviluppo per studiare la funzione e la formazione di circuiti neurali. Ci sono molti attributi del circuito retinotectal di questo girino che lo rendono un potente modello sperimentale1,2,3. Un attributo importante e il focus di questo articolo, è la capacità di effettuare tutta la cella patch morsetto registrazioni da neuroni tectal, in vivo o usando una preparazione di tutto il cervello. Con un impianto di perforazione di elettrofisiologia equipaggiato con un amplificatore che supporta la modalità di registrazione a morsetto di tensione e corrente, le registrazioni a cellula intera patch clamp permettono di elettrofisiologia di un neurone a caratterizzarsi ad alta risoluzione. Di conseguenza, tutta la cella patch clamp le registrazioni da neuroni tectal attraverso le fasi chiave della formazione del circuito di retinotectal hanno fornito una comprensione completa e dettagliata dello sviluppo e plasticità di intrinseca4,5 , 6 , 7 e proprietà sinaptiche8,9,10,11 . Combinando le registrazioni a cellula intera patch clamp tectal del neurone, la capacità di esprimere geni o morpholinos di interesse in questi neuroni12e un metodo per valutare il comportamento visivo guidato tramite un stabilito elusione visual test13 promuove la identificazione dei collegamenti tra molecole, circuito funzione e comportamento.
È importante notare che il tipo di alta risoluzione di dati acquisiti da registrazioni di cellula intera patch clamp non sono possibili utilizzando i più recenti approcci di imaging come l'indicatore di calcio genetica GCaMP6, perché anche se utilizzando indicatori di calcio permette l'imaging di calcio dinamiche attraverso le grandi popolazioni di neuroni simultaneamente, non c'è nessun diretto o modo ovvio che i parametri elettrici specifici possono essere ottenuti misurando la fluorescenza di delta nel somata e non c'è alcun modo per tensione morsetto il neurone per misurare rapporti corrente-tensione. Chiaramente questi due approcci distinti, registrazioni elettrofisiologiche e imaging del calcio, possiedono punti di forza non sovrapposte e generare diversi tipi di dati. Pertanto, l'approccio migliore dipende la questione sperimentale specifica affrontata.
Qui, descriviamo il nostro metodo per l'acquisizione di registrazioni di morsetto a cellula intera patch da neuroni del tectum ottica girino utilizzando una preparazione in vivo , preparazione di tutto il cervello, e una più recente modificato preparazione di tutto il cervello che è stato sviluppato nel nostro laboratorio14 . Nella sezione risultati rappresentante, dimostriamo i vantaggi sperimentali di ogni preparazione e le tipologie di dati che possono essere ottenuti. I limiti e i punti di forza di preparazioni differenti, così come suggerimenti per la risoluzione dei problemi, sono inclusi nella sezione discussione.
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Protocol
Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) dell'Università del Wyoming. Tutte le procedure, comprese le registrazioni elettrofisiologiche, sono effettuate a temperatura ambiente, circa 23 ° C. Tutti i metodi descritti qui sono ottimizzati per la registrazione di neuroni tectal da girini tra fase inerente allo sviluppo 42 e 49 (rappresentata nel secondo Neiuwkoop e Faber15).
1. preparazione in Vivo
- Anestetizzare il girino.
- Posizionare il girino in un piccolo piatto di Petri contenente soluzione di Steinberg con 0.01% MS-222 per circa 5 min.
Nota: MS-222 aka "tricaina" è un comune pesci e anfibi anestetico. I girini sono allevati nella soluzione di Steinberg in mM: 0,067 KCl, 0.034 Ca (NO3)2•4H2O, 0.083 MgSO4•7H2O, 5,8 NaCl, 4,9 HEPES. - Garantire che il girino è profondamente anestetizzato (non-responsivi e non più nuoto) prima di procedere al passaggio 2.
- Posizionare il girino in un piccolo piatto di Petri contenente soluzione di Steinberg con 0.01% MS-222 per circa 5 min.
- Fissare il girino anestetizzato a un blocco di silicone sommerso al piano del piatto di dissezione/registrazione.
- Utilizzare una pipetta monouso per spostare il girino anestetizzato in un piatto di dissezione/registrazione contenente soluzione di registrazione esterna (115mm di NaCl, KCl, spessore 2 mM 3 mM di CaCl2, 3mm di MgCl2, 5mm di HEPES, 1 mM di glucosio; regolare il pH a 7,25 utilizzando 10 N di NaOH, osmolarità 255 mOsm).
- Per ridurre al minimo spontanea del muscolo twitches, aggiungere il bloccante del recettore dell'acetilcolina, tubocurarina (100 µM) alla soluzione esterna. (In genere, ciò avviene mediante una pipetta di 200 µ l per aggiungere 100 µ l di uno stock di tubocurarina 10 mM a 10 mL di soluzione esterna).
- Utilizzando spilli entomologici, sicuro il girino, lato dorsale fino, a un blocco sommerso di elastomero di silicone (ad esempio Sylgard 184, Vedi Tabella materiali per dettagli), che è stato incollato al pavimento piatto per dissezione.
Nota: Il posizionamento dei perni è critico: metterli su entrambi i lati del cervello, sufficientemente caudale per evitare impalare gli assoni afferenti di RGC quel progetto dall'occhio ed entrare nel cervello solo anteriore il tectum ottica (Figura 1A).
- Utilizzare una pipetta monouso per spostare il girino anestetizzato in un piatto di dissezione/registrazione contenente soluzione di registrazione esterna (115mm di NaCl, KCl, spessore 2 mM 3 mM di CaCl2, 3mm di MgCl2, 5mm di HEPES, 1 mM di glucosio; regolare il pH a 7,25 utilizzando 10 N di NaOH, osmolarità 255 mOsm).
- Filetto del cervello lungo la linea mediana.
- Per una visione chiara del cervello, togliere la pelle che ricopre il cervello facendo un'incisione superficiale lungo il midline usando un ago sterile 25-G.
- Sfilettare il cervello sullo stesso asse del midline inserendo l'ago nel tubo neurale e tirando delicatamente verso l'alto (dorsalmente) tale che la porzione dorsale del tubo è tagliata in modo pulito (mozzata), lasciando intatta la piastra di pavimento (Figura 1B).
Nota: È importante che la piastra di pavimento del tubo neurale rimasto intatto perché l'input sensoriali afferenti immettere il tectum tramite la piastra di pavimento.
- Rimuovere la membrana trasparente ventricolare che copre i neuroni tectal.
- Spostare il piatto di registrazione per l'impianto di perforazione di elettrofisiologia e utilizzare la punta di una pipetta di vetro rotto per rimuovere la membrana ventricolare che ricopre i corpi cellulari di neuroni tectal. Rompere la punta leggermente trascinandolo attraverso un tergicristallo delicato compito.
- Avvitare la pipetta Dispensare titolare e abbassarla verso il tectum ottica tramite il micromanipolatore.
- Usare la pipetta rotta per sbucciare la membrana ventricolare lontano il tectum.
Nota: Non è necessario rimuovere la membrana dal tectum intero; una piccola finestra sarà sufficiente e fornire l'accesso a un sacco di neuroni.
- Ottenere l'intera cellula registrazioni di patch clamp.
Nota: L'approccio da questo punto in avanti è simile a svolgere le registrazioni a cellula intera patch clamp da fette di cervello del topo come descritto in Segev, et al. 16 (Figura 1C). - Registrare le risposte di neuroni tectal a un flash di tutto il campo di luce proiettati sulla retina.
- Per proiettare un lampo di tutto il campo di luce sulla retina, posto adiacente all'occhio del girino una fibra ottica. A altra estremità della fibra ottica è un LED in linea con un resistore variabile che permette per la luminanza leggera essere controllato. Attivare il LED di uscita digitale dell'amplificatore. In questo modo, tutto il campo flash di diversa intensità della luce può essere registrata (Figura 4A).
2. whole Brain preparazione
- Eseguire i passaggi da 1.1 a 1.3.
Nota: Non esiste alcuna necessità di tubocurarina nella soluzione esterna per questa preparazione. - Isolare il cervello.
- Usare un ago da 25 G per interrompere hindbrain (Figura 2A).
- Per isolare l'intero cervello da girino, eseguire delicatamente l'ago sotto il cervello, in direzione caudale--rostrale di recidere tutti i laterale e ventrale del tessuto connettivo e fibre nervose.
- Fissare il cervello a un blocco di elastomero di silicone.
- Una volta completamente liberato, fissare il cervello a un blocco di elastomero di silicone inserendo un pin attraverso uno dei bulbi olfattivi e un altro attraverso il hindbrain (Figura 2B). Questa è la configurazione ottima per la registrazione da neuroni tectal.
- Spostare il piatto contenente la preparazione appuntato intero cervello dall'ambito dissezione per l'impianto di perforazione di elettrofisiologia. Togliere la membrana ventricolare usando una pipetta di vetro rotto come descritto al punto 1.4.
- Posizionare un elettrodo stimolante bipolare il chiasm ottico (dove i tratti dell'assone da ogni occhio Croce al mesencefalo) per attivare direttamente gli assoni RGC.
- Posizionare l'elettrodo stimolante bipolare rostrale e quasi adiacente al, ventricolo medio grande. Il chiasma ottico si trova immediatamente rostral al ventricolo medio grande (Figura 2B).
- Abbassare delicatamente l'elettrodo stimolante giù sul chiasma tale che una piccola ammaccatura è formata nel tessuto. L'elettrodo bipolare è guidato da uno stimolatore di impulso che permette la forza di stimolazione per essere controllato con precisione.
- Posizionare l'elettrodo stimolante bipolare rostrale e quasi adiacente al, ventricolo medio grande. Il chiasma ottico si trova immediatamente rostral al ventricolo medio grande (Figura 2B).
- Eseguire la registrazione di morsetto di patch intera cellula (Figura 2C) come descritto da Segev, et al. 16
3. orizzontale cervello fetta preparazione
- Eseguire i passaggi 2.1 a 2.3.
- Utilizzare una lama di rasoio per asportare il quarto più laterale (che in vivo corrisponde alla quarta più dorsale) di un lato di un ottica tectum. Questo taglio è fatto parallelo al piano rostrale caudale come mostrato in Figura 3A.
- Re-pin il cervello al lato dell'elastomero siliconico con le fette lato rivolto verso l'alto (in modo che il somata e neuropil sono direttamente accessibili per la registrazione) e la superficie ventricolare del cervello dalla parte opposta del blocco di elastomero di silicone (Figura 3 B) (in modo che un elettrodo bipolare può essere posizionato su chiasm ottico).
- Eseguire l'intera cellula patch morsetto o registrazione potenziali archiviato locale (Figura 3C) come descritto da Segev, et al. 16
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Representative Results
Per registrare le risposte evocate luce un lampo di tutto il campo di luce viene proiettato la retina, mentre la risposta risultante viene registrata da singoli neuroni tectal (Figura 4A). Questo particolare protocollo è progettato per misurare sia la risposta del neurone alla luce accensione ("On" risposta) e quindi spegnendo 15 s più tardi per misurare la "risposta fuori." Neuroni tectal esibiscono tipicamente robusto e disattivare le risposte (modalità morsetto mostrato qui registrate in tensione, con il neurone fissata a - 60mV per misurare corrente sinaptica (Figura 4B)). La quantità di unità sinaptica ricevuti da qualsiasi un neurone può essere quantificata mediante la registrazione di eventi spontanei sinaptici (Figura 4C). Rapporti corrente-tensione (curve I-V) possono essere generati dal neurone stesso facendo un passo il neurone ai potenziali sempre più depolarizzati e registrazione del risultante tensione-attivato Na+ e correnti di K+ , indicati come "misto a corrente registrazioni"(Figura 4D, E). Esso è stato affermato che per questi neuroni anfibio, picco Na+ e K+ correnti possono essere quantificate tramite registrazioni corrente miste perché le cime non sovrapporsi temporaneamente uno con l'altro4,7.
Diretta attivazione degli assoni RGC al chiasma bypassa tutti i calcolo a Monte e l'elaborazione degli stimoli visivi che si svolgono nell'occhio e consente di studiare la trasmissione sinaptica tra presinaptici RGC assoni e neuroni postsinaptici tectal nel suo forma più pura e ridotta. Risposte tectal neurone all'attivazione di RGC vengono generate da RGCs stimolata dalla luce o direttamente utilizzando un elettrodo stimolante bipolare che consiste di due componenti: una componente monosinaptica (l'input sinaptico diretto da RGCs attivato) e un polisinaptici componente (la rete locale ricorrente attività alimentazione indietro sul neurone in fase di registrazione). Nel caso di risposte evocate luce, i componenti monosinaptici e polisinaptici si sovrappongono uno con l'altro da una certa quantità di undeterminable. Questa sovrapposizione temporale limita ciò che può essere concluso sulla trasmissione sinaptica tra la retina e ottica tectum. Usando una preparazione di tutto il cervello e l'attivazione del tratto di assone RGC direttamente tramite un elettrodo posizionato il chiasm ottico (Figura 5A), tuttavia, produce una mono - e polisinaptici componente che sono essenzialmente non sovrapposte nel tempo. La forza stimolante dell'elettrodo bipolare può essere regolata. Come la forza stimolante è aumentata, c'è un maggior numero di assoni RGC attivato (Figura 5B). Un protocollo di stimolazione minima determina la forza sinaptica di un singolo assone RGC su un singolo neurone tectal; un protocollo di stimolazione massima riflette il totale, o input sinaptico di massima da tutti gli assoni RGC combinato (Figura 5C). Il rapporto corretto di input sinaptico eccitatorio di inibitoria (E: ho rapporto) ricevuti da un singolo neurone tectal è critico per la funzione visiva normale18. Figura 5 D Mostra un esempio delle RGC-evocato eccitatorie ed inibitorie corrente tracce registrate da un singolo neurone tectal. La probabilità che il rilascio del trasmettitore da terminali assone presinaptico RGC è misurata da registrazioni di impulsi appaiati. Per questo, il neurone postsinaptico tectal è registrato in modalità tensione morsetto per misurare correnti sinaptiche, mentre gli assoni RGC vengono attivati successivamente, separati da un intervallo di tempo di 50 ms (Figura 5E).
A cellula intera patch morsetto registrazioni possono essere effettuate dai neuroni tectal che risiedono in qualsiasi livello somatico. Simile alla preparazione di tutto il cervello, gli assoni RGC possono essere attivati inserendo un elettrodo bipolare registrazione sul chiasma (Figura 6A). Tutte le registrazioni effettuate nella preparazione di tutto il cervello possono essere eseguite anche utilizzando questa preparazione di fetta di cervello orizzontale. Figura 6 B Mostra una traccia di esempio di una risposta evocata RGC registrata da un neurone nello strato superficiale. Questa preparazione permette anche per il modello spaziale di RGC input sinaptico sui dendriti tectal di essere misurato. Per questo, campo RGC-evocata potenziali sono registrati ogni 10 µm lungo l'asse mediale-laterale (cioè, l'asse distale-prossimale) del neuropil (Figura 6C). Questo genera un profilo ad alta risoluzione del modello di input RGC funzionale. I potenziali di campo possono quindi essere trasformati in attuale densità di origine calcolando le derivate spaziali secondo14 e le densità di origine corrente a sua volta possono essere trasformate in una trama di immagine. La trama di immagine nella Figura 6C Mostra che l'input RGC più forte obiettivi la zona più distale del neuropil.
Figura 1. In vivo procedure di preparazione. (A) girino inchiodato su un pezzo di elastomero di silicone. Perni sono indicati dalle frecce bianche. Si noti il posizionamento più caudale di pin per evitare impalare i tratti ottici. La linea tratteggiata bianca indica la linea mediana. (B) Zoomed-in vista dell'intero cervello dopo il taglio lungo la linea mediana dorsale e rimuovendo la pelle di sovrapposizione. (C) registrazione toppa-morsetto della intero-cellula in vivo. (L: laterale. M: mediale. R: rostrale. C: caudale. D: dorsale. V: ventrale. OB: bulbo olfattivo. OT: Ottica Tectum. HB: Hindbrain). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 . Procedure di preparazione del cervello intero. (A) dopo che il cervello è filettato lungo la linea mediana, il hindbrain viene interrotta. (B) l'intero cervello è dissecato fuori e appuntato l'elastomero di silicone. L'asterisco bianco indica il pin nel bulbo olfattivo sinistro. Il riquadro rosso indica il terzo medio del tectum, cioè, l'area di destinazione per la registrazione. (C) registrazione morsetto patch a cellula intera che usando tutto il cervello preparazione. L'asterisco nero indica l'area della membrana ventricolare ONU-raschiata dove le cellule non possono essere letta per la registrazione. Dove la membrana è stato rimosso con successo, il somata appaiono più chiari e definiti. La freccia indica un neurone malsano. (PZ: zona proliferativa. LMV: Grande ventricolo mediale. OB: bulbo olfattivo. OT: Ottica Tectum. HB: Hindbrain. L: laterale. M: mediale. R: rostrale. C: caudale. D: dorsale. V: ventrale). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 . Le procedure di preparazione di fetta orizzontale cervello. (A), la porzione più laterale di un lato del tectum ottica sarà tagliato (indicato dalla linea tratteggiata) dopo la preparazione di tutto il cervello. Preparazione di fetta di cervello orizzontale (B) dopo essere stato inchiodato al lato dell'elastomero siliconico. Doppie linee bianche rappresentano un elettrodo stimolante posizionato il chiasm ottico. (C), visualizzazione ingrandita del soma strati e neuropil usando un cervello orizzontale fetta preparazione. Curva tratteggiata indica il limite tra strati di soma e neuropil. Questa figura è stata modificata da Nicolò Abbate, et al. 14 (l: laterale. M: mediale. R: rostrale. C: caudale. D: dorsale. V: ventrale. OB: bulbo olfattivo. OC: Chiasm ottico. OT: Ottica Tectum. HB: Hindbrain). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 . Registrazioni da una preparazione in vivo . Schema (A) che mostra la configurazione tipica di una registrazione in vivo . (B) luce evocato risposte compresi luce su e luce spenta le risposte. Inserto tracce sono visualizzazione ingrandita su-fuori-risposta e, rispettivamente. (C) spontanea eccitatorie correnti postsinaptiche registrata. (D) Na+ e correnti di K+ in risposta alla tensione morsetto passi da -60 mV a 30 mt da un singolo neurone. (E) IV piazzole generati da tracce in (D). Tutte le registrazioni sono state fatte con il neurone disputato -60 mV tranne in (D) per generare IV-Piazzole; i neuroni sono entrati ai potenziali sempre più più depolarizzati, in incrementi di 10 mV, per attivare le correnti tensione-dipendente. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 . Registrazioni da una preparazione di tutto il cervello. Schema (A) che mostra la configurazione tipica di registrazione intero cervello compreso un elettrodo stimolante immessi sul chiasma (linee verde e rossa rappresentano gli assoni RGC). (B) Overlaying traccia delle risposte ai cambiamenti della forza di stimolazione RGC RGC. (C) massimo stimolo risposta (a sinistra) e stimolazione minima risposta (a destra). (D) An RGC-evocata risposta eccitatoria e inibitoria su un singolo neurone. (E) Paired impulsi facilitazione della risposta di un singolo neurone RGC-evocati. (OB: bulbo olfattivo. OC: Chiasm ottico. OT: Ottica Tectum). Tutte le registrazioni sono state fatte con il neurone disputato -60 mV tranne in (D) per misurare l'input eccitatori ed inibitori: l'input eccitatorio è registrato tenendo il neurone presso il potenziale di inversione di acido γ-amminobutirrico (GABA)-mediata cloruro correnti (-45 mv); l'input inibitorio tenendo il neurone presso il potenziale di inversione di acido α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic (AMPA)-mediata correnti (+ 5 mv). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6 . Registrazioni da un cervello orizzontale fetta preparazione. Schema (A) Mostra la configurazione di una preparazione di fetta di cervello orizzontale. Si noti che anche se l'elettrodo stimolante rimane al chiasm ottico, la pipetta di registrazione è ora posizionato accesso cellule attraverso tutti gli strati tectal esposti dalla preparazione fetta orizzontale del cervello. (B) una risposta RGC da un neurone che risiedono nello strato superficiale del tectum. (C) registrato potenziali di campo attraverso neuropil e le densità di origine corrente convertito (CSDs) indicate da immagine trama mappe di calore. (OC: chiasma ottico. OT: Ottica Tectum. HB: Hindbrain). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Tutti i metodi descritti in questo lavoro sono ottimizzati per la registrazione di neuroni tectal da girini tra fase inerente allo sviluppo 42 e 49 (rappresentata nel secondo Neiuwkoop e Faber15). Dalla fase 42, i girini sono sufficientemente grandi e sufficientemente sviluppati affinché i perni degli insetti possono essere posizionati su entrambi i lati del cervello per le registrazioni in vivo e di eseguire la dissezione del cervello intero. Nelle fasi precedenti, quando i girini sono essenzialmente bidimensionali (cioè, piatto), gli approcci descritti qui non sono ottimali.
A causa della facilità in cui i neuroni tectal possono essere consultati e registrati nella configurazione di cellule intere, questo circuito di modello è stato un focolaio di scoperte fondamentali sulla forma di circuiti neurali come durante il funzionamento - e funzione mentre formando19. Qui abbiamo descritto come acquisire registrazioni di morsetto a cellula intera patch da neuroni tectal, compreso il modo di eseguire il girino in vivo e preparazioni di tutto il cervello, la registrazione differenti configurazioni ed esempi dei diversi tipi di dati. Di seguito è riportato una discussione dei punti di forza e i limiti di ogni preparazione, seguita da suggerimenti per realizzare registrazioni di alta qualità tutta la cella.
Girini di Xenopus iniziano a visualizzare i comportamenti di evitamento visual da stage 47/48, circa 7-8 giorni post-fertilizzazione3,13. Questo significa che anche in queste fasi relativamente precoce di sviluppo, il circuito di retinotectal è funzionante e in grado di elaborare gli stimoli visivi. Questioni fondamentali per lo sviluppo e plasticità del circuito retinotectal sono state affrontate direttamente utilizzando la preparazione in vivo per registrare le risposte di neuroni tectal agli stimoli visivi proiettati sulla retina. In vivo le registrazioni nel girino sono relativamente semplice rispetto alla configurazione di registrazione equivalente nei mammiferi dovuto la relativa semplicità del sistema nervoso e mancanza di un teschio. Poiché i somas singoli neuroni tectal possono essere visualizzati in vivo, tenuta su un dato neurone e raggiungimento di configurazione registrazione a cellula intera patch clamp è essenzialmente equivalente allo svolgimento di morsetto di patch a cellula intera registrazione in fetta del roditore preparazioni. Girini in genere sopravvivono per diverse ore su rig (che può essere facilmente valutata monitorando il battito del cuore). Una limitazione intrinseca della preparazione girino in vivo è che solo i neuroni tectal che risiedono nello strato profondo somatico dell'ottica tectum, lo strato che è immediatamente adiacente al ventricolo medio grande, sono accessibili per la registrazione (Figura 1 ). Questo significa che i neuroni tectal residenti negli strati esterni somatici del tectum sono state in gran parte inesplorati in vivo.
Il vantaggio sperimentale del preparato intero cervello è che si isola il cervello dai recettori sensoriali periferici negli occhi e nella pelle, eliminando tutte le attività sensoriali-driven spurie. Mentre non è più in grado di essere guidato da stimoli visivi, gli ingressi di axonal RGC destinati il tectum sono ancora presenti nel preparato tutto il cervello e possono essere attivati direttamente in modo altamente controllato tramite un elettrodo stimolante bipolare (FHC) immesso sul il chiasma ottico dove i due insiemi di tratti dell'assone RGC entrassero nel cervello. Il primo uso riferito della preparazione intero cervello fu nel 1996, in un importante studio di Wu et al. 8, in cui gli assoni RGC sono stati attivati utilizzando un elettrodo stimolante bipolare tale che gli autori potevano quantificare la forza dei singoli assoni RGC sui neuroni postsinaptici tectal e facendo così fatto scoperte fondamentali circa la progressione di maturazione della sinapsi. Come con la preparazione in vivo , la preparazione di tutto il cervello consente l'accesso a solo quei neuroni che risiedono nello strato profondo, adiacente alla membrana ventricolare.
Anche se l'ottica tectum è composto di circa nove corpo cellulare strati17, tutti gli studi di elettrofisiologia precedenti hanno messo a fuoco sui neuroni tectal strato profondo perché il tradizionale intero cervello e preparati in vivo (descritti sopra) consentono l'accesso solo ai neuroni di strato profondo. Per poter accedere a neuroni tectal attraverso tutti gli strati somatici, dal più profondo al più superficiale così come l'intero neuropil cui assoni RGC formano connessioni sinaptiche con dendriti del neurone tectal, abbiamo sviluppato una preparazione modificate intero cervello, indicata come "il preparazione di fetta di cervello orizzontale"(Figura 3,14). Come con la preparazione di tutto il cervello, la preparazione di fetta di cervello orizzontale mantiene gli assoni RGC all'interno del cervello e possono essere controllati mettendo un elettrodo stimolante bipolare il chiasm ottico.
Nel complesso, i preparativi sono progettati per ottimizzare la visualizzazione di e l'accesso a somata tectal neurone per eseguire registrazioni con cellula intera patch clamp. Accesso diretto al soma è essenziale per registrazioni di qualità a cellula intera patch clamp: accesso all'interno del neurone richiede la formazione di un molto forte (> 1 × 109 Ω) tenuta tra la pipetta e membrana plasmatica del neurone, che richiede diretto contatto della punta della pipetta su tale membrana. Quindi, sufficiente asportazione della membrana ventricolare è la chiave per la registrazione di successo. Inoltre, chiave per successo registrazioni RGC-evocato è il corretto posizionamento dell'elettrodo stimolante bipolare sul chiasma. Essenzialmente tutti i neuroni tectal ricevano input sinaptico diretto da assoni RGC. Se nessuna risposta RGC-evocato è osservata, allora questo è probabilmente a causa di errato posizionamento dell'elettrodo bipolare, tale che non è il chiasm ottico e non a contatto con i nervi ottici. Questo può essere risolto semplicemente ri-posizionamento dell'elettrodo stimolante. Mancata osservanza RGC-ha evocato le risposte dopo ri-posizionamento dell'elettrodo bipolare potrebbe significare che la proiezione di assone RGC è stato accidentalmente reciso durante la dissezione. In questo caso, è necessario ricominciare da capo con una nuova preparazione. Infine, l'inosservanza di una risposta evocata RGC potrebbe essere a causa di registrazione da una cella che non è un neurone tectal comune. Per esempio, glia in genere non visualizzano la risposta monosinaptica RGC-evocati normale visualizzata dai neuroni tectal e nemmeno i neuroni mesencephalic grandi che sono stati trovati, anche se a numeri molto bassi, che risiedono nell' ottica tectum20. La probabilità di registrare da una di queste cellule non-tectal è molto bassa a causa del gran numero di neuroni tectal. Naturalmente, registrazioni di qualità richiedono anche i neuroni tectal per essere sano. Caratteristiche di un neurone tectal sano sono un compatto soma rotondo o ovale che è di colore chiaro e senza imperfezioni. Una volta raggiunta la configurazione di registrazione di tutta la cella, la salute del neurone possa essere ulteriormente valutata a livello elettrofisiologico misurando fondamentali proprietà elettriche come potenziale di membrana, resistenza di ingresso e capacità di riposo . Il potenziale di membrana di riposo dei neuroni tectal sani tra fasi inerenti allo sviluppo 42 e 49 è circa -45 mV, con una media resistenza d'ingresso di circa 1 GΩ e una capacità di 10-12 pF3,4,5. Una piccola frazione dei neuroni sarà inevitabilmente danneggiata a causa della rimozione della membrana ventricolare. Il somata dei neuroni danneggiati o insalubri appaiono granuloso, gonfio, o avvizziti. Figura 2Cè riportato un esempio di un neurone del malsano. Se la maggioranza dei neuroni appare malsana, questo potrebbe essere una riflessione che c'è qualcosa di sbagliato con la soluzione di registrazione esterna, quindi si raccomanda di soluzione fresca di registrazione esterna. Oltre a comparire sano, i neuroni migliori per la registrazione sono associati tipicamente con un gran numero di altri neuroni, al contrario di essere isolati. Inoltre, scegliere celle che sono facilmente accessibili. Ad esempio, non spingere il tessuto troppo difficile da accedere a una cella perché questo potrebbe danneggiare il tessuto o spostare il tessuto e quindi spostare l'elettrodo stimolante fuori luogo. Infine, le registrazioni dovrebbero essere limitate nel terzo medio del tectum (Figura 2B) per evitare differenze di potenziale dovuto la pendenza inerente allo sviluppo che esiste attraverso il rostro-caudale asse4,8, a meno che, naturalmente, l'obiettivo dell'esperimento è la suddetta pendenza inerente allo sviluppo. Il tectum corretta è la zona rostrale della zona proliferativa e caudale all'estremità caudale del ventricolo medio grande.
Il morsetto di patch a cellula intera registrazione tecnica non è priva di limiti. In generale, questo stile di registrazione comporta la registrazione di un neurone in un momento. Questo è in contrasto con gli approcci che coinvolgono la formazione immagine di una nuova generazione indicatori di calcio GCaMP6, che consentono l'attività di grandi popolazioni di neuroni per essere imaged simultaneamente in una fetta preparazione e in vivo.
Un altro svantaggio inerente le registrazioni a cellula intera tensione morsetto è l'errore di morsetto di spazio (l'incapacità di controllare la tensione molto più in là, oltre il soma), che limita il controllo temporale della tensione4. Nel complesso, questi problemi di morsetto di tensione sono minimi quando si registra da neuroni tectal tuttavia, a causa della loro dimensione relativamente piccola, modesta arborizations dentritici e correnti relativamente piccole e lente rispetto ai neuroni dei mammiferi. Queste caratteristiche dei neuroni tectal li rendono particolarmente favorevoli per il morsetto di tensione registrazione, misurazione di molti parametri e la costruzione di profili per singoli neuroni5,6.
Orientamenti futuri includono l'ottimizzazione di una in vivo del cervello orizzontale fetta preparazione per caratterizzare la funzione dei neuroni di strato esterno nell'elaborazione degli stimoli visivi.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Supportato dalla concessione NIH SBC COBRE 1P20GM121310-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stemi Stereo 508 | Zeiss | 495009-0006-000 | Dissecting microscope |
| MS-222 "Tricane" | Finquel | ARF5G | Amphibian general anesthetic |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-3 | Used to prepare Stienberg's solution and external solution |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | P217-500 | Used to prepare Stienberg's solution and external solution |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-1KG | Used to prepare Stienberg's solution and external solution |
| Calcium nitrate tetrahyrate (Ca(NO3)•4H2O) | Sigma-Aldrich | 237124-500G | Used to prepare Stienberg's solution |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | Mallinckrodt Chemicals | 6066-04 | Used to prepare Steinberg's solution |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5080-500G | Used to prepare external recording solution |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | J.T. Baker | 2444-01 | Used to prepare external recording solution |
| D-glucose Anhydrous | Mallinckrodt Chemicals | 6066-04 | Used to prepare external recording solution |
| Tubocurarine hydrochloride pentahydrate | Sigma | T2379 | Nicotinic acetylcholine receptor antagonist |
| Insect Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | 0.1mm diameter stainless steel pins |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 761028 | Preweighed monomer and curing agent kit |
| Sterile Polystyrene Petri Dish - 60x15mm | Fisher Scientific | AS4052 | Small petri dishes |
| PrecisionGlide Needle 25Gx5/8 (.0.5mm X 16mm) | BD | 305122 | Syringe needles |
| 1mL Slip Tip Tuberculin Syringe | BD | 309659 | Disposable, sterile syringes |
| Borosilicate pipette glass | Sutter Instrument | BF150-86-10HP | Pulled to desired specifications using pipette pulling machine |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | Fabricates micropipettes for electrophysiology recording |
| Kimwipes Kimtech wipes | Kimberly-Clark | 34120 | Delicate task lint-free wipers |
| Axon Instruments MultiClamp 700B Headstage CV-7B | Molecular Devices | 1-CV-7B | Current clamp and voltage clamp headstage |
| MP-285 Motorized Manipulator with Tabletop Controller | Sutter Instrument | MP-285/T | Control for headstage on electrophysiology rig |
| Fiber-Coupled LED (Green) | Thorlabs | M530F2 | Fiber optic cable paired with green LED |
| Cluster Bipolar Electrode (25µm diameter) | FHC | 30207 | Bipolar stimulating electrode |
| ISO-Flex Stimulator | A.M.P.I. (Israel) | Contact manufacturer | Flexible stimulus isolator |
| Axon Instruments 700B Multipatch Amplifier | Molecular Devices | 2500-0157 | Amplifier for voltage- and current-clamp recording |
| Digidata 1322A digitizer | Molecular Devices | 2500-135 | Data acquisition system for electrophysiology recording |
| Axio Examiner.A1 | Zeiss | 491404-0001-000 | Microscope for electrophysiology |
| Micro-g Lab Table | TMC | 63-533 | Air table for electrophysiology microscope |
| Inspiron 620 Personal Desktop Computer with Windows 7 64-bit | Dell | D06D001 | Computer running electrophysiology software |
| c2400 CCD camera | Hamamatsu | 70826-5 | Charge-coupled device camera for electrophysiology imaging |
| 7 O'Clock Super Platinum Stainless Razorblades | Gillette | CMM01049 | Platinum-coated stainless razor blades |
| Transfer Pipets | Fisher Scientific | 13-711-7M | Disposable Polyethylene transfer pipets |
References
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