Summary
이 종이 전체 셀 패치 클램프 기록 Xenopus laevis tadpoles의 retinotectal 회로 공부 하는 데 사용 하는 세 뇌 준비를 다루겠습니다. 그것의 자신의 특정 이점 각 준비 신경 회로 기능을 공부 하는 모델로 Xenopus 올챙이의 실험 추적성에 기여 한다.
Abstract
Xenopus 올챙이 retinotectal 회로, 어떤 형태로 광섬유 tectum에 신경에 직접 synapses 눈에서 망막 신경 절 세포 (RGCs)의 구성 어떻게 신경 회로 공부 하는 인기 모델은 자기 조립. 전체 수행 하는 기능 패치 클램프 기록 중 vivo에서 기록 RGC 갖는 응답을 tectal 뉴런에서 셀 또는 전체 두뇌 준비를 사용 하 여 일반 기본 메커니즘에 대 한 고해상도 데이터의 큰 몸 생성 했다 비정상적인, 회로 형성 및 기능. 여기 우리가 준비 vivo에서 , 원래 뇌 준비를 수행 하는 방법을 설명 하 고 더 최근 개발 tectal 뉴런에서 전체 셀 패치 클램프 녹음을 얻기 위해 수평 뇌 조각을 준비. 각 준비 독특한 실험 장점이 있습니다. Vivo에서 준비 tectal 신경의 눈에 투영 하는 시각적 자극에 직접 응답의 녹음 수 있습니다. 뇌 준비 매우 제어 방식에서 활성화 RGC 축 삭에 대 한 허용 하며 수평 두뇌 슬라이스 준비에서 녹음은 tectum의 모든 레이어에서
Introduction
Retinotectal 회로 양서류 비주얼 시스템의 주요 구성 요소. 그것은 광섬유 tectum postsynaptic tectal 신경 세포와 시 냅 스 연결을 형성 하는 어디에 그들의 축 삭을 프로젝트 눈에서 RGCs 구성 됩니다. Xenopus 올챙이 retinotectal 회로 신경 회로 형성 기능을 공부 하 고 인기 있는 개발 모델입니다. 그것은 강력한 실험 모델,12,3렌더링이 올챙이 retinotectal 회로의 많은 특성이 있습니다. 한 주요 특성, 그리고이 문서의 초점 tectal 신경, vivo에서 또는 뇌의 준비를 사용 하 여 전체 셀 패치 클램프 기록 수행 하는 기능입니다. 전압 및 전류 클램프 녹음 모드를 지원 하는 앰프와 복 전기 생리학 장비, 전체 셀 패치 클램프 기록 수 높은 해상도에서 특징에 뉴런의 전기 생리학. 그 결과, 전체 셀 패치 클램프 기록 retinotectal 회로 형성의 주요 단계에 걸쳐 tectal 뉴런에서 개발의 상세 하 고 포괄적인 이해 하 고 내장4,5 의 소성 제공 , 6 , 7 고 시 냅 스8,9,,1011 속성. 전체 셀 패치 클램프 tectal 신경 녹음을 결합, 유전자 또는 morpholinos 이러한 뉴런12, 그리고 설립된 시각적 회피 테스트13 통해 시각적 가이드 동작을 평가 하는 방법에 관심을 표현 하는 능력을 촉진 합니다 분자, 회로 기능 및 행동 사이 연결의 id입니다.
데이터 전체 셀 패치 클램프 기록에서 취득 불가능 유전 칼슘 표시기 GCaMP6, 같은 새로운 이미징 접근을 사용 하 여 있기 때문에 높은 해상도의 종류 칼슘 표시기를 사용 하 여 비록 허가 이미징 주의 하는 것이 중요 하다 칼슘의 신경 세포의 큰 인구에 걸쳐 역학 동시에, 아니 직접 또는 확실 한 방법은 특정 전기 매개 변수 somata에서 델타 형광을 측정 하 여 얻을 수 있습니다 그리고 거기 방법은 전압 클램프 측정 하 신경 전류-전압 관계입니다. 명확 하 게이 두 가지 접근, electrophysiological 녹음 및 칼슘 이미징, 겹치지 않는 강점가지고 고 다른 유형의 데이터를 생성. 따라서, 가장 좋은 방법은 해결 되 고 특정 실험적인 질문에 따라 달라 집니다.
여기, 우리가 올챙이 눈 tectum는 vivo에서 준비, 뇌 준비를 사용 하 여의 뉴런에서 전체 셀 패치 클램프 기록 인수에 대 한 우리의 방법을 설명 하 고 새로운 수정14 연구소에서 개발 된 뇌 준비 . 대표적인 결과 섹션에서 각 준비와 얻을 수 있는 데이터의 종류의 실험적인 장점을 보여 줍니다. 문제 해결을 위한 팁 뿐만 아니라 다른 준비의 강점과 한계 토론 섹션에 포함 됩니다.
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Protocol
여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 와이오밍 대학에 의해 승인 되었습니다. Electrophysiological 녹음을 포함 한 모든 절차는 실 온, 약 23 ° c.에서 실시 여기에 설명 된 모든 방법은 tadpoles 발달 단계 42 및 49 (Neiuwkoop와 페이 버15에 따라 개최) 사이에서 tectal 신경 기록 최적화 되어 있다.
1. Vivo에서 준비
- 올챙이 anesthetize
- 0.01% 스 테 인 버그의 솔루션을 포함 하는 작은 페 트리 접시에는 올챙이 놓고 약 5 분 동안 MS-222.
참고: MS-222 일명 "Tricaine"는 일반적인 물고기와 양서류 마 취. Tadpoles는 m m에서 스 테 인 버그의 솔루션에서 발생 하는: 0.067 4.9 HEPES 5.8 NaCl, KCl, 0.034 Ca (3)2•4H2O, 0.083 MgSO4•7H2O. - 올챙이 깊이 anaesthetized (무응답과 이상 수영) 2 단계를 진행 하기 전에 확인 합니다.
- 0.01% 스 테 인 버그의 솔루션을 포함 하는 작은 페 트리 접시에는 올챙이 놓고 약 5 분 동안 MS-222.
- 해 부/녹음 접시의 바닥에 잠긴된 실리콘 블록을 마 취 올챙이 보안 합니다.
- 처분할 수 있는 이동 피 펫을 사용 하 여 외부 기록 솔루션을 포함 해 부/녹음 접시 anaesthetized 올챙이 이동 (115 m m의 NaCl, KCl, 2mm CaCl23 m m, MgCl23 m m, 5mm HEPES, 1mm 포도 당; 조정 7.25 사용 하 여 pH 10 N NaOH, osmolarity 255 mOsm의).
- 자발적인 근육을 최소화 하기 위해 기, 아 세 틸 콜린 수용 체 차단제, tubocurarine (100 µ M) 외부 솔루션에 추가 합니다. (일반적으로,이 이루어집니다 외부 솔루션의 10 mL를 100 µ L 10 mM tubocurarine 주식의 추가 200 µ L 피 펫을 사용 하 여).
- 곤충 핀을 사용 하 여 보안 올챙이, 등 쪽, 실리콘 탄성 중합체의 침수 블록 (예: Sylgard 184 참조 자료 테이블 세부 정보에 대 한), 어떤 해 접시 바닥에 붙어 있다.
참고: 핀의 위치는 중요 한: 눈에서 그 프로젝트 뇌, 성의 RGC 축 삭을 impaling 피하기 위해 충분히 꼬리의 양쪽에 그들을 배치 하 고 그냥 눈 tectum (그림 1A) 앞쪽 뇌를 입력.
- 처분할 수 있는 이동 피 펫을 사용 하 여 외부 기록 솔루션을 포함 해 부/녹음 접시 anaesthetized 올챙이 이동 (115 m m의 NaCl, KCl, 2mm CaCl23 m m, MgCl23 m m, 5mm HEPES, 1mm 포도 당; 조정 7.25 사용 하 여 pH 10 N NaOH, osmolarity 255 mOsm의).
- 중간 선 따라 뇌를 모 깎기.
- 두뇌의 명확한 보기에 대 한 살 균 25 G 바늘을 사용 하 여 중간에 따라 표면 절 개 하 여 뇌를 overlying 피부를 제거 합니다.
- 신경 관에 바늘을 삽입 하 고 당겨 부드럽게 위쪽으로 (dorsally) 등 튜브의 등 쪽 부분 깔끔하게 절단 (절단) 바닥 플레이트 그대로 (그림 1B)를 떠나 있는 동안 그 같은 중간 축 따라 뇌를 모 깎기.
참고: 때문에 구심 성 감각 입력 입력은 tectum는 바닥에 접시를 통해 신경 튜브의 바닥 접시 그대로 남아 있을 중요 하다.
- Tectal 신경 세포를 포함 하는 투명 한 심 실 막을 제거 합니다.
- 전기 생리학 장비에 기록 접시를 이동 하 고 깨진된 유리 피 펫 팁을 사용 하 여 심 실 막 overlying tectal 신경 셀 시체를 제거. 가볍게 섬세 한 작업와이 퍼에 걸쳐 그것을 드래그 하 여 팁을 휴식.
- 피 펫 홀더에 피펫으로 나사와 micromanipulator 통해 광섬유 tectum 내려 낮은.
- 깨진된 피 펫을 사용 하 여 껍질은 tectum에서 심 실 막.
참고: 그것은 전체 tectum;에서 멤브레인을 제거 하는 데 필요한 작은 창이 충분 하 고 충분 한 뉴런에 대 한 액세스를 제공.
- 패치 클램프 기록을 전체 셀을 가져옵니다.
참고:이 시점에서 접근이 비슷합니다 Segev, 외. 에 설명 된 대로 마우스 뇌 조각에서 전체 셀 패치 클램프 녹음을 실시 16 (그림 1C). - 망막에 투영 하는 빛의 전체 필드 플래시 tectal 신경 응답을 기록 합니다.
- 망막에 빛의 전체 필드 플래시 프로젝트, 광학 섬유를 올챙이 눈에 인접 한 장소. 광학 섬유의 다른 끝에 LED 빛 광도 제어할 수 있도록 가변 저항 라인 이다. 앰프의 디지털 출력으로 LED를 트리거하십시오. 이 방법에서는, 섬광 빛의 다양 한 농도의 수는 전체 필드(그림 4)를기록 했다.
2. 뇌 준비
- 1.1 1.3 단계를 수행 합니다.
참고: tubocurarine이이 준비를 위한 외부 솔루션에 대 한 필요가 있다. - 뇌를 격리 합니다.
- 25 G 바늘을 사용 하 여 서버 hindbrain (그림 2A).
- 올챙이에서 뇌를 분리 하려면 부드럽게 모든 측면 및 복 부 결합 조직 및 신경 섬유를 절단 하는 꼬리-rostral 방향에서 뇌 밑 바늘을 실행 합니다.
- 실리콘 엘라 스토 머의 블록에 두뇌를 보호 합니다.
- 일단 완전히 해제 후 각 전구 중 하나를 통해 하나의 핀 hindbrain (그림 2B)를 통해 또 다른 핀을 배치 하 여 실리콘 탄성 중합체의 블록에 뇌를 보안 합니다. Tectal 신경에서 기록에 대 한 최적의 구성입니다.
- 전기 생리학 장비에 해 범위에서 고정 된 뇌 준비를 포함 하는 접시를 이동 합니다. 1.4 단계에서 설명한 대로 깨진된 유리 피 펫을 사용 하 여 심 실 멤브레인을 제거 합니다.
- 바이 폴라 자극 전극에 배치 시 chiasm (어디 각 눈에서 축 삭 책자는 midbrain에 크로스) RGC 축 삭을 직접 활성화 하.
- 바이 폴라 자극 전극 rostral, 그리고 거의 옆에, 큰 중간 심 장소. 광학 chiasm는 즉시 rostral 큰 가운데 심 (그림 2B)에 있습니다.
- 부드럽게 낮은 자극 전극 다운 시 chiasm에 되도록 작은 덴트 직물에서 형성 된다. 양극 전극은 정밀 하 게 제어 하는 자극의 강도 수 있는 펄스 자극에 의해 구동 됩니다.
- 바이 폴라 자극 전극 rostral, 그리고 거의 옆에, 큰 중간 심 장소. 광학 chiasm는 즉시 rostral 큰 가운데 심 (그림 2B)에 있습니다.
- Segev, 그 외 여러분 에 의해 설명 된 대로 수행 하는 전체 셀 패치 클램프 기록 (그림 2C) 16
3. 수평 뇌 슬라이스 준비
- 2.1 2.3 단계를 수행 합니다.
- 면도날을 사용 하 여 하나의 광섬유 tectum의 한쪽의 가장 측면 4 (는 비보에 해당 하는 가장 등 4) 소비 세. 이 컷 평면에 평행 rostral 꼬리 그림 3A와 같이 이루어집니다.
- 두뇌는 슬라이스 된 실리콘 엘라 스토 머의 측면에 다시 핀 사이드 (somata 및 neuropil는 기록에 대 한 직접 액세스할 수 있습니다)을 향하도록 하 고 실리콘 고무 블록 (그림 3 멀리 직면 하는 뇌의 심 실 표면 B) (있도록 양극 전극 광학 chiasm에 놓일 수 있다).
- 전체 셀 패치 클램프 또는 로컬 출원된 잠재적인 기록 (그림 3C) Segev, 그 외 여러분 에 의해 설명 된 대로 수행 16
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Representative Results
빛 갖는 응답를 빛의 전체 필드 플래시 결과 응답 개별 tectal 뉴런(그림 4)에서 기록 하는 동안 망막에 예상 된다. 이 특정 프로토콜은 모두 빛 ("에" 응답) 켜기 한 다음 15 신경의 응답을 측정 하도록 설계 되어 나중 "에서 응답." 측정 하는 s Tectal 신경은 일반적으로 응답에 이따금 강력한 전시 (표시 여기에 기록 된 전압 클램프 모드, 신경으로 고정-60mV 측정 시 냅 스 전류 (그림 4B)). 어떤 한 뉴런에서 수신 시 냅 스 드라이브의 양은 자발적 시 냅 스 이벤트 (그림 4C) 기록 하 여 측정할 수 있습니다. 전류-전압 관계 (I-v 곡선)을 신경 점점 depolarized 전위를 스텝으로 동일한 뉴런에서 생성 하 고 결과 전압 활성화 나+ 및 K+ 전류 라고도 "현재 혼합 수 있습니다. 기록 "(그림 4D, E). 그것은 잘 설립 되었습니다 이러한 양서류 뉴런에 대 한 피크 나+ 와 봉우리 오버랩 되지 않는 일시적으로 서로와4,7때문에 혼합된 현재 녹음을 통해 K+ 전류를 측정할 수 있습니다.
직접 시 chiasm에 RGC axons의 활성화 모든 업스트림 계산과 눈에서 시각적 자극의 처리를 무시 하 고 공부 하는 연 접 RGC 축 삭 및 postsynaptic tectal 뉴런 간의 시 냅 스 전송 허용의 가장 순수 하 고 감소 된 형태입니다. RGC 활성화 tectal 신경 응답 RGCs 빛 또는 바이 폴라 자극 전극 구성 된 두 개의 구성 요소를 사용 하 여 직접 자극된에서 생성 됩니다: monosynaptic 구성 요소 (직접 시 냅 스의 입력 활성화 RGCs)와 polysynaptic 구성 요소 (로컬 재발 네트워크 활동 수 유 기록 되 고 신경에 다시). 빛 갖는 응답의 경우 monosynaptic 및 polysynaptic 구성 요소는 일부 undeterminable 양만큼 서로 겹칩니다. 이 임시 중복 제한 무엇에 대 한 망막과 광학 tectum 사이 시 냅 스 전달 종결 될 수 있다. 그러나 뇌 준비를 사용 하 고 활성화 시 chiasm그림 5(A)에 전극을 통해 직접 RGC 축 삭으로, 모노-및 polysynaptic 구성 요소를 기본적으로 겹치지 않는 시간에 생성 합니다. 양극 전극의 자극 강도 조정할 수 있습니다. 자극 강도 증가로 RGC axons 활성화 (그림 5B)의 큰 숫자가입니다. 최소한의 자극 프로토콜의 개별 tectal 신경;에 개별 RGC 축 삭 시 냅 스 강도를 결정합니다. 최대한 자극 프로토콜 총, 또는 모든 RGC 축 삭 결합 (그림 5C)에서 최대, 시 냅 시스 입력을 반영합니다. 흥분 성의 억제에 시 냅 시스 입력의 적절 한 비율 (E: 나 비율) 개인이 받은 tectal 신경은 정상 시각 기능18중요. 그림 5 D RGC 갖는 흥분 성의 억제 현재 자취는 개별 tectal 신경에서 기록의 예가 나와 있습니다. RGC 연 접 축 삭 맨끝에서 송신기 방출의 확률은 짝된 펄스 녹음 하 여 측정 됩니다. 이 위해, tectal postsynaptic 신경 RGC axons 활성화 연속, 50 밀리초 시간 간격 (그림 5전자)를 구분 하는 동안, 시 냅 스 전류를 측정 하는 전압 클램프 모드에 기록 됩니다.
전체 셀 패치 클램프 기록 모든 체세포 계층에 있는 tectal 뉴런에서 밖으로 수행할 수 있습니다. 전체 두뇌 준비와 마찬가지로, RGC axons 활성화할 수 있습니다 (그림 6A) 광학 chiasm에 바이 폴라 기록 전극 배치 하 여. 모든 녹음 뇌 준비에서 실시 또한이 수평 두뇌 슬라이스 준비를 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 그림 6 B 표면 층에 신경에서 기록 RGC 갖는 응답의 예를 들어 추적을 보여 줍니다. 또한이 준비는 tectal 모 수석에 RGC 시 냅 시스 입력의 공간적 패턴에 대 한 측정 될 수 있습니다. RGC 갖는 필드 전위 기록 됩니다,이 대 한 neuropil (그림 6C)의 중간 측면 축 (즉, 원심 근 축)을 따라 모든 10 µ m. 이 기능 RGC 입력 패턴의 고해상도 프로 파일을 생성합니다. 있으 나 필드 후보 두 번째 공간 파생14 를 계산 하 여 현재 소스 밀도로 다음 변형 될 수 있다 고 현재 소스 밀도 이미지 플롯으로 변형 될 수 있다. 그림 6C 이미지 플롯 강한 RGC 입력은 neuropil의 더 말 초 영역을 대상 보여 줍니다.
그림 1. Vivo에서 준비 절차. (A) 올챙이 실리콘 엘라 스토 머의 조각에 쌓. 핀 흰색 화살표로 표시 됩니다. Note을 impaling 광섬유 책자를 피하기 위해 더 꼬리 핀 위치. 흰색 파선은 중간을 나타냅니다. (B) Zoomed 보기 전체 두뇌 등 중간 선 따라 절단 하 고 입히는 피부 제거 후. (C) 전체 셀 패치 클램프 기록에서 vivo에서. (L: 측면입니다. M: 중간입니다. R: rostral. C: 꼬리. D: 등입니다. V: 복 부입니다. 산부인과: 후 각 전구입니다. 오티: 광섬유 Tectum입니다. HB: Hindbrain). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 . 전체 준비 절차 두뇌. (A) 두뇌는 hindbrain 중간 따라 종속 후 절단. (B)는 전체 뇌 밖으로 해 부 이며 실리콘 엘라 스토 머에 쌓. 흰색 별표 왼쪽된 후 각 전구에 핀을 나타냅니다. 빨간색 상자는 tectum, 즉, 기록 위한 대상 지역 가운데 3을 나타냅니다. (C) 전체 셀 패치 클램프 기록 뇌 준비를 사용 하 여. 검은 별표 어디 녹음에 대 한 셀에 액세스할 수 없습니다 해제 긁힌 것 심 실 막의 영역을 나타냅니다. 막 성공적으로 제거 되었습니다, 어디는 somata 더 고유 하 고 정의 된 나타납니다. 화살표는 건강에 해로운 뉴런을 나타냅니다. (포 텐 차: 증식 영역. LMV: 큰 중간 심 산부인과: 후 각 전구입니다. 오티: 광섬유 Tectum입니다. HB: Hindbrain. L: 측면입니다. M: 중간입니다. R: rostral. C: 꼬리. D: 등입니다. 된 복 부)입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 . 수평 두뇌 슬라이스 준비 절차. (A) 광섬유 tectum의 한쪽의 가장 측면 부분 (점선으로 표시 된) 슬라이스 뇌 준비 후에. (B) 수평 뇌 슬라이스 준비 후 실리콘 탄성 중합체의 측면 고정. 이중 흰색 라인 자극 전극을 광학 chiasm에 나타냅니다. (C) Zoomed 뷰는 소마의 레이어 및 neuropil 수평 두뇌를 사용 하 여 슬라이스 준비. 파선된 곡선 소마 레이어 및 neuropil 사이 경계를 나타냅니다. 이 그림에서 Hamodi, 외. 수정 되었습니다. 14 (l: 측면. M: 중간입니다. R: rostral. C: 꼬리. D: 등입니다. V: 복 부입니다. 산부인과: 후 각 전구입니다. OC: 광학 Chiasm입니다. 오티: 광섬유 Tectum입니다. HB: Hindbrain). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 . Vivo에서 준비에서 녹음. (A) 회로도 보여주는 vivo에서 기록의 일반적인 구성 (B) 빛에 빛을 포함 한 응답 및 응답에서 빛을 되 살려. 삽입 된 흔적은 확대 보기의에 오프-응답, 각각. (C) 자발적 흥분 성의 postsynaptic 전류 기록. (D) 나+ 및 전압에 대응에서 K+ 전류 클램프-60에서 30 mV 뮤직 비디오는 하나의 신경에서. (E) 4 구획 (d) 추적에서 생성 된. 모든 녹음 끝내 고-60에서 개최 하는 신경 (d) 4-음모; 생성을 제외 하 고 mV 뉴런은 활성화 전압-종속 전류 10 mV 단위로 점점 더 depolarized 잠재력을 강화. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 . 전체 두뇌 준비에서 녹음. (A) 회로도 보여주는 뇌 녹음 자극 전극 등의 일반적인 구성 배치 시 chiasm에 (녹색, 빨간색 선은 나타냅니다 RGC 축 삭). (B) 입히는 RGC 자극 강도의 변화에 RGC 응답의 흔적. (C) 최대 자극 응답 (왼쪽) 및 최소 자극 응답 (오른쪽). (D)는 RGC 갖는 흥분 성의 억제 응답 하나의 신경에. (E) 쌍 펄스는 개별 뉴런의 RGC 갖는 반응의 촉진. (오늘: 후 각 전구. OC: 광학 Chiasm입니다. 오티: 광섬유 Tectum). 모든 녹음 끝내 고-60에서 개최 하는 신경 흥분 성의 억제 입력 측정을 (D)를 제외 하 고 뮤직 비디오: 흥분 성의 입력 γ-Aminobutyric 산 (GABA)의 역 분개 잠재력에 신경을 눌러 기록-염화 중재 전류 (-45 mv); α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic 산 (AMPA)의 역 분개 잠재력에 신경을 개최 하 여 금지 입력-중재 하는 전류 (5 mv). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6 . 수평 뇌에서 녹음 슬라이스 준비. (A) 회로도 수평 두뇌 슬라이스 준비의 구성을 보여주는 Note 자극 전극, 광섬유 chiasm에 남아 있지만 기록 피 펫은 지금 수평 두뇌 슬라이스 준비에 의해 노출 되는 모든 tectal 레이어에 걸쳐 액세스 셀에 위치. (B)는 tectum의 표면 층에 있는 뉴런에서 RGC 응답. (C)는 neuropil와 이미지 플롯 열 지도 표시 변환 된 전류 소스 밀도 (CSDs) 필드 전위를 기록. (OC: 광학 Chiasm. 오티: 광섬유 Tectum입니다. HB: Hindbrain). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이 작품에서 설명 하는 모든 방법 tadpoles 발달 단계 42 및 49 (Neiuwkoop와 페이 버15에 따라 개최) 사이에서 tectal 신경 기록 최적화 되어 있다. 무대 42는 tadpoles는 충분히 크고 충분히 개발 곤충 핀 vivo에서 녹음 한 뇌 해 부를 수행 하기 위한 뇌의 양쪽에 배치 될 수 있도록. 이전 단계에서는 tadpoles는 근본적으로 2 차원 (즉, 평면), 여기서 설명 하는 접근은 최적이 아닙니다.
용이성에 tectal 신경 수 액세스 하 고 전체 셀 구성에 기록으로 인해이 모델 회로가 되었습니다 어떻게 신경 회로 형태에 대 한 기본적인 발견에 대 한 온상-기능과 기능 하는 동안19를 형성 하는 동안. 여기 우리가 전체 셀 패치 클램프 기록 vivo에서 올챙이 뇌 준비, 다른 녹음 구성, 및 데이터의 다른 유형의 예를 수행 하는 방법을 포함 하 여 tectal 뉴런에서 취득 하는 방법을 설명 했습니다. 다음은 힘의 논의 높은-품질 전체 세포 기록 달성에 대 한 팁 다음 각 준비의 한계.
Xenopus tadpoles 시작 단계 47/48, 약 7-8 일 후 수정3,13시각적 회피 동작을 표시 합니다. 즉, 개발이 상대적으로 초기 단계 에서도 retinotectal 회로 작동 하 고 시각적 자극을 처리할 수 있습니다. 개발 및 retinotectal 회로의 소성에 관한 근본적인 질문 직접 해결 되었다 tectal 신경 망막에 투영 하는 시각적 자극에 응답을 vivo에서 준비를 사용 하 여. Vivo에서 녹음은 올챙이에 신 경계는 두개골의 부족의 상대적 단순 포유류에 해당 녹음 구성에 비해 비교적 간단. 수 있기 때문에 개별 tectal 신경 somas 시각화 된 vivo에서, 주어진된 신경에 씰링 하 고 전체 셀 패치 클램프 기록 구성 달성은 기본적으로 전체 셀 패치 클램프 설치류 조각에 녹음을 수행 준비입니다. Tadpoles는 일반적으로 장비 (는 심장 박동을 모니터링 하 여 쉽게 평가 될 수 있다)에 몇 시간 동안 남아 있다. 준비 vivo에서 올챙이의 내재 한 한계가입니다만 tectal 신경 광섬유 tectum의 체세포 깊은 층에 있는, 큰 중간 심 실에 즉시 인접 한 레이어 (그림 1 기록에 액세스할 수 ). 즉, tectal 신경은 tectum의 체세포 바깥 층에 있는 크게 탐험 되어 vivo에서.
전체 두뇌 준비의 실험 장점은 그것은 눈과 피부, 모든 가짜 감각 기반 활동을 제거에 주변 감각 수용 체에서 뇌를 분리. 동안 더 이상 수 시각적 자극에 의해 구동 되 고, 대상으로 tectum RGC axonal 입력은 여전히 뇌 준비에 존재와 그들에 바이 폴라 자극 전극 (FHC)를 통해 높은 제어 방식으로 직접 활성화 될 수 있다 광학 chiasm RGC 축 삭 책자의 두 세트는 두뇌를 입력. 전체 두뇌 준비의 첫 번째 보고 사용 우 외. 에 의해 한 중요 한 연구에서 1996 년에는 8, 어떤 RGC axons 저자 postsynaptic tectal 신경에 개별 RGC axons의 강도 정할 수는 바이 폴라 자극 전극을 사용 하 여 활성화 했다에 고 고 너무 기본적인 발견을 했다의 진행에 대 한 냅 성숙입니다. Vivo에서 준비와 마찬가지로 뇌 준비는 계층, 심 실 막에 인접 한에 거주 하는 신경에만 액세스할 수 있습니다.
비록 눈 tectum는 약 9 셀 바디 레이어17구성, 모든 이전 전기 생리학 연구에 초점을 맞춘 계층 tectal 신경 때문에 전통적인 뇌 그리고 vivo에서 준비 (설명 위) 계층의 뉴런에만 액세스를 허용 합니다. RGC 축 삭 모 수석 tectal 신경, 시 냅 스 연결을 형성 하는 가장 전체 뿐만 아니라 표면에 깊은 neuropil에서 모든 체세포 레이어에서 tectal 신경 액세스 우리 개발 "로 수정된 뇌 준비 수평 두뇌 슬라이스 준비"(그림 314). 전체 두뇌 준비와 마찬가지로 수평 두뇌 슬라이스 준비 유지 RGC 축 삭 두뇌 내에서 하 고 광학 chiasm에 바이 폴라 자극 전극 배치 하 여 제어할 수 있습니다.
전반적으로, 준비의 시각화 및 tectal 신경 somata 전체 셀 패치 클램프 기록 수행에 대 한 액세스를 최적화 하기 위해 설계 되었습니다. Soma에 액세스 품질 전체 셀 패치 클램프 기록에 대 한 필수적입니다 직접: 신경의 내부에 대 한 액세스 요구의 매우 강한 대형 (> 1 × 109 Ω) 피펫으로 직접 필요한 신경 세포의 원형질 막 사이 물개 그 막에 피 펫 팁의 접촉입니다. 따라서, 심 실 막의 충분 한 제거 성공적인 기록 위한 열쇠입니다. 또한, 성공적인 RGC 갖는 녹음에 대 한 키 시 chiasm에 바이 폴라 자극 전극의 올바른 배치 이다. 기본적으로 모든 tectal 신경 RGC axons에서 직접 시 냅 시스 입력을 받을. RGC 갖는 응답을 관찰 하는 경우 다음이 바이 폴라 전극의 잘못 된 배치 때문에 가장 가능성이 시 chiasm에 시 신경에 연락 하지 않습니다. 이 단순히 다시 자극 전극 배치 하 여 수정 될 수 있습니다. 관찰 RGC 갖는 응답 후 다시 바이 폴라 전극 위치 하는 것은 그 것을 의미할 수도 있고 RGC 축 삭 투영 실수로 해 부 동안 절단 했다. 이 경우에, 그것은 새로운 준비를 하 고부터 다시 시작 하는 데 필요한입니다. 마지막으로, RGC 갖는 응답을 관찰 하는 실패는 일반적인 tectal 신경 세포에서 녹음 때문일 수 있었다. 예를 들어, 명과 일반적으로 표시 되지 않는 정상적인 RGC 갖는 monosynaptic 응답 tectal 신경에 의해 표시 되 고도 할 발견 되었습니다 큰 mesencephalic 신경 쓰 신 광섬유 tectum20에 있는 매우 낮은 숫자. Tectal 신경의 완전 한 숫자 때문이 아닌 tectal 셀 중 하나에서 녹음의 가능성 매우 낮습니다. 물론, 품질 기록 또한 건강 tectal 신경 필요 합니다. 건강 한 tectal 신경의 특성은 빛 색 고 결점 없이 소형 원형 또는 타원형 모양의 소마. 휴식 막 잠재력, 입력된 저항 및 커패시턴스 등 기본적인 전기적 특성을 측정 하 여 신경의 건강 electrophysiological 수준에서 더 평가 수 전체 세포 기록 구성 달성 되 면 . 발달 단계 42 및 49 사이 건강 한 tectal 신경 세포의 휴식 막 잠재력은 약-45 mV, 10-12 pF3,,45의 커패시턴스와 약 1 GΩ의 평균 입력된 저항. 뉴런의 극히 심 실 막의 제거로 인해 하지 필연적으로 손상 됩니다. 손상 되거나 비정상 신경 somata 표시 낟 알, 비 대 한, 오 그 라 든. 건강에 해로운 신경의 예는 그림 2C표시 됩니다. 대부분 신경의 건강 하지 못한 경우,이 그릇 된 뭔가가 외부 녹음 솔루션 신선한 외부 녹음 솔루션을 확인 하는 것이 좋습니다 그래서 반영 수 있습니다. 건강 한 나타나는, 게다가 녹음에 대 한 최고의 신경 일반적으로 고립 되 고 반대로 다른 신경 세포의 큰 번호와 연결 됩니다. 또한, 쉽게 액세스할 수 있는 셀을 선택 합니다. 예를 들어 할 하지 밀어 조직 너무 힘들 수 있기 때문에이 조직을 손상 또는 조직 이동 따라서 이동 장소 자극 전극 셀에 액세스할. 마지막으로, 녹음 rostro 꼬리 축4,8, 걸쳐 있는 발달 그라데이션 인해 잠재적인 차이 피하기 위해 tectum (그림 2B)의 중간 3 분 제한 해야 물론, 실험의 초점 전술 개발 그라데이션입니다. 적절 한 tectum 증식 영역의 rostral와 큰 중간 심의 꼬리 가장자리에 꼬리 영역입니다.
전체 셀 패치 클램프 기술 기록의 제한 없이 하지 않습니다. 일반적으로 기록의이 스타일 한 번에 하나의 뉴런을 기록 포함 한다. 이것은 새로운 세대의 이미지를 포함 하는 접근 달리 슬라이스 준비와 에 vivo에서 동시에 이미지를 신경 세포의 큰 인구를의 활동에 대 한 허용 GCaMP6 칼슘 지표 이다.
또 다른 단점은 전체 셀 전압 클램프 녹음에 내재 된 제한 전압4의 일시적인 제어 공간 클램프 오류 (soma 넘어 훨씬 더 전압을 제어 하 무 능력),입니다. 그러나, 그들의 상대적으로 작은 크기, 겸손 한 수지상 arborizations, 및 포유류 신경에 비해 상대적으로 작고 느린 전류 tectal 뉴런에서 기록할 때 전반적으로, 이러한 전압 클램프 문제 최소화 됩니다. Tectal 신경의 이러한 특성 특히 전압 클램프 기록, 많은 매개 변수, 측정 및 개별 뉴런5,6에 대 한 프로필의 건설에 대 한 의무가 그들을 렌더링 합니다.
미래 방향 최적화는 vivo에서 수평 두뇌 슬라이스 준비 시각적 자극의 처리에 외부 층 뉴런의 기능 특성을 포함 합니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
NIH 그랜트 SBC COBRE 1P20GM121310-01에 의해 지원.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stemi Stereo 508 | Zeiss | 495009-0006-000 | Dissecting microscope |
| MS-222 "Tricane" | Finquel | ARF5G | Amphibian general anesthetic |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-3 | Used to prepare Stienberg's solution and external solution |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | P217-500 | Used to prepare Stienberg's solution and external solution |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-1KG | Used to prepare Stienberg's solution and external solution |
| Calcium nitrate tetrahyrate (Ca(NO3)•4H2O) | Sigma-Aldrich | 237124-500G | Used to prepare Stienberg's solution |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | Mallinckrodt Chemicals | 6066-04 | Used to prepare Steinberg's solution |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5080-500G | Used to prepare external recording solution |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | J.T. Baker | 2444-01 | Used to prepare external recording solution |
| D-glucose Anhydrous | Mallinckrodt Chemicals | 6066-04 | Used to prepare external recording solution |
| Tubocurarine hydrochloride pentahydrate | Sigma | T2379 | Nicotinic acetylcholine receptor antagonist |
| Insect Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | 0.1mm diameter stainless steel pins |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 761028 | Preweighed monomer and curing agent kit |
| Sterile Polystyrene Petri Dish - 60x15mm | Fisher Scientific | AS4052 | Small petri dishes |
| PrecisionGlide Needle 25Gx5/8 (.0.5mm X 16mm) | BD | 305122 | Syringe needles |
| 1mL Slip Tip Tuberculin Syringe | BD | 309659 | Disposable, sterile syringes |
| Borosilicate pipette glass | Sutter Instrument | BF150-86-10HP | Pulled to desired specifications using pipette pulling machine |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | Fabricates micropipettes for electrophysiology recording |
| Kimwipes Kimtech wipes | Kimberly-Clark | 34120 | Delicate task lint-free wipers |
| Axon Instruments MultiClamp 700B Headstage CV-7B | Molecular Devices | 1-CV-7B | Current clamp and voltage clamp headstage |
| MP-285 Motorized Manipulator with Tabletop Controller | Sutter Instrument | MP-285/T | Control for headstage on electrophysiology rig |
| Fiber-Coupled LED (Green) | Thorlabs | M530F2 | Fiber optic cable paired with green LED |
| Cluster Bipolar Electrode (25µm diameter) | FHC | 30207 | Bipolar stimulating electrode |
| ISO-Flex Stimulator | A.M.P.I. (Israel) | Contact manufacturer | Flexible stimulus isolator |
| Axon Instruments 700B Multipatch Amplifier | Molecular Devices | 2500-0157 | Amplifier for voltage- and current-clamp recording |
| Digidata 1322A digitizer | Molecular Devices | 2500-135 | Data acquisition system for electrophysiology recording |
| Axio Examiner.A1 | Zeiss | 491404-0001-000 | Microscope for electrophysiology |
| Micro-g Lab Table | TMC | 63-533 | Air table for electrophysiology microscope |
| Inspiron 620 Personal Desktop Computer with Windows 7 64-bit | Dell | D06D001 | Computer running electrophysiology software |
| c2400 CCD camera | Hamamatsu | 70826-5 | Charge-coupled device camera for electrophysiology imaging |
| 7 O'Clock Super Platinum Stainless Razorblades | Gillette | CMM01049 | Platinum-coated stainless razor blades |
| Transfer Pipets | Fisher Scientific | 13-711-7M | Disposable Polyethylene transfer pipets |
References
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