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Bioengineering

Co transplantation de tissu ovarien humain avec des cellules endothéliales ingénieries : une combinaison de stratégie basés sur les cellules accéléré la Perfusion avec livraison directe Paracrine

Published: May 16, 2018 doi: 10.3791/57472
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3, 1, 4, 1,3, 1,3
1Center for Reproductive Medicine and Infertility, Weill Cornell Medical College, 2Angiocrine Biosciences, Inc., 3Tri-Institutional Stem Cell Derivation Laboratory, Weill Cornell Medical College, 4Joan and Sanford I. Weill Department of Medicine, Weill Cornell Medical College

Summary

Pour certains patients, la seule option pour la préservation de la fertilité est cryopréservation de tissu ovarien. Malheureusement, revascularisation tardive sape la viabilité folliculaire. Nous présentons ici un protocole co transplantation de tissu ovarien humain avec des cellules endothéliales pour utilisation comme une stratégie axée sur la cellule qui combinerait accélérée de perfusion avec une livraison directe paracrine de molécules bioactives.

Abstract

L’infertilité est un effet secondaire fréquent de la chimiothérapie et/ou radiothérapie et pour certains patients, la cryopréservation d’ovocytes ou d’embryons n’est pas une option. Comme alternative, un nombre croissant de ces patients choisissent de cryopréserver des tissus ovariens pour autogreffe après récupération et remise. Malgré des améliorations dans les résultats chez les patients subissant une auto-transplantation de tissu ovarien cryopréservé, efficace revascularisation du tissu greffé demeure un obstacle majeur. Pour atténuer l’ischémie et ainsi améliorer les résultats chez les patients qui doivent subir une auto, nous avons développé une stratégie axée sur les cellules vasculaire pour accélérer la perfusion des tissus ovariens. Nous décrivons une méthode pour la transplantation de cellules endothéliales exogènes (ExECs) Co avec tissu ovarien cryopréservé dans un modèle de xénogreffe de souris. Nous étendre cette approche à employer des ExECs qui ont été conçus pour exprimer constitutivement hormone Anti-Müller (AMH), permettant ainsi soutenue paracrine signalisation entrée aux greffes de l’ovaires. Transplantation Co avec ExECs ont augmenté de volume folliculaire et le développement de follicules antraux améliorée, et exprimant l’AMH ExECs promu rétention des follicules primordiaux quiescentes. Cette stratégie combinée peut être un outil utile pour atténuer l’ischémie et moduler l’activation folliculaire dans le contexte de la préservation de la fertilité ou de stérilité dans son ensemble.

Introduction

Le cancer demeure parmi les principales causes de décès dans le monde développé, mais des décennies de recherches ont abouti à des progrès significatifs pour la plupart des types de cancer et dans certains cas presque doublé de survie taux1. Malheureusement, les chimiothérapies sont souvent gonadotoxiques, appauvrissant la réserve de follicules primordiaux dans les ovaires et la réduction de la fertilité2. Cette croissance de la population peut bénéficier de diverses méthodes de préservation de la fertilité dont la cryopréservation d’ovocytes ou d’embryons, cependant, les patients nécessitant un lancement rapide de la thérapie contre le cancer et les patients prépubères ne sont pas admissibles pour ces options. Comme alternative, certains patients ont choisi de cryopréserver tissu ovarien avant d’entreprendre leur régime thérapeutique et sur la récupération et la rémission, auto-transplantation de tissus pour restaurer la fertilité3. Pourtant, à ce jour, survie du greffon et folliculaire sortie auto-TRANSPLATATION demeurent relativement faible4, principalement en raison de tissu ischémie et l’hypoxie5,6,7. Malgré les nombreux efforts visant à améliorer la viabilité des greffons de corticales ovariennes à l’aide des anti-oxydants8,9, pro-angiogénique cytokines10,11,12,1 3, ou des manipulations mécaniques14, ischémie greffon dans une post-transplantation de fenêtre de 5 à 7 jours sape la viabilité et la survie du greffon7. Pour y remédier, nous avons développé une stratégie de base de cellules pour faciliter l’anastomose des vaisseaux hôte et prothèse et ainsi accélérer une reperfusion de tissu ovarien.

En plus de l’accident ischémique de tissu ovarien greffé dans la fenêtre suivant la greffe, la perturbation de la signalisation inter folliculaire peut contribuer à l’appauvrissement de la piscine15,16. Car les cellules endothéliales exogènes (ExECs) contribuent à bateaux stable et fonctionnel dans la périphérie de la prothèse, ils présentent une opportunité unique de transmettre une entrée moléculaire définie au tissu transplanté. Comme une preuve de principe, ExECs ont été machinés pour niveaux express Super-physiologiques de l’hormone Anti-Müller (AMH), un membre de la superfamille de bêta (TGFβ) facteur de croissance transformant qui a été montré pour limiter la croissance folliculaire17. Comparaison de la distribution folliculaire dans les greffons transplantés conjointement avec le contrôle et les cellules exprimant l’AMH vérifie l’activité biologique et la puissance d’exECs machinés.

En résumé, en améliorant la greffe la viabilité et la suppression de mobilisation prématurée du pool de follicules, cette approche peut augmenter la productivité des tissus ovariens transplantés auto dans les patients subissant une préservation de la fertilité. De plus, la plate-forme ExEC permet interrogatoire expérimentale des régulateurs moléculaires qui ont été impliqués dans le développement folliculaire.

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Protocol

Toutes les procédures impliquant des sujets animaux ont été approuvés par l’animalier institutionnel et utilisation Comité (IACUC) au Weill Cornell Medical College. Toutes les expériences de xénotransplantation, à l’aide de tissus ovariens ont été effectuées conformément aux règlements et aux lignes directrices pertinentes. De tissu ovarien humain ont été recueilli chez des patients à la demande pour la chimiothérapie ou la radiothérapie pour le traitement du cancer ou de la transplantation de moelle épinière préalable. La Commission de révision institutionnelle (CISR) Comité du Weill Cornell Medical College a approuvé la collection de tissus pour usage autologue potentiel et après consentement éclairé du patient qu'un Don jusqu'à 10 % de leur tissu ovarien pour la recherche a été effectué.

1. collection de tissu ovarien humain

Remarque : Lorsqu’un tissu ovarien est transporté d’un transit d’installation à distance, temps ne doit pas dépasser 5 h18,19.

  1. Recueillir le tissu ovarien et rincer avec une solution saline stérile.
  2. Placez l’ovaire dans un récipient stérile.
  3. Versez le moyen L-15 de Leibovitz jusqu'à ce que l’ovaire est complètement immergé dans le milieu.
  4. Fermer et sceller le contenant.
  5. Transporter le conteneur sur la glace.

2. traitement du tissu ovarien au niveau multinational, adapté de Schmidt et al. 18

  1. Préparations pour traitement ovarien et la congélation
    1. Préparer 100 mL de milieu pour le traitement : solution antibiotique-antimycosiques de la L-15 de moyenne 99 mL + 1 mL de Leibovitz. Masses filtrantes à l’aide de 0,2 µm filtre. Garder le milieu réfrigéré.
    2. Préparer 100 mL de solution de gel à l’aide de DMSO comme un cryo-protecteur. Ajouter L-15 moyenne, 17,66 mL bovin sérum foetal de 69,64 mL Leibovitz (FBS), 3,42 g de saccharose (pour créer une concentration finale de 0,1 mol/L), 10,65 mL de DMSO (pour créer une concentration finale de 1,5 mol/L) et 1 mL de solution antibiotique-antimycosiques. Filtrer le milieu à l’aide d’une unité de filtration de 150 mL, 0,2 µm. Rangez le support à 4 ° C.
    3. Stériliser les instruments chirurgicaux à l’aide d’un autoclave programmé pour un cycle de stérilisation de solides enveloppé.
  2. À l’arrivée du tissu
    1. Définir les outils chirurgicaux stériles dans la prévention des risques biotechnologiques armoire : ciseaux scalpel avec numéro 21, de la lame bien affûtée courbée fine et pinces à diversité de tailles : long (environ 150 mm de longueur) et 2 moyennes (environ 110 mm de longueur).
    2. Porter des gants stériles, ouvrez le conteneur au sein de la biosécurité du cabinet. Prendre l’ovaire et placez-le dans un plat de Pétri de 150 mm et versez milieu froid préparé à l’étape 2.1.1 sur le dessus de l’ovaire pour prévenir la déshydratation du tissu ovarien.
    3. Isoler l’ovaire de n’importe quel tissu résiduel et le rincer à froid moyen jusqu'à ce qu’elle est dépourvue de tissus et de sang.
    4. Placer l’ovaire dans une propre 150 mm boîte de Pétri, ajouter froid moyen, préparé à l’étape 2.1.1 jusqu'à ce que l’ovaire est à moitié immergé dedans.
  3. Dissection du tissu ovarien
    1. Coupent l’ovaire et enlevez d’abord la medulla par dissection pointue, à l’aide de courbes des ciseaux. Puis gratter la zone médullaire, à l’aide d’un scalpel stérile avec un nombre de lame 21. Précèdent jusqu'à ce que le tissu cortical est de 1 à 1,5 mm d’épaisseur.
    2. Couper le tissu cortical en lamelles de 2-3 mm de largeur, la longueur de la bande sera toute la longueur de la pièce ovarienne qui a été traitée.

3. ovaire tissu congélation lente, adapté de Newton et al. et Oktay et al. 6 , 20

  1. Préparation pour la congélation
    1. Cryovials étiquette (1,8 mL).
    2. Ajouter 1,5 mL de la solution de congélation préparée à l’étape 2.1.2 dans chaque flacon.
    3. Transférer une bande corticale par cryogénique flacon contenant la solution de congélation.
    4. Equilibrez la bande corticale pendant 20 min sur un plateau tournant, s’appliquent à une agitation modérée à 4 ° C.
  2. Congélation lente de tissu ovarien
    1. Charger le cryovials dans un congélateur de raboteuse programmable à partir de 0 ° C.
    2. Refroidir à 2 ° C/min jusqu'à-7 ° C.
    3. Garder les tissus à cette température constante pendant 10 min.
    4. Effectuer un semis manuel pour l’induction nucléation de glace cristalline, en touchant chaque cryovial avec un bout de coton plongé dans l’azote liquide (LN2).
    5. Continuer à refroidir à 0,3 ° C/min jusqu'à ce que la température de l’échantillon atteint-40 ° C.
    6. Refroidir à un rythme plus rapide de 10 ° C/min jusqu'à-140 ° C.
    7. Transfert de cryovials à la dewar pour entreposage à LN2 (-196 ° C).

4. les préparations pour les chirurgies (ovariectomie bilatérale et transplantation Co)

  1. Préparation des plaques
    1. Un jour avant le dégel du tissu ovarien à la transplantation
      1. Placez un morceau d’un film de paraffine en plastique au fond d’un plat de Pétri de 50 mm, vaporisez-le avec 70 % éthanol jusqu'à ce qu’il sera complètement couvert.
      2. Laisser les boîtes de Pétri avec une nuit dans la prévention des risques biotechnologiques du cabinet. Préparer 2 boîtes de Pétri par la souris.
    2. Lors de la journée d’interventions chirurgicales
      1. Aspirer l’éthanol à partir de la boîte de Pétri contenant le film de paraffine en plastique dans l’armoire de biosécurité.
      2. Laisser la tête de la boîte de Pétri moitié ouverte jusqu'à ce que l’éthanol s’évapore complètement.
      3. Fermer le couvercle de la boîte de Pétri lorsque le film plastique paraffine est complètement sèche. Gardez-le dans la prévention des risques biotechnologiques du cabinet.
      4. Puits de l’étiquette d’un 6 plaque bien en conséquence, 0,1 mol/L de saccharose + 1 mol/L DMSO, 0,1 mol/L saccharose + 0,5 mol/L DMSO, 0,1 mol/L de saccharose, Solution base de dégel (BTS), moyen.
  2. Préparation des solutions
    1. Préparation de 100 mL de BTS : L-15 de Leibovitz moyenne 79 mL + BF 20 mL de solution antibiotique-antimycosiques 1 mL. Filtrer avec un système de filtre de 0,22 µm.
    2. Préparer 10 mL de BTS à 0,1 mol/L de saccharose. Échelle de 0,342 g de saccharose et ajouter 10 mL de BTS préparé à l’étape 4.2.1, agiter doucement jusqu'à dissolution complète de la saccharose. Filtrer la solution à l’aide d’une seringue filtre 0,22 µm.
    3. Préparer les solutions selon le tableau 1. Couvrir les tubes contenant le DMSO avec du papier aluminium. Conserver au réfrigérateur jusqu'à l’utilisation.

5. ovaire tissu décongélation rapide

  1. Sortez le LN2 dewar un flacon contenant congelé de tissu ovarien et gardez-le à température ambiante pendant 30 s.
  2. Essuyez le flacon à l’aide d’un papier de soie.
  3. Plonger le flacon dans un bain d’eau de 30 ° C pendant 1-2 min jusqu'à ce que son « contenu est décongelé.
  4. Ouvrir le flacon et placez une bande corticale dans le premier puits qui contient 3ml de la solution première (0,1 mol/L DMSO, préparé à l’étape 4.2.3 de saccharose + 1 mol/L).
    Remarque : Toutes les étapes impliquant l’ouverture du couvercle de la plaque seront fera sous hotte à flux laminaire.
  5. Incuber la plaque 6 puits sur un plateau tournant à 4 ° C pendant 5 min. Gardez la plaque couverte avec du papier aluminium pour cette étape.
  6. Transvaser la bande corticale dans le deuxième bien contenant 3 mL de la deuxième solution (0,1 mol/L saccharose + 0,5 mol/L DMSO, préparé à l’étape 4.2.3).
  7. Incuber la plaque 6 puits sur un plateau tournant pour agitation modérée à 4 ° C pendant 5 min. Gardez la plaque couverte avec du papier aluminium pour cette étape.
  8. Transvaser la bande corticale dans le troisième puits, contenant 4 mL de solution (BTS avec 0,1 mol/L de Sucrose, préparé à l’étape 4.2.2).
  9. Incuber sur un plateau tournant pour agitation modérée à 4 ° C pendant 5 min.
  10. Transvaser la bande corticale dans le quatrième bien contenant 4 mL de solution (BTS, préparé à l’étape 4.2.1).
  11. Incuber sur un plateau tournant pour agitation modérée à 4 ° C pendant 5 min.
  12. Transvaser la bande corticale dans le dernier bien contenant 4 mL de milieu froid (préparé à l’étape 2.1.1). Conservez les tissus ovariens décongelés sur la glace jusqu'à effectuer la transplantation.

6. encapsulation du tissu ovarien

  1. Préparer les solutions suivantes
    1. Préparer 25 mL d’un tampon HEPES 20 mmol/L en solution saline à 0,9 %. Filtrer et conserver à 4 ° C.
    2. 1 mL de CaCl2 à une concentration de 1 mol/L. filtre de préparer et de conserver à 4 ° C.
  2. Préparer une solution fibrinogène 50 mg/mL
    1. Ajouter 1 g de fibrinogène dans 20 mL d’un tampon HEPES 20 mmol/L dans une solution saline en mélangeant lentement fibrinogène dans l’HEPES 0,9 % solution saline tamponnée pendant plusieurs heures à 37 ° C.
    2. L’étiquette de 1,7 mL tubes à centrifuger-micro.
    3. Filtrer la solution à travers un filtre de seringue de 0,45 µm, puis à travers un filtre de seringue 0,2 µm.
    4. Partie aliquote de la solution dans 200 µL de tube à centrifuger-micro et conserver à-20 ° C.
  3. Préparer une solution thrombine 100 U/mL
    NOTE : Solutions de thrombine s’adsorber sur les verre, aliquote de la solution dans les tubes/fioles en plastique.
    1. Ajouter 2,5 mL de sérum physiologique 0,9 % à 250 U de la thrombine.
    2. Secouer doucement jusqu'à ce que la solution pour dissoudre complètement.
    3. L’étiquette de 1,7 mL tubes à centrifuger-micro.
    4. Filtrer à travers un filtre de seringue 0,2 µm, aliquote 50 µL dans les tubes à centrifuger-micro et conserver à-80 ° C.
  4. Faire un caillot de fibrine 70 µl, obtenir une concentration finale de 10 mg/mL fibrinogène et de thrombine de U/mL 5
    Remarque : Veillez à travailler vite, les caillots de la solution en quelques secondes. Aussi, éviter l’ajout de bulles dans le mélange.
    1. Préparer une solution de fibrinogène dans un tube à centrifuger-micro 1,7 mL.
      1. Ajouter 360 µL de 20 mmol/L HEPES tampon à 0,9 % solution saline à l’aliquotés 200 µL de la crosse de fibrinogène, préparé à l’étape 6.2.4.
      2. La composition de pipetage doux.
      3. Gardez-le sur la glace.
    2. Préparer une solution de thrombine dans un deuxième tube micro-centrifuge.
      1. Ajouter 148,7 µL de DMEM dans l’aliquotés 50 µL de la crosse de la thrombine, préparées à l’étape 6.3.4.
      2. La composition de pipetage doux.
      3. Ajouter 1,3 µL de 1 mol/L CaCl2.
      4. La composition de pipetage doux.
      5. Gardez-le sur la glace.
    3. Préparer une suspension monocellulaire, dans un troisième tube micro-centrifuge.
      1. Détacher les cellules endothéliales machinés de la plaque à l’aide d’un milieu de détachement enzyme cellulaire.
      2. Tournez en bas l’et compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre avec un couvercle en verre.
      3. Utilisez 20 000 cellules par tous de 1 mm2 de tissu ovarien. Calculez 20 000 x surface de tissu ovarien en mm2.
      4. Tournez en bas les cellules endothéliales machinés et remettre en suspension il en milieu basique (DMEM) pour atteindre un volume total de 16,8 µL.
      5. Gardez-le sur la glace.
    4. Placez un morceau de tissu ovarien sur un tampon de gaze stérile afin de sécher pendant quelques secondes.
    5. Placez le morceau de tissu ovarien sur le dessus le film plastique paraffine dans la boîte de Pétri de 50 mm.
    6. Ajouter 39,2 µL de la solution de fibrinogène, préparée à l’étape 6.4.1.2, dans la suspension de cellules préparée à l’étape 6.4.3.4, mélange de pipetage doux. Gardez-le sur la glace.
    7. Ajouter 14 µL de la solution de thrombine préparée à l’étape 6.4.2.4. Mélanger doucement en pipettant également, une fois. Travail rapide.
    8. Placez le mélange sur le dessus du tissu ovarien, pipette sous la forme d’une goutte allongée.
    9. Placez la boîte de Pétri avec le caillot dans l’incubateur à 37 ° C.

7. bilatéraux ovariectomie et co transplantation de tissu ovarien humain avec des cellules endothéliales machinés, à NSG souris

NOTE : Dix à quatorze semaines femelle NSG souris21 ont été utilisés (Jackson Labs).

  1. Préparer des outils tout chirurgicales, comme défini à l’étape 2.1.3, assurez-vous de qu'avoir toutes les sutures, plaquettes et rubans chirurgicaux très pratiques.
  2. Anesthésier la souris à l’aide d’un système d’anesthésie à l’Isoflurane.
    1. Placez votre souris dans la chambre de l’induction, fermer le couvercle et ouvrir le robinet approprié.
    2. Débitmètre ouverte à 1 000 mL/min. Allumez le vaporisateur et réglez-le pour livrer 2 à 3,5 %.
    3. Observer les effets de l’anesthésie ; perte de conscience, lente et régulières respirations.
    4. Transfert vers le cône de nez pour maintenir l’anesthésie. Tourner le vaporisateur pour offrir de 1 à 3 %, selon les signes vitaux.
    5. Vérifier l’absence de réflexe de pédale ou queue. Si le réflexe est présent, augmenter l’isoflurane jusqu'à ce qu’il est absent.
  3. Couper les cheveux en arrière de la souris, depuis la queue jusqu'à la ligne des clavicules, à l’aide d’une tondeuse à cheveux électrique.
  4. Placez votre souris dans une position couchée sur la plate-forme chirurgicale.
  5. Difficulté du cône de nez à la plate-forme chirurgicale à l’aide d’un ruban chirurgical.
  6. Bande des membres de la souris doucement vers la plate-forme chirurgicale à l’aide d’un ruban perforé chirurgicale de 1,25 cm de large.
  7. Utilisez une gelée lubrifiante stérile et insérer un thermomètre PR. Fix le thermomètre par du ruban adhésif il à la plate-forme chirurgicale à l’aide d’un ruban chirurgical en plastique de 1,25 cm de large perforé.
  8. Tape la queue à la plate-forme chirurgicale à l’aide d’un ruban chirurgical large de 2,5 cm.
  9. Chaleur, à l’aide d’un infrarouge ou un coussin, chauffant l’eau chaude et surveiller la température du corps de la souris tout au long de la procédure. Maintenir la température du corps dans la plage de 35-37 ° C.
  10. Nettoyer la zone rognée avec un coton-tige stérile de Solution de Povidone-iode et essuyer à l’aide de préparation d’alcool stérile.
  11. Répétez l’étape deux fois plus de 6,9.
  12. Déposer une goutte de pommade vétérinaire Lubrifiant oculaire stérile sur chacun des yeux de la souris pour protéger de la déshydratation et les dommages à la cornée.
  13. Couvrir la souris à l’aide d’un drap stérile chirurgical.
  14. Injecter la buprénorphine (1 mg/Kg) sous-cutanée (S/C).
  15. Effectuer une incision dorsale médiale longitudinale à l’aide d’un scalpel (lame #21).
  16. Effectuer une ovariectomie bilatérale, utiliser une approche dorsale.
    1. Libérer le tissu conjonctif sous-cutané par dissection par clivage à l’aide des ciseaux.
    2. Pincez le fascia latéralement pour la marque de la ligne médiane une incision et atteindre la cavité péritonéale à l’aide des ciseaux pointus.
    3. Prenez la grosse garniture ovarien et l’ovaire doucement avec des pincettes et tirez-la hors de la cavité abdominale.
    4. Saisir l’ovaire et les coussinets adipeux avec une pince vasculaire.
    5. Ligaturer l’ovaire et la garniture à l’aide d’une suture résorbable de monofilament de 4/0 à la base de l’ovaire, distale de la trompe de Fallope.
    6. Clip l’ovaire distale à la cravate. Assurez-vous qu’il n’y a pas de saignement de la base du moignon.
    7. Replacez le tissu intérieur de la cavité abdominale et la suture de l’aponévrose à l’aide d’une suture résorbable tressée 6/0.
    8. Répétez les étapes 7.15.1-7.15.7 sur le côté controlatéral.
  17. Conjointement une transplantation du tissu ovarien.
    1. Effectuer une incision horizontale dans le fascia ci-dessus le Gluteus Maximus, à la longueur qui correspond à la dimension de la formation de caillots. Créer une poche au sein de cet espace virtuel en ouvrant les ciseaux sous le fascia.
    2. Ramasser un morceau de tissu cortical encapsulé, tel qu’établi à l’étape 6.4.8 et placez-le dans cette poche.
    3. Suture de l’aponévrose avec un 6/0 tressé résorbable.
  18. Répétez les étapes 7.16.1-7.16.3 sur le côté controlatéral ainsi.
  19. Proche de la paroi dorsale à l’aide de points interrompus simples avec une suture résorbable de monofilament de 4/0.
  20. Injection de lidocaïne 0,5 % (1,2 mL/Kg) S/C sur le site d’incision.
  21. Utilisez une préparation d’alcool stérile pour nettoyer la peau.
  22. Désactiver l’isoflurane tout en contrôlant la température de la souris.
  23. Prévoir 1-2 min d’O2, sans l’Isoflurane. Garder le réchauffement sur la souris jusqu'à ce qu’il commence à se déplacer et de retour à la conscience.
  24. Placez la souris dans une cage propre rétablissement et plus tard la maison la souris dans une cage séparée jusqu'à la guérison complète de la plaie opératoire.
  25. Injecter la buprénorphine (1 mg/Kg) S/C au besoin toutes les 8-12 h, 24 h après l’opération.
  26. Gardez les souris dans des cages séparées lorsque tous les aliments, eau, literie et cages sont stérilisés à l’autoclave, jusqu’au point de fin de l’expérience. Garder les cages dans une pièce aérée et sous pression. Utiliser les équipements de protection individuelle toute manipulation des souris.

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Representative Results

Pour déterminer si la transplantation Co de ExECs fournit un avantage pour les tissus malades, bandes corticales ovariennes décongelés ont été divisés en morceaux de taille égale et implantés bilatéral en immuno-déprimées, de gamma NOD scid (NSG), souris. Avec un côté intégré dans un seul caillot de fibrine (aucun ECs) et les autres ExECs contenant (Figure 1 a), chaque souris a servi son propre témoin. ExECs ont été obtenus par l’isolement de l’endothélium primaire de humaine de cordons ombilicaux et traitement subséquent avec fragment de gène adénoviral E4-ORF1, comme précédemment décrit22,23. Au sein des passages 2-5, ECs de veine ombilicale humaine (hUVEC) ont été traités avec des Particules Lentivirales qui encodent l’expression constitutive ADNc codant le fragment de gène adénoviral E4-ORF1. Ce traitement améliore la survie et le potentiel angiogénique de l’endothélium décrite précédemment22,23. Après deux semaines, fonctionnellement perfusés navires ont été formés à partir d’exECs GFP-étiqueté à l’interface des tissus de l’hôte et du greffon (Figure 1 b). Afin d’étiqueter les vaisseaux sanguins fonctionnelles, les souris ont été injectées avec lectine de 100 mL (0,5 mg/mL) sous anesthésie isoflurane 10 minutes avant leur récolte le tissu. Quantification des follicules à 2 semaines suivante transplantation a démontré un avantage significatif au follicule relative compter dans les greffons assistée par ExECs qui était clairement évident à deux semaines (Figure 1C). ECs exogènes forment de vaisseaux fonctionnels lorsque co transplantés avec tissu ovarien (Figure 1 b) et des pièces corticales transplantés conjointement avec la souris ou humaine ExECs ont augmenté le nombre de follicules survivants par rapport aux greffes de contrôle (Figure 1C ). Cet avantage était lié à la zone fibreuse une diminution dans les greffons ExECs assistée (Figure 1D) — de chaque greffon transplanté, 3 sections ont été colorées avec Trichrome, un moyen établi de délimiter le tissu fibreux24, afin d’évaluer zone de fibrose : une section médiane et une section de profondeur 600 µm sur les côtés supérieures et inférieures de la prothèse. Sections colorées ont été numérisées et analysés par ImageJ pour quantifier la surface et la zone fibreuse a été manuellement décrites et quantifiée en pourcentage de la superficie de toute prothèse (logiciels ImageJ). Les valeurs finales ont été calculés pour chaque greffon comme la moyenne des 3 sections analysées. Ce qui est important, les greffes qui ont été transplantés conjointement avec les fibroblastes humains prépuce a montré viabilité des tissus pauvres et relativement peu de follicules. (Figure 1e).

Ensuite, nous avons évalué la fonction à long terme des greffes de tissu ovarien avec et sans ExECs (Figure 2 ad, f, h). Après 14 semaines, les souris ont été stimulés tous les jours avec ménotrophines pour des longueurs variables de temps avant que les animaux ont été sacrifiés, avec la progression de la croissance folliculaire surveillée dans deux souris par MRI (Figure 2 b-c). Follicules en voie de développement ont été relevées dans les témoins (Figure 2e) et assisté par ExECs greffes (Figure 2 g, i). Plus et plus grands follicules de tailles avaient été relevées dans les greffons ExECs assistée (Figure 2 g, j’ai). Par rapport aux follicules antraux provenant de tissus de la patiente même, stimulée avec ménotrophines amont et transplantées conjointement avec ExECs, la couche de cellules granuleuses dans le follicule plus avancé affiche une expression accrue des marqueurs ovulatoire CD4425 et HABP126, ainsi qu’a augmenté de mort cellulaire (Caspase) et réduit la prolifération (Ki67) (Figure 2j).

Plusieurs études ont montré que le pool de follicules est activé prématurément après greffe de tissu ovarien27,28,29,30. Nous avons observé une tendance similaire dans plusieurs greffons d’un seul patient à 2, 3 et 14 semaines (Figure 3 a). Pour capitaliser sur la fonction présumée de l’AMH en réprimant l’activation et/ou la croissance des follicules de17,31, nous avons conçu l’ExECs avec lentivirus à constitutivement express et fournissent ainsi une source directe de paracrine de sécréter AMH à transplantation de tissu ovarien (Figure 3 b). Transduction LENTIVIRAUX passé 100 fois GC ci-dessus dans ExEC qui, autrement, a exprimé des quantités indétectables de l’AMH. Des cellules de la granulosa cellules tumorales, sécrétée en revanche, un niveau basal d’AMH dans le surnageant de culture cellulaire. (Figure 3C). Deux semaines après la transplantation Co, dérivés de ExECs de navires ont été observés à l’interface hôte-greffon et immunostaining révélé protéine abondante d’AMH dans la lumière des vaisseaux dérivés de AMH-ExECs (Figure 3d) par rapport aux vaisseaux formés de contrôle ExECs. Afin de tester la fonction des AMH indépendamment de l’influence pro-angiogénique de ExECs, nous avons utilisé des cellules souches mésenchymateuses (CSM) qui ont été isolées à partir de fragments de la medulla ovarienne. Ces cellules étaient transduites avec Particules Lentivirales encodage AMH et élargis en culture destinés à la transplantation Co. Après transplantation Co avec AMH-ExECs, on a observé une augmentation de 2 fois la proportion des follicules primordiaux. Cela, cependant, conduit à une diminution du pourcentage des follicules primaires. AMH-MSCs entraîner une rétention accrue des follicules primordiaux par 10 fois par rapport au contrôle MSCs (Figure 3f, h). L’avantage le plus significatif à la rétention de la piscine repos folliculaire a été conféré par AMH-ECs lorsqu’une comparaison est faite entre MSCs, ExECs, non alvéolaires greffes (Ctl), AMH-MSCs ExEC et AMH-ExECs (Figure 3i).

Figure 1
Figure 1 : co transplantation d’ovaires bandes corticales avec ExECs améliore la viabilité et préserve la piscine folliculaire. (a) schéma du plan expérimental. Tissu ovarien humain congelé-décongelé était renfermé dans un caillot de fibrine, avec ou sans ExECs. Les caillots ont été transplantées chez souris NSG et récoltés à la fin de l’expérience. (b) des greffes corticales humains transplantés conjointement avec dérivés hUVEC ExECs (verts) ; globules rouges sont étiquetés par TER-119 et limites de la prothèse sont énoncées en blanc. (c) le pourcentage médian de follicules totales de transplantation avec et sans la souris ou les exECs humaines + les MAD. * P < 0,05. (d) le pourcentage médian de la zone fibreuse de transplantation avec et sans la souris ou humaine ExECs + MAD. ** P < 0,001. sections représentante (e) des greffes ovariens transplantés conjointement avec ExECs, sans cellules et les fibroblastes humains prépuce. Ce chiffre a été modifié par l’homme et al. SCI REP 2017 15 Aug ; 1:8203. doi : 10.1038/s41598-017-08491-z. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : la viabilité à long terme et la fonction des greffes de tissus ovariens sont améliorées par exECs. Dans h, c, d, f et b chiffres les greffons sur la gauche sont l’ECs contrôle-pas, tandis que du côté droit les greffons transplantés conjointement avec ExECs. (a) système expérimental pour les xénogreffes à long terme du tissu cortical ovarien. (b) dans les figures b et c, l’astérisque (à droite) représente les tissus ovariens transplantés conjointement avec ECs, tandis que la pointe de flèche (à gauche) représente les tissus ovariens transplantés avec aucune cellule. Souris #1 a été initialement avec les tissus d’un donneur ans 6 et surveillé par l’IRM au début de la stimulation (14 semaines, à gauche) et après dix jours de stimulation (15,5 semaines, droite). (c) souris #3 a été initialement avec les tissus d’un donneur ans 19 et surveillé par l’IRM à 6 (20 semaines suivant la transplantation), 7 (21 w) et 8 (22 w) semaines après le début de la stimulation. (d) image macroscopique du tissu ovarien humain implantée récolté à 15,5 semaines souris #1, la prothèse sur le côté droit est la prothèse assistée par ExEC et un histologiques de la prothèse de contrôle est affichée dans (e). image macroscopique (f) des greffons, souris #2 a été sacrifié après 20 semaines et contrôle et assistée par exEC greffons ont été prélevés pour analyse histologique ; la prothèse assistée par ExEC est montrée dans (g). (h) image macroscopique des greffons en souris #3 qui a été sacrifié après 22 semaines, une analyse histologique de la prothèse assistée par ExEC est montrée dans (i). (j) Sections des greffons ExEC assistée de souris #2 et #3 de souris ont été colorées pour les marqueurs moléculaires et sont élargissent dans la case associée. Barreaux de l’échelle = 100 µm. Ce chiffre a été modifié par l’homme et al. SCI REP 2017 15 Aug ; 1:8203. doi : 10.1038/s41598-017-08491-z. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : ExECs conçus pour exprimer des AMH préserver une réserve folliculaire quiescente. (a) la proportion des follicules a été quantifiée pour plusieurs fragments de tissu ovarien chez le même patient qui ont été transplantés conjointement avec ECs pour des intervalles de longs et à court terme ; n = 3 a 2 semaines, n = 4 à 3 semaines et n = 2 à 14 semaines. (b) schéma du plan expérimental. Tissu ovarien humain congelé-décongelé était renfermé dans un caillot de fibrine, avec ExECs/MSCs transduites avec une particule des gènes DP, agissant comme un contrôle, ou ExECs/MSCs transduites avec une particule LENTIVIRAUX AMH-mCherry générant AMH-ECs/MSCs. Les caillots ont été transplantées chez souris NSG et récoltées à 2 semaines. (c) ExECs étaient transduites avec lentivirus encodage sécrétée AMH humaine ; surnageant de culture cellulaire de AMH-transduites exECs a été comparée à la lignée de COV-434 culture granulosa cellules tumorales et contrôle ExECs. fragments de tissu ovarien (d) deux semaines après la transplantation, qui ont été transplantés conjointement avec l’ECs (à gauche) ou AMH-ExECs (à droite) ont été colorées avec un anticorps spécifique pour la protéine de l’AMH. (e) la proportion relative des follicules dans les xénogreffes ont transplanté avec contrôle et AMH-ExECs a été quantifiée après 2 semaines (n = 6). (f) la proportion relative des follicules dans les xénogreffes ont transplanté avec contrôle et AMH-MSCs a été quantifiée après 2 semaines (n = 6). (g) la médiane + MAD de la proportion relative des follicules a été comparée dans les xénogreffes transplantés avec contrôle et AMH-transduites ExECs (n = 6) après 2 semaines. (h) la proportion relative médiane + folle des follicules a été comparée dans les xénogreffes transplantés avec contrôle et AMH-transduites MSCs (n = 6) après 2 semaines. (i) le pourcentage médian des follicules primordiaux observées par greffon dans les xénogreffes transplantés avec MSCs (n = 6), ExECs (n = 6), AMH-MSCs (n = 6) et AMH-ExECs (n = 6) a été comparée dans l’ensemble des conditions de contrôle (aucune cellule, n = 15). Empiècements en (ré) sont élargissent dans les cases vers la droite pour l’AMH-ExECs et à la peur pour Ctl ExECs ; lignes de trait rouge et bleu en (ré) décrivent des tissus ovariens de tissu et de la foule, respectivement. Barres d’erreur (c) représentent écart entre 3 répétitions. Barres d’erreur (un, g-i) représentent MAD entre le nombre de répétitions énumérés ou montré dans le graphique. Echelle = 100 µm (d). * P < 0,05, ** P < 0,005. Ce chiffre a été modifié par l’homme et al. SCI REP 2017 15 Aug ; 1:8203. doi : 10.1038/s41598-017-08491-z. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Solution Saccharose-BTS (préparé à l’étape 4.2.2) dans le μL DMSO dans μL
Saccharose-BTS avec 1 mol/L DMSO 2787 213
Saccharose-BTS avec 0,5 mol/L de DMSO 2894 106

Tableau 1 : Préparation de solutions de saccharose.

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Discussion

Nous démontrons que co transplantation d’exECs fournit un avantage important pour la viabilité des tissus ovariens et fonction après xénogreffe chez la souris. Normes relatives à l’application clinique des auto-transplantation de tissu ovarien pour la préservation de la fertilité n’ont pas été ensemble et les paramètres optimaux (taille, site de transplantation, durée de la prothèse, etc.) 32 , 33 , 34 pour la récupération assistée du pool folliculaire reste indéfini. Lorsque auto-greffe est effectuée, avasculaire greffe de tissu ovarien cortical décongelé est effectuée principalement dans des sites pelviens comme l’ovaire restant, fosse ovarienne ou large ligament35,36. Puisque aucune anastomose bout à bout ne se déroule, cette méthode de transplantation se traduit par une vague de perte de tissu ischémique et activation prématurée des follicules résidant au sein de la prothèse. Par conséquent, tandis que co transplantation avec exECs implique livraison des cellules endothéliales proliférantes nécessitant beaucoup un examen approfondi avant d’être envisager pour l’application clinique, cette approche peut accélérer la revascularisation du tissu et peut sauver une robuste proportion des follicules dans les ovaires greffes.

Ces résultats mis en avant une stratégie novatrice de basés sur les cellules vasculaire pour optimiser la viabilité des tissus ovariens et fonction suite à une transplantation. Compte tenu du bassin grandissant de patients optant pour cryoconservé tissu ovarien et appels récents à la transplantation de tissus ovariens de passer du statut expérimental d’ouvrir l’application clinique37,38, cette méthode peut offrir une thérapeutique stratégie qui permet une plus grande viabilité des greffons, réduisant ainsi le nombre de bandes de corticales ovariennes qui doit être transplanté et augmenter leur longévité et/ou de la fonction.

Recrutement prématuré, ou « épuisement professionnel », a également été associée à l’épuisement du pool folliculaire au cours de la chimiothérapie39, mais aussi suivant la transplantation auto de tissu ovarien34. De nombreuses études ont identifié les voies de signalisation qui fonctionnent pour activer de réprimer les mobilisation folliculaire et la perturbation de la fonction de cette réglementation peut se traduire par une activation massive du pool folliculaire pendant une fenêtre de l’ischémie critique lorsque la besoins métaboliques des follicules naissantes ne peuvent être satisfaites. Application d’exECs dans ce contexte n’accélérerait pas seulement la reperfusion, mais en raison de leur potentiel de greffe, exECs peuvent également être conçues pour fournir un approvisionnement direct paracrine facteurs que la mobilisation folliculaire directe. La notion d’utiliser AMH comme modulateur de la croissance folliculaire a été appliquée par d’autres groupes aussi bien. Kano et al. AMH livré par l’intermédiaire de deux pompes osmotiques contenant la protéine recombinante ou injection Intrapéritonéale de particules virales40. Ces approches une tendance similaire dans la rétention des follicules primordiaux, mais la livraison est systémique. Comme alternative, exECs sécrétant AMH fournissent une source locale et soutenue de l’AMH, cependant, l’incorporation des cellules vasculaires machinés dans les greffes de tissus ovariens est limitée par myriades risques associés à des thérapies basées sur les cellules. Réponse immunitaire aux antigènes étrangers sur exECs est possible et l’utilisation de cellules prolifératives soulève la possibilité des cellules circulantes, d’implantation et de stimuler la croissance néoplasique ailleurs dans le corps. Bien que ces limitations empêchent la traduction de cette approche pour les patients actuels qui doivent subir une auto, ces expériences étayer le potentiel pro-angiogénique influences et de la répression de la mobilisation folliculaire prématurée pour augmenter la sortie de tissu ovarien greffes et établir un modèle de xénogreffe robuste pour l’étude mécanistique de la physiologie ovarienne humaine.

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Disclosures

Michael Ginsberg est un employé de Angiocrine Biosciences, Inc., San Diego, CA, 92130, aux États-Unis, qui isolé, transfectées avec E4-ORF-1 et étiqueté les cellules endothéliales, que nous avons utilisé.

Acknowledgments

Omar Alexander Man pour les illustrations.
L.M. a été soutenue par une bourse de pilote de la clinique de Cornell et de subvention de recherche translationnelle Science Center et l’ASRM.
Les auteurs tiennent à remercier James lab membres pour une lecture critique du manuscrit.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Leibovitz’s L-15 medium Gibco 11415064
Antibiotic-Antimycotic Gibco 15240062 Anti-Anti X100
Sucrose Sigma S 1888
Fibrinogen Sigma F 8630 from bovine plasma
Thrombin Sigma T 1063 from human plasma
DMSO Sigma D 2650
DMEM Gibco 12491015
Enzyme Cell Detachment Medium Invitrogen 00-4555-56 Accutase
Plastic paraffin film Bemis NA Parafilm M
Surgical paper tape 2.5 cm 3M 1530-1 Micropore
Surgical Paper tape 1.25 cm 3M 1530-0 Micropore
Perforated plastic Surgical tape 1.25 cm 3M 1527-0 Transpore
Monofilament Absorbable Suture Covidien UM-203 Biosyn
Braided Absorbable Suture Covidien GL-889 Polysorb
Povidone-iodine Solution USP 10% Purdue Products 67618-153-01 Betadine Solution Swab Stick
Cryoviales Nunc 377267 CryoTube
sterile ocular lubricant Dechra 17033-211-38 Puralube
1.7 ml micro-centrifuge tube Denville C-2172 Eppendorf
Anasthesia system VetEquip V-1 table top system with scavenging
Endothelial cells Angiocrine Biosciences, Inc., San Diego, CA, USA Isolated, transfected with E4-ORF- 1 and labeled endothelial cells
Trichrome stain Sigma HT15-1kt Trichrome Stain (Masson) Kit
Isolectin Invitrogen I32450 isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor™ 647 Conjugate

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Numéro 135 préservation de la fertilité cryopréservation de tissu ovarien bio-ingénierie auto-transplantation d’ovaire co transplantation les cellules endothéliales exogènes (exECs) revascularisation mobilisation folliculaire prématurée anti-Müller hormone (AMH)
Co transplantation de tissu ovarien humain avec des cellules endothéliales ingénieries : une combinaison de stratégie basés sur les cellules accéléré la Perfusion avec livraison directe Paracrine
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Man, L., Park, L., Bodine, R., Ginsberg, M., Zaninovic, N., Schattman, G., Schwartz, R. E., Rosenwaks, Z., James, D. Co-transplantation of Human Ovarian Tissue with Engineered Endothelial Cells: A Cell-based Strategy Combining Accelerated Perfusion with Direct Paracrine Delivery. J. Vis. Exp. (135), e57472, doi:10.3791/57472 (2018).

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