Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att rena exosomes från både plasma och serum med minskad Co rening av icke-exosomal blodproteiner. Optimerad protokollet innehåller ultrafiltrering, proteas behandling och storlek utslagning kromatografi. Förbättrad rening av exosomes fördelar nedströms analyser, inklusive mer exakt kvantifiering av blåsor och proteomiska karakterisering.
Abstract
Exosomes, en typ av nanovesicle som släppt från alla celltyper, kan isoleras från alla kroppsliga vätskor. Innehållet i exosomes, inklusive proteiner och RNAs, är unika för cellerna från vilken de härrör och kan användas som indikatorer på sjukdom. Flera gemensamma anrikning protokoll, inklusive ultracentrifugering, ge exosomes lastad med lösligt protein föroreningar. Specifikt, har vi funnit att de vanligast förekommande proteinerna i blodet ofta samtidig rena med exosomes och kan förvirra nedströms proteomiska studier, omintetgörs identifiering av låg överflöd biomarkör kandidater. Är irreproducibility av exosome protein kvantifiering på grund av inkonsekventa representation av icke-exosomal proteinnivåer ytterligare oroande. Protokollet beskrivs här utvecklades för att ta bort icke-exosomal proteiner som tillsammans renar tillsammans med exosomes, lägga till stringens till exosome reningsprocessen. Fem metoder jämfördes med hjälp av ihopkopplade blod plasma och serum från fem givare. Analys med nanopartiklar spårning analys och mikro bicinchoninic acid protein analysen avslöjade att ett kombinerat protokoll utnyttja ultrafiltrering och storlek utslagning kromatografi gav för optimal vesikler anrikning och lösligt protein borttagning. Western blotting användes för att kontrollera att de förvänta riklig blodproteiner, inklusive albumin och apolipoproteiner, tömdes.
Introduction
Exosomes är nanovesicles (varierar i storlek från 30 nm till 150 nm) släpptes av nästan alla celler i människokroppen att underlätta cell-till-cell kommunikation bearbetar1,2. Intressant, sammansättningen av exosomes ändras beroende på cellerna i ursprung liksom hälsotillståndet hos den enskilda3,4,5. Dessutom kan exosomes hämtas från flera biologiska vätskor såsom: saliv, urin och blod2. På grund av dessa funktioner anses exosomes vara en bra källa av sjukdom biomarkörer. Tyvärr finns det ingen standard metod för isolering av exosomes. Vissa laboratorier anser utgångsämnet centrifugering, med ett sista snabba steg på 100 000 x g använder täthetlutningar som guldmyntfoten metod för exosome isolering. Senare studier har dock visat att ultracentrifugering inducerar aggregering av exosomes med lösliga proteiner och andra exosomes, förutom som påverkar exosome integritet, vilka båda kan hämma nedströms tillämpningar6,7 . Andra vanliga metoder för exosome isolering inkluderar, men begränsas inte till: fällning av kommersiella polyetylenglykol (PEG) baserat reagenser, centrifugal ultrafiltrering och storlek-utslagning kromatografi (SEC). De kommersiella reagenser med polyetylenglykol (PEG) polymerer berika exosomes genom att orsaka dem att fällningen och bilda en pellet. Begränsningar med denna polymer är kontamination med kvarstående PEG polymer och ett överflöd av icke-exosomal av lösliga proteiner i slutprodukten. Ultrafiltrering använder tredjeparts centrifugering för att rena och koncentrera blåsor med en cellulosa membran; exosomes finns kvar ovanför filtret, medan mindre orenheter och andra proteiner passerar genom membranet7,8. Precis som andra metoder har centrifugal ultrafiltrering en begränsad kapacitet att rena exosomes på grund av bibehållandet av höga nivåer av icke-exosomal proteiner, inklusive proteinkomplex och mängder. Slutligen använder SEC rening porösa harts för att separera molekyler av storlek. SEC har visat lovande resultat, att övervinna de flesta av problem som är erfarna med andra metoder genom att fånga flesta främmande proteiner och bevara exosomal integritet, eftersom isolering är baserad på gravitation eller lågtryck system7, 9. Dock påverkar större protein aggregat och lipoproteiner10 samtidig isolering under SEC renheten av den slutliga exosome beredningen. Medan vissa metoder har testats för exosome rening från cell cellkulturer och plasma7eller endast plasma9,11, finns det ingen information om prestanda för metoder direkt jämföra blod plasma och serum från samma individ.
Här fokuserar vi på rening av blod exosomes genom att jämföra en mängd arbetsflöden att avgöra om vesikler anrikning tekniker är översättningsbara mellan plasma och serum. Nanopartiklar spårning analys och western blot har använts för att kvantifiera skillnaderna i exosome koncentration, renhet och protein sammansättningen i slutprodukter. Den sista metoden, som beskrivs i detta protokoll, ökar vesikelprotein siffror och minskar icke-exosomal proteinnivåer. Ännu viktigare, demonstreras en drastisk minskning av gemensamma samtidig fällning proteiner inklusive albumin och apolipoproteiner. Hög överflödet av dessa två proteiner i blodet och frekvensen vid vilken de Co rena med exosomes orsakar inkonsekvenser mellan ”renat” prover, skevning nedströms analyserna. Detta protokoll innefattar användning av en kommersiellt tillgänglig SEC harts; Hartset utgörs av porösa pärlor där proteiner mindre än 700 kDa kan ange pärlorna. En gång inuti, proteinerna behålls av en octylamine-ligand. Eluatet är sammansatt av exosomes och molekyler större än 700 kDa12. Dessutom, för att minska protein aggregat och apolipoproteiner som undgå pärla svällning, inkluderar vi ett proteas matsmältningen steg i arbetsflödet. För närvarande finns det ingen enda teknik kan maximera exosome kapacitet samtidigt minska Co renande icke-exosomal proteiner. Denna studie visar att en rening-protokollet som kombinerar ett proteas matsmältningen förbehandling med flera metoder för återvinning och rening kan användas för att öka exosome avkastning och renhet från blod serum och plasma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta arbete fastställdes inte vara mänskliga subjektet forskning vid inledande granskning från Colorado State Universitys institutionella granska Board (IRB), som alla mänskliga prover erhölls som avidentifierade prover från den Bioreclamation IVT biorepository och var som samlas in enligt IRB godkända protokoll.
1. beredning av rå prov (Plasma eller Serum) genom pelletering större blåsor och cellulära skräp
Obs: Säkerhets övervägande: plasma, serum och andra biologiska vätskor är biologiskt material och måste hanteras med särskild omsorg, iklädd grundläggande personlig skyddsutrustning, inklusive handskar och labbrock. Det rekommenderas starkt att biologiska prover bearbetas i en biosäkerhet skåp; om inte finns tillgängliga, rekommenderas användning av ögonskydd.
- Temperera ett serum eller plasmaprov genom att placera röret under icke-skakning förhållanden i kylskåp 4 ° C över natten (från antingen -20 eller -80 ° C lagring).
- Alikvotens 250 µL av provet i en mikrocentrifug rör med 1000 µL pipett.
- Centrifugera provet vid 18.000 x g under 30 minuter vid 4 ° C.
- Med 200 µL pipett bort 200 µL clearade supernatanten och lägga det till ett nytt mikrocentrifug rör. Undvika pelleterat material när du överför supernatanten. Kassera pelleterat material.
- Kvantifiera proteinhalten i urvalet av bicinchoninic syra (BCA) analys, med tillverkarens protokollet. För att utföra analysen, späd provet 1:50 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Dubbeltesta varje prov.
Obs: Använd 1 x PBS i hela protokollet om inte annat anges. I genomsnitt ger 200 µL skirat serum eller plasma (efter 18 000 x g) 15 mg totalprotein. Andra typer av prov, med lägre eller högre proteinhalt, kan kräva ytterligare BCA utspädningar. - Alikvotens 10 mg av provet i ett nytt mikrocentrifug rör. Använd den koncentration som erhålls i steg 1,5 för att beräkna motsvarande volym av provet. Alikvot provet med 200 µL pipett.
Obs: Det rekommenderas att förvara resterande provet vid-80 ° C. Alikvotens provet i olika rör på 10 mg per rör att undvika flera frysning-tining cykler i framtiden använda.
2. nedbrytning av icke-exosomal blodproteiner
Obs: Det matsmältning steget syftar till att minska de icke-exosomal proteiner som tillsammans kan rena med exosomes. Om bevarandet av exosome ytproteiner krävs för nedströms analyser, bör det tas hänsyn till att detta steg har potential att störa denna analys. Upptäckt av exosomal CD63, en yta-exponerade tetraspanin protein, påverkades inte signifikant negativt av denna process.
- Förbereda proteinas K lösning med en koncentration på 500 µg/mL i PBS. Lägga till motsvarande mängd proteinas K i ett koniskt rör. Tillsätt sedan buffert och virvel för 30 s, 3 x vid rumstemperatur.
- Tillsätt 50 µL av proteinas K lösningen 10 mg alikvotens och blanda försiktigt genom pipettering upp och ner med 200 µL pipett.
- Inkubera provet vid 37 ° C i ett vattenbad för 30 min. plats röret i en float tube rack och undvika fullständig nedsänkning av röret i vattenbad att undvika potentiella läckage.
- Överför provet och flytande tube rack till 60 ° C vattenbad i ca 10 min, för att inaktivera proteinas K.
3. avlägsnande av små proteiner och peptider av centrifug ultrafiltrering
- Skölj en ultrafiltrering enhet innehållande 100 kDa molekylvikt cut-off (MWCO)-filter med PBS före användning. Gör detta genom att lägga till 500 µL av PBS filtret med 1000 µL pipett. Snurra enheten på 3 700 x g för 5 min. kassera eventuella återstående retentate samt eluatet.
Obs: Provets volymkapacitet ultrafiltrering enheten måste vara 0,5 mL - 4 mL för att den slutliga reducerat provvolymen av 50 µL är uppnåeligt. - Ta provet från steg 2,4 och öka volymen till 500 µL genom att lägga till PBS. Pipettera provet i enhetens pre sköljda ultrafiltrering.
Obs: I genomsnitt är provvolymen från steg 2.4 185 µL (120 till 150 µL prov och 50 µL proteinas K lösning). - Placera ultrafiltrering enheten i en fast vinkel bänkmonterade Centrifugera vid 3 700 x g vid 4 ° C tills provet har minska till en volym på 50 µL.
Varning: När du använder ultrafiltrering enheter med stopp volym, försiktighet måste iakttas för att undvika fullständig torrhet av filtermembranet under centrifugering steg. - Tillsätt 500 µL av PBS direkt in i filtermembranet och pipett upp och ner 5 gånger. Centrifugera som i steg 3.3. Utföra denna TVÄTTNINGSSTEGET totalt 3 gånger.
- Överföra de sista 50 µL retentate i en ny mikrocentrifug rör.
- Skölj filtermembranet med 200 µL PBS, pipettering upp och ner 10 gånger, och överföra tvätten till röret från steg 3.5.
- Placera filterhållaren i omvänd position i en ny tub. Kör en omvänd spin återhämtning för 5 min vid 2000 x g att hämta resterande prov från membranet. Pool provet med provet från steg 3.5.
4. rening av blåsor av storlek utslagning kromatografi (SEK)
- Tillsätt 850 µL av SEC flytgödsel, med pärlor med en MWCO av 700 kDa, in i en tom, utjämnade gravitation flöde kolumn med 1000 µL pipett. Placera kolumnerna i en storlek som lämpliga rack försedd med en dropplåda.
- Uncap botten av kolumnen och låt flytande avloppet för 5 min. När väl avrunna, tillsätt 10 mL PBS att tvätta kådan. Tillåta 20 min för tvätten rinna ur kolumnen.
- Placera den koncentrerade, proteinas K behandlas provet från steg 3.5 in i en 15 mL koniska rör, och öka provvolymen till 5 mL lägga till PBS med serologiska pipett. Blanda röret försiktigt genom att gunga för 1 min och sedan långsamt tillämpa provet till kolumnen bereddes i steg 4,2 med serologiska pipett.
Obs: När locket på kolumnen avlägsnas, kommer att provet flöda genom kådan av gravitation; 5 mL provet kommer helt flöde genom kolumnen i 10 min. - Samla in flödet genom i en ny 15 mL koniska tub.
- Med serologisk pipett gäller det insamlade materialet till harts igen för att ta bort återstående material nedan 700 kDa.
- Samla in flödet genom i en ny 15 mL koniska tub. Tvätta kådan dubbelt tillsats av 1 mL PBS. Samla in flödet genom i röret från steg 4,5; den totala slutliga volymen blir ungefär 7 mL.
Obs: Efter steg 4,6 kommer provet att spädas ca 35 gånger från den ursprungliga provvolymen; följande steg kommer att minska volymen och koncentrat renade exosome provet.
5. koncentrationen av renat Exosomes och totalt Protein kvantifiering
- Skölj en ultrafiltrering enhet med 3 kDa MWCO filter med PBS före användning, enligt beskrivningen i steg 3.1.
- Lägg provet från steg 4,6 till ultrafiltrering enhet och Centrifugera i en svängande-hink rotor vid 3 700 x g vid 4 ° C. Bufferten kommer att passera genom filtret och kan kastas. Koncentrerad exosomes behålls ovanför filtret. Centrifugera provet tills volymen ovanför filtret (retentate) minskas till 200 µL.
- Överföra retentate till en ny mikrocentrifug rör.
- Skölj filtermembranet med 200 µL PBS genom pipettering över membranet 10 gånger och överföra tvätten till röret från steg 5.3. Detta kommer att möjliggöra insamling av varje prov på kvarvarande exosome.
- Ta provtagningsvolym upp till 500 µL genom att lägga till PBS. Blanda genom pipettering långsamt upp och ner 10 gånger.
Obs: Protokollet kan pausas här. Prover ska förvaras vid 4 ° C över natten eller vid-20 /-80 ° C för långtidslagring. - Kvantifiera proteinhalten i provet med BCA assay, med tillverkarens protokollet. Späd den prov 1:10 och 1:50 i PBS. Kör varje prov i två exemplar.
Obs: Börja med 10 mg totalprotein i serum eller plasma, totalt protein avkastningen i renat exosomes från steg 5,6 är, i genomsnitt 150 µg. ytterligare utspädningar kan vara nödvändigt om prover än serum eller plasma används; avkastningen kan variera med Provtyp.
6. kvantifiering och dimensionering av Exosomes av nanopartiklar spårning analys (NTA)
- Lägga till 5 µg av renat exosomes (som kvantifieras i 5.6) till 1 mL PBS och virvel för 15 s på låg-medium hastighet.
- Placera provet i en 1 mL engångsspruta. Om tillgängligt, ställa in sprutan i en automatisk sprutpumpen att injicera utspädda exosome provet vid en hastighet av 30 µL/min.
- Utföra NTA mätningar med videoinspelning inställningar: skärm vinst på 3-4 och kameran nivå 12-13.
- Definiera skriptet för analys att köra tre tekniska replikat för minst 30 s med ett konstant flöde för varje replikat. För analysen, ange fånga tröskelvärde på 5.
Obs: Information angående användning av automatisk sprutan, och inställningar för videoinspelning finns i referens13. Inställningar för NTA Capture och analys måste vara konsekvent över olika prover att säkerställa jämförbarhet.
7. bestämning av lösligt Protein minskning
- Lägga till 1-10 µg av renat exosomes till SDS prov buffert och utföra polyakrylamid gelelektrofores (sidan) med en 4-12% Bis-Tris Gel i 1 x MES SDS kör buffert för 35 min på 200 V. överföring löst proteiner till en nitrocellulosa 0,2 µm membran genom att tillämpa en spänning o f 50 V för 1-1,5 h. utför western blot analys för att utvärdera förekomsten av albumin, apolipoproteiner A och B och den exosome markören CD 63 efter standardmetoder.
Obs: Fullständiga protokoll för metoderna i 7,1 kan hittas i referens14; specifikt, SP007: kör av polyakrylamidgeler och SP011: Western blot-protokollet. - Separata 10 µg av renat exosomes använder sidan som i steg 7,1 och fläcken protein banden använder coomassie dye, följande standard rekommendationer, att visualisera protein variation och minskning mellan prover.
Obs: Ytterligare information om protokollet för western blotting specifika för CD63 beskrivs av Diaz et al. 15
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De data som presenteras nedan erhölls med Parade plasma och serum prover från fem friska blodgivare. För att avgöra effekterna av varje bearbetningssteg, fem varianter av protokollet presenterade utfördes, och exosome återhämtning och icke-exosome protein borttagning jämfördes. Metoderna trialed inkluderade: 1) SEK 700 kDa + ultrafiltrering 3 kDa; (2) ultrafiltrering 100 kDa; (3) proteinas K + ultrafiltrering 100 kDa; (4) SEK 700 kDa + ultrafiltrering 100 kDa och 5) proteinas K + ultrafiltrering 100 kDa + SEK 700 kDa + ultrafiltrering 3 kDa.
Kollektivt, producerat alla metoder som involverar SEK 700 kDa (1, 4 och 5) ett betydligt högre antal blåsor per mikrogram av protein i båda typer av prov, serum och plasma (figur 1A-B). Metod 5 genereras emellertid ett betydligt högre antal blåsor per mikrogram av plasma jämfört med serum (figur 1 c). Omvänt, koncentrationen av protein i renat exosome prover var betydligt lägre medan med SEK 700 kDa-baserade metoder (1, 4 och 5). Envägs ANOVA och Tukeys flera jämförelser tester visade att den slutliga proteinkoncentration efter metoder 2 och 3 var betydligt högre än den slutliga proteinkoncentration efter metoder 1, 4 och 5 (p < 0,001). Skillnaderna var konsekvent använder plasma eller serum, men med metod 1 den slutliga proteinkoncentration av renat exosomes var betydligt högre (t-test, p < 0,05) när du använder serum (figur 2A). För att utvärdera protein fördelningen av renat exosomes av de olika fem metoderna, var 10 µg av prov från varje metod löst i en sida och fläckade coomassie färgämne. Resultaten tyder på att majoriteten av proteinet som finns i den ”renade exosomes” från metoder 2 och 3 var albumin betecknas med det starka bandet ~ 65 kDa (figur 2B).
Nästa steg var att bekräfta ökningen i renhet av isolerade exosomes baserat på förekomst av albumin, det mest förekommande proteinet i blodet. Ultrafiltrering processen visade en markant koncentrationen av albumin i den exosomal fraktionen som delvis minskade förbehandling av provet med proteinas K (figur 3A, körfält S och P). Införandet av SEK 700 kDa i processen minskade mängden albumin (figur 3A, körfält P1/S1 och P4/S4) men kombinationen av SEK 700 kDa, proteinas K och ultrafiltrering visade den mest effektiv borttagningen av albumin från renat exosomes ( Figur 3A, lane P5/S5). Nyligen genomförda studier har visat att apolipoproteiner isoleras även vanligen Co under exosome rening10,16. Specifikt, befanns ApoB, som finns i låg densitet lipoproteiner, vara mycket koncentrerad i renat exosomes från humanblod10. Därför utvärderat vi Lipoproteinerna ApoB och ApoA-1 Co isolering. Ultracentrifugering metoder och kombinationen av ultracentrifugering och SEK 700 kDa visade ett liknande belopp av ApoB jämfört med det belopp som detekteras i serum och plasma av western blot (figur 3B, körfält P1/S1, P2/S2 och P4/S4; Kompletterande siffror 1/2). Intressant, resulterade tillägg av proteinas K i fullständig nedbrytning av ApoB från renat provet (figur 3B, körfält P3/S3 och P5/S5). På samma sätt minskade ApoA-1, den stora protein komponenten av hög densitet lipoproteiner i human plasma, med alla metoder som omfattar antingen SEK 700 kDa eller proteinas K (figur 3 c). Även om, ungefär som albumin, kunde de 100 MWCO ultrafiltrering på egen hand att avsevärt minska mängden Co renande ApoA-1.
Slutligen, för att avgöra effekten av proteinas K på proteiner som utsätts för yttre membranet i exosomes, vi utvärderat närvaron av den CD63 tetraspanin, ett protein som kännetecken av exosomes. En analys av Western blotting visade att proteinet var inte bara upptäckas i metoder som använder proteinas K (figur 3D, körfält P3/S3 och P5/S5), men banden för CD63 metoden 5 hade en mer intensiv signal (figur 3D, körfält P5/S5). Detta fynd tyder metod 5 ger antingen en högre koncentration av exosomes eller ökning av CD63 antikropp bindande på grund av minskningen av protein aggregat är associerad med den exosome ytan.
Figur 1 : Exosome avkastning från plasma och serum efter fem olika reningsmetoder. (A) koncentrationen av exosomes erhålls från plasma (n = 5). (B) koncentrationen av exosomes erhålls från serum (n = 5). ()C) jämförelse mellan antalet exosomes per mikrogram av protein från 5 Parade uppsättningar av plasma och serum. Siffrorna på x-axeln representerar varje metod används, 1 = SEK 700 kDa + ultrafiltrering 3 kDa; 2 = ultrafiltrering 100 kDa; 3 = proteinas K + ultrafiltrering 100 kDa; 4 = SEK 700 kDa + ultrafiltrering 100 kDa och 5 = proteinas K + ultrafiltrering 100 kDa + SEK 700 kDa + ultrafiltrering 3 kDa. I A och B, skillnaderna beräknades genom envägs ANOVA och Tukey's flera jämförelser tester. I C beräknades skillnader mellan serum och plasma per metod av t-test. p < 0,05; Felstaplar: 95% av konfidensintervall. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Protein avkastning i renat exosomes från plasma och serum med fem olika metoder. (A) jämförelse av totalprotein avkastningen i den renade exosomes erhålls från plasma och serum (n = 5). (B) representativ bild av en coomassie färgning av 10 µg av renat exosomes löst med SDS-PAGE; n = 1, Parade plasma och serum. Siffrorna i figuren representerar varje metod 1 = SEK 700 kDa + ultrafiltrering 3 kDa; 2 = ultrafiltrering 100 kDa; 3 = proteinas K + ultrafiltrering 100 kDa; 4 = SEK 700 kDa + ultrafiltrering 100 kDa och 5 = proteinas K + ultrafiltrering 100 kDa + SEK 700 kDa + ultrafiltrering 3 kDa. I Aberäknades skillnader mellan plasma och serum-derived prover av t-test. p < 0,05. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Minskning av de normala föroreningarna av exosomes som isolerats från blod och stabilitet av proteinet signum CD63. Western blot utvärdering av: (A) Albumin, 1 µg per körfält; (B) Apolipoprotein B, 1 µg per körfält; och (C) Apolipoprotein A1, 10 µg per körfält; (D) CD63, 1 µg per körfält. L = stege; S = rå serum; P = rå plasma. Renade exosome: rening med 5 olika metoder. Siffrorna i figuren representerar varje metod 1 = SEK 700 kDa + ultrafiltrering 3 kDa; 2 = ultrafiltrering 100 kDa; 3 = proteinas K + ultrafiltrering 100 kDa; 4 = SEK 700 kDa + ultrafiltrering 100 kDa och 5 = proteinas K + ultrafiltrering 100 kDa + SEK 700 kDa + ultrafiltrering 3 kDa. Representativa resultat från Parade serum och plasma hos en patient; trender överensstämde mellan givare prover. Protein lastning omväxlande vid blot; normalisering baserades på BCA bestämning av totala provets koncentration. Totalprotein belastning per körfält har angetts för varje blot. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 1: Original Okuperade western blotting från figur 3. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur 2: densitet kvantifiering av Albumin, ApoB och ApoA-1, CD63 band från figur 3. ImageJ programvara användes. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En optimerad metod för att öka renhet och avkastningen av exosomes från blod kommer att öka förmågan att korrekt gruvan extracellulära blåsor som en källa av biomarkörer för flera sjukdomar. De standardmetoder som används för att isolera exosomes, specifikt, ultracentrifugering och nederbörd metoder, har flera nackdelar inklusive exosome aggregation och pelletering av lösliga proteiner7,17, 18. Alternativt, användning av SEC har visat en signifikant förbättring i exosome isolering, skydda exosomes från aggregering, och förbättra avlägsnande av vanliga föroreningar icke-exosomal proteiner9,11,18 , 19. dock apolipoproteiner10, större blåsor och protein aggregat, inklusive albumin, isoleras ofta tillsammans med exosomes, om SEC ensam används. Två kritiska steg i presenteras protokollet stöd för att övervinna de sista två nämnda begränsningarna. Första, centrifugeringen av plasma eller serum provet vid 18.000 x g fällningar som de flesta av de större blåsor finns i provet. Andra, förbehandling av serum eller plasma prover med proteinas K, en serinproteas med bred specificitet20, är avgörande för att minska mängden albumin och apolipoproteiner A-1 och B som är associerad med exosomes under reningen. Vi kombinerade användning av proteinas K med ett ultrafiltrering steg med ett membran med en MWCO av 100 kDa att delvis eluera små proteiner och peptider, och då vi anpassat användning av en SEC harts med en MWCO av 700 kDa ytterligare rensa mindre peptider/proteiner från den exosomes. Detta harts, ursprungligen optimerad för virusisolering, fångar återstående stora proteiner och/eller komplex under 700 kDa. Principen om isolering av detta SEC harts tillåter en skonsam återhämtning av exosomes, eftersom flödet av provet genom kådan drivs av gravitation. Detta möjliggör mindre aggregering och balanserade integriteten för den exosomes, att övervinna två av de största begränsningarna av ultracentrifugering-baserade metoder. Slutligen, det visades av Baranyai o.a. att utspädning av plasma innan SEC behandlingen förbättrar exosome återhämtning21. I detta protokoll, har vi inkluderat en utspädningssteg före SEC att öka kontakttiden av provet med harts.
En viktig begränsning av protokollet presenteras är potentiella matsmältningen av proteiner i exosomal membran av proteinas K behandling. Detta kan försämra nedströms experiment om ytan-utsatt membranproteiner krävs för nedströms analyser inklusive western blot, ELISA, eller flödescytometri. För att delvis testa effekten av proteinas K på associerade membranproteiner, analyserade vi proteas-behandlade proverna för förekomsten av CD63, ett tetraspanin protein, som normalt finns i exosomes. Dessa resultat visade att användning av proteinas K med beskrivs villkoren för koktiden och koncentration inte ledde till betydande CD63 nedbrytning. Ytterligare utvärdering av membran-associerade protein stabilitet baserat på specifika forskningsintressen kommer dock krävas.
Avslutningsvis erbjuder presenteras protokollet flera fördelar jämfört med nuvarande befintliga metoder. Varje steg som ingår i protokollet har visat i oberoende studier att vara fördelaktigt för renheten av exosomes: pelletering av större blåsor, serum eller plasma utspädning och SEC. Additionally, som nämnts ovan, ett proteinas matsmältningen steg ingick att ta bort apolipoproteiner samt protein aggregat och en koncentration steg i slutet av reningsprocessen som gynnar exosome stabilitet och avkastning. Slutligen kan detta protokoll lätt anpassas till isolera exosomes från större volym prover som urin eller cell cellkulturer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning stöds av interna medel från CSU (till KMD), ATCC kontrakt nr 2016-0550-0002 (underleveranser av NIAID HHSN272201600013C), och The Bill och Melinda Gates Foundation (OPP1039688) (till KMD/NKG). Vi tackar NSF forskning upplevelsen för studenter (GRO) sommarprogram vid Colorado State University för ytterligare support.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nanosight | Malvern | NS300 | |
| Benchtop microcentrifuge | Thermo | Legend Mico21 | |
| Benchtop centrifuge | Beckman Coulter | Allegra 6R | |
| Waterbath | Benchmark | B2000-4 | |
| Microplate reader | BIOTEK | Epoch | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | THERMO | 23227 | |
| Micro BCA Protein Assay Kit | THERMO | 23235 | |
| Phosphate buffered saline | Corning | 21-040-CV | |
| 96 well plate | Corning | 15705-066 | |
| Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane | EMD-Millipore | UFC510096 | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Units | EMD-Millipore | UFC800324 | |
| Capto Core 700 | GE Healthcare | 17548103 | |
| Poly-Prep Chromatography Columns | BIORAD | 7311550 | |
| NuPAGE 4-12% Bis-Tris Protein Gels | THERMO | NP0323BOX | |
| Nitrocellulose Membrane, Roll, 0.2 µm | BIORAD | 1620112 | |
| Proteinase K, Tritirachium album | EMD-Millipore | 539480 | |
| SimplyBlue SafeStain | THERMO | LC6065 | |
| SIGMAFAST BCIP/NBT | Millipore-SIGMA | B5655 | |
| 4-Chloro-1-naphthol | Millipore-SIGMA | C6788 | |
| Anti-CD63 Antibody (rabbit anti-human) with goat anti-rabbit HRP secondary antibody | SYSTEM BIOSCIENCES | EXOAB-CD63A-1 | Primary and secondary antibodies |
| ALB Antibody (F-10) | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. | sc-271605 | Primary antibody |
| apoB Antibody (C1.4) | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. | sc-13538 | Primary antibody |
| apoA-I Antibody (B-10) | SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC. | sc-376818 | Primary antibody |
References
- Stoorvogel, W., Kleijmeer, M. J., Geuze, H. J., Raposo, G. The biogenesis and functions of exosomes. Traffic. 3 (5), 321-330 (2002).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. J Cell Biol. 200 (4), 373-383 (2013).
- Schorey, J. S., Harding, C. V. Extracellular vesicles and infectious diseases: new complexity to an old story. J Clin Invest. 126 (4), 1181-1189 (2016).
- Taylor, D. D., Gercel-Taylor, C. Exosome platform for diagnosis and monitoring of traumatic brain injury. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 369 (1652), (2014).
- Nilsson, J., et al. Prostate cancer-derived urine exosomes: a novel approach to biomarkers for prostate cancer. Br J Cancer. 100 (10), 1603-1607 (2009).
- Linares, R., Tan, S., Gounou, C., Arraud, N., Brisson, A. R. High-speed centrifugation induces aggregation of extracellular vesicles. J Extracell Vesicles. 4, 29509 (2015).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27031 (2015).
- Vergauwen, G., et al. Confounding factors of ultrafiltration and protein analysis in extracellular vesicle research. Scientific Reports. 7 (1), 2704 (2017).
- Welton, J. L., Webber, J. P., Botos, L. A., Jones, M., Clayton, A. Ready-made chromatography columns for extracellular vesicle isolation from plasma. J Extracell Vesicles. 4, 27269 (2015).
- Sódar, B. W., et al. Low-density lipoprotein mimics blood plasma-derived exosomes and microvesicles during isolation and detection. Sci Rep. 6, 24316 (2016).
- de Menezes-Neto, A., et al. Size-exclusion chromatography as a stand-alone methodology identifies novel markers in mass spectrometry analyses of plasma-derived vesicles from healthy individuals. J Extracell Vesicles. 4, 27378 (2015).
- Corso, G., et al. Reproducible and scalable purification of extracellular vesicles using combined bind-elute and size exclusion chromatography. Scientific Reports. 7 (1), 11561 (2017).
- Nanosight Ltd. NanoSight NTA 2.1 Analytical Software, Operating Manual. , Available from: http://nanobio.physics.ucsb.edu/pdfs/equipment/Nanosight%20NTA2.1%20software%20manual.pdf (2010).
- Dobos, K. Production Manuals & SOPs. , Available from: http://csu-cvmbs.colostate.edu/academics/mip/research/Pages/dobos-lab-production-manuals-sops.aspx (2017).
- Diaz, G., Wolfe, L. M., Kruh-Garcia, N. A., Dobos, K. M. Changes in the Membrane-Associated Proteins of Exosomes Released from Human Macrophages after Mycobacterium tuberculosis Infection. Sci Rep. 6, 37975 (2016).
- Yuana, Y., Levels, J., Grootemaat, A., Sturk, A., Nieuwland, R. Co-isolation of extracellular vesicles and high-density lipoproteins using density gradient ultracentrifugation. J Extracell Vesicles. 3, (2014).
- Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 3 Unit 3.22 (2006).
- Muller, L., Hong, C. S., Stolz, D. B., Watkins, S. C., Whiteside, T. L. Isolation of biologically-active exosomes from human plasma. J Immunol Methods. 411, 55-65 (2014).
- Böing, A. N., et al. Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography. J Extracell Vesicles. 3, (2014).
- Sweeney, P. J., Walker, J. M. Proteinase K (EC 3.4.21.14). Methods Mol Biol. 16, 305-311 (1993).
- Baranyai, T., et al. Isolation of Exosomes from Blood Plasma: Qualitative and Quantitative Comparison of Ultracentrifugation and Size Exclusion Chromatography Methods. PLoS One. 10 (12), e0145686 (2015).
