Summary
Bu yazıda, Xenopus laevis Kurbağa yavrularını retinotectal devre eğitim için tüm cep telefonu yama kelepçe kaydetmek için kullanılan üç beyin hazırlıkları görüşmek. Kendi belirli avantajları ile her hazırlık Xenopus iribaş deneysel tractability nöral devre işlevi incelemek için bir model olarak katkıda bulunmaktadır.
Abstract
Hangi formu synapses doğrudan üzerine nöronlarda optik tectum göz retina ganglion hücrelerinin (RGCs) oluşan Xenopus iribaş retinotectal devre nasıl sinir devreleri çalışma popüler modelidir kendini topla. Bütün taşıma yeteneği yama kelepçe kayıtları tectal nöronlar ve RGC uyarılmış yanıt, ya da içinde vivo hücre veya tüm beyin hazırlık kullanarak büyük bir vücut, normal yatan mekanizmaları yüksek çözünürlüklü verilerin üretti ve anormal, devre oluşumu ve işlev. Burada nasıl vivo içinde hazırlık, özgün tüm beyin hazırlık gerçekleştirileceğini açıklar ve daha yakın zamanda yatay beyin dilim hazırlık tectal neurons tüm cep telefonu yama kelepçe kayıtları elde etmek için geliştirilmiştir. Her hazırlık benzersiz deneysel avantajları vardır. Vivo hazırlık tectal nöronlar doğrudan yanıt göz yansıtılan görsel uyaranlara karşı kayıt sağlayan. Tüm beyin hazırlık için son derece kontrollü bir şekilde var olmak harekete geçirmek RGC akson, ve yatay beyin dilim hazırlık kaydından tectum tüm katmanları arasında sağlar.
Introduction
Retinotectal devre amfibi görsel sisteminin önemli bileşenidir. Hangi onların aksonlar optik tectum nerede postsinaptik tectal nöronlar ile sinaptik bağlantıları oluşturmak için proje RGCs gözünde, oluşur. Xenopus iribaş retinotectal devre nöral devre oluşumu ve işlev eğitim için popüler bir gelişim modelidir. Bu kurbağa'nın retinotectal devrenin bir güçlü deneysel model1,2,3render birçok özniteliği vardır. Bir büyük öznitelik ve odağı bu makalenin tüm cep telefonu yama kelepçe kayıtları tectal nöronlar, içinde VIVO veya tüm beyin hazırlık kullanarak yürütmek için yeteneği var. Gerilim ve akım kayıt modları kelepçe destekler bir amplifikatör ile donatılmış bir Elektrofizyoloji sondaj platformu ile tüm cep telefonu yama kelepçe kayıtları bir nöron'ın Elektrofizyoloji yüksek çözünürlükte karakterize edilebilir izin verir. Sonuç olarak, tüm cep telefonu yama kelepçe kayıtları tectal nöronlar retinotectal devre oluşumu temel aşamaları boyunca geliştirme detaylı ve kapsamlı bir anlayış ve plastisite içsel4,5 hazırladık , 6 , 7 ve sinaptik8,9,10,11 özellikleri. Tüm cep telefonu yama kelepçe tectal nöron kayıtları birleştirerek, genlerin veya morpholinos bu nöronların12ve kurulan görsel kaçınma testi13 ile görsel destekli davranışını değerlendirmek için bir yöntem ilgi ifade yeteneği teşvik molekülleri, devre fonksiyon ve davranışı arasındaki bağlantıları tanımlaması.
Tüm cep telefonu yama kelepçe kayıtları elde veri çünkü genetik kalsiyum göstergesi GCaMP6, gibi daha yeni görüntüleme yaklaşımları kullanarak mümkün değildir yüksek çözümleme türü bulunmakla birlikte kalsiyum göstergeler kullanarak görüntüleme verir unutmamak gerekir Kalsiyum dynamics büyük popülasyonlarda nöronların arasında aynı anda, orada hayır doğrudan veya özel elektrik parametreleri somata delta Floresans ölçerek elde edilebilir ve gerilim bir yolu yoktur belirgin şekilde kelepçe ölçmek için nöron akım-gerilim ilişkileri. Açıkça bu ayrı iki yaklaşım, Elektrofizyolojik kayıtlar ve kalsiyum görüntüleme, üst üste güçlü sahip ve farklı veri oluşturmak. Bu nedenle, en iyi yaklaşım belirli deneysel soru ele alınmaktadır bağlıdır.
Burada, biz tüm cep telefonu yama kelepçe kayıtları bir vivo içinde hazırlık, tüm beyin hazırlık, kullanarak iribaş optik tectum nöronlar edinme için bizim yöntem tanımlamak ve daha yeni bir14 bizim laboratuarımızda geliştirildi tüm beyin hazırlık modifiye . Temsilcisi sonuçları bölümünde her hazırlık ve elde edilebilir veri farklı türde deneysel avantajları göstermektedir. Sınırları ve güçlü ipuçları sorun giderme, yanı sıra farklı ürünleri bir tartışma bölümünde dahil edilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC), Wyoming Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. Elektrofizyolojik kayıtlar da dahil olmak üzere tüm yordamları oda sıcaklığında yaklaşık 23 ° c yapılmaktadır Tüm yöntem tanımlamak burada tectal Kurbağa yavrularını gelişimsel sahne 42 ve (Neiuwkoop ve Faber15göre sahnelenen) 49 arasında neurons kaydetmek için optimize edilmiştir.
1. Vivo içinde hazırlık
- İribaş anestezi.
- İribaş % 0,01 ile Steinberg'ın solüsyon içeren küçük bir Petri kabına yerleştirin MS-222 yaklaşık 5 min için.
Not: Ortak bir balık ve amfibi anestezik MS-222 aka "Tricaine" dır. Kurbağa yavrularını mM Steinberg'ın çözümde yetiştirilir: 0.067 KCl, 0,034 Ca (NO3)2•4H2O, 0,083 MgSO4•7H2O, 5.8 NaCl, 4.9 HEPES. - Adım 2 için devam etmeden önce derin anaesthetized (non-yanıt veren ve artık yüzme) iribaş olduğundan emin olun.
- İribaş % 0,01 ile Steinberg'ın solüsyon içeren küçük bir Petri kabına yerleştirin MS-222 yaklaşık 5 min için.
- Anatomi/kayıt çanak yere batık silikon bloğu için imzalat iribaş güvenli.
- Harici kayıt solüsyon içeren bir diseksiyon/kayıt yemek anaesthetized kurbağa taşımak için tek kullanımlık transfer pipet kullanın (115 mM NaCl, KCl, 2 mM CaCl23 mM, 3 mM MgCl2, HEPES, glikoz; 1 mM 5 mM ayarlamak 7,25 kullanarak pH 10 N NaOH, Osmolarite 255 mOsm).
- Spontan kas en aza indirmek için twitches, asetilkolin reseptör engelleyici, tubocurarine (100 µM) harici çözüm için ekleyin. (Genellikle, bu bir 10 mM tubocurarine stokunun 100 µL harici çözüm 10 mL için eklemek için 200 µL pipet kullanarak yapılır).
- Böcek iğne kullanarak, kurbağa, dorsal tarafta, silikon elastomer batık bir blok için güvenli (Sylgard 184 gibi Malzemeler tablo Ayrıntılar için bakınız), hangi-var yapıştırılmış diseksiyon çanak yere.
Not: Pimleri yerleşimini önemlidir: Proje göz beyin, afferent RGC akson impaling önlemek için yeterince Kaudal her iki tarafında yer onları ve optik tectum (şekil 1A) anterior beyin girin.
- Harici kayıt solüsyon içeren bir diseksiyon/kayıt yemek anaesthetized kurbağa taşımak için tek kullanımlık transfer pipet kullanın (115 mM NaCl, KCl, 2 mM CaCl23 mM, 3 mM MgCl2, HEPES, glikoz; 1 mM 5 mM ayarlamak 7,25 kullanarak pH 10 N NaOH, Osmolarite 255 mOsm).
- Orta çizgi boyunca beyin fileto.
- Beyin net görebilmek için steril 25-G iğne kullanarak orta çizgi boyunca yüzeysel bir kesi yaparak beyni örten cilt kaldırın.
- İğne Nöral tüp içine yerleştirip hafifçe yukarı doğru (dorsally) öyle ki tüp dorsal kısmı temiz bir şekilde yere plaka sağlam (şekil 1B) bırakarak (parçalanmış) kesilir çekerek aynı orta çizgi ekseni boyunca beyin fileto.
Not: Afferent duyusal girdiler tectum kat plaka girin çünkü Nöral tüp zemin plakası olduğu gibi bırakılması önemlidir.
- Tectal nöronlar kapakları şeffaf ventrikül membran kaldırın.
- Kayıt çanak Elektrofizyoloji teçhizat taşımak ve bir kırık cam pipet ucu tectal nöron hücre organları örten ventrikül membran kaldırmak için kullanın. Ucunu hafifçe narin görev silecek arasında sürükleyerek kır.
- Pipet pipet yuvasına vida ve optik tectum micromanipulator üzerinden aşağı indir.
- Tectum uzak ventrikül membran soyma için kırık pipet kullanın.
Not: Membran tüm tectum kaldırmak için gerekli değildir. küçük bir pencere yeterli ve nöronlar bol erişim sağlar.
- Tüm cep telefonu yama kelepçe kayıtları elde etmek.
Not: Bu aşamadan itibaren Segev, et al. açıklandığı gibi fare beyin dilimleri tüm cep telefonu yama kelepçe kayıtları taşımaya benzer bir yaklaşımdır 16 (Şekil 1C). - Retina yansıtılan ışık tüm alanı parıltısı tectal nöron yanıtlarını kaydetmek.
- Tüm alan flaş ışık retina proje için bir optik fiber kurbağa'nın göz bitişik yerleştirin. Optik fiber diğer ucunda bir LED ışık parlaklığı denetlenmesini sağlar bir değişken direnç doğrultusunda olduğunu. Tetikleyici LED Dijital çıkış ile amplifikatör. Bu şekilde, tüm alanı değişen şiddetlerde ışık yanıp söner olabilir (şekil 4A) kaydedildi.
2. tüm beyin hazırlık
- 1.1-1,3 adımları gerçekleştirin.
Not: Bu hazırlık için dış çözümde tubocurarine gereği yok. - Beyin izole et.
- 25-G iğne (Şekil 2A) arka beyin sever için kullanın.
- İribaş bütün beyninden izole etmek için hafifçe beyinde tüm yanal ve ventral bag doku ve sinir lifleri koparmaya Kaudal-için-rostral bir yön altında iğne çalıştırın.
- Beyin silikon elastomer bloğu için güvenli.
- Tamamen serbest geldiğinde, silikon elastomer bloğu için beyin yanında duvar ilanı olfaktör ampuller biri aracılığıyla bir PIN ve arka beyin (Şekil 2B) aracılığıyla başka bir PIN güvenli. Bu kayıt tectal nöronlar için en uygun yapılandırmadır.
- Diseksiyon kapsamdan sabitlenmiş tüm beyin hazırlık Elektrofizyoloji teçhizat için içeren yemek taşımak. 1.4. adımda açıklandığı gibi bir kırık cam pipet kullanarak ventrikül membran kaldırın.
- İki kutuplu bir uyarıcı elektrot optik hemisferlerine (nerede her Eye'dan axon yolları orta çapraz) doğrudan RGC akson etkinleştirmek için yerleştirin.
- İki kutuplu uyarıcı elektrot rostral ve hemen hemen bitişiğinde, büyük orta ventrikül yerleştirin. Optik hemisferlerine hemen rostral büyük orta ventrikül (Şekil 2B) için yer alır.
- Böyle küçük bir göçük dokusunda oluşan yavaşça uyarıcı elektrot optik hemisferlerine indirin. İki kutuplu elektrot stimülasyon tam olarak kontrol edilebilir gücünü sağlayan bir darbe uyarıcı tarafından tahrik edilmektedir.
- İki kutuplu uyarıcı elektrot rostral ve hemen hemen bitişiğinde, büyük orta ventrikül yerleştirin. Optik hemisferlerine hemen rostral büyük orta ventrikül (Şekil 2B) için yer alır.
- Segev, et al. tarafından açıklandığı gibi bütün hücre yama kelepçe kayıt (Şekil 2C) gerçekleştirmek 16
3. yatay beyin dilim hazırlık
- 2.1-2,3 adımları gerçekleştirin.
- (Hangi vivo içinde karşılık gelen en dorsal dördüncü) en yanal dördüncü bir yüzünün bir optik tectum tüketim için jilet kullanın. # Bu parçayı şekil 3' teAgösterilen Kaudal rostral uçağa paralel yapılmıştır.
- Silikon elastomer ile dilimlenmiş tarafına beyin yeniden pin yukarı bakacak şekilde (somata ve neuropil doğrudan kayıt için erişilebilir böylece) ve silikon elastomer blok (şekil 3 uzak bakan beyin ventrikül yüzeyine yan B) böylece (İki kutuplu bir elektrot optik hemisferlerine üzerinde yerleştirilebilir).
- Segev, et al. açıklandığı gibi tüm cep telefonu yama kelepçe veya yerel dosyalanmış potansiyel kayıt (şekil 3C) yerine getirmek 16
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tüm alan flaş ışık ışık uyarılmış yanıt-e doğru kaydetmek için elde edilen yanıt bireysel tectal neurons (şekil 4A) kaydedilir iken retina tahmin edilmektedir. Bu belirli iletişim kuralı her iki nöron (yanıt "On") açma ve 15 off dönüm ışığa tepki ölçmek için tasarlanmıştır daha sonra "Off yanıt." ölçmek için s Tectal nöronlar genellikle sağlam ve yanıt kapalı sergi (nöron gösterilen burada içinde kaydedilen gerilim kelepçe moduyla klempe 60mV-sinaptik akım (şekil 4B) ölçmek için). Sinaptik sürücü herhangi bir neuron tarafından alınan miktarı spontan sinaptik olaylar (şekil 4C) kaydederek sayılabilir. Akım-gerilim ilişkileri (ı-V eğrileri) aynı nöron nöron giderek depolarized potansiyelleri adım tarafından oluşturulan ve kayıt elde edilen gerilim aktif Na+ ve K+ akımları, "geçerli karma olarak anılacaktır kayıtları"(şekil 4D, E). Bu iyi kurulmuş oldu bu amfibi nöronlar için zirve Na+ ve K+ akımları sayısal karışık geçerli kayıtları doruklarına geçici bir başka4,7örtüşmeyen çünkü.
Doğrudan harekete geçirmek-in RGC akson optik hemisferlerine, Bütün ters yönde hesaplama ve işleme almak göz yerine görsel uyaranlara atlar ve presynaptic RGC akson ve postsinaptik tectal nöronlarda arasında sinaptik iletimi çalışmak için sağlar, en saf ve azaltılmış formu. Tectal nöron yanıt RGC harekete geçirmek için RGCs ışık veya doğrudan iki bileşenden oluşan iki kutuplu bir uyarıcı elektrot kullanarak uyarılmış üzerinden oluşturulur: monosynaptic bileşeni (aktif RGCs direkt sinaptik girişi) ve bir polysynaptic (yerel tekrarlayan ağ aktivite kaydedilen nöron geri besleme) bileşeni. Işık uyarılmış yanıtlar söz konusu olduğunda, monosynaptic ve polysynaptic bileşenleri birbirleriyle undeterminable miktar tarafından üst üste. Bu geçici örtüşme retina ve optik tectum arasında sinaptik iletimi hakkında ne söylenebilir sınırlar. Tüm beyin hazırlık kullanarak ve RGC akson yolu üzerinden doğrudan bir optik hemisferlerine (şekil 5A), yerleştirilen elektrot etkinleştirme ancak, mono ve aslında zaman içinde üst üste polysynaptic bileşeni oluşturur. İki kutuplu elektrot uyarıcı gücünü ayarlanabilir. Uyarıcı gücü arttıkça, aktif RGC akson (şekil 5B) daha fazla sayıda olduğunu. Minimal stimulasyon protokolü bir bireysel tectal nöron üzerine bireysel bir RGC akson sinaptik gücünü belirler; maksimal stimülasyon Protokolü toplam veya kombine tüm RGC akson (şekil 5C) maksimum, sinaptik girişten yansıtır. Eksitatör için inhibitör sinaptik giriş uygun oranını (E: Ben oranı) bir birey tarafından alınan tectal nöron normal görsel fonksiyon18için önemlidir. Şekil 5 D bireysel bir tectal nöron kaydedilen RGC uyarılmış eksitatör ve inhibitör geçerli izlerini bir örneği gösterilir. RGC presynaptic akson terminalleri verici yayınlamasını olasılığını eşleştirilmiş darbe kayıtları tarafından ölçülür. Bunun için RGC akson gittikçe, 50 ms zaman aralığı (şekil 5E) tarafından ayrılmış aktif iken sinaptik akımları, ölçmek için gerilim kelepçe modunda postsinaptik tectal nöron kaydedilir.
Tüm cep telefonu yama kelepçe kayıtları tectal nöronlar somatik herhangi bir katmanda bulunan üzerinden yapılabilir. Benzer şekilde tüm beyin hazırlık, RGC akson optik hemisferlerine (şekil 6A) İki kutuplu kayıt elektrot koyarak aktif hale getirilebilir. Tüm beyin hazırlık aşamasında yürütülen tüm kayıtları da bu yatay beyin dilim hazırlık kullanarak gerçekleştirilebilir. Şekil 6 B bir örnek izleme yüzeysel katmanındaki bir nöron kaydedilen bir RGC uyarılmış tepki gösterir. Bu hazırlık için de tectal dendrites üzerine RGC sinaptik giriş kayma desen ölçülecek sağlar. Bunun için alan RGC uyarılmış potansiyeller kaydedilir neuropil (şekil 6C) medial-lateral eksen (Yani, proksimal distal ekseni) boyunca her 10 µm. Bu işlev RGC giriş desenini yüksek çözünürlüklü bir profil oluşturur. Alan potansiyelleri sonra geçerli kaynak yoğunluğu ikinci kayma türev14 hesaplayarak dönüştürülebilir ve geçerli kaynak yoğunluğu sırayla bir görüntü komplo içine dönüştürülebilir. Şekil 6C görüntü mezarlığına en güçlü RGC giriş neuropil daha distal alan hedefler gösterir.
Şekil 1. Vivo hazırlama yordamları. (A)iribaş silikon elastomer bir parçası üzerinde sıkıştırdı. İğne beyaz oklarla belirtilmiştir. Daha Kaudal PIN optik yolları impaling kaçınmak konumlandırma unutmayın. Beyaz Kesikli çizgi orta çizgi gösterir. (B) tüm vınlamak görünümü beyin dorsal orta çizgi kesme ve overlaying cilt çıkarmadan sonra. (C) bütün hücreli yama-kelepçe kayıt vivo içinde. (L: Lateral. M: medial. R: Rostral. C: Kaudal. D: Dorsal. V: ventral. OB: olfaktör ampul. OT: Optik Tectum. HB: Arka beyin). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 . Bütün beyin hazırlama yordamları. (Beyin orta çizgi, arka beyin filtrelendi sonraA) olan bağları kopardı. (B) tüm beyin dışarı disseke ve silikon elastomer sıkıştırdık. Beyaz Yıldız sol olfaktör ampul PIN gösterir. Kırmızı bir kutu tectum, Yani, kayıt için hedef alan orta üçte gösterir. Tüm beyin hazırlık kullanarak (C) tüm cep telefonu yama kelepçe kaydı. Siyah yıldız işareti nerede kayıt için hücrelerin erişilemiyor un alıntı ventrikül membran alanı gösterir. Membran başarıyla kaldırıldı nerede somata daha belirgin ve tanımlanmış görünür. Ok sağlıksız bir neuron gösterir. (PZ: proliferatif bölge. LMV: Büyük Medial ventrikül. OB: olfaktör ampul. OT: Optik Tectum. HB: arka beyin. L: lateral. M: medial. R: Rostral. C: Kaudal. D: Dorsal. V: Ventral). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 . Yatay beyin dilim hazırlama yordamları. (A) optik tectum bir tarafı en lateral kısmı dilimlenmiş (Kesikli çizgiyle gösterilen) tüm beyin hazırlık sonra. (B) yatay beyin dilim hazırlık olmak sonra silikon elastomer tarafına sıkıştırdık. Çift beyaz çizgi üzerinde optik hemisferlerine yerleştirilen bir uyarıcı elektrot temsil eder. (C) soma katmanları ve bir yatay beyin dilim hazırlık kullanarak neuropil vınlamak görünümü. Kesik çizgili eğri soma katmanları ve neuropil arasındaki sınır gösterir. Bu rakam Hamodi, et al. değiştirildi 14 (L: Lateral. M: medial. R: Rostral. C: Kaudal. D: Dorsal. V: ventral. OB: olfaktör ampul. OC: optik hemisferlerine. OT: Optik Tectum. HB: Arka beyin). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 . Vivo hazırlık kayıtları. (A)şematik bir vivo içinde kayıt tipik yapılandırmasını gösteren. (B) ışık ışık de dahil olmak üzere yanıt ve yanıt ışığı uyarılmış. İç metin izlemeler Yakınlaştırılmış görünümü, Tarih - ve kapama-tepki, sırasıyla vardır. (C) spontan eksitatör postsinaptik akımları kaydetti. (D) Na+ ve K+ akımlar yanıt-e doğru gerilim kelepçe -60 adım mV 30 üzerinden tek bir nöron mV. (E) IV araziler izlemeler (d) oluşturulur. Tüm kayıtları -60 düzenlenen nöron ile bittiğini IV-araziler; oluşturmak için (D) içinde dışında mV nöronlar voltaj bağımlı akımları etkinleştirmek için giderek daha depolarized potansiyelleri, 10 mV artışlarla adım attı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 . Tüm beyin hazırlık kayıtları. (A)şematik bir uyarıcı elektrot da dahil olmak üzere tüm beyin kayıt tipik yapılandırmasını gösteren yerleştirilen optik hemisferlerine (yeşil ve kırmızı çizgiler temsil RGC akson). (B) Overlaying değişikliklere RGC stimülasyon güç RGC tepkilerin izler. (C) maksimum stimülasyon tepkisi (solda) ve en düşük stimülasyon yanıtı (sağda). (D) bir RGC uyarılmış eksitatör ve inhibitör yanıt tek bir nöron üzerine. (E) çiftli kolaylaştırma bireysel bir nöron RGC uyarılmış yanıtının nabız. (OB: olfaktör ampul. OC: optik hemisferlerine. OT: Optik Tectum). Tüm kayıtları -60 düzenlenen nöron ile yapıldı (eksitatör ve inhibitör girişleri ölçmek için,D) dışında mV: γ-aminobütirik asit (GABA) ters potansiyelini nöron tutarak eksitatör giriş kaydedilir-klorür aracılı akımları (-45 mv); α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic asit (AMPA) ters potansiyelini nöron tutarak inhibitör giriş-akımları (+ 5 mv) aracılı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6 . Yatay bir beyin kayıtları dilim hazırlık. (A)şematik bir yatay beyin dilim hazırlık yapılandırmasını gösteren. Uyarıcı elektrot optik hemisferlerine kalsa, kayıt pipet olduğunu şimdi yatay beyin dilim hazırlık tarafından maruz tectal katmanlar arasında erişim hücrelere konumlandırılmış unutmayın. (B) tectum yüzeysel katmanda bulunan bir nöron gelen bir RGC yanıt. (C) neuropil ve görüntü arsa ısı haritaları tarafından gösterilen dönüştürülmüş geçerli kaynak yoğunluğu (CSDs) alan potansiyelleri kaydedildi. (OC: optik hemisferlerine. OT: Optik Tectum. HB: Arka beyin). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmada açıklanan tüm yöntemleri tectal Kurbağa yavrularını gelişimsel sahne 42 ve (Neiuwkoop ve Faber15göre sahnelenen) 49 arasında neurons kaydetmek için optimize edilmiştir. Sahne 42 ile Kurbağa yavrularını yeterince büyük ve yeterince gelişmiş böylece böcek pimleri beyin vivo kayıtları için ve tüm beyin diseksiyon taşımak için her iki tarafında yerleştirilebilir. Daha önceki aşamalarında, Kurbağa yavrularını aslında iki boyutlu olduğunda (Yani, düz), burada açıklanan yaklaşımlar uygun değillerdir.
Hangi tectal nöronlar erişilebilir ve tüm cep telefonu yapılandırmada kaydedilen kolaylığı nedeniyle bu modeli devre nasıl sinir devreleri formu hakkında temel buluşlar için yuva işleyişi - ve işlevi19şekillendirme sırasında olmuştur. Burada tectal nöronlar iribaş vivo içinde ve tüm beyin hazırlıklar, farklı kayıt yapılandırmaları ve farklı veri tipleri örnekleri nasıl gerçekleştirileceği de dahil olmak üzere, tüm cep telefonu yama kelepçe kayıtları elde etmek nasıl tarif var. Bir tartışma güçlü ve yüksek kaliteli tüm cep telefonu kayıtları elde etmek için ipuçları ardından her hazırlık sınırlamalar aşağıdadır.
Xenopus Kurbağa yavrularını görsel kaçınma davranışları aşama tarafından 47/48, yaklaşık 7-8 gün sonrası döllenme3,13görüntüleme başlar. Bu bile bu nispeten erken yaşlardaki, işleyen ve görsel uyaranlara işleme yeteneğine retinotectal devre olduğu anlamına gelir. Geliştirme ve retinotectal devre plastisite ile ilgili temel soru doğrudan görsel uyaranlara retina öngörülen tectal nöron yanıtlarını kaydetmek için in vivo hazırlık kullanarak ele alınmıştır. İribaş vivo kayıtları nispeten basit eşdeğer kayıt yapılandırma sinir sistemi ve bir kafatası eksikliği ile göreli kolaylık nedeniyle memelilerde karşılaştırılır. Bireysel tectal nöron somas görüntülenmeyecektir vivo içindeolduğundan, belirli bir neuron sızdırmazlık ve tüm cep telefonu yama kelepçe kayıt yapılandırma elde tüm cep telefonu yama kelepçe kemirgen dilimi kayıt oynayabilmeniz için aslında eşdeğerdir hazırlıklar. Kurbağa yavrularını genellikle (hangi kolayca kalp atışı izleyerek tespit edilebilir) sondaj platformu üzerinde birkaç saat hayatta. Bir sınırlama doğasında iribaş vivo içinde hazırlık sadece tectal nöronlar, optik tectum derin somatik katmanda bulunan büyük orta ventrikül için hemen bitişik katman (Resim 1 kaydetmek için erişilebilir olmasıdır ). Bu tectal nöronlar tectum dış somatik katmanlarda bulunan büyük ölçüde keşfedilmemiş edilmiştir anlamına gelir içinde vivo.
Deneysel tüm beyin hazırlık gözleri ve tüm sahte duyusal uygulamalı aktivite ortadan kaldırarak cildi, periferik duyu reseptörleri beyinden yalıtarak avantajdır. Süre artık görsel uyaranlara tarafından tahrik olma yeteneğine, tectum hedef RGC aksonal girdileri tüm beyin hazırlık aşamasında hala mevcut ve onlar son derece kontrollü bir şekilde yerleştirilen bir uyarıcı bipolar elektrot (FHC) üzerinden doğrudan etkinleştirilebilir optik hemisferlerine nerede beyin RGC akson yolları iki kümesini girin. İlk rapor edilen kullanım tüm beyin hazırlık 1996 yılında Wu ve ark. tarafından önemli bir çalışma yapıldı. 8, hangi RGC akson yazarlar bireysel RGC akson postsinaptik tectal nöronlar üzerine gücünü ölçmek öyle ki iki kutuplu bir uyarıcı elektrot kullanarak etkinleştirildi ve yaparken çok ilerleme hakkında temel keşifler yaptı SYNAPSE olgunlaşma. Vivo içinde hazırlık tüm beyin hazırlık sadece derin katmanda, ventrikül membran için bitişik ikamet eden nöronlar erişmelerine izin verir.
Optik tectum yaklaşık dokuz hücre vücut katmanları17' oluşmaktadır rağmen tüm önceki Elektrofizyoloji çalışmaları derin katmanı tectal nöronlar üzerinde çünkü odaklanmıştır geleneksel tüm beyin ve in vivo hazırlıkları (açıklanan yukarıda) derin tabakasının nöronlar sadece erişmesine izin vermek. "Adlandırılan bir değiştirilmiş tüm beyin hazırlık geliştirdiğimiz tüm somatik katmanlardan, nerede RGC akson ile tectal nöron dendrites, sinaptik bağlantıları oluşturmak için tüm yanı sıra en yüzeysel en derin neuropil arasında tectal nöronlar erişmek için Yatay beyin dilim hazırlık"(şekil 314). Tüm beyin hazırlık yatay beyin dilim hazırlık RGC akson beyin içinde tutar ve onlar-ebilmek var olmak güdümlü yanında duvar ilanı İki kutuplu bir uyarıcı elektrot optik hemisferlerine.
Genel olarak, hazırlıklar görselleştirme ve erişim tectal nöron somata tüm cep telefonu yama kelepçe kayıt dışarı taşımak için optimize etmek için tasarlanmıştır. Doğrudan erişim için soma kalite tüm cep telefonu yama kelepçe kayıtları için gerekli: nöron içini erişmesi çok güçlü bir oluşumu (> 1 × 109 Ω) mühür pipet ve doğrudan gerektirir nöron'ın plazma zarı arasında kişi bu membran üzerine pipet ucu. Bu nedenle, yeterli ventrikül membran kaldırılması başarılı kayıt için anahtardır. Ayrıca, başarılı RGC uyarılmış kayıtları anahtarıdır bipolar uyarıcı elektrot optik hemisferlerine üzerine doğru yerleşimini. Aslında tüm tectal nöronlar RGC akson doğrudan sinaptik giriş alırsınız. RGC uyarılmış yanıt gözlem yapılırsa, optik hemisferlerine ve görme sinirini temas yok değil böyle sonra bunun iki kutuplu elektrot yanlış yerleştirilmesi nedeniyle olabilir. Bu sadece uyarıcı elektrot yeniden konumlandırma tarafından düzeltilebilir. İki kutuplu elektrot yeniden konumlandırma bu anlamına gelebilir sonra RGC uyarılmış yanıt RGC akson projeksiyon uymamak yanlışlıkla diseksiyon sırasında kesildi. Bu durumda, yeniden yeni bir hazırlık ile başlamak gereklidir. Son olarak, bir RGC uyarılmış yanıt uymamak kayıt ortak bir tectal nöron değil bir hücreden nedeni olabilir. Örneğin, glia genellikle tectal nöronlar tarafından görüntülenen normal RGC uyarılmış monosynaptic tepki görüntülenmez ve tespit edilmiştir, büyük mesencephalic nöronlar çok düşük numaralarından optik tectum20dakika içinde ikamet eden de olsa, ben de hoşlanmayacağım. Bu tectal olmayan hücrelerden birini kaydından olasılığını tectal nöronlar sayısının çokluğu nedeniyle çok düşüktür. Tabii ki, kalite kayıtları da sağlıklı olmak için tectal nöronlar gerektirir. Açık renkli ve lekeleri bir kompakt yuvarlak veya oval şekilli soma sağlıklı bir tectal nöron özellikleridir. Bir kez tüm cep telefonu kayıt yapılandırma elde, nöron sağlığını daha da Elektrofizyolojik düzeyinde membran potansiyeli, giriş direnci ve kapasite dinlenme gibi temel elektriksel özellikleri ölçerek değerlendirilebilir . Gelişim dönemleri ve 42 49 arasında sağlıklı tectal nöronlar istirahat membran potansiyelini yaklaşık -45 olduğunu mV, yaklaşık 1 GΩ ortalama bir giriş direnci ve bir kapasite 10-12 pF3,4,5. Nöronlar küçük bir kısmını kaçınılmaz olarak Ventriküler membran kaldırılması nedeniyle zarar görür. Zarar görmüş veya sağlıksız nöronlar somata davul gibi şişmiş ya da buruşuk grenli, görünür. Sağlıksız bir neuron örneği Şekil 2Cgörülmektedir. Nöronlar çoğunluğu sağlıksız görünüyorsa, bu yüzden dış kayıt çözümle, yanlış bir şey taze harici kayıt çözüm kadar yapmak için tavsiye edilir bir yansıması olabilir. Sağlıklı gösterilmenin yanı sıra, kayıt için en iyi nöronların izole aksine diğer neurons çok sayıda ile genellikle ilişkili olan. Ayrıca, kolayca erişilebilir hücreleri seçin. Örneğin, doku çok zor çünkü bu dokusuna zarar veya doku taşımak ve böylece yersiz uyarıcı elektrot vardiya bir hücre erişmek itmek yok. Son olarak, kayıtları potansiyel farkları arasında rostro Kaudal eksen4,8bulunmaktadır gelişimsel degrade nedeniyle önlemek için tectum (Resim 2B) orta üçte sınırlandırılmalıdır, Tabii ki, yukarıda belirtilen gelişim degrade odak deneme olmadığı sürece. Tectum uygun rostral proliferatif bölgesi ve büyük orta ventrikül Kaudal kenarına Kaudal alandır.
Teknik kayıt tüm cep telefonu yama kelepçe sınırlamaları değil. Genel olarak, kayıt bu tarz bir neuron teker teker kayıt içerir. Aynı anda bir dilim hazırlık ve içinde vivoyansıması için büyük popülasyonlarda nöronların etkinlik için izin GCaMP6 kalsiyum göstergeleri görüntüleme yeni nesil içeren yaklaşımların aksine bu.
Başka bir dezavantajı tüm cep telefonu gerilim kelepçe kayıtları için içsel gerilim4zamansal kontrolünü sınırlayan alan kelepçe (soma ötesinde çok daha fazla voltaj kontrol yetersizlik), hatadır. Genel olarak, onların nispeten küçük boyutlu, mütevazı dendritik arborizations ve memeli nöronlar için karşılaştırıldığında nispeten küçük ve yavaş akımlar nedeniyle tectal neurons ancak, kaydederken az bu gerilim kelepçe sorunlar bulunmaktadır. Bu özellikleri tectal nöronların onları özellikle gerilim kelepçe kayıt, birçok parametrelerinin ölçüm ve profilleri bireysel nöronlar5,6inşası için mükellef işlemek.
Gelecekteki yön vivo içinde yatay beyin dilim hazırlık görsel uyaranlara işlenmesi nöronlarda dış tabaka fonksiyonu karakterize etmek için en iyi duruma getirme içerir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
SBC COBRE 1P20GM121310-01 NIH grant tarafından desteklenen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stemi Stereo 508 | Zeiss | 495009-0006-000 | Dissecting microscope |
| MS-222 "Tricane" | Finquel | ARF5G | Amphibian general anesthetic |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-3 | Used to prepare Stienberg's solution and external solution |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | P217-500 | Used to prepare Stienberg's solution and external solution |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-1KG | Used to prepare Stienberg's solution and external solution |
| Calcium nitrate tetrahyrate (Ca(NO3)•4H2O) | Sigma-Aldrich | 237124-500G | Used to prepare Stienberg's solution |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | Mallinckrodt Chemicals | 6066-04 | Used to prepare Steinberg's solution |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C5080-500G | Used to prepare external recording solution |
| Magnesium Chloride (MgCl2) | J.T. Baker | 2444-01 | Used to prepare external recording solution |
| D-glucose Anhydrous | Mallinckrodt Chemicals | 6066-04 | Used to prepare external recording solution |
| Tubocurarine hydrochloride pentahydrate | Sigma | T2379 | Nicotinic acetylcholine receptor antagonist |
| Insect Pins | Fine Science Tools | 26002-10 | 0.1mm diameter stainless steel pins |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 761028 | Preweighed monomer and curing agent kit |
| Sterile Polystyrene Petri Dish - 60x15mm | Fisher Scientific | AS4052 | Small petri dishes |
| PrecisionGlide Needle 25Gx5/8 (.0.5mm X 16mm) | BD | 305122 | Syringe needles |
| 1mL Slip Tip Tuberculin Syringe | BD | 309659 | Disposable, sterile syringes |
| Borosilicate pipette glass | Sutter Instrument | BF150-86-10HP | Pulled to desired specifications using pipette pulling machine |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | Fabricates micropipettes for electrophysiology recording |
| Kimwipes Kimtech wipes | Kimberly-Clark | 34120 | Delicate task lint-free wipers |
| Axon Instruments MultiClamp 700B Headstage CV-7B | Molecular Devices | 1-CV-7B | Current clamp and voltage clamp headstage |
| MP-285 Motorized Manipulator with Tabletop Controller | Sutter Instrument | MP-285/T | Control for headstage on electrophysiology rig |
| Fiber-Coupled LED (Green) | Thorlabs | M530F2 | Fiber optic cable paired with green LED |
| Cluster Bipolar Electrode (25µm diameter) | FHC | 30207 | Bipolar stimulating electrode |
| ISO-Flex Stimulator | A.M.P.I. (Israel) | Contact manufacturer | Flexible stimulus isolator |
| Axon Instruments 700B Multipatch Amplifier | Molecular Devices | 2500-0157 | Amplifier for voltage- and current-clamp recording |
| Digidata 1322A digitizer | Molecular Devices | 2500-135 | Data acquisition system for electrophysiology recording |
| Axio Examiner.A1 | Zeiss | 491404-0001-000 | Microscope for electrophysiology |
| Micro-g Lab Table | TMC | 63-533 | Air table for electrophysiology microscope |
| Inspiron 620 Personal Desktop Computer with Windows 7 64-bit | Dell | D06D001 | Computer running electrophysiology software |
| c2400 CCD camera | Hamamatsu | 70826-5 | Charge-coupled device camera for electrophysiology imaging |
| 7 O'Clock Super Platinum Stainless Razorblades | Gillette | CMM01049 | Platinum-coated stainless razor blades |
| Transfer Pipets | Fisher Scientific | 13-711-7M | Disposable Polyethylene transfer pipets |
References
- Pratt, K. G., Khakhalin, A. S. Modeling human neurodevelopmental disorders in the Xenopus tadpole: from mechanisms to therapeutic targets. Dis. Model Mech. 6, 1057-1065 (2013).
- Pratt, K. G. Finding Order in Human Neurological Disorder Using a Tadpole. Curr. Pathobio. Rep. 3 (2), 129-136 (2015).
- Liu, Z., Hamodi, A. S., Pratt, K. G. Early development and function of the Xenopus tadpole retinotectal circuit. Curr. Opin. Neurobiol. 41, 17-23 (2016).
- Hamodi, A. S., Pratt, K. G. Region-specific regulation of voltage-gated intrinsic currents in the developing optic tectum of the Xenopus tadpole. J. Neurophysiol. 112 (7), 1644-1655 (2014).
- Pratt, K. G., Aizenman, C. D. Homeostatic regulation of intrinsic excitability and synaptic transmission in a developing visual circuit. J. Neurosci. 27 (31), 8268-8277 (2007).
- Cialeglio, C. M., Khakhalin, A. S., Wang, A. F., Constantino, A. C., Yip, S. P., Aizenman, C. D. Multivariate analysis of electrophysiological diversity of Xenopus visual neurons during development and plasticity. Elife. 4, 11351 (2015).
- Aizenman, C. D., Akerman, C. J., Jensen, K. R., Cline, H. T. Visually driven regulation of intrinsic neuronal excitability improves stimulus detection in vivo. Neuron. 39 (5), 831-842 (2003).
- Wu, G., Malinow, R. Cline H.T. of a central glutamatergic synapse. Science. , 972-976 (1996).
- Van Rheed, J. J., Richards, B. A., Akerman, C. J. Sensory-evoked spiking behavior emerges via an experience-dependent plasticity mechanism. Neuron. 87 (5), 1050-1060 (2015).
- Schwartz, N., Schohl, A., Ruthazer, E. S. Activity-dependent transcription of BDNF enhances visual acuity during development. Neuron. 70 (3), 455-467 (2011).
- Zhang, L. I., Tao, H. W., Holt, C. E., Harris, W. A., Poo, M. A critical window for cooperation and competition among developing retinotectal synapses. Nature. 395 (6697), 37-44 (1998).
- Hewapathirane, D. S., Haas, K. Single cell electroporation in vivo within the intact developing brain. J. Vis. Exp. (17), e705 (2008).
- Dong, W., et al. Visual avoidance in Xenopus tadpoles is correlated with the maturation of visual responses in the optic tectum. J. Neurophysiol. 101 (2), 803-815 (2009).
- Hamodi, A. S., Pratt, K. G. The horizontal brain slice preparation: a novel approach for visualizing and recording from all layers of the tadpole tectum. J. Neurophysiol. 113 (1), 400-407 (2015).
- Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , Garland. New York. (1994).
- Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices. J. Vis. Exp. (112), e54024 (2016).
- Muldal, A. M., Lillicrap, T. P., Richards, B. A., Akerman, C. J. Clonal Relationships Impact Neuronal Tuning within a Phylogenetically Ancient Vertebrate Brain Structure. Curr. Biol. 24 (16), 1929-1933 (2014).
- Khakhalin, A. S., Koren, D., Gu, J., Xu, H., Aizenman, C. D. Excitation and inhibition in recurrent networks mediate collision avoidance in Xenopus tadpoles. Eur. J. Neurosci. 40 (6), 2948-2962 (2014).
- Ruthazer, E. S., Aizenmann, C. D. Learning to see: patterned visual activity and the development of visual function. Trends Neurosci. 44 (4), 183-192 (2010).
- Pratt, K. G., Aizenman, C. D. Multisensory integration in mesencephalic trigeminal neurons in Xenopus tadpoles. J. Neurophysiol. 102 (1), 399-412 (2009).
