Summary
I detta papper diskuterar vi tre hjärnan preparat som används för inspelning av hela cellen patch clamp för att studera retinotectal kretsen i Xenopus laevis grodyngel. Varje beredning, med sina särskilda fördelar, bidrar till den experimentella tractability av den Xenopus grodyngel som en modell för att studera neural krets funktion.
Abstract
Xenopus grodyngel retinotectal kretsen, består av de retinala ganglioncellerna (RGCs) i ögat som bildar synapser direkt på nervceller i den fiberoptiska tectum, är en populär modell att studera hur neurala kretsar själv montera. Förmågan att utföra hela cellen patch clamp inspelningar från tectal nervceller och att registrera RGC-framkallat svar, antingen i vivo eller använda en hela hjärnan beredning, har genererat ett stort antal högupplösta data om mekanismerna bakom normala , och onormal, krets bildning och funktion. Beskriver här vi hur du utför i vivo preparatet, ursprungliga hela hjärnan beredning, och en mer nyligen utvecklat övergripande hjärnan slice inför att erhålla hela cellen patch clamp inspelningar från tectal nervceller. Varje beredning har unika experimentella fördelar. I vivo preparatet möjliggör inspelning av direkta svar på tectal nervceller visuella stimuli projiceras på ögat. Hela hjärnan preparatet tillåter RGC axoner aktiveras på ett mycket kontrollerat sätt, och horisontella hjärnan slice preparatet tillåter inspelning från över alla lager av tectum.
Introduction
Retinotectal kretsen är den största komponenten i amfibie visuella systemet. Det består av en RGCs i ögat, som skjuter ut sina axoner till den fiberoptiska tectum där de bildar synapsförbindelser med postsynaptiska tectal nervceller. Xenopus grodyngel retinotectal kretsen är en populär utvecklingsmässiga modell att studera neural krets bildning och funktion. I området i närheten finns det många attribut av denna grodyngel retinotectal krets som gör det en kraftfull experimentell modell1,2,3. Ett större attribut, och i fokus för denna artikel, är förmågan att utföra hela cellen patch clamp inspelningar från tectal nervceller, i vivo eller använda hela hjärnan förberedelse. Med ett elektrofysiologi rigg utrustad med en förstärkare som stöder spänning - och ström-clamp inspelningslägena, tillåter hela cellen patch clamp inspelningar en neuron elektrofysiologi att präglas i hög upplösning. Som ett resultat, har hela cellen patch clamp inspelningar från tectal nervceller över de viktigaste skeendena i retinotectal krets bildandet lämnat en detaljerad och omfattande förståelse av utvecklingen och plasticitet av inneboende4,5 , 6 , 7 och synaptic8,9,10,11 boenden. Kombinera hela cellen patch clamp tectal neuron inspelningar, förmågan att uttrycka gener eller morpholinos av intresse i dessa nervceller12, och en metod att bedöma visuella guidade beteende via en etablerad visuella undvikande test13 främjar den identifiering av länkar mellan molekyler, krets funktion och beteende.
Det är viktigt att notera att typ av högupplösta data förvärvas från hela cellen patch clamp inspelningar inte är möjligt med nyare bildgivande metoder såsom indikatorn genetiska kalcium GCaMP6, eftersom även om använda kalcium indikatorer tillåter bildtagning av kalcium dynamics över stora populationer av nervceller samtidigt, finns det ingen direkt eller uppenbara sättet att de specifika elektriska parametrarna kan erhållas genom att mäta delta fluorescens i somata, och det finns inget sätt att spänning klämma neuron att mäta ström-spänning relationer. Tydligt dessa två distinkta tillvägagångssätt, elektrofysiologiska inspelningar och kalcium imaging, äger icke-överlappande styrkor och skapa olika typer av data. Således beror det bästa tillvägagångssättet på den specifika experimentella frågan behandlas.
Här beskriver vi vår metod för att förvärva hela cellen patch clamp inspelningar från nervceller i den grodyngel fiberoptiska tectum använder en i vivo förberedelse, hela hjärnan förberedelse, och en nyare ändrades hela hjärnan förberedelse som utvecklades i vårt labb14 . I avsnittet representativa resultat visar vi experimentella fördelarna med varje beredning och olika typer av data som kan erhållas. Gränser och styrkor av olika preparat, samt tips för felsökning, ingår i diskussionsavsnittet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoderna som beskrivs här har godkänts av den institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) av University of Wyoming. Alla procedurer, inklusive elektrofysiologiska inspelningar, utförs i rumstemperatur, cirka 23 ° C. Alla metoderna som beskrivs här är optimerade för inspelning tectal nervceller från grodyngel mellan utvecklingsstadiet 42 och 49 (iscensatt enligt Neiuwkoop och Faber15).
1. in Vivo förberedelse
- Söva grodyngel.
- Placera grodyngel i en liten petriskål innehållande Steinbergs lösning med 0,01% MS-222 under cirka 5 minuter.
Obs: MS-222 aka ”Tricaine” är en gemensam fiskar och amfibiska bedövningsmedel. Grodyngel höjs i den Steinbergs lösning i mM: 0.067 KCl, 0,034 Ca (nr3)2•4H2O, 0,083 MgSO4•7H2O, 5,8 NaCl, 4,9 HEPES. - Säkerställa grodyngel är djupt bedövat (icke-lyhörd och inte längre simning) innan du fortsätter till steg 2.
- Placera grodyngel i en liten petriskål innehållande Steinbergs lösning med 0,01% MS-222 under cirka 5 minuter.
- Säkra den sövda tadpole till ett nedsänkt silikon block på golvet av dissekera/inspelning skålen.
- Använd en disponibel överföring pipett för att flytta de bedövat tadpole till en dissektion/inspelning maträtt innehållande extern inspelning lösning (115 mM NaCl, 2 mM av KCl, 3 mM CaCl2, 3 mM med MgCl2, 5 mM HEPES, 1 mM av glukos, justera pH till 7,25 använder 10 N NaOH, osmolaritet 255 mOsm).
- För att minimera spontana muskel ryckningar, Lägg den acetylkolin-receptorblockerare, tubokurarin (100 µM) till den externa lösningen. (Normalt, detta görs genom att använda 200 µL pipett för att tillsätt 100 µL av en 10 mM tubokurarin lager 10 ml av extern lösning).
- Använda insekt pins, säkert den grodyngel, ryggsidan upp, till en nedsänkt block av silikonelastomer (såsom Sylgard 184, se Material tabell för detaljer), som har limmats till dissekera maträtt golvet.
Obs: Placering av stiften är kritisk: placera dem på vardera sidan av hjärnan, tillräckligt stjärtfenan att undvika impaling afferenta RGC axoner projektet från ögat och in i hjärnan bara Anterior till den fiberoptiska tectum (figur 1A).
- Använd en disponibel överföring pipett för att flytta de bedövat tadpole till en dissektion/inspelning maträtt innehållande extern inspelning lösning (115 mM NaCl, 2 mM av KCl, 3 mM CaCl2, 3 mM med MgCl2, 5 mM HEPES, 1 mM av glukos, justera pH till 7,25 använder 10 N NaOH, osmolaritet 255 mOsm).
- Kycklingfilé hjärnan längs mittlinjen.
- För en klar bild av hjärnan, ta bort huden överliggande hjärnan genom att göra en ytliga snitt längs mittlinjen med hjälp av en steril 25-G nål.
- Filé hjärnan längs samma mittlinjen axeln genom att sätta in nålen i neuralrörsdefekter och dra försiktigt uppåt (dorsalt) sådan som den dorsala delen av röret skärs renlig (avhuggna) samtidigt som den lämnar golvplattan intakt (figur 1B).
Obs: Det är viktigt att bottenplattan av neuralrörsdefekter lämnas intakt eftersom de afferenta sensoriska input ange tectum via bottenplattan.
- Avlägsna den genomskinliga ventrikulära membranet som täcker tectal nervceller.
- Flytta inspelningen skålen till elektrofysiologi rigg och använda en glaskross pipettspetsen för att avlägsna den ventrikulära membranet överliggande tectal neuron cell organ. Bryta spetsen genom att försiktigt dra den över en grannlaga uppgift torkare.
- Skruva fast pipetten i pipett hållaren och sänka den ner till den fiberoptiska tectum via micromanipulator.
- Använd bruten pipetten för att skala ventrikulära membranet från tectum.
Obs: Det är inte nödvändigt att ta bort membranet från den hela tectum; ett litet fönster kommer räcka och ge tillgång till massor av nervceller.
- Få en hel cell patch clamp inspelningar.
Obs: Metoden från denna punkt framåt är liknande till att utföra hela cellen patch clamp inspelningar från mus hjärnan skivor som beskrivs i Segev, et al. 16 (Figur 1C). - Spela in tectal neuron svaren på en hela fältet blixt av ljus som projiceras på näthinnan.
- För att projicera en hela fältet blixt av ljus på näthinnan, placera en optisk fiber anslutning till den grodyngels eye. I andra änden av optisk fiber är ett LED i linje med ett variabelt motstånd som möjliggör lätta luminansen kontrolleras. Utlösa LED av den digitala utsignalen från förstärkaren. På det sättet inspelade hela fältet blixtar av varierande intensitet ljus kan vara (figur 4A).
2. hela hjärnan förberedelse
- Utför steg 1.1-1.3.
Obs: Det finns inget behov av tubokurarin i den externa lösningen för detta preparat. - Isolera hjärnan.
- Använda en 25-G nål för att kapa hindbrain (figur 2A).
- För att isolera hela hjärnan från grodyngel, kör försiktigt nålen under hjärnan, i kaudala-till-rostralt riktning för att bryta alla laterala och ventrala bindväv och nervfibrer.
- Säkra hjärnan till ett block av silikonelastomer.
- När helt befriad, säkra hjärnan till ett block av silikon elastomer genom att placera en pin genom en av de luktsinnet lökarna och en annan pin genom hindbrain (figur 2B). Detta är optimal konfiguration för inspelning från tectal nervceller.
- Flytta den maträtt som innehåller fästa hela hjärnan preparatet från dissekera tillämpningsområdet till elektrofysiologi rigg. Avlägsna den ventrikulära membranet med krossat glas pipett som beskrivs i steg 1.4.
- Placera en bipolär stimulerande elektrod på den optiska chiasm (där de axon skrifter från varje öga kors på mellanhjärnan) för att direkt aktivera RGC axoner.
- Placera den bipolära stimulerande elektroden rostralt, och nästan intill den stora mittersta ventrikeln. Den optiska chiasm ligger omedelbart rostralt om den stora mittersta ventrikeln (figur 2B).
- Försiktigt sänka den stimulerande elektroden ner på den optiska chiasm så att en liten buckla bildas i vävnaden. Bipolär elektrod drivs av en puls-stimulator vilket gör att styrkan av stimulering kontrolleras exakt.
- Placera den bipolära stimulerande elektroden rostralt, och nästan intill den stora mittersta ventrikeln. Den optiska chiasm ligger omedelbart rostralt om den stora mittersta ventrikeln (figur 2B).
- Utför hela cellen patch clamp inspelningen (figur 2C) som beskrivs av Segev, o.a. 16
3. övergripande hjärnan Slice förberedelse
- Utför steg 2.1 till 2.3.
- Använd ett rakblad för att punktskatt mest laterala fjärde (som i vivo motsvarar den mest dorsala fjärde) på ena sidan av en fiberoptisk tectum. Detta snitt görs parallellt till rostralt-stjärtfenan som visas i figur 3A.
- Re-nåla fast hjärnan vid sidan av en silikon-elastomer med den skivade sidan vänd uppåt (så att de somata och neuropil kan nås direkt för inspelning) och ventrikulär ytan av hjärnan vänd bort från silikon elastomer blocket (figur 3 B) (så att en bipolär elektrod kan placeras på den optiska chiasm).
- Utför hela cellen patch clamp eller lokal filed potentiella inspelning (figur 3C) som beskrivs av Segev, o.a. 16
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att registrera ljus-framkallat svar är en hela fältet blixt av ljus projiceras på näthinnan medan den resulterande Svaren registreras från enskilda tectal nervceller (figur 4A). Detta särskilt protokollet är utformat för att mäta både svaret från neuron till ljuset sätta (”On” response) och sedan stänga av 15 s senare att mäta ”Off svar”. Tectal nervceller normalt uppvisar robust på och av svaren (visas här inspelade i spänningen klämman läge, med neuron spänns till - 60mV för att mäta synaptic ström (figur 4B)). Mängden synaptic enhet tas emot av någon en neuron kan kvantifieras genom att spela in spontana synaptic händelser (figur 4C). Ström-spänning relationer (i-V kurvor) kan genereras från samma neuron genom att kliva neuron till alltmer Aricebo potential och inspelning den resulterande spänningen-aktiverad Na+ och K+ strömmar, kallad ”blandat nuvarande inspelningar ”(figur 4D, E). Det har varit väl etablerat som för dessa amfibie nervceller, topp Na+ och K+ strömmar kan kvantifieras via blandade aktuella registreringar eftersom topparna inte temporally överlappar med varandra4,7.
Direkt aktivering av RGC axoner på den optiska chiasm kringgår alla uppströms uträkning och bearbetning av visuella stimuli som sker i ögat, och tillåter för att studera den synaptisk transmissionen mellan presynaptiska RGC axoner och postsynaptiska tectal nervceller i dess mest ren och reducerad form. Tectal neuron Svaren till RGC aktiveringen genereras från RGCs stimuleras av ljus eller direkt med hjälp av en bipolär stimulerande elektrod bestående av två komponenter: en monosynaptic komponent (direkta synaptiska input från aktiverade RGCs) och en polysynaptic komponent (lokalt återkommande nätverk aktivitet utfodring rygg onto neuron som spelas in). När det gäller ljus evoked Svaren överlappa monosynaptic och polysynaptic komponenterna varandra av några undeterminable belopp. Detta timliga överlappning begränsar vad kan ingås om synaptisk transmission mellan näthinnan och fiberoptiska tectum. Använda hela hjärnan förberedelse och aktivera den RGC axon tarmkanalen direkt via en elektrod placeras på den optiska chiasm (figur 5A), men producerar en mono- och polysynaptic komponent som är i huvudsak icke-överlappande i tid. Stimulerande styrkan av bipolär elektrod kan justeras. Som stimulerande styrkan ökas, finns det ett större antal RGC axoner aktiveras (figur 5B). En minimal stimulans protokoll avgör synaptisk styrka ett enskilda RGC axon på en enskild tectal neuron; en maximal stimulering protokollet återspeglar totalen eller maximal, synaptic input från alla RGC axoner kombinerat (bild 5C). Rätt förhållande av excitatoriska till hämmande synaptisk input (E: Jag baserat) tas emot av en individ tectal neuron är kritiska för normalt visuell funktion18. Figur 5 D visar ett exempel på RGC-framkallat retande och hämmande nuvarande spår inspelade från en individuell tectal neuron. Sannolikheten för sändaren frigöraren från RGC presynaptiska axon terminaler mäts av Parade puls inspelningar. För detta registreras den postsynaptiska tectal neuronen i spänningen klämman läge att mäta synaptic strömmar, medan RGC axoner aktiveras efter varandra, separerade av ett 50 ms tidsintervall (figur 5E).
Hela cellen patch clamp inspelningar kan utföras från tectal nervceller som är bosatta i någon somatisk lager. Liknande till hela hjärnan förberedelsen, RGC axoner kan aktiveras genom att placera en bipolär inspelning elektrod på den optiska chiasm(figur 6). Alla inspelningar genomförs i hela hjärnan preparatet kan också utföras med denna horisontella hjärnan slice beredning. Figur 6 B visar ett exempel spår av en RGC-framkallat svar inspelade från en neuron i det ytliga lagret. Denna förberedelse kan också för rumsliga mönster av RGC synaptic ingång på tectal dendriter skall mätas. För detta, RGC-framkallat fältet potentialer registreras varje 10 µm längs den mediala-laterala axeln (dvs, den distala-proximala axeln) av neuropil (figur 6C). Detta genererar en högupplöst profil mönstret av funktionella RGC input. De fält potentialerna kan sedan omvandlas till nuvarande källa densiteter genom att beräkna den andra rumsliga härledda14 och den nuvarande källa täthet kan i sin tur omvandlas till en bild tomt. Bild tomten i figur 6C visar att den starkaste RGC ingången riktar mer distala området av neuropil.
Figur 1. In vivo förberedelse förfaranden. (A) Tadpole nålas ner på en bit av silikonelastomer. Pins indikeras av de vita pilarna. Observera den mer kaudalt flaggplacering för att undvika spetsa de fiberoptiska skrifter. Den vita streckade linjen indikerar mittlinjen. (B), zoomad-i vy av hela hjärnan efter skärning längs dorsala mittlinjen och ta bort överliggande hud. (C) hela-cell patch-clamp inspelning i vivo. (L: sido. M: mediala. R: rostralt. C: stjärtfenan. D: dorsala. V: ventrala. OB: luktbulben. OT: Fiberoptiska Tectum. HB: Hindbrain). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 . Hela hjärnan förberedelse förfaranden. (A) efter hjärnan är filead längs mittlinjen, hindbrain är avskurna. (B) hela hjärnan är dissekeras ut och nålas ner till silikonelastomerer. Den vita asterisken anger PIN-koden i vänster luktbulben. Den röda rutan anger den mellersta tredjedelen av tectum, dvs, målområdet för inspelning. (C) hela cellen patch clamp inspelning med hela hjärnan förberedelse. Svart asterisken indikerar området i un-skrapade ventrikulära membran där celler inte kan nås för inspelning. Där membranet har tagits bort, visas somata mer distinkta och definierade. Pilen anger en ohälsosam neuron. (PZ: proliferativ zon. LMV: Stora mediala ventrikeln. OB: luktbulben. OT: Fiberoptiska Tectum. HB: Hindbrain. L: sidled. M: mediala. R: rostralt. C: stjärtfenan. D: dorsala. V: ventrala). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 . Horisontella hjärnan slice förberedelse förfaranden. (A), den mest laterala delen av den fiberoptiska tectum sida kommer vara skivad (indikeras av den streckade linjen) efter hela hjärnan förberedelse. (B) horisontella hjärnan slice förberedelse efter att nålas ner vid sidan av silikonelastomerer. Dubbla vita linjer representerar en stimulerande elektrod placeras på den optiska chiasm. (C) zoomad-i utsikt över soma lager och neuropil med hjälp av en horisontell hjärnan slice beredning. Streckad kurva anger gränsen mellan soma lager och neuropil. Denna siffra har ändrats från Horis, o.a. 14 (L: sido. M: mediala. R: rostralt. C: stjärtfenan. D: dorsala. V: ventrala. OB: luktbulben. OC: optiska Chiasm. OT: Fiberoptiska Tectum. HB: Hindbrain). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 . Inspelningar från en in-vivo -förberedelse. (A) Schematisk visar den normala konfigurationen av en in vivo -inspelning. (B) ljus framkallat svar som inklusive ljus på och ljuset av svaren. Infällda spår är inzoomade vyn av på - och av-svar, respektive. (C) spontana excitatoriska postsynaptiska strömmar in. (D) Na+ och K+ strömmar svar på spänning klämma steg från -60 mV till 30 mV från en enda neuron. (E), IV tomter genereras från spår i (D). Alla inspelningar gjordes med neuron hölls på -60 mV utom i (D) att generera IV-tomter; nervceller är klev till allt mer Aricebo potential, i steg om 10 mV, aktivera spänningsberoende strömmar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5 . Inspelningar från en hela hjärnan beredning. (A) Schematisk visar den normala konfigurationen av hela hjärnan inspelning inklusive en stimulerande elektrod placeras på den optiska chiasm (gröna och röda linjerna representerar RGC axoner). (B) överliggande spår av RGC Svaren till förändringar av RGC stimulering styrka. (C) maximal stimulering svar (vänster) och minsta stimulering (höger). (D) en RGC-framkallat retande och hämmande svar på en enda neuron. (E) ihopkopplade puls underlättande av RGC-framkallat svar av en enskild neuron. (OB: luktbulben. OC: optiska Chiasm. OT: Fiberoptiska Tectum). Alla inspelningar gjordes med neuron hölls på -60 mV utom i (D) för att mäta de retande och hämmande ingångarna: den excitatoriska ingången registreras genom att hålla neuron på återföring potential av γ-aminosmörsyra (GABA)-medierad klorid strömmar (-45 mv); hämmande input genom att hålla neuron på återföring potentialen för α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic syra (AMPA)-medierad strömmar (+ 5 mv). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6 . Inspelningar från en horisontell hjärna skiva förberedelse. (A) Schematisk visar konfigurationen av en horisontell hjärnan slice beredning. Observera att även om stimulerande elektroden ligger kvar på den optiska chiasm, inspelning pipetten är nu placerad till tillgång celler över alla tectal lager utsätts genom horisontella hjärnan slice beredningen. (B) en RGC-svar från en nervcell som bosatta i det ytliga lagret av tectum. (C) inspelade fält potentialer över neuropil och den konvertera nuvarande källa tätheter (värdepapperscentraler) visas av bildscheman tomt värme. (OC: optiska Chiasm. OT: Fiberoptiska Tectum. HB: Hindbrain). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Alla metoder som beskrivs i detta arbete är optimerade för inspelning tectal nervceller från grodyngel mellan utvecklingsstadiet 42 och 49 (iscensatt enligt Neiuwkoop och Faber15). Av etapp 42, grodyngel är tillräckligt stor och tillräckligt utvecklad så att insekt stiften kan placeras på vardera sidan av hjärnan för in vivo -inspelningar och för att genomföra hela hjärnan dissektion. I tidigare stadier, när grodyngel är i huvudsak tvådimensionella (dvs, platta), de metoder som beskrivs här är inte optimala.
På grund av den lätthet som tectal nervceller kan nås och inspelade i hela cellen konfiguration, har denna modell krets varit en grogrund för grundläggande upptäckter om hur neurala kretsar form medan funktion- och funktion samtidigt som bildar19. Här har vi beskrivit hur förvärva hela cellen patch clamp inspelningar från tectal nervceller, inklusive hur du utför den grodyngel i vivo och hela hjärnan preparat, olika inspelning konfigurationer och exempel på olika typer av data. Följande är en diskussion om styrkor och begränsningar av varje beredning, följt av tips för att uppnå hög kvalitet hela cellen inspelningar.
Xenopus grodyngel börja Visa visuella undvikande beteenden av stage 47/48, cirka 7-8 dagar efter befruktning3,13. Detta innebär att även vid dessa relativt tidigt utvecklingsstadium, retinotectal kretsen är fungerande och kan bearbeta visuella stimuli. Grundläggande frågor om utveckling och plasticitet i retinotectal kretsen har åtgärdats direkt använda preparatet i vivo för att registrera tectal neuron Svaren till visuella stimuli projiceras på näthinnan. In vivo inspelningar i grodyngel är relativt enkelt jämfört med motsvarande inspelning konfigurationen i däggdjur på grund av den relativa enkelheten för nervsystemet och brist på en skalle. Eftersom enskilda tectal neuron somas kan visualiseras i vivo, motsvarar fjättrar en given neuron och uppnå hela cellen patch clamp inspelning konfiguration i huvudsak utför hela cellen patch clamp inspelning i gnagare slice preparat. Grodyngel vanligtvis överleva i flera timmar på riggen (som lätt kan bedömas genom att övervaka hjärtrytm). En begränsning inneboende av grodyngel i vivo förberedelsen är att endast tectal nervceller som bor i den fiberoptiska tectum djup somatisk lager, lagret som ligger i direkt anslutning till den stora mittersta ventrikeln, är tillgängliga för inspelning (figur 1 ). Detta innebär att tectal nervceller som är bosatta i de yttre somatiska skikten av tectum har varit till stor del outforskade invivo.
Den experimentella fördelen av hela hjärnan preparatet är att det isolerar hjärnan från de perifera sensoriska receptorerna i ögon och hud, att eliminera alla falska sensoriska-driven verksamhet. Medan längre kan drivs av visuella stimuli, RGC axonal ingångarna som riktar tectum är fortfarande närvarande i hela hjärnan förberedelserna och de kan aktiveras direkt på ett mycket kontrollerat sätt via en bipolär stimulerande elektrod (FHC) placeras på den optiska chiasm där de två uppsättningarna av RGC axon skrifter in i hjärnan. Den första rapportera användningen av hela hjärnan preparatet var 1996, i en viktig studie av Wu et al. 8, i vilka RGC axoner aktiverades med en bipolär stimulerande elektrod så att författarna kan kvantifiera styrkan i enskilda RGC axoner på postsynaptiska tectal nervceller och därigenom så gjort grundläggande upptäckter om utvecklingen av synaps mognad. Som med i vivo preparatet, ger hela hjärnan preparatet åtkomst till endast de nervceller som är bosatta i den djupa lagret, angränsande till ventrikulära membranet.
Även om den fiberoptiska tectum består av cirka nio cellkroppen lager17, alla tidigare elektrofysiologi studier har fokuserat på de djupa lager tectal nervcellerna eftersom de traditionella hela hjärnan och i vivo preparat (beskrivs ovan) Tillåt endast åtkomst till nervceller i den djupa lagret. För att komma åt tectal nervceller över alla somatiska lager, från djupaste till mest ytliga liksom hela neuropil där RGC axoner bildar synapsförbindelser med tectal neuron dendriter, utvecklade vi en modifierad hela hjärnan förberedelse, kallad ”the horisontella hjärnan slice beredning ”(figur 3-14). Som med hela hjärnan preparatet, horisontella hjärnan slice preparatet underhåller RGC axoner i hjärnan och de kan styras genom att placera en bipolär stimulerande elektrod på den optiska chiasm.
Övergripande, förberedelserna är utformade för att optimera visualisering av och tillgång till tectal neuron somata att genomföra hela cellen patch clamp inspelning. Direkt tillgång till soma är avgörande för kvalitet hela cellen patch clamp inspelningar: tillgång till insidan av neuron kräver bildandet av ett mycket starkt (> 1 × 109 Ω) tätning mellan pipetten och neuron's plasmamembran, vilket kräver direkt kontakt av pipettspetsen på det membranet. Därför är tillräcklig borttagning av ventrikulära membranet nyckel för lyckade inspelningar. Nyckel för framgångsrika RGC-framkallat inspelningar är också den korrekta placeringen av bipolär stimulerande elektrod på den optiska chiasm. I huvudsak alla tectal nervceller får direkta synaptiska input från RGC axoner. Om inget RGC-framkallat svar har observerats, är detta troligen på grund av felaktig placering av bipolär elektrod så att det inte är på den optiska chiasm och inte kontaktar synnerverna. Detta kan korrigeras genom att helt enkelt åter placera den stimulerande elektroden. Underlåtenhet att iaktta RGC-framkallat svar efter omplacering bipolär elektrod kan innebära att RGC axon projektionen var oavsiktligt brutit under dissektion. I det här fallet är det nödvändigt att börja om med ett nytt preparat. Slutligen, underlåtenhet att iaktta en RGC-framkallat svar kan bero på inspelning från en cell som inte är en vanlig tectal neuron. Exempelvis glia visas vanligtvis inte den normala RGC-framkallat monosynaptic svar visas genom tectal nervceller, och inte heller de stora mesencephalic nervceller som har hittats, om än i mycket låga siffror, bosatta i fiberoptiska tectum20. Sannolikheten för inspelning från en av dessa icke-tectal celler är mycket låg på grund av det stora antalet tectal nervceller. Naturligtvis kräver kvalitet inspelningar också tectal nervceller att vara friska. Kännetecknar en frisk tectal neuron är en kompakt runda eller ovala soma som är ljusa och utan fläckar. När hela cellen inspelning konfiguration har uppnåtts, kan hälsa neuron ytterligare utvärderas på elektrofysiologiska nivå genom att mäta grundläggande elektriska egenskaper såsom vila membranpotentialen, Ingångsmotstånd och kapacitans . Vilande membranet potential av friska tectal nervceller mellan utvecklingsstadier 42 och 49 är cirka -45 mV, med en genomsnittlig Ingångsmotstånd av ungefärligt 1 GΩ och en kapacitans av 10-12 pF3,4,5. En bråkdel av nervceller kommer oundvikligen att skadas på grund av borttagning av ventrikulära membranet. Somata av skadade eller sjuka nervceller visas korniga, uppsvälld eller skrumpnade. Ett exempel på en ohälsosam neuron visas figur 2C. Om majoriteten av nervceller visas ohälsosamt, kan detta vara en reflektion som det är något fel med extern inspelning lösning, så det rekommenderas att göra upp färska extern inspelning lösning. Förutom som förekommer friska, är bästa nervceller för inspelning vanligtvis förknippas med ett stort antal andra nervceller, i motsats till att vara isolerad. Välj också celler som är lättillgängliga. Till exempel, Skjut inte vävnaden för svårt att komma åt en cell eftersom detta kan skada vävnaden eller flytta vävnaden och därmed skifta stimulerande elektroden malplacerad. Slutligen, inspelningar bör begränsas till den mellersta tredjedelen av tectum (figur 2B) att undvika potentiella skillnader på grund av utvecklingstoxicitet toningen som finns över den rostro-kaudala axel4,8, om inte, naturligtvis, fokuserar experimentet ovan nämnda utvecklingsmässiga övertoningen. Tectum korrekt är området rostralt proliferativ zonen och stjärtfenan till kaudala kanten av stora mellersta ventrikeln.
Hela cellen patch klämman inspelning teknik är inte utan sina begränsningar. I allmänhet innebär denna typ av inspelning inspelning en neuron i taget. Detta är i motsats till metoder som omfattar avbildning av en ny generation GCaMP6 kalcium indikatorer som möjliggör aktiviteten av stora populationer av nervceller att avbildas samtidigt i en slice förberedelse och in vivo.
En annan nackdel inneboende till hela cellen spänningen klämman inspelningar är utrymme klämma felet (oförmåga att styra spänningen mycket längre beyond soma), vilket begränsar temporal kontroll av spänning4. Sammantaget är dessa spänningen klämman frågor minimal vid inspelning från tectal nervceller dock på grund av deras relativt liten storlek, blygsamma dendritiska längst och relativt små och långsamma strömmar jämfört med däggdjur nervceller. Dessa kännetecken av tectal nervceller gör dem särskilt lämpade för spänningen klämman inspelning, mätning av många parametrar, och byggandet av profiler för enskilda nervceller5,6.
Framtida inriktningar inkluderar optimera en i vivo horisontella hjärnan slice förberedelse att karakterisera funktionen av yttre lager nervceller i bearbetningen av visuella stimuli.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Stöds av NIH bidraget SBC COBRE 1P20GM121310-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stemi Stereo 508 | Zeiss | 495009-0006-000 | Dissecting microscope |
| MS-222 "Tricane" | Finquel | ARF5G | Amphibian general anesthetic |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-3 | Used to prepare Stienberg's solution and external solution |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | P217-500 | Used to prepare Stienberg's solution and external solution |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-1KG | Used to prepare Stienberg's solution and external solution |
| Calcium nitrate tetrahyrate (Ca(NO3)•4H2O) | Sigma-Aldrich | 237124-500G | Used to prepare Stienberg's solution |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | Mallinckrodt Chemicals | 6066-04 | Used to prepare Steinberg's solution |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5080-500G | Used to prepare external recording solution |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | J.T. Baker | 2444-01 | Used to prepare external recording solution |
| D-glucose Anhydrous | Mallinckrodt Chemicals | 6066-04 | Used to prepare external recording solution |
| Tubocurarine hydrochloride pentahydrate | Sigma | T2379 | Nicotinic acetylcholine receptor antagonist |
| Insect Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | 0.1mm diameter stainless steel pins |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 761028 | Preweighed monomer and curing agent kit |
| Sterile Polystyrene Petri Dish - 60x15mm | Fisher Scientific | AS4052 | Small petri dishes |
| PrecisionGlide Needle 25Gx5/8 (.0.5mm X 16mm) | BD | 305122 | Syringe needles |
| 1mL Slip Tip Tuberculin Syringe | BD | 309659 | Disposable, sterile syringes |
| Borosilicate pipette glass | Sutter Instrument | BF150-86-10HP | Pulled to desired specifications using pipette pulling machine |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | Fabricates micropipettes for electrophysiology recording |
| Kimwipes Kimtech wipes | Kimberly-Clark | 34120 | Delicate task lint-free wipers |
| Axon Instruments MultiClamp 700B Headstage CV-7B | Molecular Devices | 1-CV-7B | Current clamp and voltage clamp headstage |
| MP-285 Motorized Manipulator with Tabletop Controller | Sutter Instrument | MP-285/T | Control for headstage on electrophysiology rig |
| Fiber-Coupled LED (Green) | Thorlabs | M530F2 | Fiber optic cable paired with green LED |
| Cluster Bipolar Electrode (25µm diameter) | FHC | 30207 | Bipolar stimulating electrode |
| ISO-Flex Stimulator | A.M.P.I. (Israel) | Contact manufacturer | Flexible stimulus isolator |
| Axon Instruments 700B Multipatch Amplifier | Molecular Devices | 2500-0157 | Amplifier for voltage- and current-clamp recording |
| Digidata 1322A digitizer | Molecular Devices | 2500-135 | Data acquisition system for electrophysiology recording |
| Axio Examiner.A1 | Zeiss | 491404-0001-000 | Microscope for electrophysiology |
| Micro-g Lab Table | TMC | 63-533 | Air table for electrophysiology microscope |
| Inspiron 620 Personal Desktop Computer with Windows 7 64-bit | Dell | D06D001 | Computer running electrophysiology software |
| c2400 CCD camera | Hamamatsu | 70826-5 | Charge-coupled device camera for electrophysiology imaging |
| 7 O'Clock Super Platinum Stainless Razorblades | Gillette | CMM01049 | Platinum-coated stainless razor blades |
| Transfer Pipets | Fisher Scientific | 13-711-7M | Disposable Polyethylene transfer pipets |
References
- Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets. Dis. Model Mech. 6, 1057-1065 (2013).
- Pratt, K. G. Finding Order in Human Neurological Disorder Using a Tadpole. Curr. Pathobio. Rep. 3 (2), 129-136 (2015).
- Liu, Z., Hamodi, A. S., Pratt, K. G. Early development and function of the Xenopus tadpole retinotectal circuit. Curr. Opin. Neurobiol. 41, 17-23 (2016).
- Hamodi, A. S., Pratt, K. G. Region-specific regulation of voltage-gated intrinsic currents in the developing optic tectum of the Xenopus tadpole. J. Neurophysiol. 112 (7), 1644-1655 (2014).
- Pratt, K. G., Aizenman, C. D. Homeostatic regulation of intrinsic excitability and synaptic transmission in a developing visual circuit. J. Neurosci. 27 (31), 8268-8277 (2007).
- Cialeglio, C. M., Khakhalin, A. S., Wang, A. F., Constantino, A. C., Yip, S. P., Aizenman, C. D. Multivariate analysis of electrophysiological diversity of Xenopus visual neurons during development and plasticity. Elife. 4, 11351 (2015).
- Aizenman, C. D., Akerman, C. J., Jensen, K. R., Cline, H. T. Visually driven regulation of intrinsic neuronal excitability improves stimulus detection in vivo. Neuron. 39 (5), 831-842 (2003).
- Wu, G., Malinow, R. Cline H.T. of a central glutamatergic synapse. Science. , 972-976 (1996).
- Van Rheed, J. J., Richards, B. A., Akerman, C. J. Sensory-evoked spiking behavior emerges via an experience-dependent plasticity mechanism. Neuron. 87 (5), 1050-1060 (2015).
- Schwartz, N., Schohl, A., Ruthazer, E. S. Activity-dependent transcription of BDNF enhances visual acuity during development. Neuron. 70 (3), 455-467 (2011).
- Zhang, L. I., Tao, H. W., Holt, C. E., Harris, W. A., Poo, M. A critical window for cooperation and competition among developing retinotectal synapses. Nature. 395 (6697), 37-44 (1998).
- Hewapathirane, D. S., Haas, K. Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain. J. Vis. Exp. (17), e705 (2008).
- Dong, W., et al. Visual avoidance in Xenopus tadpoles is correlated with the maturation of visual responses in the optic tectum. J. Neurophysiol. 101 (2), 803-815 (2009).
- Hamodi, A. S., Pratt, K. G. The horizontal brain slice preparation: a novel approach for visualizing and recording from all layers of the tadpole tectum. J. Neurophysiol. 113 (1), 400-407 (2015).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , Garland. New York. (1994).
- Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices. J. Vis. Exp. (112), e54024 (2016).
- Muldal, A. M., Lillicrap, T. P., Richards, B. A., Akerman, C. J. Clonal Relationships Impact Neuronal Tuning within a Phylogenetically Ancient Vertebrate Brain Structure. Curr. Biol. 24 (16), 1929-1933 (2014).
- Khakhalin, A. S., Koren, D., Gu, J., Xu, H., Aizenman, C. D. Excitation and inhibition in recurrent networks mediate collision avoidance in Xenopus tadpoles. Eur. J. Neurosci. 40 (6), 2948-2962 (2014).
- Ruthazer, E. S., Aizenmann, C. D. Learning to see: patterned visual activity and the development of visual function. Trends Neurosci. 44 (4), 183-192 (2010).
- Pratt, K. G., Aizenman, C. D. Multisensory integration in mesencephalic trigeminal neurons in Xenopus tadpoles. J. Neurophysiol. 102 (1), 399-412 (2009).
