Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Samtidig transplantation av mänskliga äggstocksvävnad med bearbetade Endothelial celler: en Cell-baserad strategi kombinera accelererade Perfusion med direkta parakrin leverans

Published: May 16, 2018 doi: 10.3791/57472
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3, 1, 4, 1,3, 1,3
1Center for Reproductive Medicine and Infertility, Weill Cornell Medical College, 2Angiocrine Biosciences, Inc., 3Tri-Institutional Stem Cell Derivation Laboratory, Weill Cornell Medical College, 4Joan and Sanford I. Weill Department of Medicine, Weill Cornell Medical College

Summary

För vissa patienter är det enda alternativet för fertilitet bevarande frysförvaring för äggstocksvävnad. Tyvärr undergräver försenad revaskularisering follikulära livskraft. Här presenterar vi ett protokoll för att co transplantera mänskliga äggstocksvävnad med endotelceller för utnyttjande som cell-baserad strategi kombinerar accelererade perfusion med en direkt parakrin leverans av bioaktiva molekyler.

Abstract

Infertilitet är en vanlig biverkning av kemoterapi eller strålbehandling och för vissa patienter, Frysförvaring av oocyter eller embryon är inte ett alternativ. Som ett alternativ, ett ökande antal dessa patienter väljer att frysa äggstocksvävnad för autograft efter återkrav och eftergift. Trots förbättringar i resultat bland patienter som genomgår auto-transplantation av frysförvarade äggstocksvävnad, förblir effektiv revaskularisering ympade vävnad ett stort hinder. För att mildra ischemi och därmed förbättra utfall hos patienter som genomgår auto-transplantation, utvecklade vi en vaskulära cell-baserad strategi för att påskynda perfusion för äggstocksvävnad. Vi beskriver en metod för samtidig transplantation av exogena endotelceller (chefer) med frysförvarade äggstocksvävnad i en musmodell xenograft. Vi förlänga denna strategi att anställa chefer som har konstruerats för att konstitutivt express Anti-Mullerian hormon (AMH), vilket möjliggör ihållande parakrin signalering indata till äggstockscancer ympkvistar. Samtidig transplantation med chefer ökat follikulära volym och förbättrad antral follikeln utveckling och AMH-uttryckande chefer främjas lagring av quiescent primordial folliklar. Denna kombinerade strategi kan vara ett användbart verktyg för förmildrande ischemi och modulerande follikulära aktivering inom ramen av fertilitet bevarande och/eller infertilitet i stort.

Introduction

Cancer är fortfarande bland de ledande dödsorsakerna i industriländerna, men decennier av forskning har gett betydande framsteg för de flesta typer av cancer, och i vissa fall nästan fördubblad överlevnad priser1. Kemoterapeutika är tyvärr ofta gonadotoxic, ozonnedbrytande reserven av primordial folliklar i äggstockarna och minska fertilitet2. Denna växande befolkning kan dra nytta av olika metoder för fertilitet bevarande inklusive äggcell eller embryo frysförvaring, men patienter som kräver snabbt insättande av cancerbehandling och prepubertala patienter är berättigade till dessa alternativ. Alternativt kan har vissa patienter valt att frysa äggstocksvävnad innan deras terapeutiska regimen, och på återkrav och eftergift, auto-transplantation vävnad att återställa fertilitet3. Ännu, hittills har överlevnaden för njurtransplantaten och follikulär utdata efter auto-transplantation förblir relativt låg4, främst på grund av vävnad ischemi och hypoxi5,6,7. Trots många insatser för att förbättra lönsamheten för äggstockscancer kortikala grafter med anti-oxidanter8,9, proangiogena cytokiner10,11,12,1 3eller mekaniska manipulationer14, transplantat ischemi i en 5-7 dag fönster efter transplantation undergräver lönsamhet och överlevnad av transplantat7. För att lösa detta, utvecklat vi en cell-baserad strategi för att underlätta anastomos värd och transplantat fartyg och därmed påskynda reperfusion för äggstocksvävnad.

Förutom den ischemisk förolämpningen mot ympade äggstocksvävnad i fönstret efter transplantation, kan störningar av Inter follikulära signalering bidra till utarmning av pool15,16. Eftersom exogena endotelceller (chefer) bidrar till stabil och fungerande fartyg i peripheryen av graften, presenterar de en unik möjlighet att förmedla en definierad molekylär ingång transplanterad vävnad. Som ett bevis på principen, var chefer konstruerad för att snabb Super fysiologiska nivåer av Anti-Mullerian hormon (AMH), medlem av omvandla tillväxtfaktor beta (TGFβ) superfamiljen som har visat att begränsa follikeltillväxten17. Jämförelse av follikulära distribution i ympkvistar Co transplanteras med kontroll och AMH-uttryckande celler kontrollerar biologisk aktivitet och styrkan av bakåtkompilerade chefer.

Sammanfattningsvis, kan genom att förbättra transplantat livskraft och undertrycka tidig mobilisering av follikulära poolen, detta tillvägagångssätt öka produktiviteten i auto-transplanterade äggstocksvävnad hos patienter som genomgår fertilitet bevarande. Dessutom kan den ExEC-baserad plattformen experimentella förhör av molekylär tillsynsmyndigheter som har varit inblandade i follikulär utveckling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla förfaranden som berör animaliska ämnen har godkänts av den institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) vid Weill Cornell Medical College. Alla xenotransplantation experiment med hjälp av äggstocksvävnad utfördes i enlighet med tillämpliga riktlinjer och förordningar. Mänskliga äggstocksvävnad samlades in från patienter som planeras för kemoterapi eller strålbehandling för cancerbehandling eller tidigare benmärgstransplantation. Den institutionella Granskningsnämnden (IRB) kommittén vid Weill Cornell Medical College godkänd insamling av vävnad för potentiell autolog användning, och på patientens informerade samtycke en donation på upp till 10% av deras äggstocksvävnad för forskningsändamål utfördes.

1. insamling av mänskliga äggstocksvävnad

Obs: När en äggstocksvävnad transporteras från en fjärransluten anläggning transit, tid bör inte överstiga 5 h18,19.

  1. Samla äggstocksvävnad och skölj med en steril saltlösning.
  2. Placera äggstockarna i en steril behållare.
  3. Häll Leibovitzs l-15 medium tills äggstocken är helt nedsänkt i mediet.
  4. Nära och täta behållaren.
  5. Transportera behållaren på is.

2. bearbetning av de upphandlade äggstocksvävnad, anpassad från Schmidt m.fl. 18

  1. Förberedelserna för äggstockscancer bearbetning och frysning
    1. Bereda 100 mL medium för bearbetning: Leibovitzs l-15 medelstora 99 mL + 1 mL antibiotikum-antimycotic lösning. Filtrera media med 0,2 µm filter. Hålla det medium som kyld.
    2. Bereda 100 mL av lösningen frysning med DMSO som en cryo-protectant. Tillsätt 69.64 mL Leibovitzs l-15 medelstora, 17.66 mL fetalt bovint serum (FBS), 3,42 g sackaros (för att skapa en slutlig koncentration på 0,1 mol/L), 10.65 mL DMSO (för att skapa en slutkoncentration 1,5 mol/l), och 1 mL antibiotikum-antimycotic lösning. Filtrera det medium som använder en filterenhet 150 mL, 0,2 µm. Förvara mediet vid 4 ° C.
    3. Sterilisera kirurgiska verktyg använder autoklav programmerad för en inslagna solids steriliseringscykel.
  2. Vid ankomsten av vävnad
    1. Ange de sterila kirurgiska verktyg i biosäkerhet skåp: skalpell med bladet nummer 21, skarpa fina böjd sax och pincett i varierade storlekar: lång (ca 150 mm längd) och 2 medelstora (ca 110 mm längd).
    2. Använd sterila handskar, öppna behållaren inom biosäkerhet skåp. Ta äggstockarna och placera den i en 150 mm petriskål och häll kallt medium som bereddes i steg 2.1.1 ovanpå äggstocken för att förhindra uttorkning av äggstockscancer vävnad.
    3. Isolera äggstocken från eventuella kvarvarande vävnad och skölj den med kallt medium tills det saknar vävnad och blod.
    4. Placera äggstockarna i en ren 150 mm petriskål, tillsätt kallt medium, beredda i steg 2.1.1 tills äggstocken är hälften nedsänkt i den.
  3. Dissektion av äggstockscancer vävnad
    1. Tudela äggstocken och ta bort medulla först genom vassa dissektion, med böjda fina sax. Sedan skrapa medulla bort, med en steril skalpell med ett blad nummer 21. Föregå tills kortikal vävnad är 1-1,5 mm i tjocklek.
    2. Skär den kortikala vävnaden i fiberband av 2-3 mm i bredd, blir längden på remsan hela längden av den ovarian bit som bearbetas.

3. äggstockscancer vävnad långsam frysning, anpassas från Newton et al. och Oktay o.a. 6 , 20

  1. Förberedelse för frysning
    1. Etikett cryovials (1,8 mL).
    2. Tillsätt 1,5 mL frysning lösningen bereddes i steg 2.1.2 till varje injektionsflaska.
    3. Överföra en kortikal remsa per kryogen injektionsflaskan med lösningen frysning.
    4. Temperera den kortikala remsan i 20 min på en roterande tallrik, tillämpa försiktig skakning vid 4 ° C.
  2. Långsam frysning för äggstocksvävnad
    1. Läsa in cryovials i en programmerbar hyvel frys börjar vid 0 ° C.
    2. Cool vid 2 ° C/min till-7 ° C.
    3. Hålla vävnader på detta konstant temperatur under 10 minuter.
    4. Utföra manuell sådd för ice crystal kärnbildning induktion, genom att röra vid varje cryovial med bomull spets nedsänkt i flytande kväve (LN2).
    5. Fortsätta att kyla vid 0,3 ° C/min tills provtemperaturen når-40 ° C.
    6. Cool i en snabbare takt på 10 ° C/min till-140 ° C.
    7. Överför cryovials till dewar för lagring i LN2 (-196 ° C).

4. preparat för operationerna (Bilateral ooforektomi och samtidig transplantation)

  1. Beredning av plattor
    1. En dag innan upptining äggstockscancer vävnad för transplantation
      1. Placera en bit av en plast paraffin film längst ned på en 50 mm petriskål, spraya det med 70% etanol tills det kommer att vara helt täckt.
      2. Lämna Petriskålarna över natten i biosäkerhet skåp. Förbered 2 petriskålar per mus.
    2. På dagen av operationer
      1. Aspirera etanolen från petriskål som innehåller plast paraffin filma inom biosäkerhet skåp.
      2. Lämna petriskål ledningen halvöppen tills etanol avdunstar helt.
      3. Stäng locket på petriskål när plast paraffin filma är helt torr. Håll det inom biosäkerhet skåp.
      4. Etiketten brunnar i en 6 tallrik väl således 0,1 mol/L sackaros + 1 mol/L DMSO, 0,1 mol/L sackaros + 0,5 mol/L DMSO, 0,1 mol/L sackaros, grundläggande upptining lösning (BTS), Medium.
  2. Beredning av lösningar
    1. Bereda 100 mL BTS: Leibovitzs l-15 medelstora 79 mL + FBS 20 mL + antibiotika-Antimycotic lösning 1 mL. Filter med en 0,22 µm filtersystem.
    2. Förbereda 10 mL av BTS med 0,1 mol/L sackaros. Skala 0.342 g sackaros och tillsätt 10 mL av BTS som bereddes i steg 4.2.1, agitera försiktigt tills sackaros är helt upplöst. Filtrera lösningen med hjälp av en spruta filter 0,22 µm.
    3. Förbereda lösningarna enligt tabell 1. Täcka rör innehållande DMSO med aluminiumfolie. Förvara kallt fram till användning.

5. äggstocksvävnad snabb upptining

  1. Ta ur de LN2 dewar en injektionsflaskan med frusen äggstocksvävnad och förvara den i rumstemperatur i 30 s.
  2. Torka injektionsflaskan ren med en pappersnäsduk.
  3. Fördjupa injektionsflaskan i en 30 ° C vattenbad för 1-2 min tills dess ' innehåll är tinade.
  4. Öppna flaskan och placera den kortikala remsan i den första brunnen som innehåller 3ml av den första lösningen (0,1 mol/L sackaros + 1 mol/L DMSO, bereddes i steg 4.2.3).
    Obs: Alla åtgärder som rör öppna locket på plattan kommer att ske under laminärt flöde.
  5. Inkubera 6 väl plattan på en roterande platta vid 4 ° C i 5 min. Håll plattan täckt med aluminiumfolie för detta steg.
  6. Över den kortikala remsan till den andra väl innehållande 3 mL av den andra lösningen (0,1 mol/L sackaros + 0,5 mol/L DMSO, bereddes i steg 4.2.3).
  7. Inkubera 6 väl plattan på en roterande platta för mild agitation vid 4 ° C i 5 min. Håll plattan täckt med aluminiumfolie för detta steg.
  8. Överföra den kortikala remsan i den tredje brunn, innehållande 4 mL lösning (BTS med 0,1 mol/L sackaros, bereddes i steg 4.2.2).
  9. Inkubera i en roterande tallrik för skonsam omrörning vid 4 ° C i 5 min.
  10. Över den kortikala remsan till den fjärde väl innehåller 4 mL lösning (BTS, bereddes i steg 4.2.1).
  11. Inkubera i en roterande tallrik för skonsam omrörning vid 4 ° C i 5 min.
  12. Över den kortikala remsan till den sista väl innehåller 4 mL kallt medium (bereddes i steg 2.1.1). Förvara upptinade äggstocksvävnad på is tills utför transplantation.

6. inkapsling av äggstockscancer vävnad

  1. Förbered följande lösningar
    1. Förbereda 25 mL 20 mmol/L HEPES buffert i 0,9% koksaltlösning. Filter och förvaras vid 4 ° C.
    2. Förbereda 1 mL CaCl2 vid koncentration av 1 mol/L. Filter och förvaras vid 4 ° C.
  2. Förbereda en Fibrinogen 50 mg/mL stamlösning
    1. Tillsätt 1 g av Fibrinogen i 20 mL 20 mmol/L HEPES buffert i 0,9% saltlösning genom att blanda långsamt fibrinogen i HEPES buffrad koksaltlösning under flera timmar vid 37 ° C.
    2. Etikett 1,7 mL mikro-centrifugrör.
    3. Filtrera lösningen genom ett 0,45 µm spruta filter och sedan genom ett 0,2 µm spruta filter.
    4. Alikvot lösningen till 200 µL mikro-centrifugrör och förvaras vid-20 ° C.
  3. Förbereda en trombin 100 U/mL stamlösning
    Obs: Trombinlösningar adsorberas till glas, alikvotens lösningen i plast rör/injektionsflaskor.
    1. Tillsätt 2,5 mL 0.9% steril koksaltlösning 250 U av trombin.
    2. Mild skaka fram till lösningen att helt upplösa.
    3. Etikett 1,7 mL mikro-centrifugrör.
    4. Filtrera genom ett 0,2 µm spruta filter, alikvotens 50 µL mikro-centrifugrör och förvaras vid-80 ° C.
  4. Göra en Fibrin propp på 70 µL, att erhålla en slutlig koncentration på 10 mg/mL fibrinogen och 5 U/mL trombin
    Obs: Se till att arbeta snabbt, lösningen blodproppar i några sekunder. Undvik också att tillägg av bubblor till blandningen.
    1. Bered en Fibrinogen i ett 1,7 mL mikro-centrifugrör.
      1. Lägg till 360 µL 20 mmol/l HEPES buffra i 0,9% koksaltlösning till den aliquoted 200 µL av Fibrinogen beståndet, bereddes i steg 6.2.4.
      2. Blanda genom skonsam pipettering.
      3. Håll det på is.
    2. Bered en trombin i ett andra mikro-centrifugrör.
      1. Tillsätt 148,7 µL DMEM i den aliquoted 50 µL av trombin beståndet, bereddes i steg 6.3.4.
      2. Blanda genom skonsam pipettering.
      3. Tillsätt 1,3 µL av 1 mol/L CaCl2.
      4. Blanda genom skonsam pipettering.
      5. Håll det på is.
    3. Förbered en enda cellsuspension, i ett tredje mikro-centrifugrör.
      1. Lossa de bakåtkompilerade endotelcellerna från plattan med hjälp av ett enzym cell avlossning medium.
      2. Snurra ner den och räkna cellerna med en hemocytometer med en skyddsglaset.
      3. Använd 20 000 celler per varje 1 mm2 för äggstocksvävnad. Beräkna 20 000 x området för äggstocksvävnad i mm2.
      4. Snurra ner bakåtkompilerade endotelceller och slamma det i bassubstratet (DMEM) att nå en total volym på 16,8 µL.
      5. Håll det på is.
    4. Placera en bit för äggstocksvävnad på en steril kompress svamp för att torka den i några sekunder.
    5. Placera pjäsen för äggstocksvävnad ovanpå plast paraffin filma inom 50 mm petriskål.
    6. Lägg till 39,2 µL av Fibrinogen lösningen, bereddes i steg 6.4.1.2, in cellsuspensionen bereddes i steg 6.4.3.4, mix av mild pipettering. Håll det på is.
    7. Tillsätt 14 µL av trombin lösningen bereddes i steg 6.4.2.4. Blanda försiktigt genom pipettering en gång. Arbeta snabbt.
    8. Lägg blandningen ovanpå äggstocksvävnad, Pipettera det i form av en långsträckt droplet.
    9. Placera petriskål med koagel i inkubatorn vid 37 ° C.

7. bilateral ooforektomi och samtidig transplantation av mänskliga äggstockscancer vävnad med bearbetade Endothelial celler till NSG möss

Obs: Tio till fjorton-vecka-gammal kvinna NSG möss21 användes (Jackson Labs).

  1. Förbered alla kirurgiska verktyg, som utarbetats i steg 2.1.3, kontrollera att du har alla suturer, kuddar och kirurgisk tejp händig.
  2. Söva musen med hjälp av en anestesi-system med isofluran.
    1. Placera musen i induktion kammaren, Stäng locket och öppna lämplig Avstängningskranen.
    2. Öppna flödesmätare till 1 000 mL/min. slå på spridare och ställa in den att leverera 2-3,5%.
    3. Iaktta effekterna av anestesi; förlust av medvetande, långsam och regelbundna andetag.
    4. Överföra till näsan konen att underhålla anestesi. Vrid den spridare för att leverera 1-3%, beroende på vitala tecken.
    5. Kontrollera frånvaron av pedal eller svans reflex. Om reflexen är närvarande, öka isofluran tills det är frånvarande.
  3. Trimma musens tillbaka hår, från svansen upp till nyckelbenen linjen, med en elektriska hår trimmer.
  4. Placera musen i en liggande ställning på kirurgiska plattformen.
  5. Fixa näsan konen den kirurgiska Platform med en kirurgisk tejp.
  6. Tejpa musens lemmar försiktigt till kirurgiska plattformen använder en 1,25 cm bred kirurgisk papperstejp.
  7. Använd en steril smörjmedel gelé och infoga en termometer PR. Fix termometern genom att tejpa det till kirurgiska plattformen med en 1,25 cm bred perforerad plast kirurgtejp.
  8. Tejpa svansen till kirurgiska plattformen med hjälp av en 2,5 cm bred kirurgisk papperstejp.
  9. Värme, med hjälp av IR eller en varmvatten värmedyna, och övervaka musens kroppstemperatur under hela förfarandet. Hålla kroppstemperaturen inom spänna av 35-37 ° C.
  10. Rengör området trimmade med en steril povidon-jodlösning pinnen pinne och torka med steril alkohol prep.
  11. Upprepa steg 6,9 dubbelt mer.
  12. Placera en droppe steril okulär smörjmedel vet salva över varje musens ögon att skydda mot uttorkning och skador på hornhinnan.
  13. Täcka musen med hjälp av en steril kirurgiska draperi.
  14. Injicera buprenorfin (1 mg/Kg) subkutan (S/C).
  15. Utföra en längsgående mediala dorsala snitt med en skalpell (blad #21).
  16. Utföra en bilateral ooforektomi, Använd en dorsal metod.
    1. Gratis subkutana bindväv av trubbig dissektion med sax.
    2. Nypa fascian sidled till mittlinjen gör ett snitt och nå den bukhålan med vass sax.
    3. Ta den ovarian fett pad och äggstocken försiktigt med pincett och dra ut det ur bukhålan.
    4. Ta tag i äggstocken och fettet pad med en vaskulär klämma.
    5. Ligera äggstockar och fettet pad med en 4/0 monofilament resorberbar sutur vid basen av äggstockarna, distalt äggledaren.
    6. Klipp äggstocken distalt slips. Kontrollera att det finns ingen blödning från basen av stubben.
    7. Placera vävnaden tillbaka i bukhålan och sutur fascia med en 6/0 flätad resorberbar sutur.
    8. Upprepa steg 7.15.1-7.15.7 på den kontralaterala sidan.
  17. Samtidig transplantation av äggstocksvävnad.
    1. Utföra ett horisontellt snitt i fascian ovan Gluteus Maximus, vid längden som passar blodproppar dimensioner. Skapa en ficka i den virtuella rymden genom att öppna saxen under fascian.
    2. Plocka upp en bit av inkapslade kortikal vävnad, som bereddes i steg 6.4.8 och placera den i denna ficka.
    3. Sutur fascia med 6/0 flätad resorberbar sutur.
  18. Upprepa steg 7.16.1-7.16.3 på den kontralaterala sidan.
  19. Stäng den dorsala väggen med enkel avbrutna stygn med en 4/0 monofilament resorberbar sutur.
  20. Injicera lidokain 0,5% (1,2 mL/Kg) S/C på webbplatsen snitt.
  21. Använd en steril alkohol prep för att rengöra huden.
  22. Stäng av isofluran under övervakning av musens temperatur.
  23. Ge 1-2 min O2, utan isofluran. Hålla i uppvärmningen musen tills det börjar flytta och återvända till medvetande.
  24. Placera musen i en ren återhämtning bur och senare hus musen i en separat bur tills fullständig läkning av kirurgiska såret.
  25. Injicera buprenorfin (1 mg/Kg) S/C som behövs varje 8-12 h, för 24 h postoperativt.
  26. Hålla mössen i separata burar när alla mat, vatten, strö och burar är autoklaveras, tills slutpunkten för experimentet. Hålla burar i ett trycksatt ventilerat rum. Använd personlig skyddsutrustning när hantering möss.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

För att fastställa om samtidig transplantation av chefer ger en förmån till patienternas vävnad, var tinade cystor kortikala band uppdelad i lika stora bitar och rekonstituerades bilateralt i immunförsvar, nicka scid gamma (NSG), möss. Med ena sidan inbäddade i en fibrin propp ensam (ingen ECs) och de andra innehåller chefer (figur 1a), tjänade varje mus som sin egen kontroll. Chefer erhölls via isolering av primära endotel från mänskliga navelsträngar och efterföljande behandling med adenovirala gen fragment E4-ORF1, som tidigare beskrivits22,23. Inom passager 2-5, mänskliga navel ven ECs (hUVEC) behandlades med lentiviral partiklar som kodar konstitutiva uttryck cDNA kodning adenovirala gen fragmentet E4-ORF1. Denna behandling förbättrar överlevnad och endotel angiogena potential som tidigare beskrivs22,23. Efter två veckor bildades funktionellt perfunderade fartyg från GFP-märkta chefer på gränssnittet för värd vävnad och transplantat (figur 1b). För att märka funktionella blodkärl, injicerades möss med 100 mL lektin (0,5 mg/mL) under isofluran anestesi 10 minuter före skörd vävnaden. Kvantifiering av folliklar på 2 veckor följande transplantation visade en betydande fördel för relativa follikeln räknas i chefer-assisted ympkvistar som var tydligt på två veckor (figur 1 c). Exogena ECs bildas funktionella fartyg när Co transplanterade med äggstocksvävnad (figur 1b) och kortikala bitar tillsammans transplanteras med musen eller mänskliga chefer ökat antalet överlevande folliklar i förhållande till kontroll transplantat (figur 1 c ). Denna fördel var kopplad till minskad fibrotiska området i chefer-assisted transplantat (figur 1 d) — från varje transplanterade transplantat, 3 sektioner var färgas med Trichrome, ett etablerat sätt att avgränsar den fibrotiska vävnad24, att utvärdera fibrotiska område: en mitten och ett 600 µm djup avsnitt från övre och nedre sidorna av graften. Färgade sektioner skannades och analyseras med ImageJ för att kvantifiera yta och fibrotiska området var manuellt beskrivs och kvantifieras som en procentandel av den hela transplantat (ImageJ software). Slutvärdena beräknades för varje transplantat som genomsnittet av avsnitten 3 analyseras. Ännu viktigare, transplantat som var samtidig transplanterade med mänskliga förhud fibroblaster visade dålig vävnad livskraft och relativt få folliklar. (Figur 1e).

Vi bedömde nästa långsiktiga funktionen för äggstocksvävnad grafter med och utan chefer (figur 2ad, f, h). Efter 14 veckor var möss stimuleras dagligen med menotropins för variabla längder tid innan djur offrades, med utvecklingen av follikeln tillväxt övervakas i två möss via Mr (figur 2b-c). Utveckla folliklar noterades i både kontroll (figur 2e) och chefer-assisted transplantat (figur 2 g, jag). Fler och större storlek folliklar märktes i chefer-assisted grafterna (figur 2 g, jag). Jämfört med antral folliklar härrör från samma patientens vävnad, stimuleras med menotropins och samtidig transplanteras med chefer, det granulosa celllagrar i mer avancerade follikeln visas ökat uttryck av ovulatoriska markörer CD4425 och HABP126, samt ökad celldöd (kaspas), och minskad proliferation (Ki67) (figur 2j).

Flera studier har visat att poolen av folliklar aktiveras tidigt efter transplantat för äggstocksvävnad27,28,29,30. Vi observerade en liknande trend i flera transplantat från en enda patient vid 2, 3 och 14 veckor (figur 3a). För att kapitalisera på den förmodade funktionen av AMH i undertrycka aktivering eller tillväxten av folliklar17,31, konstruerade vi chefer med lentivirus konstitutivt uttrycka och ger därmed en direkt parakrin källa till utsöndrar AMH till transplanterade äggstocksvävnad (figur 3b). Lentiviral transduktion ökade 100-faldig ovan GC i ExEC som annars uttryckt omätbara mängder AMH. Granulosa celler tumörceller, utsöndras däremot, en basal nivå av AMH i cellkultur supernatant. (Figur 3 c). Två veckor efter samtidig transplantation, fartyg som härrör från chefer observerades vid gränssnittet värd-graft och immunfärgning visade riklig AMH protein i lumen av fartyg som härrör från AMH-ExECs (figur 3d) i förhållande till fartyg som bildas från kontroll chefer. Vi använde för att testa funktionen av AMH oberoende av proangiogena påverkan av chefer, mesenkymala stamceller (MSC) som isolerades från fragment av äggstockscancer medulla. Dessa celler var sensorik med lentiviral partiklar kodning AMH och expanderat i kultur för användning i samtidig transplantation. Vid samtidig transplantation med AMH-chefer observerades en 2-faldig ökning i andelen primordial folliklar. Detta leder dock till en minskning av andelen primära folliklar. AMH-MSCs leda till ökad retention av primordial folliklar av 10-faldig släkting till kontroll MSCs (figur 3f, h). Den mest betydande fördelen för lagring av quiescent follikulära poolen förlänades av AMH-ECs när en jämförelse görs mellan MSCs, chefer, icke-cellulära transplantat (Ctl), AMH-MSCs ExEC och AMH-ExECs (figur 3i).

Figure 1
Figur 1: samtidig transplantation av äggstockscancer kortikala remsor med Chefer förbättrar lönsamheten och bevarar follikulära poolen. (a) system för experimentell design. Fryst-tinat mänskliga äggstocksvävnad var inkapslad i en fibrin-propp, med eller utan chefer. Blodproppar var transplanteras i oophorectomized NSG möss och skördas vid slutpunkten av experimentet. (b) mänskliga kortikala ympkvistar Co transplanteras med hUVEC-derived chefer (grön); röda blodkroppar är märkta av TER-119 och gränserna för transplantatet beskrivs i vitt. (c), medianvärdet andelen totala folliklar från transplantation med och utan den mus eller mänskliga chefer + MAD. * P < 0,05. (d) median andelen fibrotiska området från transplantation med och utan den mus eller mänskliga chefer + MAD. ** P < 0,001. (e) representativa delar av äggstockscancer ympkvistar Co transplanteras med chefer, utan celler, och med mänskliga förhud fibroblaster. Denna siffra har ändrats från mannen et al. Sci Rep. 2017 Aug 15; 7 (1): 8203. DOI: 10.1038/s41598-017-08491-z. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: bättre långsiktiga lönsamhet och funktion för äggstocksvävnad ympkvistar av chefer. I siffror b, c, d, f och h är grafterna till vänster kontroll-inga exportkreditsystemet, medan på höger sida transplanterade grafterna tillsammans med chefer. (a) experimentella system för långsiktiga xenografts i kortikala äggstocksvävnad. (b) siffror b och c, asterisken (höger sida) representerar den äggstocksvävnad Co transplanteras med ECs, medan pilspetsen (vänster sida) representerar den äggstocksvävnad transplanteras med inga celler. Mus #1 var xenografted med vävnad från en 6 år gammal donator och övervakas av MRI vid uppkomsten av stimulering (14 veckor, vänster) och igen efter tio dagar av stimulering (15,5 veckor, rätt). (c) mus #3 var xenografted med vävnad från en 19 årig givare och övervakas av MRI vid 6 (20 veckor efter transplantation), 7 (21 w), och 8 (22 w) veckor efter debuten av stimulering. (d) makroskopiska bilden av engrafted mänskliga äggstockscancer vävnad skördas på 15,5 veckor mus nr 1, transplantat på höger sida är det ExEC-assisted transplantatet och histologiska utsikt över kontroll graften visas i (e). (f) makroskopiska bilden av grafterna, mus #2 offrades efter 20 veckor och kontroll och exEC-assisted ympkvistar skördades för histologisk analys; ExEC-assisted graften visas i (g). (h) makroskopiska bilden av grafterna i mus #3 som offrades efter 22 veckor, histologisk analys av ExEC-assisted graften visas i (i). (j) avsnitt av ExEC-assisted grafterna från mus nr 2 och mus #3 var färgas för molekylära markörer och förstoras i rutan associerade. Skala barer = 100 µm. Denna siffra har ändrats från mannen et al. Sci Rep. 2017 Aug 15; 7 (1): 8203. DOI: 10.1038/s41598-017-08491-z. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: chefer konstruerad för att uttrycka AMH bevara en quiescent follikulära pool. (a) andelen av folliklar kvantifierades för flera äggstocksvävnad fragment från samma patient som var samtidig transplanterade med ECs för långa och korta intervaller; n = 3 på 2 veckor, n = 4 på 3 veckor och n = 2 på 14 veckor. (b) system för experimentell design. Fryst-tinat mänskliga äggstocksvävnad var inkapslad i en fibrin-propp, med chefer/MSCs sensorik med en RFP lentiviral partikel som fungerar som en kontroll eller chefer/MSCs sensorik med ett AMH-mCherry lentiviral partikel genererar AMH-ECs/MSCs. Blodproppar var transplanteras i oophorectomized NSG möss och skördas på 2 veckor. (c) chefer var sensorik med lentivirus kodning utsöndrade mänskliga AMH; cell kultur supernatanten av AMH-sensorik chefer jämfördes COV-434 kultur granulosa cellinje tumör och kontroll chefer. (d) två veckor efter transplantationen, äggstocksvävnad fragment som transplanterades tillsammans med antingen ECs (vänster) eller AMH-ExECs (höger) var målat med en antikropp specifik för AMH protein. (e) den relativa andelen av folliklar i xenograft Co transplanteras med kontroll och AMH-ExECs kvantifierades efter 2 veckor (n = 6). (f) den relativa andelen av folliklar i xenograft Co transplanteras med kontroll och AMH-MSCs kvantifierades efter 2 veckor (n = 6). (g) på median + MAD den relativa andelen av folliklar jämfördes i xenograft transplanteras med kontroll och AMH-sensorik chefer (n = 6) efter 2 veckor. (h) median + MAD relativa andelen folliklar jämfördes i xenograft transplanteras med kontroll och AMH-sensorik MSCs (n = 6) efter 2 veckor. (i) median andelen observerade primordiala folliklarna per transplantat i xenograft transplanteras med MSCs (n = 6), chefer (n = 6), AMH-MSCs (n = 6), och AMH-ExECs (n = 6) jämfördes sammanlagt kontroll villkor (inga celler, n = 15). Inläggningar i (d) är förstorade i rutorna till höger för AMH-ExECs och till de lest för Ctl chefer; röda och blå stroke linjer i (d) beskriva vävnad och värd äggstocksvävnad, respektive. Felstaplar i (c) representerar standardavvikelsen mellan 3 replikat. Felstaplarna i (a, g-i) representerar MAD mellan antalet replikat som anges eller visas i diagrammet. Skalstapeln = 100 µm (d). * P < 0,05, ** P < 0,005. Denna siffra har ändrats från mannen et al. Sci Rep. 2017 Aug 15; 7 (1): 8203. DOI: 10.1038/s41598-017-08491-z. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Lösning Sackaros-BTS (bereddes i steg 4.2.2) i μL DMSO i μL
Sackaros-BTS med 1 mol/L DMSO 2787 213
Sackaros-BTS med 0,5 mol/L DMSO 2894 106

Tabell 1: Sackaros lösning beredning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Här visar vi att samtidig transplantation av chefer ger en betydande fördel för äggstocksvävnad livskraft och funktion efter xenografts i möss. Standarder för klinisk tillämpning för äggstocksvävnad auto-transplantation för fertilitet bevarande har inte set och de optimala parametrarna (storlek, transplantation webbplats, varaktigheten av transplantat, etc.) 32 , 33 , 34 för förbättrad återvinning av follikulära poolen förblir odefinierad. När auto-transplantation utförs, utförs avaskulär ympning av tinade kortikala äggstocksvävnad främst i bäcken platser såsom kvarvarande äggstock, cystor fossa, eller breda ligament35,36. Eftersom inga end-to-end anastomos sker, resulterar transplantation metoden i en våg av ischemisk vävnad förlust och tidig aktivering av folliklar som är bosatta i transplantat. Därför, medan samtidig transplantation med chefer innebär leverans av proliferativ endotelceller som kräver mycket ytterligare granskning innan att man överväger för klinisk tillämpning, detta tillvägagångssätt kan påskynda vävnad revaskularisering och kan rädda en robust andelen folliklar inom äggstockscancer ympkvistar.

Dessa fynd uträcka en roman vaskulära cell-baserad strategi för att optimera äggstocksvävnad livskraft och funktion efter transplantation. Med tanke på den växande poolen av patienter väljer för att frysa äggstocksvävnad och samtalslistor för äggstocksvävnad transplantation att flytta från experimentell status till öppna klinisk tillämpning37,38, kan denna metod erbjuda en terapeutisk strategi som möjliggör större bärkraft ympkvistar, därmed minska antalet cystor kortikala remsor som ska transplanteras och öka deras livslängd och/eller funktion.

För tidig rekrytering eller ”utbrändhet”, har också kopplats till utarmning av follikulära poolen under kemoterapi39, liksom följande auto transplantation för äggstocksvävnad34. Ett flertal studier har identifierat signalvägar som fungerar att aktivera undertrycka follikulära mobilisering och störningar av denna reglerande funktion kan resultera i en massa aktivering av follikulära poolen under ett kritiskt ischemisk fönster när den metaboliska behov av begynnande folliklar kan inte uppfyllas. Tillämpningen av chefer i detta sammanhang skulle inte bara påskynda reperfusion men på grund av deras potentiella engraftment, chefer kan också vara konstruerade för att ge en direkt parakrin leverans av faktorer som direkt follikulära mobilisering. Begreppet utnyttja AMH som en modulator av follikeltillväxt har tillämpats av andra grupper också. Kano o.a. levererade AMH via antingen osmotisk pumpar som innehåller rekombinant protein eller IP-injektion av viruspartiklar40. Dessa tillvägagångssätt resulterat i en liknande trend i lagstiftningshänseende primordial folliklar, men leveransen var systemisk. Alternativt kan chefer utsöndrar AMH ger en lokal och ihållande källa av AMH, införlivandet av bearbetade vaskulära celler i äggstocksvävnad ympkvistar är dock begränsad av otaliga riskerna med cellbaserade terapier. Immunsvar mot främmande antigener på chefer är möjligt och användning av proliferativ celler ökar möjligheten att cellerna cirkulerar, implantation och främja neoplastisk tillväxt någon annanstans i kroppen. Medan dessa begränsningar hindrar översättning av detta tillvägagångssätt för nuvarande patienter som genomgår auto-transplantation, påvisa dessa experiment risken för proangiogena influenser och förtryck av förtida follikulära mobilisering för att öka utdata för äggstocksvävnad grafter och upprätta en robust xenograft modell för mekanistiska studier av mänskliga äggstockscancer physiology.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Michael Ginsberg är anställd av Angiocrine biovetenskaper, Inc., San Diego, CA, 92130, USA, som isolerade, transfekterade med E4-ORF-1 och märkt endotelceller vi använt.

Acknowledgments

Omar Alexander Man för illustrationerna.
L.M. stöddes av en Pilot Award från Cornell kliniska och Translational Science Center och en ASRM forskning bidrag.
Författarna vill tacka James lab medlemmar för kritisk läsning av manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Leibovitz’s L-15 medium Gibco 11415064
Antibiotic-Antimycotic Gibco 15240062 Anti-Anti X100
Sucrose Sigma S 1888
Fibrinogen Sigma F 8630 from bovine plasma
Thrombin Sigma T 1063 from human plasma
DMSO Sigma D 2650
DMEM Gibco 12491015
Enzyme Cell Detachment Medium Invitrogen 00-4555-56 Accutase
Plastic paraffin film Bemis NA Parafilm M
Surgical paper tape 2.5 cm 3M 1530-1 Micropore
Surgical Paper tape 1.25 cm 3M 1530-0 Micropore
Perforated plastic Surgical tape 1.25 cm 3M 1527-0 Transpore
Monofilament Absorbable Suture Covidien UM-203 Biosyn
Braided Absorbable Suture Covidien GL-889 Polysorb
Povidone-iodine Solution USP 10% Purdue Products 67618-153-01 Betadine Solution Swab Stick
Cryoviales Nunc 377267 CryoTube
sterile ocular lubricant Dechra 17033-211-38 Puralube
1.7 ml micro-centrifuge tube Denville C-2172 Eppendorf
Anasthesia system VetEquip V-1 table top system with scavenging
Endothelial cells Angiocrine Biosciences, Inc., San Diego, CA, USA Isolated, transfected with E4-ORF- 1 and labeled endothelial cells
Trichrome stain Sigma HT15-1kt Trichrome Stain (Masson) Kit
Isolectin Invitrogen I32450 isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor™ 647 Conjugate

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer Statistics, 2017. CA Cancer J Clin. 67 (1), 7-30 (2017).
  2. Magelssen, H., Melve, K. K., Skjaerven, R., Fossa, S. D. Parenthood probability and pregnancy outcome in patients with a cancer diagnosis during adolescence and young adulthood. Hum Reprod. 23 (1), 178-186 (2008).
  3. Donnez, J., Dolmans, M. M., Diaz, C., Pellicer, A. Ovarian cortex transplantation: time to move on from experimental studies to open clinical application. Fertil Steril. 104 (5), 1097-1098 (2015).
  4. Stoop, D., Cobo, A., Silber, S. Fertility preservation for age-related fertility decline. Lancet. 384 (9950), 1311-1319 (2014).
  5. Aubard, Y., et al. Orthotopic and heterotopic autografts of frozen-thawed ovarian cortex in sheep. Hum Reprod. 14 (8), 2149-2154 (1999).
  6. Newton, H., Aubard, Y., Rutherford, A., Sharma, V., Gosden, R. Low temperature storage and grafting of human ovarian tissue. Hum Reprod. 11 (7), 1487-1491 (1996).
  7. Van Eyck, A. S., et al. Electron paramagnetic resonance as a tool to evaluate human ovarian tissue reoxygenation after xenografting. Fertil Steril. 92 (1), 374-381 (2009).
  8. Nugent, D., Newton, H., Gallivan, L., Gosden, R. G. Protective effect of vitamin E on ischaemia-reperfusion injury in ovarian grafts. J Reprod Fertil. 114 (2), 341-346 (1998).
  9. Kim, S. S., et al. Quantitative assessment of ischemic tissue damage in ovarian cortical tissue with or without antioxidant (ascorbic acid) treatment. Fertil Steril. 82 (3), 679-685 (2004).
  10. Abir, R., et al. Improving posttransplantation survival of human ovarian tissue by treating the host and graft. Fertil Steril. 95 (4), 1205-1210 (2011).
  11. Friedman, O., et al. Possible improvements in human ovarian grafting by various host and graft treatments. Hum Reprod. 27 (2), 474-482 (2012).
  12. Shikanov, A., et al. Fibrin encapsulation and vascular endothelial growth factor delivery promotes ovarian graft survival in mice. Tissue Eng Part A. 17 (23-24), 3095-3104 (2011).
  13. Soleimani, R., Heytens, E., Oktay, K. Enhancement of neoangiogenesis and follicle survival by sphingosine-1-phosphate in human ovarian tissue xenotransplants. PLoS One. 6 (4), e19475 (2011).
  14. Israely, T., Dafni, H., Nevo, N., Tsafriri, A., Neeman, M. Angiogenesis in ectopic ovarian xenotransplantation: multiparameter characterization of the neovasculature by dynamic contrast-enhanced MRI. Magn Reson Med. 52 (4), 741-750 (2004).
  15. Buratini, J., Price, C. A. Follicular somatic cell factors and follicle development. Reprod Fertil Dev. 23 (1), 32-39 (2011).
  16. Dunlop, C. E., Anderson, R. A. The regulation and assessment of follicular growth. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 244, discussion 17 13-17 (2014).
  17. Durlinger, A. L., et al. Control of primordial follicle recruitment by anti-Müllerian hormone in the mouse ovary. Endocrinology. 140 (12), 5789-5796 (1999).
  18. Schmidt, K. L., Ernst, E., Byskov, A. G., Nyboe Andersen, A., Yding Andersen, C. Survival of primordial follicles following prolonged transportation of ovarian tissue prior to cryopreservation. Hum Reprod. 18 (12), 2654-2659 (2003).
  19. Jensen, A. K., et al. Outcomes of transplantations of cryopreserved ovarian tissue to 41 women in Denmark. Hum Reprod. 30 (12), 2838-2845 (2015).
  20. Oktay, K., Newton, H., Aubard, Y., Salha, O., Gosden, R. G. Cryopreservation of immature human oocytes and ovarian tissue: an emerging technology? Fertil Steril. 69 (1), 1-7 (1998).
  21. Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. J Immunol. 174 (10), 6477-6489 (2005).
  22. Ramalingam, R., Rafii, S., Worgall, S., Brough, D. E., Crystal, R. G. E1(-)E4(+) adenoviral gene transfer vectors function as a "pro-life" signal to promote survival of primary human endothelial cells. Blood. 93 (9), 2936-2944 (1999).
  23. Seandel, M., et al. Generation of a functional and durable vascular niche by the adenoviral E4ORF1 gene. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (49), 19288-19293 (2008).
  24. Meirow, D., et al. Cortical fibrosis and blood-vessels damage in human ovaries exposed to chemotherapy. Potential mechanisms of ovarian injury. Hum Reprod. 22 (6), 1626-1633 (2007).
  25. Assidi, M., et al. Identification of potential markers of oocyte competence expressed in bovine cumulus cells matured with follicle-stimulating hormone and/or phorbol myristate acetate in vitro. Biol Reprod. 79 (2), 209-222 (2008).
  26. Thakur, S. C., Datta, K. Higher expression of hyaluronan binding protein 1 (HABP1/p32/gC1qR/SF2) during follicular development and cumulus oocyte complex maturation in rat. Mol Reprod Dev. 75 (3), 429-438 (2008).
  27. Dolmans, M. M., et al. Short-term transplantation of isolated human ovarian follicles and cortical tissue into nude mice. Reproduction. 134 (2), 253-262 (2007).
  28. Amorim, C. A., et al. Impact of freezing and thawing of human ovarian tissue on follicular growth after long-term xenotransplantation. J Assist Reprod Genet. 28 (12), 1157-1165 (2011).
  29. Kawamura, K., et al. Hippo signaling disruption and Akt stimulation of ovarian follicles for infertility treatment. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (43), 17474-17479 (2013).
  30. Suzuki, N., et al. Successful fertility preservation following ovarian tissue vitrification in patients with primary ovarian insufficiency. Hum Reprod. 30 (3), 608-615 (2015).
  31. Campbell, B. K., Clinton, M., Webb, R. The role of anti-Müllerian hormone (AMH) during follicle development in a monovulatory species (sheep). Endocrinology. 153 (9), 4533-4543 (2012).
  32. Donnez, J., et al. Restoration of ovarian activity and pregnancy after transplantation of cryopreserved ovarian tissue: a review of 60 cases of reimplantation. Fertil Steril. 99 (6), 1503-1513 (2013).
  33. Ferreira, M., et al. The effects of sample size on the outcome of ovarian tissue cryopreservation. Reprod Domest Anim. 45 (1), 99-102 (2010).
  34. Gavish, Z., Peer, G., Roness, H., Cohen, Y., Meirow, D. Follicle activation and 'burn-out' contribute to post-transplantation follicle loss in ovarian tissue grafts: the effect of graft thickness. Hum Reprod. 30 (4), 1003 (2015).
  35. Donnez, J., Dolmans, M. M. Fertility Preservation in Women. N Engl J Med. 377 (17), 1657-1665 (2017).
  36. Salama, M., Woodruff, T. K. New advances in ovarian autotransplantation to restore fertility in cancer patients. Cancer Metastasis Rev. 34 (4), 807-822 (2015).
  37. Donnez, J., Dolmans, M. M. Ovarian cortex transplantation: 60 reported live births brings the success and worldwide expansion of the technique towards routine clinical practice. J Assist Reprod Genet. 32 (8), 1167-1170 (2015).
  38. Meirow, D., et al. Transplantations of frozen-thawed ovarian tissue demonstrate high reproductive performance and the need to revise restrictive criteria. Fertil Steril. 106 (2), 467-474 (2016).
  39. Kalich-Philosoph, L., et al. Cyclophosphamide triggers follicle activation and "burnout"; AS101 prevents follicle loss and preserves fertility. Sci Transl Med. 5 (185), 185ra162 (2013).
  40. Kano, M., et al. AMH/MIS as a contraceptive that protects the ovarian reserve during chemotherapy. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (9), E1688-E1697 (2017).

Tags

Fråga 135 äggstocksvävnad frysförvaring fertilitet bevarande bioteknik cystor auto-transplantation samtidig transplantation exogena endotelceller (chefer) revaskularisering tidig follikulära mobilisering anti-Mullerian hormon (AMH)
Samtidig transplantation av mänskliga äggstocksvävnad med bearbetade Endothelial celler: en Cell-baserad strategi kombinera accelererade Perfusion med direkta parakrin leverans
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Man, L., Park, L., Bodine, R.,… More

Man, L., Park, L., Bodine, R., Ginsberg, M., Zaninovic, N., Schattman, G., Schwartz, R. E., Rosenwaks, Z., James, D. Co-transplantation of Human Ovarian Tissue with Engineered Endothelial Cells: A Cell-based Strategy Combining Accelerated Perfusion with Direct Paracrine Delivery. J. Vis. Exp. (135), e57472, doi:10.3791/57472 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter