Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Bioengineering

Co transplantasjon av menneskelig Ovarian vev med konstruert endotelceller: en celle-basert strategi kombinere akselerert perfusjon med direkte Paracrine levering

doi: 10.3791/57472 Published: May 16, 2018

Summary

For noen pasienter er det eneste alternativet for fertilitet bevaring kryonisk bevaring av eggstokkene vev. Dessverre, forsinket revaskularisering undergraver follikulær levedyktighet. Her presenterer vi en protokoll for co transplantasjon menneskelig ovarian vev med endotelceller for utnyttelse som cellen-basert strategi kombinere akselerert perfusjon med en direkte paracrine levering av bioaktive molekyler.

Abstract

Infertilitet er en hyppig bivirkning av kjemoterapi og/eller strålebehandling og for noen pasienter, kryonisk bevaring av oocytes eller embryoer er ikke et alternativ. Som et alternativ, et økende antall disse pasientene velger å cryopreserve ovarian vev for autograft etter utvinning og tilgivelse. Til tross for forbedringer i resultatene blant pasienter som gjennomgår auto-transplantasjon av cryopreserved ovarian vev, fortsatt effektiv revaskularisering av podet vev en stor utfordring. Å redusere iskemi og dermed bedre resultater i pasienter som gjennomgår auto-transplantasjon, utviklet vi en vaskulær cellen-basert strategi for akselererende perfusjon av eggstokkene vev. Vi beskriver en metode for co transplantasjon av eksogene endotelceller (ExECs) med cryopreserved ovarian vev i en mus xenograft modell. Vi utvider denne tilnærmingen å ansette ExECs som har blitt utviklet for å uttrykke constitutively Anti-Mullerian hormon (AMH), dermed muliggjør vedvarende paracrine signalering innspill til eggstokkene grafts. Co transplantasjon med ExECs økt follikulær volum og forbedret Boas hårsekken utvikling, og AMH-uttrykke ExECs forfremmet oppbevaring av quiescent primordial follikler. Denne kombinerte strategi kan være et nyttig verktøy for begrensende iskemi og modulerende follikulær aktivisering i sammenheng fertilitet bevaring og/eller infertilitet generelt.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Kreft er fortsatt blant de viktigste årsakene til dødsfall i den industrialiserte verden, men tiår med forskning har gitt vesentlig fremgang for de fleste typer kreft, og i noen tilfeller nesten doblet overlevelse priser1. Dessverre er chemotherapeutic agenter ofte gonadotoxic, tappe reserve av primordial follicles i eggstokkene og reduserer fruktbarheten2. Denne voksende befolkningen kan ha nytte av ulike metoder for fertilitet bevaring inkludert oocyte og/eller embryoet kryonisk bevaring, men pasienter som krever rask oppstart av kreft terapi og pre pubertale pasienter er kvalifisert for disse alternativene. Som et alternativ, har noen pasienter valgt å cryopreserve ovarian vev før foretaket kaloriforbrenning terapeutiske og utvinning og remisjon, auto-transplanting vev gjenopprette fruktbarhet3. Likevel, hittil pode overlevelse og follikulær utdataene etter auto-transplantasjon fortsatt relativt lav4, hovedsakelig på grunn av vev iskemi og hypoksi5,6,7. Til tross for utallige forsøk på å forbedre levedyktigheten til eggstokkene kortikale grafts bruker antioksidanter8,9, pro-angiogenic cytokiner10,11,12,1 3eller mekanisk manipulasjoner14, pode iskemi i en 5 til 7 dagers vinduet etter transplantasjon undergraver levedyktighet og overlevelse av pode7. For å løse dette, utviklet vi en cellen-basert strategi for å lette anastomose av verten og pode fartøy og dermed fremskynde reperfusion av eggstokkene vev.

I tillegg til iskemiske fornærmelse mot podet ovarian vev i vinduet etter transplantasjon, kan avbrudd i Inter follikulær signalering bidra til uttømming av bassenget15,16. Fordi eksogene endotelceller (ExECs) bidra til stabile og fungerende fartøy i utkanten av graftet, presenterer de en unik mulighet til å formidle en definert molekylær inngang til transplanterte vev. Som et bevis på prinsippet, var ExECs konstruert å uttrykke super fysiologiske nivåer av Anti-Mullerian hormon (AMH), medlem av transformere vekstfaktor beta (TGFβ) gruppe som har vist seg å begrense follikulær vekst17. Sammenligning av follikulær distribusjon i grafts co transplantert med kontroll og AMH-uttrykke celler bekrefter biological aktivitet og styrken på utvikling exECs.

I sammendraget, kan ved å forbedre pode levedyktighet og undertrykke tidlig mobilisering av follikulær bassenget, denne tilnærmingen øke produktiviteten til auto-transplanted ovarian vev i pasienter som gjennomgår fertilitet bevaring. Videre kan den ExEC-basert plattformen eksperimentelle avhør av molekylære regulatorer som har vært innblandet i follikulær utvikling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle prosedyrer som involverer dyr fag er godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) på Weill Cornell Medical College. Alle xenotransplantation eksperimenter ved hjelp av eggstokkene vev ble utført i samsvar med relevante retningslinjer og regler. Menneskelig ovarian vev ble samlet inn fra pasienter planlagt for kjemoterapi eller strålebehandling for kreftbehandling eller tidligere benmarg transplantasjon. Institusjonelle review board (IRB) komiteen av Weill Cornell Medical College godkjent samlingen av vev for potensielle autologous bruk og pasientens samtykke en donasjon på opptil 10% av eggstokkene vev til forskningsbruk ble utført.

1. innsamling av menneskelig Ovarian vev

Merk: Når en ovarian vev transporteres fra en ekstern anlegget transitt, tid bør ikke overstige 5 h18,19.

  1. Samle ovarian vevet og skyll med et sterilt saltvann.
  2. Plass eggstokken i en sterile containeren.
  3. Hell Leibovitz's L-15 medium til eggstokken er helt nedsenket i medium.
  4. Lukk og sel beholderen.
  5. Transport beholderen på is.

2. behandling anskaffet Ovarian vevet, tilpasset fra Schmidt et al. 18

  1. Forberedelser for eggstokkreft behandling og frysing
    1. Forberede 100 mL medium for behandling: Leibovitz's L-15 middels 99 mL + 1 mL antibiotika-antimycotic løsning. Filtrere media med 0,2 µm filter. Holde mediet kjøling.
    2. Forberede 100 mL frysing løsning med DMSO som en cryo-protectant. Legg 69.64 mL Leibovitz L-15 middels, 17.66 mL fosterets bovin serum (FBS), 3,42 g av sukrose (for å opprette en siste konsentrasjon av 0.1 mol/L), 10.65 mL DMSO (for å opprette en siste konsentrasjon på 1,5 mol/L) og 1 mL antibiotika-antimycotic løsning. Filtrere mediet bruker en 150 mL filter enhet, 0,2 µm. Store middels på 4 ° C.
    3. Sterilisere kirurgiske verktøy bruker en autoklav programmert for en innpakket tørrstoff sterilisering syklus.
  2. Ved ankomst av vev
    1. Angi sterilt kirurgiske verktøy i fravær av smittefarlige stoffer skap: skalpell blad nummer 21, skarp fint buet saks og tang på varierte størrelser: lang (150 mm lengde) og 2 middels (ca 110 mm lengde).
    2. Bruk sterilt hansker, åpne beholderen i biosikkerhet kabinett. Ta eggstokken og plasserer den i en 150 mm Petriskål og hell kald medium forberedt i trinn 2.1.1 på toppen av eggstokkene å hindre dehydrering av eggstokkene vev.
    3. Isolere eggstokken fra eventuelle gjenværende vev og skyll den med kaldt medium til det er blottet for vev og blod.
    4. Sted eggstokken i en ren 150 mm Petriskål, Legg kaldt medium, forberedt i trinn 2.1.1 til eggstokken er halvt neddykket i den.
  3. Disseksjon av eggstokkene vev
    1. Halvere eggstokken og fjerne medulla først ved skarpe disseksjon, med buet fine saks. Deretter skrape margen, sterile skalpell med et blad nummer 21. Foran til kortikale vevet er 1-1,5 mm tykkelse.
    2. Skjær kortikale vevet i trykte lunter av 2-3 mm i bredden, blir lengden på stripen hele lengden av eggstokkene brikken som ble behandlet.

3. ovarian vev treg frysing, tilpasset fra Newton et al. og Oktay et al. 6 , 20

  1. Forberedelse for frysing
    1. Etiketten cryovials (1,8 mL).
    2. Legge til 1,5 mL av frysing løsningen forberedt i trinn 2.1.2 til hvert hetteglass.
    3. Overføre en kortikale stripe per kryogene medisinglass med frysing løsningen.
    4. Equilibrate kortikale stripen for 20 min på en roterende plate, gjelder milde agitasjon på 4 ° C.
  2. Treg frysing av eggstokkene vev
    1. Legg til cryovials i en programmerbar planer fryser starter på 0 ° C.
    2. Avkjøle for 2 ° C/min å-7 ° C.
    3. Hold vev på dette konstant temperatur på 10 min.
    4. Utføre manuell seeding for is krystall nucleation induksjon, ved å berøre hver cryovial med bomull tips i flytende nitrogen (LN2).
    5. Fortsette avkjøles på 0,3 ° C/min før eksempel temperaturen når 40 ° C.
    6. Cool raskere på 10 ° C/min til-140 ° C.
    7. Overføre cryovials til dewar for lagring i LN2 (-196 ° C).

4. forberedelser for operasjoner (bilaterale Oophorectomy og co transplantasjon)

  1. Utarbeidelse av plater
    1. En dag før tining ovarian vev for transplantasjon
      1. Legg et stykke en plast parafin film nederst på en 50 mm Petriskål, spray det med 70% etanol før det vil være helt dekket.
      2. La Petri retter over natten i fravær av smittefarlige stoffer skap. Forberede 2 Petri retter per musen.
    2. På dagen for kirurgi
      1. Sug opp etanol fra Petriskål inneholder plast parafin filmen i biosikkerhet kabinett.
      2. La Petriskål ledelsen halv åpen til etanol fordamper helt.
      3. Lukk lokket på Petriskål når plast parafin filmen er helt tørt. Holde det i fravær av smittefarlige stoffer skap.
      4. Etiketten brønner en 6 plate vel følgelig 0.1 mol/L sukrose + 1 mol/L DMSO, 0.1 mol/L sukrose + 0,5 mol/L DMSO, 0.1 mol/L sukrose, grunnleggende tining løsning (BTS), middels.
  2. Forberedelse av løsninger
    1. Forberede 100 mL BTS: Leibovitz's L-15 middels 79 mL + FBS 20 mL + antibiotika-Antimycotic løsning 1 mL. Filtrere med et 0.22 µm filtersystem.
    2. Forberede 10 mL av BTS med 0.1 mol/L sukrose. Skalere 0.342 g av sukrose og tilsett 10 mL av BTS i trinn 4.2.1, Agitate forsiktig til sukrose er fullstendig oppløst. Filtrere løsningen ved å benytte en sprøyte filter 0.22 µm.
    3. Forberede løsningene tabell 1. Dekk rør med DMSO med aluminiumsfolie. Oppbevares i kjøleskap før bruk.

5. ovarian vev rask tining

  1. Ta ut av LN2 dewar en ampullen inneholder frosset ovarian vev og holde det ved romtemperatur for 30 s.
  2. Tørk ampullen rengjøres med en papir.
  3. Fordype ampullen i et vannbad 30 ° C i 1-2 min til dens ' innhold er tint.
  4. Åpne ampullen og plasser kortikale stripen i den første brønnen som inneholder 3ml første løsning (0.1 mol/L sukrose + 1 mol/L DMSO forberedt i trinn 4.2.3).
    Merk: Alle foranstaltningene innvolvere åpning lokket på platen vil bli gjort under laminær strømning.
  5. Inkuber 6 godt plate på en roterende plate ved 4 ° C i 5 min. holde platen dekket med aluminiumsfolie for dette trinnet.
  6. Overføre kortikale stripen til de andre godt med 3 mL den andre løsningen (0.1 mol/L sukrose + 0,5 mol/L DMSO forberedt i trinn 4.2.3).
  7. Inkuber 6 godt plate på en roterende plate for mild agitasjon på 4 ° C for 5 min. holde platen dekket med aluminiumsfolie for dette trinnet.
  8. Overføre kortikale stripen i tredje brønnen, som inneholder 4 mL løsning (BTS med 0.1 mol/L sukrose, utarbeidet i trinn 4.2.2).
  9. Ruge på en roterende plate for mild agitasjon på 4 ° C i 5 min.
  10. Overføre kortikale stripen til den fjerde også inneholder 4 mL løsning (BTS, utarbeidet i trinn 4.2.1).
  11. Ruge på en roterende plate for mild agitasjon på 4 ° C i 5 min.
  12. Overføre kortikale stripen i det siste også inneholder 4 mL kaldt middels (forberedt i trinn 2.1.1). Holde tinte ovarian vev på is inntil utfører transplantasjon.

6. innkapsling av eggstokkene vev

  1. Klargjør følgende løsninger
    1. Forberede 25 mL av 20 mmol/L HEPES buffer i 0,9% saltløsning. Filtrere og lagre på 4 ° C.
    2. Forberede 1 mL av CaCl2 på konsentrasjonen av 1 mol/L. Filter og lagre på 4 ° C.
  2. Forberede en Fibrinogen 50 mg/mL lagerløsning
    1. Legge 1 g av Fibrinogen i 20 mL 20 mmol/L HEPES buffer i 0,9% saltløsning av sakte blande fibrinogen i HEPES bufret saline over flere timer på 37 ° C.
    2. Etiketten 1,7 mL mikro-sentrifuge rør.
    3. Filtrere løsningen gjennom filtere 0,45 µm sprøyten og deretter gjennom filtere 0,2 µm sprøyten.
    4. Aliquot løsningen til 200 µL mikro-sentrifuge rør og butikk på 20 ° C.
  3. Forberede en trombin 100 U/mL lagerløsning
    Merk: Trombin løsninger adsorberes til glass, aliquot løsningen i plast rør/hetteglass.
    1. Legge til 2,5 mL 0,9% sterilt saltvann 250 U av trombin.
    2. Mild riste inntil løsningen å løse.
    3. Etiketten 1,7 mL mikro-sentrifuge rør.
    4. Filtrere gjennom 0,2 µm sprøyte filter, aliquot 50 µL mikro-sentrifuge rør og butikk på-80 ° C.
  4. Gjøre en Fibrin blodpropp av 70 µL, skaffe en siste konsentrasjon av 10 mg/mL fibrinogen og 5 U/mL trombin
    Merk: Sørg for å jobbe raskt, løsningen blodpropp i noen sekunder. Også unngå tillegg av bobler til blanding.
    1. Klargjør en Fibrinogen løsning i en 1,7 mL mikro-sentrifuge rør.
      1. Legge til 360 µL av 20 mmol/L HEPES Buffer i 0,9% saltvann til den aliquoted 200 µL av Fibrinogen aksjen, utarbeidet i trinn 6.2.4.
      2. Bland ved mild pipettering.
      3. Hold det på is.
    2. Forberede en trombin løsning i et andre mikro-sentrifuge rør.
      1. Legg 148.7 µL av DMEM til den aliquoted 50 µL av trombin aksjen, utarbeidet i trinn 6.3.4.
      2. Bland ved mild pipettering.
      3. Legge til 1,3 µL av 1 mol/L CaCl2.
      4. Bland ved mild pipettering.
      5. Hold det på is.
    3. Forberede en enkeltcelle suspensjon i et tredje mikro-sentrifuge rør.
      1. Koble utviklet endotelceller fra platen bruker et enzym celle avdeling medium.
      2. Nedspinning den og telle celler ved hjelp av en hemocytometer med et cover glass.
      3. Bruke 20.000 celler per hver 1 mm2 av eggstokkene vev. Beregne 20.000 x området av eggstokkene vev i mm2.
      4. Nedspinning utviklet endotelceller og å stoppe den grunnleggende medium (DMEM) for å nå et samlet volum på 16,8 µL.
      5. Hold det på is.
    4. Legg et stykke ovarian vev på en sterilt gasbind svamp å tørke den i noen sekunder.
    5. Plass stykke ovarian vev på plast parafin filmen innen 50 mm Petriskål.
    6. Legg 39.2 µL av Fibrinogen løsningen, utarbeidet i trinn 6.4.1.2, til cellen suspensjon i trinn 6.4.3.4, blandingen av mild pipettering. Hold det på is.
    7. Legge til 14 µL av trombin løsningen i trinn 6.4.2.4. Bland forsiktig ved pipettering en gang. Arbeide raskt.
    8. Plasser blandingen på toppen av eggstokkene vevet, Pipetter i form av en langstrakt slippverktøy.
    9. Plass Petriskål med blodpropp i kuvøse på 37 ° C.

7. bilaterale Oophorectomy og co transplantasjon av menneskelig Ovarian vev med konstruert endotelceller til NSG mus

Merk: Ti til fjorten-uke-gamle kvinnelige NSG mus21 ble brukt (Jackson Labs).

  1. Forberede alle kirurgiske redskaper, som utdypet i trinn 2.1.3, kontroller at du har alle suturer, pads og kirurgisk bånd hendig.
  2. Bedøve musen bruker en bedøvelse system med Isoflurane.
    1. Plasserer musen i induksjon chamber, lukker lokket og åpne den aktuelle stopcock.
    2. Åpne flowmeter til 1000 mL/min. slå på vaporizer og sette den å levere 2-3,5%.
    3. Observere effekten av anesthesia; tap av bevissthet, langsom og vanlige åndedrag.
    4. Overføre til nesen kjegle å opprettholde anestesi. Slå vaporizer å levere 1-3%, avhengig av vitale.
    5. Kontroller fravær av pedal eller hale refleks. Hvis refleks, øke isoflurane til det er fraværende.
  3. Kutte musen er tilbake hår, fra halen til clavicles linjen, med en elektrisk hår trimmer.
  4. Plass musen i en utsatt posisjon på kirurgisk plattformen.
  5. Fastsette nesen kjegle kirurgisk plattformen på en kirurgisk tape.
  6. Tape musen er lemmer forsiktig til kirurgisk plattformen på en 1,25 cm brede kirurgisk papir tape.
  7. Bruk en steril smøremiddel gelé og sette inn et termometer PR. fastsette termometeret ved taping det kirurgiske plattformen på en 1,25 cm bred perforert plast kirurgisk tape.
  8. Tapen tail kirurgiske plattformen ved hjelp av en 2,5 cm brede kirurgisk papir tape.
  9. Varme, en infrarød eller varmt vann oppvarming pad, og dataskjerm musen er kroppstemperatur i hele denne prosedyren. Holde kroppstemperatur innen 35-37 ° C.
  10. Rengjør beskjæringsområdet med en bakteriefri povidon-jod løsning vattpinne pinne og tørk bruker sterilt alkohol prep.
  11. Gjenta trinn 6,9 to ganger mer.
  12. Plass en dråpe bakteriefri ocular smøremiddel vet salve over hver av musen er øynene å beskytte mot dehydrering og skade på hornhinnen.
  13. Dekk musen bruker en steril kirurgisk drapere.
  14. Injisere buprenorfin (1 mg/Kg) sub cutaneous (S/C).
  15. Utføre en langsgående mediale dorsal snitt ved hjelp av en skalpell (blad #21).
  16. Utføre bilaterale oophorectomy, bruke en dorsal tilnærming.
    1. Gratis subkutan connective vev av sløv disseksjon ved hjelp av saks.
    2. Knip fascia lateralt til midtlinjen gjør et snitt og nå bukhulen ved hjelp av skarp saks.
    3. Grab ovarian fett puten og eggstokken forsiktig med pinsett og trekk den ut av bukhulen.
    4. Forstå eggstokken og fett pad med en vaskulær klemme.
    5. Ligate eggstokken og fett pad med en 4/0 monofilament absorberbare Sutur ved foten av eggstokken, distale til egglederen.
    6. Klipp eggstokken distale å tie. Kontroller at det er ingen blødning fra bunnen av stump.
    7. Plasser vevet tilbake i bukhulen og Sutur fascia bruker en 6/0 flettet absorberbare Sutur.
    8. Gjenta trinn 7.15.1-7.15.7 på kontralateral side.
  17. Co transplantasjon ovarian vevet.
    1. Utføre en vannrett snitt i fascia over Gluteus Maximus, på lengden som passer clots dimensjonene. Opprette en lomme i denne virtuelle rom ved å åpne saksen under fascia.
    2. Plukke opp en del av innkapslede kortikale vev, som utarbeidet i trinn 6.4.8 og plasser den i denne lomme.
    3. Sutur fascia bruker 6/0 flettet absorberbare Sutur.
  18. Gjenta stadier 7.16.1-7.16.3 på kontralateral side også.
  19. Lukk dorsal veggen med enkel avbrutt masker med en 4/0 monofilament absorberbare Sutur.
  20. Injisere Lidocaine 0,5% (1,2 mL/Kg) S/C på webområdet snitt.
  21. Bruk en steril alkohol prep for å rengjøre huden.
  22. Slå av isoflurane mens overvåking musen er temperaturen.
  23. Gir 1-2 min O2, uten Isoflurane. Holder på oppvarming musen før det begynner å flytte og bevissthet.
  24. Plasser musen i ren utvinning bur og senere huset musen i separate bur til fullstendig helbredelse av kirurgiske såret.
  25. Injisere buprenorfin (1 mg/Kg) S/C behov hver 8-12 h, 24 h postoperatively.
  26. Hold musene inne separat burene når alle mat, vann, sengetøy og bur er autoklaveres, til sluttpunktet for eksperimentet. Holde merdene i en trykksatt ventilert rom. Bruke personlig verneutstyr når håndtere musene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

For å fastslå om co transplantasjon av ExECs gir en fordel til pasienter vev, var tinte ovarian kortikale strimler delt i like store stykker og engrafted bilateralt i immun kompromittert, hilsen scid gamma (NSG), mus. En side i en fibrin blodpropp alene (ingen ECs) og de andre inneholder ExECs (figur 1a), hver musen tjenestegjorde som sin egen kontroll. ExECs ble innhentet via isolering av primære endotelet fra menneskelige kontrollkabler og påfølgende behandling med Adenoviral gene fragment E4-ORF1, som beskrevet tidligere22,23. I avsnitt 2-5, menneskelige umbilical blodåre ECs (hUVEC) ble behandlet med lentiviral partikler som kode grunnleggende uttrykk cDNA koding adenoviral gene fragmentet E4-ORF1. Denne behandlingen forbedrer overlevelse og angiogenic potensialet i endotelet som tidligere beskrevet22,23. Etter to uker, ble funksjonelt perfused fartøyer dannet fra GFP-merket exECs på grensesnittet av vert vev og pode (figur 1b). For å merke funksjonelle blodkar, ble musene injisert med 100 mL Lektiner (0,5 mg/mL) under isoflurane anestesi 10 minutter før høsting vevet. Kvantifisering av hårsekkene to uker følgende transplantasjon viste en betydelig fordel for relativ hårsekken telle i ExECs-assistert grafts som var tydelig på to uker (figur 1 c). Eksogene ECs dannet funksjonelle fartøy når co transplantert med ovarian vev (figur 1b) og kortikale co transplantert med musen eller menneskelig ExECs økte antallet overlevende follikler i forhold til kontrollen grafts (figur 1 c ). Denne fordelen var knyttet til redusert fibrotiske området i ExECs-assistert grafts (figur 1 d) – fra hver enkelt graft, 3 deler var farget med Trichrome, en etablert metode for skildre fibrotiske vev24, å vurdere fibrotiske område: en midtre delen og en 600 µm dybde del fra de øvre og nedre sidene av graftet. Farget delene ble skannet og analysert ved hjelp av ImageJ for å kvantifisere areal og fibrotiske området ble manuelt skissert og kvantifisert som en prosent av hele pode området (ImageJ programvare). Sluttverdiene ble beregnet for hver pode som et gjennomsnitt av 3 deler analysert. Viktigere, grafts som var co transplantert med menneskelige foreskin fibroblaster viste dårlig vev levedyktighet og relativt få follikler. (Figur 1e).

Vi vurdert neste langsiktige funksjonen av eggstokkene vev grafts med og uten ExECs (figur 2ad, f, h). Etter 14 uker var mus stimulert daglig med menotropins for variable lengder før dyr ble ofret, med utviklingen av hårsekken vekst overvåkes i to mus via MRI (figur 2b-c). Utvikle follikler ble bemerket i både kontroll (figur 2e) og ExECs-assistert grafts (figur 2 g, jeg). Flere og større størrelse follikler ble merket i ExECs-assistert graftene (figur 2 g, jeg). Sammenlignet med Boas follikler avledet fra samme pasientens vev, stimulert med menotropins og co transplantert med ExECs, granulosa celle laget i mer avanserte hårsekken vises økt uttrykk av eggløsning markører CD4425 og HABP126, så vel som økt celledød (Caspase), og redusert spredning (Ki67) (figur 2j).

Flere studier har vist at utvalget av hårsekkene aktiveres for tidlig etter pode ovarian vev27,28,29,30. Observerte vi en lignende trend i flere grafts fra en enkelt pasient på 2, 3 og 14 uker (figur 3a). For å kapitalisere på antatte funksjon AMH i repressing utløsning eller vekst av hårsekkene17,31, vi utviklet ExECs med lentivirus constitutively express og dermed gi en direkte paracrine kilde til skiller AMH til transplantert ovarian vev (figur 3b). Lentiviral signaltransduksjon økt 100-fold over GC i ExEC som ellers uttrykt undetectable mengder AMH. Granulosa celler kreftceller, derimot, skilles ut en basal nivå av AMH i cellekultur supernatant. (Figur 3 c). To uker etter co transplantasjon, fartøy avledet fra ExECs ble observert på verten-graftet grensesnittet og immunostaining avslørt rikelig AMH protein i lumen av avledet fra AMH-ExECs (figur 3d) i forhold til skip fra kontrollere ExECs. For å teste funksjonen av AMH uavhengig av pro-angiogenic påvirkning av ExECs, brukt vi mesenchymal stamceller (MSC) som ble isolert fra fragmenter av eggstokkene margen. Disse cellene var transduced med lentiviral partikler koding AMH og utvidet i kultur for bruk i co transplantasjon. På co transplantasjon med AMH-ExECs, ble en 2-fold økning observert i forhold til opprinnelige follikler. Dette fører imidlertid til en nedgang i andelen primære follikler. AMH-MSCs føre til økt oppbevaring av primordial follicles av 10 ganger i forhold til kontrollen MSCs (figur 3f, h). Den viktigste fordelen for oppbevaring av quiescent follikulær bassenget var gitt av AMH-ECs når en sammenligning ble laget mellom MSCs, ExECs, ikke-mobilnettet grafts (Ctl), AMH-MSCs ExEC og AMH-ExECs (figur 3i).

Figure 1
Figur 1: co transplantasjon av eggstokkene kortikale strips med ExECs forbedrer levedyktighet og bevarer follikulær bassenget. (a) ordningen av eksperimentell design. Frosset-tint menneskelig ovarian vev var innkapslet i en fibrin blodpropp, med eller uten ExECs. Clots transplantert inn i oophorectomized NSG mus og høstes ved endepunktet for eksperimentet. (b) Human kortikale grafter transplantert co med hUVEC-avledet ExECs (grønn); røde blodlegemer merket av TER-119 og grensene av graftet er skissert i hvitt. (c) median andelen totale follikler fra transplantasjon med og uten mus eller menneskelig exECs + MAD. * P < 0,05. (d) median prosentandelen av fibrotiske området fra transplantasjon med og uten mus eller menneskelig ExECs + MAD. ** P < 0,001. (e) representant deler av eggstokkene grafter transplantert co ExECs, uten celler, og med menneskelige foreskin fibroblaster. Dette tallet har blitt endret fra mann et al. Sci rep 2017 15 august; 7 (1): 8203. Doi: 10.1038/s41598-017-08491-z. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: langsiktig levedyktighet og funksjon av eggstokkene vev grafts er forbedret ved exECs. I tall b, c, d, f og h er graftene til venstre kontroll-ingen ECs, mens høyre graftene co transplantert med ExECs. (a) eksperimentelle skjemaet for langsiktig xenograft av eggstokkene kortikale vev. (b) i tall b og c, stjernen (høyre side) representerer ovarian vevet co transplantert med ECs, mens pilspissen (venstre side) representerer ovarian vevet transplantert med noen celler. Musen #1 var xenografted med vev fra 6 år gamle giver og overvåket av Mr ved utbruddet av stimulering (14 uker, venstre) og igjen etter ti dager med stimulering (15.5 uker, høyre). (c) musen #3 var xenografted med vev fra 19 år gamle giver og overvåket av Mr 6 (20 uker etter transplantasjon), 7 (21 m), og 8 (22 w) uker etter utbruddet av stimulering. (d) makroskopisk bildet av engrafted menneskelige ovarian vev høstes ved 15.5 uker musen #1, graftet til høyre er ExEC-assistert graftet histologiske utsikt over kontrollen graftet vises i (e). (f) makroskopisk bilde av graftene, musen #2 ble ofret etter 20 uker og kontroll og exEC-assistert grafts ble høstet for histologiske analyse; ExEC-assistert graftet vises i (g). (h) makroskopisk bildet av graftene i mus #3 som ble ofret etter 22 uker, histologiske analyse av ExEC-assistert graftet vises i (i). (j) deler av ExEC-assistert graftene fra musen #2 og mus #3 var farget for molekylære markører og blir forstørret i boksen tilknyttet. Skalere barer = 100 µm. Dette tallet har blitt endret fra mann et al. Sci rep 2017 15 august; 7 (1): 8203. Doi: 10.1038/s41598-017-08491-z. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: ExECs konstruert for å uttrykke AMH bevare en quiescent follikulær pool. (a) andelen av hårsekkene ble kvantifisert for flere ovarian vev fragmenter fra samme pasient som var co transplantert med ECs for lang- og kortsiktige intervaller; n = 3 to uker, n = 4 i 3 uker og n = 2 på 14 uker. (b) ordningen eksperimentell design. Frosset-tint menneskelig ovarian vev var innkapslet i en fibrin blodpropp, ExECs/MSCs transduced med en RFP lentiviral partikkel som en kontroll, eller ExECs/MSCs transduced med en AMH-mCherry lentiviral partikkel generere AMH-ECs/MSCs. Clots ble transplantert inn i oophorectomized NSG mus og høstet to uker. (c) ExECs var transduced med lentivirus koding utskilles menneskelige AMH; celle kultur nedbryting av AMH-transduced exECs var sammenlignet COV-434 kultur granulosa celle tumor linje og kontroll ExECs. (d) to uker etter transplantasjon, ovarian vev fragmenter som ble co transplantert med enten ECs (venstre) eller AMH-ExECs (høyre) var farget med et antistoff bestemt AMH protein. (e) var den relative andelen follikler i xenografts co transplantert med kontroll og AMH-ExECs kvantifisert etter 2 uker (n = 6). (f) var den relative andelen follikler i xenografts co transplantert med kontroll og AMH-MSCs kvantifisert etter 2 uker (n = 6). (g) det median + MAD av den relative andelen follikler ble sammenlignet i xenografts transplantert med kontroll og AMH-transduced ExECs (n = 6) etter 2 uker. (h) median + gal relative andel av hårsekkene ble sammenlignet xenografts transplantert med kontroll og AMH-transduced MSCs (n = 6) etter 2 uker. (i) median andelen observert primordial follikler per pode i xenografts transplantert med MSCs (n = 6), ExECs (n = 6), AMH-MSCs (n = 6), og AMH-ExECs (n = 6) ble sammenlignet samlet kontroll forhold (ingen celler, n = 15). Insets i (d) er forstørret i boksene til høyre for AMH-ExECs og til den lest for sertifikatklareringslisten ExECs; rød og blå strek linjer i (d) skissere ovarian vev og vert vev, henholdsvis. Feilfelt c representerer standard avvik mellom 3 gjentak. Feilfelt i (a, g-i) representerer MAD mellom antall gjentak vises eller vises i diagrammet. Skala bar = 100 µm (d). * P < 0,05, ** P < 0.005. Dette tallet har blitt endret fra mann et al. Sci rep 2017 15 august; 7 (1): 8203. Doi: 10.1038/s41598-017-08491-z. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Løsning Sukrose-BTS (forberedt i trinn 4.2.2) i μL DMSO i μL
Sukrose-BTS med 1 mol/L DMSO 2787 213
Sukrose-BTS med 0,5 mol/L DMSO 2894 106

Tabell 1: Sukrose løsning forberedelse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Her viser vi at co transplantasjon av exECs gir en betydelig fordel for eggstokkreft vev levedyktighet og funksjon etter xenograft i mus. Standarder for klinisk anvendelse av eggstokkene vev auto-transplantasjon for fertilitet bevaring er ikke sett og optimale parametere (størrelse, transplantasjon område, varigheten av pode, etc.) 32 , 33 , 34 for økt utvinning av follikulær fortsatt udefinert. Når auto-transplantasjon er utført, utføres avascular pode av tinte kortikale ovarian vev i bekken nettsteder som gjenværende eggstokk, ovarian fossa eller bred ligament35,36. Siden ingen ende-til-ende anastomose foregår, resulterer denne transplantasjon metoden i en bølge av iskemiske vevet tap og tidlig aktivering av hårsekkene bosatt graftet. Derfor, mens co transplantasjon med exECs innebærer levering av proliferativ endotelceller som krever mye videre granskning før som vurderer for klinisk anvendelse, denne tilnærmingen kan fremskynde vev revaskularisering og kan redde en robust andel av hårsekkene i eggstokkene grafts.

Disse funnene fremsatt en ny vaskulær cellen-basert strategi for å optimalisere ovarian vev levedyktighet og funksjon etter transplantasjon. Gitt den økende pool av pasienter velger cryopreserve ovarian vev og anropslogg for eggstokkreft vev transplantasjon flytte fra eksperimentelle status åpne klinisk anvendelse37,38, kan denne metoden tilby en terapeutisk strategi som muliggjør større levedyktighet av grafts, og dermed redusere antall ovarian kortikale strimler som må være transplantert og øke sin levetid og/eller funksjon.

Tidlig rekruttering, eller "burnout", har også vært knyttet til uttømming av follikulær bassenget under kjemoterapi39, samt følgende auto transplantasjon av eggstokkene vev34. Tallrike studier har identifisert signalveier som funksjon å aktivere av undertrykke follikulær mobilisering og avbrudd i regulatoriske funksjonen kan føre til en masse aktivering av follikulær bassenget under en kritisk iskemiske vindu når den metabolske behov begynnende follikler er ikke kan oppfylles. Anvendelse av exECs i denne sammenheng ville ikke bare akselerere reperfusion, men på grunn av deres engraftment potensielle, exECs kan også være utviklet for å gi en direkte paracrine tilførsel av faktorer som direkte follikulær mobilisering. Begrepet utnytte AMH som en modulator follikulær vekst har blitt brukt av andre grupper. Kano et al. leverte AMH via enten osmotisk pumper som inneholder rekombinante proteiner eller IP injeksjon av virus partikler40. Disse tilnærmingene resulterte i en lignende trend i oppbevaring av primordial follikler, men leveringen var systemiske. Alternativt exECs sekresjon AMH gi en lokal og vedvarende kilde til AMH, men inkorporering av konstruert vaskulære celler i eggstokkene vev grafts er begrenset av utallige risikoen forbundet med cellen-basert behandling. Immunrespons mot utenlandske antigener i exECs er mulig bruk av proliferativ celler øker muligheten for cellene sirkulerer, implanting og fremme neoplastic vekst ellers i kroppen. Mens disse begrensningene utelukke oversettelse av denne tilnærmingen for gjeldende pasienter som gjennomgår auto-transplantasjon, underbygge disse eksperimentene potensialet for pro-angiogenic innflytelse og undertrykkelse av tidlig follikulær mobilisering øke resultatet av eggstokkene vev graft og etablere en robust xenograft modell for mekanistisk studiet av menneskelig ovarian fysiologi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Michael Ginsberg er ansatt i Angiocrine Biosciences, Inc., San Diego, CA, 92130, USA, som isolert, transfekterte med E4-ORF-1 og merkes endotelceller vi brukte.

Acknowledgments

Omar Alexander mann for illustrasjonene.
L.M. ble støttet av en Pilot Award fra Cornell klinisk og Translational Science Center og en ASRM forskning tilskudd.
Forfatterne vil gjerne takke James lab medlemmer for kritisk lesning av manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Leibovitz’s L-15 medium Gibco 11415064
Antibiotic-Antimycotic Gibco 15240062 Anti-Anti X100
Sucrose Sigma S 1888
Fibrinogen Sigma F 8630 from bovine plasma
Thrombin Sigma T 1063 from human plasma
DMSO Sigma D 2650
DMEM Gibco 12491015
Enzyme Cell Detachment Medium Invitrogen 00-4555-56 Accutase
Plastic paraffin film Bemis NA Parafilm M
Surgical paper tape 2.5 cm 3M 1530-1 Micropore
Surgical Paper tape 1.25 cm 3M 1530-0 Micropore
Perforated plastic Surgical tape 1.25 cm 3M 1527-0 Transpore
Monofilament Absorbable Suture Covidien UM-203 Biosyn
Braided Absorbable Suture Covidien GL-889 Polysorb
Povidone-iodine Solution USP 10% Purdue Products 67618-153-01 Betadine Solution Swab Stick
Cryoviales Nunc 377267 CryoTube
sterile ocular lubricant Dechra 17033-211-38 Puralube
1.7 ml micro-centrifuge tube Denville C-2172 Eppendorf
Anasthesia system VetEquip V-1 table top system with scavenging
Endothelial cells Angiocrine Biosciences, Inc., San Diego, CA, USA Isolated, transfected with E4-ORF- 1 and labeled endothelial cells
Trichrome stain Sigma HT15-1kt Trichrome Stain (Masson) Kit
Isolectin Invitrogen I32450 isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor™ 647 Conjugate

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer Statistics, 2017. CA Cancer J Clin. 67, (1), 7-30 (2017).
  2. Magelssen, H., Melve, K. K., Skjaerven, R., Fossa, S. D. Parenthood probability and pregnancy outcome in patients with a cancer diagnosis during adolescence and young adulthood. Hum Reprod. 23, (1), 178-186 (2008).
  3. Donnez, J., Dolmans, M. M., Diaz, C., Pellicer, A. Ovarian cortex transplantation: time to move on from experimental studies to open clinical application. Fertil Steril. 104, (5), 1097-1098 (2015).
  4. Stoop, D., Cobo, A., Silber, S. Fertility preservation for age-related fertility decline. Lancet. 384, (9950), 1311-1319 (2014).
  5. Aubard, Y., et al. Orthotopic and heterotopic autografts of frozen-thawed ovarian cortex in sheep. Hum Reprod. 14, (8), 2149-2154 (1999).
  6. Newton, H., Aubard, Y., Rutherford, A., Sharma, V., Gosden, R. Low temperature storage and grafting of human ovarian tissue. Hum Reprod. 11, (7), 1487-1491 (1996).
  7. Van Eyck, A. S., et al. Electron paramagnetic resonance as a tool to evaluate human ovarian tissue reoxygenation after xenografting. Fertil Steril. 92, (1), 374-381 (2009).
  8. Nugent, D., Newton, H., Gallivan, L., Gosden, R. G. Protective effect of vitamin E on ischaemia-reperfusion injury in ovarian grafts. J Reprod Fertil. 114, (2), 341-346 (1998).
  9. Kim, S. S., et al. Quantitative assessment of ischemic tissue damage in ovarian cortical tissue with or without antioxidant (ascorbic acid) treatment. Fertil Steril. 82, (3), 679-685 (2004).
  10. Abir, R., et al. Improving posttransplantation survival of human ovarian tissue by treating the host and graft. Fertil Steril. 95, (4), 1205-1210 (2011).
  11. Friedman, O., et al. Possible improvements in human ovarian grafting by various host and graft treatments. Hum Reprod. 27, (2), 474-482 (2012).
  12. Shikanov, A., et al. Fibrin encapsulation and vascular endothelial growth factor delivery promotes ovarian graft survival in mice. Tissue Eng Part A. 17, (23-24), 3095-3104 (2011).
  13. Soleimani, R., Heytens, E., Oktay, K. Enhancement of neoangiogenesis and follicle survival by sphingosine-1-phosphate in human ovarian tissue xenotransplants. PLoS One. 6, (4), e19475 (2011).
  14. Israely, T., Dafni, H., Nevo, N., Tsafriri, A., Neeman, M. Angiogenesis in ectopic ovarian xenotransplantation: multiparameter characterization of the neovasculature by dynamic contrast-enhanced MRI. Magn Reson Med. 52, (4), 741-750 (2004).
  15. Buratini, J., Price, C. A. Follicular somatic cell factors and follicle development. Reprod Fertil Dev. 23, (1), 32-39 (2011).
  16. Dunlop, C. E., Anderson, R. A. The regulation and assessment of follicular growth. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 244, discussion 17 13-17 (2014).
  17. Durlinger, A. L., et al. Control of primordial follicle recruitment by anti-Müllerian hormone in the mouse ovary. Endocrinology. 140, (12), 5789-5796 (1999).
  18. Schmidt, K. L., Ernst, E., Byskov, A. G., Nyboe Andersen, A., Yding Andersen, C. Survival of primordial follicles following prolonged transportation of ovarian tissue prior to cryopreservation. Hum Reprod. 18, (12), 2654-2659 (2003).
  19. Jensen, A. K., et al. Outcomes of transplantations of cryopreserved ovarian tissue to 41 women in Denmark. Hum Reprod. 30, (12), 2838-2845 (2015).
  20. Oktay, K., Newton, H., Aubard, Y., Salha, O., Gosden, R. G. Cryopreservation of immature human oocytes and ovarian tissue: an emerging technology? Fertil Steril. 69, (1), 1-7 (1998).
  21. Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. J Immunol. 174, (10), 6477-6489 (2005).
  22. Ramalingam, R., Rafii, S., Worgall, S., Brough, D. E., Crystal, R. G. E1(-)E4(+) adenoviral gene transfer vectors function as a "pro-life" signal to promote survival of primary human endothelial cells. Blood. 93, (9), 2936-2944 (1999).
  23. Seandel, M., et al. Generation of a functional and durable vascular niche by the adenoviral E4ORF1 gene. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (49), 19288-19293 (2008).
  24. Meirow, D., et al. Cortical fibrosis and blood-vessels damage in human ovaries exposed to chemotherapy. Potential mechanisms of ovarian injury. Hum Reprod. 22, (6), 1626-1633 (2007).
  25. Assidi, M., et al. Identification of potential markers of oocyte competence expressed in bovine cumulus cells matured with follicle-stimulating hormone and/or phorbol myristate acetate in vitro. Biol Reprod. 79, (2), 209-222 (2008).
  26. Thakur, S. C., Datta, K. Higher expression of hyaluronan binding protein 1 (HABP1/p32/gC1qR/SF2) during follicular development and cumulus oocyte complex maturation in rat. Mol Reprod Dev. 75, (3), 429-438 (2008).
  27. Dolmans, M. M., et al. Short-term transplantation of isolated human ovarian follicles and cortical tissue into nude mice. Reproduction. 134, (2), 253-262 (2007).
  28. Amorim, C. A., et al. Impact of freezing and thawing of human ovarian tissue on follicular growth after long-term xenotransplantation. J Assist Reprod Genet. 28, (12), 1157-1165 (2011).
  29. Kawamura, K., et al. Hippo signaling disruption and Akt stimulation of ovarian follicles for infertility treatment. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, (43), 17474-17479 (2013).
  30. Suzuki, N., et al. Successful fertility preservation following ovarian tissue vitrification in patients with primary ovarian insufficiency. Hum Reprod. 30, (3), 608-615 (2015).
  31. Campbell, B. K., Clinton, M., Webb, R. The role of anti-Müllerian hormone (AMH) during follicle development in a monovulatory species (sheep). Endocrinology. 153, (9), 4533-4543 (2012).
  32. Donnez, J., et al. Restoration of ovarian activity and pregnancy after transplantation of cryopreserved ovarian tissue: a review of 60 cases of reimplantation. Fertil Steril. 99, (6), 1503-1513 (2013).
  33. Ferreira, M., et al. The effects of sample size on the outcome of ovarian tissue cryopreservation. Reprod Domest Anim. 45, (1), 99-102 (2010).
  34. Gavish, Z., Peer, G., Roness, H., Cohen, Y., Meirow, D. Follicle activation and 'burn-out' contribute to post-transplantation follicle loss in ovarian tissue grafts: the effect of graft thickness. Hum Reprod. 30, (4), 1003 (2015).
  35. Donnez, J., Dolmans, M. M. Fertility Preservation in Women. N Engl J Med. 377, (17), 1657-1665 (2017).
  36. Salama, M., Woodruff, T. K. New advances in ovarian autotransplantation to restore fertility in cancer patients. Cancer Metastasis Rev. 34, (4), 807-822 (2015).
  37. Donnez, J., Dolmans, M. M. Ovarian cortex transplantation: 60 reported live births brings the success and worldwide expansion of the technique towards routine clinical practice. J Assist Reprod Genet. 32, (8), 1167-1170 (2015).
  38. Meirow, D., et al. Transplantations of frozen-thawed ovarian tissue demonstrate high reproductive performance and the need to revise restrictive criteria. Fertil Steril. 106, (2), 467-474 (2016).
  39. Kalich-Philosoph, L., et al. Cyclophosphamide triggers follicle activation and "burnout"; AS101 prevents follicle loss and preserves fertility. Sci Transl Med. 5, (185), 185ra162 (2013).
  40. Kano, M., et al. AMH/MIS as a contraceptive that protects the ovarian reserve during chemotherapy. Proc Natl Acad Sci U S A. 114, (9), E1688-E1697 (2017).
Co transplantasjon av menneskelig Ovarian vev med konstruert endotelceller: en celle-basert strategi kombinere akselerert perfusjon med direkte Paracrine levering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Man, L., Park, L., Bodine, R., Ginsberg, M., Zaninovic, N., Schattman, G., Schwartz, R. E., Rosenwaks, Z., James, D. Co-transplantation of Human Ovarian Tissue with Engineered Endothelial Cells: A Cell-based Strategy Combining Accelerated Perfusion with Direct Paracrine Delivery. J. Vis. Exp. (135), e57472, doi:10.3791/57472 (2018).More

Man, L., Park, L., Bodine, R., Ginsberg, M., Zaninovic, N., Schattman, G., Schwartz, R. E., Rosenwaks, Z., James, D. Co-transplantation of Human Ovarian Tissue with Engineered Endothelial Cells: A Cell-based Strategy Combining Accelerated Perfusion with Direct Paracrine Delivery. J. Vis. Exp. (135), e57472, doi:10.3791/57472 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter