Summary
В этой статье мы обсуждаем три мозга препаратов, используемых для записи зажим клеточных патч для изучения retinotectal цепь Xenopus laevis головастиков. Каждый подготовки, с свои собственные конкретные преимущества, способствует экспериментальной уступчивость Xenopus головастика как модель для изучения функции нейронные цепи.
Abstract
Xenopus головастика retinotectal цепи, состоит из клеток сетчатки ганглия (РГК) в глаза, какая форма синапсов непосредственно на нейронов в оптические tectum, является популярной моделью для изучения как нейронных цепей самостоятельно собрать. Способность выполнять целом ячейки записи зажим патч от тектальный нейронов и запись RGC-вызвала ответов, либо в естественных условиях или с помощью весь мозг подготовки, вызвала большой объем данных с высоким разрешением о механизмах, лежащих в основе нормальной и аномальные, схемы формирования и функции. Здесь мы опишем, как для выполнения в естественных условиях подготовка, оригинальные весь мозг, и более недавно разработала горизонтальный мозга ломтик подготовка для получения клеточных патч зажим записи от тектальный нейронов. Каждый препарат имеет уникальные экспериментальные преимущества. В естественных условиях подготовки позволяет запись прямого ответа тектальный нейронов визуальные раздражители, проецируется на глаз. Весь мозг подготовки позволяет RGC аксоны активироваться очень контролируемым образом, и подготовка срез горизонтальных мозга запись с на всех слоях tectum.
Introduction
Retinotectal схема является основным компонентом амфибия зрительной системы. Она состоит из РГК в глаза, которые проект их аксоны оптические tectum, где они образуют синаптических связей с тектальный постсинаптических нейронов. Схема retinotectal головастика Xenopus является популярной модели развития для изучения нейронные цепи формирования и функции. Существует множество атрибутов этот головастик retinotectal цепи, которые делают его мощным Экспериментальная модель1,2,3. Один из основных атрибутов и в центре внимания этой статьи, является способность выполнять клеточных патч зажим записи из тектальный нейронов, в естественных условиях или с помощью весь мозг подготовки. С буровой электрофизиологии, оснащен усилитель, который поддерживает записи режимов напряжения и тока зажим клеточных патч зажим записи позволяют электрофизиологии нейрон характеризуется высоким разрешением. В результате клеточных патч зажим записи от тектальный нейронов через основные этапы формирования retinotectal цепи представили подробное и всеобъемлющее понимание развития и пластичности встроенные4,5 , 6 , 7 и синаптическую8,9,10,11 свойства. Сочетание клеточных патч зажим тектальный нейрон записи, способствует способность выражать гены или морфолиновая интерес в этих нейронов12и метод для оценки управляемое поведение через установленных визуальных недопущение испытаний13 выявление связей между молекулами, цепи функции и поведение.
Важно отметить, что тип высокого разрешения, полученных из клеточных патч зажим записей данных возможен не с помощью новых изображений подходов, таких как генетические кальция индикатор GCaMP6, потому что хотя использование показателей кальция позволяет изображений кальция динамики через больших популяций нейронов одновременно, там нет прямого или очевидным способом что конкретных электрических параметров могут быть получены путем измерения флуоресценции Дельта в somata и нет никакого способа, чтобы напряжение зажим нейрон для измерения вольт амперных отношения. Очевидно эти два различных подхода, электрофизиологические записи и кальция изображений, обладают non перекроя сильные и генерировать различные типы данных. Таким образом наилучший подход зависит от конкретных экспериментальных вопрос решается.
Здесь мы описываем наш метод для получения клеточных патч зажим записи из нейронов оптические tectum головастика, с использованием в естественных условиях подготовка, весь мозг, и новые изменения весь мозг подготовки, которая была разработана в нашей лаборатории14 . В разделе представитель результаты мы демонстрируем экспериментальной преимущества каждого подготовки и различные виды данных, которые могут быть получены. Ограничения и сильные стороны различных препаратов, а также советы по устранению неполадок, включены в раздел "обсуждение".
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все методы, описанные здесь были одобрены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) из университета штата Вайоминг. Все процедуры, включая электрофизиологических записи, осуществляется при комнатной температуре, примерно 23 ° C. Все описанные здесь методы оптимизированы для записи тектальный нейроны от головастиков между стадии развития 42 и 49, (постановка согласно Neiuwkoop и Фабер-15).
1. Подготовка в естественных условиях
- Анестезировать головастик.
- Место головастиков в небольшой Петри, содержащий решение Стейнберга с 0,01% MS-222 примерно 5 минут.
Примечание: MS-222 ака «Tricaine» является общим рыб и земноводных анестезии. Головастики выращиваются в растворе Стейнберга в мм: 0.067 KCl, O 0,034 Ca (№3)2•4H2, 0,083 MgSO4•7H2O, 5,8 NaCl, 4.9 HEPES. - Убедитесь, что головастика глубоко анестезированные (не отвечают и не плавание) перед переходом к шагу 2.
- Место головастиков в небольшой Петри, содержащий решение Стейнберга с 0,01% MS-222 примерно 5 минут.
- Закрепите наркотизированных головастика погруженной силиконовые блок на полу рассекает запись блюдо.
- Используйте одноразовые передачи пипетки для перемещения анестезированные головастика блюдо рассечение/записи, содержащие внешние записи решение (115 мм NaCl, 2 мм хлористого калия, 3 мм CaCl2, 3 мм MgCl2, 5 мм HEPES, 1 мм глюкозы; скорректировать рН до 7,25 с помощью 10 N NaOH, осмолярность 255 мОсм).
- Для сведения к минимуму спонтанное мышцы дергается, добавьте блокатора рецепторов ацетилхолина, тубокурарин (100 мкм) для внешнего решения. (Как правило, это делается с помощью 200 мкл пипетки для 100 мкл запас тубокурарин 10 мм на 10 мл раствора внешних).
- Использование насекомых булавки, обеспечить головастика, спинной стороне вверх, погруженной блок силиконового эластомера (например Sylgard 184, таблица Материалов для деталей), который был приклеен к рассечения этаж блюдо.
Примечание: Важно размещение контакты: разместить их на обе стороны мозга, достаточно хвостового избежать Пронзающий афферентных аксоны RGC проекта от глаз и проникают в мозг просто впереди оптические tectum (рис. 1А).
- Используйте одноразовые передачи пипетки для перемещения анестезированные головастика блюдо рассечение/записи, содержащие внешние записи решение (115 мм NaCl, 2 мм хлористого калия, 3 мм CaCl2, 3 мм MgCl2, 5 мм HEPES, 1 мм глюкозы; скорректировать рН до 7,25 с помощью 10 N NaOH, осмолярность 255 мОсм).
- Филе мозга вдоль средней линии.
- Для четкого представления мозга удалите кожа, мозг, делая поверхностный надрез вдоль средней линии, с помощью иглы стерильные 25-G.
- Филе мозга вдоль той же средней линии оси, вставляя иглу в нервной трубки и потянув аккуратно вверх (дорсально) такие, что спинная часть трубы аккуратно вырезать (разорвала) оставляя нетронутыми напольной плиты (рис. 1Б).
Примечание: Важно, что напольной плиты нервной трубки оставить нетронутыми потому что афферентные сенсорные входы ввести tectum через напольной плиты.
- Удаление прозрачный желудочков мембраны, которая охватывает тектальный нейронов.
- Переместить запись блюдо Рог электрофизиологии и использовать наконечник пипетки сломленного стекла для удаления желудочков мембраны, обволакивающие тектальный нейрон органов ячейки. Разорвать кончик перетаскиванием его слегка через деликатную задачу стеклоочистителя.
- Винт пипеткой в пипетку держатель и опустите его вниз до оптических tectum через микроманипулятор.
- Используйте сломанной пипетку для пил желудочков мембраны от tectum.
Примечание: Это не необходимо удалить мембрану из всего tectum; небольшое окно будет достаточно и обеспечивают доступ к большим количеством нейронов.
- Получите всю ячейку записи зажим патч.
Примечание: Подход с этой точки вперед похож на проведение клеточных патч зажим записей из кусочков мозга мыши, как описано в Сегев, et al. 16 (Рис. 1C). - Запишите ответы тектальный нейрон поля целиком вспышка света проецируется на сетчатке.
- Для проекта поля целиком вспышка света на сетчатку, разместите волоконно рядом с головастика глаз. На другом конце оптического волокна является светодиод соответствует переменный резистор, который позволяет для яркости света необходимо контролировать. Триггер светодиодный цифровой выход усилителя. Таким образом все поле, вспышки различной интенсивности света могут быть записаны (рис. 4A).
2. весь мозг подготовки
- Выполните шаги от 1.1 до 1.3.
Примечание: Нет необходимости для тубокурарин внешние решения для этой подготовки. - Изолируйте мозга.
- Использование иглы 25-G разорвать задний мозг (рисA).
- Чтобы изолировать весь мозг от головастика, осторожно запустите иглы под мозга, в хвостовой в ростральной направлении разорвать все боковые и брюшной соединительной ткани и нервных волокон.
- Закрепите мозга к блоку силиконового эластомера.
- После полностью освобожден, безопасные мозга к блоку кремния эластомер, поместив один через один из обонятельные луковицы и другой контактные через задний мозг (рис. 2B). Это оптимальная настройка для записи от тектальный нейронов.
- Переместите блюдо, содержащий закрепленного весь мозг подготовки от рассечения сферы Рог электрофизиологии. Удаление желудочков мембраны с помощью пипетки сломленного стекла как описано в шаге 1.4.
- Место биполярный электрод стимулирования на зрительных нервов (где участки аксона от каждого глаза крест на среднего мозга) напрямую активировать аксоны RGC.
- Место биполярный электрод стимулирования ростральной и почти рядом, большой средней желудочка. Зрительных нервов расположен сразу ростральной большого среднего желудочек (рис. 2B).
- Аккуратно опустите стимулирующих электродов вниз на зрительных нервов, таким образом, что небольшая вмятина образуется в тканях. Биполярный электрод управляется импульсный стимулятор, который позволяет сила стимуляции, чтобы точно контролировать.
- Место биполярный электрод стимулирования ростральной и почти рядом, большой средней желудочка. Зрительных нервов расположен сразу ростральной большого среднего желудочек (рис. 2B).
- Выполните всю ячейку записи патч зажим (рис. 2C), как описано в Сегев, et al. 16
3. горизонтальный мозга ломтик подготовка
- Выполните шаги 2.1-2.3.
- Используйте лезвие бритвы для акцизных наиболее боковой четвертой (которые в естественных условиях соответствует наиболее спинной четвертый) одной стороны одной оптической tectum. Этот отруб делается параллельно плоскости ростральной хвостового как показано на рисунке 3A.
- Повторно прикрепить мозга в сторону силиконового эластомера с ломтиками стороной вверх (так, что somata и Нейропиль могут быть непосредственно доступны для записи) и поверхности желудочков головного мозга, стоящие вдали от силиконового эластомера блока (рис. 3 B) (так что биполярного электрода может быть размещен на зрительных нервов).
- Выполните клеточных патч зажим или местных поданной потенциальных запись (рис. 3C), как описано в Сегев, et al. 16
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Для записи света вызвали ответы поля целиком вспышка света проецируется на сетчатке хотя полученный ответ записывается из отдельных нейронов тектальный (рис. 4A). Этот конкретный протокол предназначен для измерения реакции нейрона к свету включение («на «ответ) и затем выключается 15 s позднее, чтобы измерить «Off ответ.» Тектальный нейроны обычно демонстрируют надежных и выключать ответы (показано здесь в напряжение зажим режим, с нейроном зажато - 60mV для измерения синаптических тока (рис. 4B)). Количество синаптических диска, полученные любой один нейрон может быть определена количественно, записывая спонтанное синаптических события (рис. 4C). Вольт амперных отношения (-V кривых) может быть образующиеся же нейрон, ступая нейрон более деполяризованный потенциалы и запись результирующего напряжения активированный Na+ и K+ токи, именуемый как «смешанного текущего записи» (Рисунок 4D, E). Он был хорошо установленных для этих земноводных нейронов, пик Na+ и K+ токи могут быть количественно через смешанного текущего записи, потому что вершины не височно перекрываются друг с другом4,7.
Прямая активация RGC аксоны в зрительных нервов обходит все вверх по течению вычислений и обработки зрительных раздражителей, которые происходят в глаза и позволяет для изучения синаптической передачи между Пресинаптический RGC аксонов и постсинаптических нейронов тектальный в ее наиболее чистой и снижение формы. Тектальный нейрон ответы на RGC активации генерируются из РГК стимулируется света или напрямую с помощью биполярного электрода стимулирования, состоящий из двух компонентов: компонент monosynaptic (прямой синаптических ввод из активированных РГК) и полисинаптические компонент (местные периодические сетевой активности кормления обратно на нейрон записывается). В случае легкой вызвали ответы компоненты monosynaptic и полисинаптические перекрываются друг с другом на определенный определимыми. Это временные перекрытия ограничивает то, что можно сделать вывод о синаптической передачи между сетчатки и оптические tectum. Используя весь мозг подготовки и активация урочище аксона RGC непосредственно через электрод на зрительных нервов (рис. 5A), однако, производит моно - и полисинаптические компонент, который, по существу non перекроя во времени. Стимулирующее прочность биполярного электрода может быть скорректирована. Как стимулирующее прочность увеличивается, есть большее количество RGC аксоны активирована (рис. 5B). Минимальная стимуляция протокол определяет синаптических прочность отдельных RGC аксона на отдельных тектальный нейрона; максимальной стимуляции протокола отражает общее, или максимум, синаптических ввода от всех RGC аксоны комбинированный (рис. 5C). Правильное соотношение возбуждающим для тормозной синаптических ввода (E: я соотношение) получил индивидуалом тектальный нейрон имеет решающее значение для нормальной зрительной функции18. Рисунок 5 D показывает пример RGC-вызвала возбуждающих и тормозящий текущего следы записанных из отдельных тектальный нейрона. Вероятность выпуска передатчика от RGC Пресинаптический аксона терминалов измеряется парных импульса записи. Для этого постсинаптических тектальный нейрон записывается в режиме напряжение зажим для измерения синаптических токов, в то время как аксоны RGC активируются последовательно, разделенных промежуток времени 50 мс (5 рисунокE).
Вся ячейка патч зажим записи может осуществляться от тектальный нейронов, проживающих в любой соматических слоя. Подобно весь мозг подготовки, аксоны RGC может быть активирован, поместив электрод биполярный запись на зрительных нервов(рис. 6). Все записи, проведенные в ходе подготовки весь мозг также может выполняться с помощью этой подготовки ломтик горизонтальных мозга. Рисунок 6 B показывает пример трассировки RGC-вызвал ответ Записанная от нейрона в поверхностном слое. Этот препарат также позволяет пространственное распределение RGC синаптических ввода на тектальный дендритов измеряется. Для этого, потенциалов RGC-вызвала поля записываются каждые 10 мкм вдоль медиальной боковой оси (т.е., оси дистальной к проксимальной) Нейропиль (рис. 6C). Это создает профиль с высоким разрешением модели функционального ввода RGC. Потенциалов поля затем могут быть преобразованы в текущий источник плотности путем расчета второй пространственных производных14 и текущий источник плотности в свою очередь могут быть преобразованы в участок изображения. Участок изображения в Рисунок 6C показывает, что сильнейших ввода RGC целей более дистальной области Нейропиль.
Рисунок 1. В естественных условиях подготовка процедур. (A) головастика возлагали на кусок силиконового эластомера. Штыри обозначаются белые стрелки. Обратите внимание, более хвостового позиционирования ПИН во избежание Пронзающий оптических трактов. Белый пунктирная линия указывает на средней линии. (B) Zoomed в представление всего мозга после разрезания вдоль наспинная срединной и удаления наложение кожи. (C) поклеточного патч зажим запись в естественных условиях. (L: сбоку. M: медиальной. R: Ростральных. C: хвостового. D: спинной. V: вентральный. Оби: обонятельные луковицы. OT: Оптические Tectum. HB: Задний мозг). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 . Весь мозг подготовки процедур. Разорваны (.A) после того, как мозг филе вдоль средней линии, задний мозг. (B) весь мозг расчлененный и возлагали до силиконового эластомера. Белая звездочка указывает ПИН в левой обонятельной луковицы. Красный флажок указывает на средней трети tectum, т.е., целевой области для записи. (C) клеточных патч зажим записи с помощью весь мозг подготовки. Черный звездочка указывает области ООН царапины желудочков мембраны где клетки не могут быть доступны для записи. Там, где успешно удалена мембраны, somata появляются более четкими и определенными. Стрелка указывает нездоровой нейрона. (PZ: Пролиферативная зоны. LMV: Большой медиальной желудочка. Оби: обонятельные луковицы. OT: Оптические Tectum. HB: задний мозг. L: боковой. M: медиальной. R: Ростральных. C: хвостового. D: спинной. V: вентральной). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 . Горизонтальные мозга фрагмент подготовки процедуры. (A) наиболее боковой части одной стороны оптические tectum будет нарезанный (указано пунктирной линией) после подготовки весь мозг. (B) горизонтальные мозга фрагмент подготовки после того, как возлагали в сторону силиконового эластомера. Двойной белые линии представляют стимулирования электрода на зрительных нервов. (C) Zoomed в вид Сома слои и Нейропиль, с помощью подготовки фрагмент горизонтального мозга. Пунктирная кривая показывает границы между слоями сома и Нейропиль. Эта цифра была изменена от Азамат, и др. 14 (L: сбоку. M: медиальной. R: Ростральных. C: хвостового. D: спинной. V: вентральный. Оби: обонятельные луковицы. OC: зрительных нервов. OT: Оптические Tectum. HB: Задний мозг). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 . Записи от подготовки в vivo . (A) схема показаны Типичная конфигурация записи в естественных условиях . (B) света вызвали ответы, включая свет и свет от ответов. Врезные следы, увеличенное представление о на - и у ответ, соответственно. (C) спонтанный возбуждающих постсинаптических токи записаны. (D) Na+ и K+ течений в ответ на напряжение зажим шагах от -60 мВ до 30 мВ от одного нейрона. (E) IV участков, созданных от следов в (D). Все записи были сделаны с нейрона, состоявшейся в -60 МВ за исключением в (D) для создания IV-участки; нейроны шагнуло все более деполяризованный потенциалы, приращением 10 МВ, чтобы активировать напряжени тока зависимых течений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 . Записи от весь мозг подготовки. (A) схемы показаны Типичная конфигурация записи весь мозг, включая стимулирование электрода сделан на зрительных нервов (зеленые и красные линии представляют RGC аксонов). (B) наложение следы RGC реакции на изменения численности RGC стимуляции. (C) максимальной стимуляции реагирования (слева) и Минимальная стимуляция реакции (справа). (D) вызвала RGC возбуждающих и тормозящий ответ на один нейрон. (E) сопряженные пульс содействие RGC-вызвала реакцию отдельных нейронов. (OB: обонятельные луковицы. OC: зрительных нервов. OT: Оптические Tectum). Все записи были сделаны с нейрона, состоявшейся в -60 МВ за исключением в (D) для измерения возбуждающих и тормозящий материалов: возбуждающим ввода фиксируется путем проведения нейрон на потенциал реверсирования γ-аминомасляной кислоты (ГАМК)-опосредованной хлорид токи (МВ-45); ингибирующее входных данных путем проведения нейрон на потенциал реверсирования α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic кислоты (АМПА)-опосредованной токов (+ 5 МВ). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6 . Записи от горизонтальной мозга фрагмент подготовки. (A) схема показаны конфигурации подготовки срез горизонтальной мозга. Обратите внимание, что хотя стимулирующих электродов остается в зрительных нервов, Пипетка записи теперь позиционируется доступа к ячейкам на всех слоях тектальный, предоставляемые горизонтальной мозга подготовки фрагмента. (B) RGC ответ от проживающих в поверхностный слой tectum нейрона. (C) Записанная потенциалов поля через Нейропиль и преобразованный текущий источник плотности (ЦСО), показано изображение участка тепловых карт. (OC: зрительных нервов. OT: Оптические Tectum. HB: Задний мозг). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Все методы, описанные в этой работе оптимизированы для записи тектальный нейроны от головастиков между стадии развития 42 и 49, (постановка согласно Neiuwkoop и Фабер-15). На этапе 42, головастиков, достаточно большой и достаточно развитой так, что насекомое булавки могут быть размещены на обеих сторон мозга для записей в естественных условиях и для проведения вскрытия весь мозг. На ранних стадиях, когда головастиков по существу двумерной (т.е., плоский), описанные здесь подходы не являются оптимальными.
Из-за легкости в котором тектальный нейроны могут быть доступны и записаны в клеточных конфигурации эта модель цепи был очагом для фундаментальных открытий о как нейронных цепей формы во время функционирования - и функции при формировании19. Здесь мы описали как приобрести клеточных патч зажим записи от тектальный нейронов, включая выполнение головастиков в естественных условиях и весь мозг препараты, различные записи конфигурации и примеры различных типов данных. Ниже приводится обсуждение преимуществ и ограничений каждого препарата, следуют советы для достижения высокого качества всей ячейки записи.
Xenopus головастиками начать отображение визуального избежания поведения на сцене 47/48, примерно 7-8 дней после оплодотворения3,13. Это означает, что даже в этих относительно ранних стадиях развития, retinotectal схема функционирования и способны обрабатывать визуальные раздражители. Основные вопросы, касающиеся развития и пластичности retinotectal цепи непосредственно рассматривались, с помощью подготовки в естественных условиях для записи тектальный нейрон ответы на визуальные раздражители, проецируется на сетчатке. В естественных условиях записи в головастика относительно простой по сравнению с эквивалентной запись конфигурации в млекопитающих благодаря относительной простоте нервной системы и отсутствие черепа. Потому что СОСМ отдельных тектальный нейрон может быть визуализирован в естественных условиях, уплотнения на данный нейрон и достижение клеточных патч зажим записи конфигурации является по существу эквивалентно проведение клеточных фиксации записи в грызунов ломтик подготовка. Головастики обычно выжить на несколько часов на буровой (который можно легко оценить по мониторингу сердцебиение). Одно ограничение присущие головастиков в естественных условиях подготовки является то, что только тектальный нейронов, проживающих в глубоких соматических слое оптические tectum, слой, непосредственно примыкающем к большой средней желудочка, доступными для записи (Рисунок 1 ). Это означает, что во многом неизведанные тектальный нейронов, проживающих в соматической внешние слои tectum в vivo.
Экспериментальный преимуществом весь мозг подготовки является, что он изолирует мозг от периферийных сенсорные рецепторы в глаз и кожи, устраняя все ложные сенсорные управляемая деятельность. Хотя они уже не способны управляться визуальные раздражители, RGC аксональное входов, которые нацелены tectum все еще присутствуют в весь мозг подготовки, и они могут быть непосредственно активированы очень контролируемым образом через биполярный электрод стимулирования (FHC) размещены на зрительных нервов, где два набора RGC аксона участки проникают в мозг. Первые сообщения о весь мозг подготовки использовались в 1996 году важное исследование по Wu et al. 8, в котором RGC аксоны были активированы с помощью биполярного электрода стимулирования, таким образом, чтобы авторы могли бы количественно оценить прочность отдельных RGC аксоны на постсинаптических нейронов тектальный и при этом так сделал фундаментальных открытий о прогрессии СИНАПС созревания. Как и в естественных условиях подготовки, весь мозг подготовки позволяет получить доступ к только нейроны, проживающих в глубокий слой, прилегающий к желудочковой мембраны.
Хотя оптические tectum состоит из приблизительно девяти слоев клеток тела17, все предыдущие исследования электрофизиологии были сосредоточены на глубокий слой тектальный нейронов, потому что традиционные весь мозг и в естественных условиях препараты (описано выше) разрешить доступ только к нейронам глубокий слой. Чтобы получить доступ к тектальный нейронов на всех слоях соматических, от глубокие к наиболее поверхностный, а также весь Нейропиль, где RGC аксоны составляют синаптических связей с тектальный нейрон дендритов, мы разработали модифицированных весь мозг подготовки, именуемые как» горизонтальные мозга ломтик подготовка» (рис.14). Как с весь мозг подготовки, подготовка срез горизонтальных мозга поддерживает RGC аксоны в головном мозге, и ими можно управлять путем размещения биполярный электрод стимулирования на зрительных нервов.
В целом препараты предназначены для оптимизации визуализация и доступ к somata тектальный нейрон выполнять клеточных патч зажим записи. Прямой доступ к Сома имеет важное значение для качества клеточных патч зажим записей: доступ к внутренней части нейрон требует формирования очень сильным (> 1 Ω9 × 10) уплотнение между пипетки и плазматической мембраны нейрона, которая требует прямого контакт кончика пипетки на что мембраны. Таким образом достаточное удаление желудочка оболочки является ключевым для успешной записи. Кроме того ключ для успешной записи RGC-вызвала является правильное размещение биполярного электрода стимулирования на зрительных нервов. По существу все тектальный нейроны получают прямой синаптических ввод от аксоны RGC. Если ответ не вызывали RGC наблюдается, то это скорее всего из-за неправильного размещения биполярного электрода, таким образом, что это не на зрительных нервов и не контактирует зрительных нервов. Это может быть исправлена путем просто повторного позиционирования стимулирующих электродов. Несоблюдение вызывало RGC ответы после повторного позиционирования биполярный электрод может означать, что проекции аксона RGC был случайно разорваны во время вскрытия. В этом случае необходимо начать с нового препарата. Наконец несоблюдение RGC-вызвал ответ может быть вызвано записи из ячейки, которая не является общей тектальный нейрона. Например глии обычно не отображать нормальной вызывали RGC monosynaptic ответ отображается тектальный нейронов и не делать большой нейронов среднего мозга, которые были найдены, хотя и на очень низких числах, проживающих в оптические tectum20. Вероятность записи от одного из этих не тектальный клеток очень низка из-за огромного числа тектальный нейронов. Конечно качество записи также требуют тектальный нейронов, чтобы быть здоровым. Характеристики здорового тектальный нейрона являются компактные круглые или овальные сома, это светлый и без пятен. После того, как был достигнут клеточных запись конфигурации, здоровье нейрон может далее оцениваться на уровне электрофизиологические измерения основных электрических свойств, таких как отдыхает мембранного потенциала, входное сопротивление и емкость . Мембранного потенциала покоя здорового тектальный нейронов между этапы развития 42 и 49,-примерно 45 МВ, с среднем входное сопротивление примерно 1 GΩ и емкость 10-12 pF3,4,5. Небольшая часть нейронов неизбежно будет быть повреждены в результате удаления желудочка оболочки. Somata поврежденные или нездоровый нейронов появляются зернистым, раздутые, или разорвал. Рисунок 2Cприведен пример нездорового нейрона. Если большинство нейронов появляется нездоровый, это может быть отражением, что есть что-то неправильно с решение внешние записи, поэтому рекомендуется сделать решение свежие внешние записи. Помимо появления здоровых, лучший нейронов для записи обычно связаны с большим числом других нейронов, в отличие от изоляции. Кроме того выберите ячейки, которые легко доступны. Например не толкайте ткани слишком сложно для доступа к ячейке, потому что это может повредить ткани или переместить ткани и таким образом сдвиг стимулирующих электродов неуместны. Наконец записи должна быть ограничена средней трети tectum (рис. 2B) чтобы избежать потенциальных различий вследствие развития градиент, который существует между rostro хвостового оси4,8, Если, конечно, в центре внимания этого эксперимента вышеупомянутого развития градиента. Tectum надлежащего — это область ростральной пролиферативной зоны и хвостовой каудальный край большого среднего желудочка.
В клеточных патч зажим записи техника является не без его ограничения. В общем этот стиль записи включает в себя записи один нейрон одновременно. Это отличается от подходов, включающих изображений нового поколения GCaMP6 кальция показатели, которые позволяют быть одновременно imaged в ломтик подготовки и в естественных условияхдеятельности больших популяций нейронов.
Еще один недостаток, присущие клеточных напряжение зажим записи — ошибка зажим пространства (неспособность контролировать напряжение гораздо дальше, за пределы сома), который ограничивает временного контроля напряжения4. В целом эти вопросы зажим напряжения минимальны, при записи от тектальный нейронов, однако, из-за их относительно малый размер, скромный дендритных arborizations и относительно небольшими и медленного течения, по сравнению с млекопитающих нейронов. Эти характеристики тектальный нейронов делают их особенно подходит для мембраной, запись, измерение многих параметров и строительство профилей для отдельных нейронов5,6.
Будущие направления включают оптимизацию в vivo горизонтальных мозга ломтик подготовка характеризуют функцию внешнего слоя нейронов в обработке зрительных раздражителей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
При поддержке гранта NIH SBC COBRE 1P20GM121310-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stemi Stereo 508 | Zeiss | 495009-0006-000 | Dissecting microscope |
| MS-222 "Tricane" | Finquel | ARF5G | Amphibian general anesthetic |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-3 | Used to prepare Stienberg's solution and external solution |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | P217-500 | Used to prepare Stienberg's solution and external solution |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-1KG | Used to prepare Stienberg's solution and external solution |
| Calcium nitrate tetrahyrate (Ca(NO3)•4H2O) | Sigma-Aldrich | 237124-500G | Used to prepare Stienberg's solution |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | Mallinckrodt Chemicals | 6066-04 | Used to prepare Steinberg's solution |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5080-500G | Used to prepare external recording solution |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | J.T. Baker | 2444-01 | Used to prepare external recording solution |
| D-glucose Anhydrous | Mallinckrodt Chemicals | 6066-04 | Used to prepare external recording solution |
| Tubocurarine hydrochloride pentahydrate | Sigma | T2379 | Nicotinic acetylcholine receptor antagonist |
| Insect Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | 0.1mm diameter stainless steel pins |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 761028 | Preweighed monomer and curing agent kit |
| Sterile Polystyrene Petri Dish - 60x15mm | Fisher Scientific | AS4052 | Small petri dishes |
| PrecisionGlide Needle 25Gx5/8 (.0.5mm X 16mm) | BD | 305122 | Syringe needles |
| 1mL Slip Tip Tuberculin Syringe | BD | 309659 | Disposable, sterile syringes |
| Borosilicate pipette glass | Sutter Instrument | BF150-86-10HP | Pulled to desired specifications using pipette pulling machine |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | Fabricates micropipettes for electrophysiology recording |
| Kimwipes Kimtech wipes | Kimberly-Clark | 34120 | Delicate task lint-free wipers |
| Axon Instruments MultiClamp 700B Headstage CV-7B | Molecular Devices | 1-CV-7B | Current clamp and voltage clamp headstage |
| MP-285 Motorized Manipulator with Tabletop Controller | Sutter Instrument | MP-285/T | Control for headstage on electrophysiology rig |
| Fiber-Coupled LED (Green) | Thorlabs | M530F2 | Fiber optic cable paired with green LED |
| Cluster Bipolar Electrode (25µm diameter) | FHC | 30207 | Bipolar stimulating electrode |
| ISO-Flex Stimulator | A.M.P.I. (Israel) | Contact manufacturer | Flexible stimulus isolator |
| Axon Instruments 700B Multipatch Amplifier | Molecular Devices | 2500-0157 | Amplifier for voltage- and current-clamp recording |
| Digidata 1322A digitizer | Molecular Devices | 2500-135 | Data acquisition system for electrophysiology recording |
| Axio Examiner.A1 | Zeiss | 491404-0001-000 | Microscope for electrophysiology |
| Micro-g Lab Table | TMC | 63-533 | Air table for electrophysiology microscope |
| Inspiron 620 Personal Desktop Computer with Windows 7 64-bit | Dell | D06D001 | Computer running electrophysiology software |
| c2400 CCD camera | Hamamatsu | 70826-5 | Charge-coupled device camera for electrophysiology imaging |
| 7 O'Clock Super Platinum Stainless Razorblades | Gillette | CMM01049 | Platinum-coated stainless razor blades |
| Transfer Pipets | Fisher Scientific | 13-711-7M | Disposable Polyethylene transfer pipets |
References
- Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets. Dis. Model Mech. 6, 1057-1065 (2013).
- Pratt, K. G. Finding Order in Human Neurological Disorder Using a Tadpole. Curr. Pathobio. Rep. 3 (2), 129-136 (2015).
- Liu, Z., Hamodi, A. S., Pratt, K. G. Early development and function of the Xenopus tadpole retinotectal circuit. Curr. Opin. Neurobiol. 41, 17-23 (2016).
- Hamodi, A. S., Pratt, K. G. Region-specific regulation of voltage-gated intrinsic currents in the developing optic tectum of the Xenopus tadpole. J. Neurophysiol. 112 (7), 1644-1655 (2014).
- Pratt, K. G., Aizenman, C. D. Homeostatic regulation of intrinsic excitability and synaptic transmission in a developing visual circuit. J. Neurosci. 27 (31), 8268-8277 (2007).
- Cialeglio, C. M., Khakhalin, A. S., Wang, A. F., Constantino, A. C., Yip, S. P., Aizenman, C. D. Multivariate analysis of electrophysiological diversity of Xenopus visual neurons during development and plasticity. Elife. 4, 11351 (2015).
- Aizenman, C. D., Akerman, C. J., Jensen, K. R., Cline, H. T. Visually driven regulation of intrinsic neuronal excitability improves stimulus detection in vivo. Neuron. 39 (5), 831-842 (2003).
- Wu, G., Malinow, R. Cline H.T. of a central glutamatergic synapse. Science. , 972-976 (1996).
- Van Rheed, J. J., Richards, B. A., Akerman, C. J. Sensory-evoked spiking behavior emerges via an experience-dependent plasticity mechanism. Neuron. 87 (5), 1050-1060 (2015).
- Schwartz, N., Schohl, A., Ruthazer, E. S. Activity-dependent transcription of BDNF enhances visual acuity during development. Neuron. 70 (3), 455-467 (2011).
- Zhang, L. I., Tao, H. W., Holt, C. E., Harris, W. A., Poo, M. A critical window for cooperation and competition among developing retinotectal synapses. Nature. 395 (6697), 37-44 (1998).
- Hewapathirane, D. S., Haas, K. Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain. J. Vis. Exp. (17), e705 (2008).
- Dong, W., et al. Visual avoidance in Xenopus tadpoles is correlated with the maturation of visual responses in the optic tectum. J. Neurophysiol. 101 (2), 803-815 (2009).
- Hamodi, A. S., Pratt, K. G. The horizontal brain slice preparation: a novel approach for visualizing and recording from all layers of the tadpole tectum. J. Neurophysiol. 113 (1), 400-407 (2015).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , Garland. New York. (1994).
- Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices. J. Vis. Exp. (112), e54024 (2016).
- Muldal, A. M., Lillicrap, T. P., Richards, B. A., Akerman, C. J. Clonal Relationships Impact Neuronal Tuning within a Phylogenetically Ancient Vertebrate Brain Structure. Curr. Biol. 24 (16), 1929-1933 (2014).
- Khakhalin, A. S., Koren, D., Gu, J., Xu, H., Aizenman, C. D. Excitation and inhibition in recurrent networks mediate collision avoidance in Xenopus tadpoles. Eur. J. Neurosci. 40 (6), 2948-2962 (2014).
- Ruthazer, E. S., Aizenmann, C. D. Learning to see: patterned visual activity and the development of visual function. Trends Neurosci. 44 (4), 183-192 (2010).
- Pratt, K. G., Aizenman, C. D. Multisensory integration in mesencephalic trigeminal neurons in Xenopus tadpoles. J. Neurophysiol. 102 (1), 399-412 (2009).
