Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Bioengineering

Совместное трансплантация человеческих тканей яичника с инженерии эндотелиальных клеток: несамостоятельных Cell-based стратегии ускоренного перфузии с паракринными прямой доставки

doi: 10.3791/57472 Published: May 16, 2018

Summary

Для некоторых пациентов единственным вариантом для сохранения плодородия является Криоконсервация тканей яичника. К сожалению задержки реваскуляризации подрывает фолликулярной жизнеспособность. Здесь мы представляем протокол к совместной трансплантации человеческих тканей яичника с эндотелиальных клеток для использования как на основе ячеек стратегии, сочетающей ускоренного перфузии с паракринными прямой доставки биологически активных молекул.

Abstract

Бесплодие является частым побочным эффектом химиотерапии или лучевой терапии и для некоторых пациентов, криоконсервация яйцеклеток или эмбрионов не вариант. В качестве альтернативы, все большее число этих больных выбирают для криоконсервации тканей яичника для аутотрансплантатом после восстановления и ремиссии. Несмотря на улучшение результатов среди пациентов, перенесших auto трансплантация криоконсервированных тканей яичника эффективное реваскуляризации привитые ткани остается серьезным препятствием. Чтобы смягчить ишемии и таким образом улучшить исходы у пациентов, перенесших Авто трансплантации, мы разработали стратегию на основе клеток сосудистой для ускорения перфузии тканей яичника. Мы описываем метод для совместного трансплантации экзогенных эндотелиальных клеток (ExECs) с криоконсервированных тканей яичника в модели ксенотрансплантата мыши. Мы расширяем этот подход использовать ExECs которые были инженерии выразить конститутивно анти-только гормон (AMH), таким образом позволяя устойчивый паракринными сигнализации вклад яичников графтов. Сопредседатель трансплантации с ExECs увеличился объем фолликулярной и улучшение полостная фолликула развития, и выражая AMH ExECs поощрять сохранение покоя первичных фолликулов. Эта Комбинированная стратегия может быть полезным инструментом для смягчения ишемии и модулирует фолликулярной активации в контексте сохранения фертильности и/или бесплодия в целом.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Рак остается одной из ведущих причин смерти в развитых странах, однако десятилетия исследований принесли значительный прогресс для большинства типов рака и в некоторых случаях почти удвоилось выживание ставки1. К сожалению химиотерапевтических агентов, часто gonadotoxic, истощает запас первичных фолликулов в яичниках и сокращение рождаемости2. Этот рост численности населения могут пользоваться различные методы сохранения плодородия, включая криоконсервация яйцеклеток или эмбрионов, однако, пациентов, требующих скорейшего начала терапии рака и периода полового созревания пациентов непригодной для этих вариантов. В качестве альтернативы некоторые пациенты решили криоконсервировать тканей яичника, прежде чем их терапевтический режим и после восстановления и ремиссии, Авто трансплантации тканей, для восстановления плодородия3. Тем не менее на сегодняшний день, трансплантат выживания и фолликулярной вывода после Авто трансплантации остаются относительно низкие4, главным образом из-за ткани ишемия и гипоксия5,6,7. Несмотря на многочисленные усилия по повышению жизнеспособности яичников корковых графтов с использованием антиоксидантов8,9, про ангиогенных цитокинов10,11,12,1 3, или механических манипуляций14, ишемии трансплантата в 5 – 7 день окно после трансплантации подрывает жизнеспособность и выживания трансплантата7. Для решения этой проблемы мы разработали стратегию на основе клеток для облегчения анастомоза хост и трансплантата судов и таким образом ускорить реперфузии тканей яичника.

В дополнение к ишемического инсульта чтобы привитые тканей яичника в окне после трансплантации срыв между фолликулярной сигнализации может способствовать истощения бассейн15,16. Потому что экзогенные эндотелиальных клеток (ExECs) способствуют стабильной и функционирования судов на периферии трансплантата, они представляют уникальную возможность передать молекулярный ввод пересаженных тканей. Как доказательство принципа ExECs были спроектированы для Экспресс Супер-физиологические уровни гормона (AMH), анти-только членом преобразование надсемейства бета (TGFβ) фактор роста, что было показано, чтобы ограничить фолликулярного роста17. Сравнение фолликулярной распределения в графтов, пересаженные совместно с контролем и выражая AMH клетки проверяет биологической активности и потенции инженерии exECs.

В целом улучшая трансплантата жизнеспособность и подавления преждевременной мобилизации фолликулярной бассейн, этот подход может повысить производительность Авто трансплантации тканей яичника у пациентов, перенесших сохранение плодородия. Кроме того ExEC-платформа позволяет экспериментальной допроса молекулярных регуляторов, которые замешаны в фолликулярной развития.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Все процедуры с участием животных темы были одобрены институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) в медицинский колледж Вейл Корнелл. Все ксенотрансплантации эксперименты с использованием тканей яичника были проведены в соответствии с соответствующих руководящих принципов и правил. Человеческие ткани яичника была собрана из запланировано химио- или радиотерапии для лечения рака или предварительного костного мозга пациентов. Институциональных Наблюдательный Совет (IRB) Комитета по Weill Cornell медицинский колледж одобрил коллекции тканей для потенциальных аутологических использования и осознанного согласия пациента, выполненных пожертвование до 10% их тканей яичника для использования в исследовательских целях.

1. совокупность человеческих тканей яичника

Примечание: Когда тканей яичника транспортируется от транзита удаленного объекта, время не должно превышать 5 h18,19.

  1. Собирать тканей яичника и сполосните стерильным физиологическим раствором.
  2. Поместите яичника в стерильный контейнер.
  3. Залейте Лейбовиц в L-15 среде до тех пор, пока завязи полностью погружен в среде.
  4. Закройте и уплотнение контейнера.
  5. Перевозки контейнеров на льду.

2. обработка закупленных тканей яичника, адаптированный Шмидт и др. 18

  1. Подготовка к яичников переработки и замораживания
    1. Подготовка 100 мл среды для обработки: Лейбовиц в L-15 средних 99 + 1 мл антибиотик противогрибковое решения. Фильтра средств массовой информации с использованием 0.2 мкм фильтром. Храните средство в холодильнике.
    2. Подготовка 100 мл замораживания раствора с помощью ДМСО в крио Протравитель. Добавить 69.64 мл Лейбовиц L-15 Средний, 17,66 мл плода бычьим сывороточным (ФБС), 3.42 г сахарозы (для создания окончательного концентрацией 0,1 моль/Л), 10.65 мл ДМСО (для создания конечной концентрации 1,5 моль/Л) и 1 мл раствора антибиотик противогрибковое. Фильтр носитель с помощью блок фильтра 150 мл 0,2 мкм. магазина среды при 4 ° C.
    3. Стерилизуйте хирургические инструменты, с помощью автоклав запрограммированы для цикла стерилизации завернутый тел.
  2. По прибытии ткани
    1. Установите стерильные хирургические инструменты в области биобезопасности кабинета: скальпель с лезвием число 21, острые отлично изогнутые ножницы и щипцы на разнообразных размеров: длинный (длина около 150 мм) и 2 среднего размера (около 110 мм длины).
    2. Наденьте стерильные перчатки, откройте контейнер внутри шкафа биобезопасности. Возьмите завязи и поместите его в 150 мм Петри блюдо и залить холодной среды, подготовленную на этапе 2.1.1 верхней завязи для предотвращения обезвоживания тканей яичника.
    3. Изолировать от любой остаточной ткани яичника и промойте его холодной среде до тех пор, пока она лишена тканей и крови.
    4. Завязи в чистой 150 мм Петри блюдо, добавить холодный средний, подготовленную на этапе 2.1.1 пока завязи наполовину погружен в нем.
  3. Рассечение тканей яичника
    1. Пополам завязи и сначала снимите продолговатого мозга, острый рассечение, используя изогнутые ножницы штраф. Затем очистите продолговатого мозга, используя стерильным скальпель с номером лезвие 21. Предшествовать пока кортикального слоя ткани толщиной 1-1,5 мм.
    2. Нарезать кортикального слоя ткани осколки 2-3 мм в ширину, длину полосы будет по всей длине яичников кусок, который был обработан.

3. яичников ткани медленного замораживания, адаптировано из Ньютона и др. и Октай и др. 6 , 20

  1. Подготовка для замораживания
    1. Криопробирки этикетки (1,8 мл).
    2. Добавьте 1,5 мл замораживания раствором, приготовленным на шаге 2.1.2 каждого флакона.
    3. Передача одного кортикального слоя газа на криогенных флакон, содержащий замораживания раствора.
    4. Сбалансировать корковых газа для 20 мин на вращающуюся, применять нежные агитации при 4 ° C.
  2. Медленное замораживание тканей яичника
    1. Загрузить криопробирки программируемый рубанок морозильник, начиная с 0 ° C.
    2. Прохладный на 2 ° C/мин до-7 ° C.
    3. Держите ткани на этой постоянной температуре втечение 10 мин.
    4. Выполнение ручного заполнения для индукции нуклеации кристаллов льда, прикоснувшись каждого cryovial с хлопок наконечником погружен в жидком азоте (2л).
    5. По-прежнему прохладно на 0,3 ° C/мин до тех пор, пока температура образца достигает 40 ° с.
    6. Прохладный более быстрыми темпами, 10 ° C/мин-140 ° c.
    7. Передавать криопробирки Дьюара для хранения в LN2 (-196 ° C).

4. Подготовка к операции (двусторонние придатками и Сопредседатель трансплантации)

  1. Подготовка пластин
    1. За день до оттаивания тканей яичника для трансплантации
      1. Поместите кусок пластиковой парафин фильма в нижней части 50 мм Петри, спрей с 70% этанол до тех пор, пока он будет полностью закрыта.
      2. Оставьте Петри на ночь в биобезопасности кабинета. Готовить 2 чашки Петри на мышь.
    2. В день операции
      1. Аспирационная этанола из Петри, содержащие фильм пластиковые парафина в рамках кабинета биобезопасности.
      2. Оставьте Петри свинца наполовину открытым до тех пор, пока полностью испаряется этанола.
      3. Закройте крышку Петри блюдо, когда фильм пластиковые парафин полностью сухой. Держите его в пределах биобезопасности кабинета.
      4. Метки колодцев 6 хорошо пластины соответственно, 0,1 моль/Л сахарозы + 1 моль/Л ДМСО, 0,1 моль/Л сахарозы + 0,5 моль/Л ДМСО, 0,1 моль/Л сахарозы, основные решения оттаивания (BTS), средний.
  2. Подготовка решений
    1. Подготовка 100 мл BTS: Лейбовиц в L-15 средних 79 мл + FBS 20 мл + противогрибковое Антибиотик раствор 1 мл. Фильтр с системой фильтра 0.22 мкм.
    2. Подготовка 10 мл BTS с 0,1 моль/Л сахарозы. Масштаб 0,342 г сахарозы и добавляют 10 мл BTS, подготовленную на этапе 4.2.1, взволновать осторожно до тех пор, пока полностью не растворится сахарозы. Фильтр решения с помощью шприца фильтра 0.22 мкм.
    3. Подготовка решения согласно таблице 1. Обложка пробирки, содержащие ДМСО с алюминиевой фольгой. Храните в холодильнике до использования.

5. яичников ткани Быстрое размораживание

  1. Возьмите из LN2 Дьюар, флакон, содержащий замороженные тканей яичника и держать его при комнатной температуре за 30 s.
  2. Протрите флакон с помощью папиросной бумаги.
  3. Погружать флакона в ванну воды 30 ° C для 1-2 мин до его ' содержание разморожен.
  4. Откройте флакон и корковые газа в первой скважины, содержащий 3 мл раствора первого (0,1 моль/Л сахарозы + 1 моль/Л ДМСО, подготовленную на этапе 4.2.3).
    Примечание: Все шаги, связанные с открыванием крышки пластины будет осуществляться под ламинарного потока.
  5. Инкубируйте 6 хорошо пластины на вращающуюся на 4 ° C на 5 минут оставить пластины покрыты с алюминиевой фольги для этого шага.
  6. Перевести корковых газа на второй хорошо содержащие 3 мл раствора второго (0,1 моль/Л сахарозы + 0,5 моль/Л ДМСО, подготовленную на этапе 4.2.3).
  7. Инкубируйте 6 хорошо пластины на вращающуюся для нежный агитации на 4 ° C за 5 минут держать пластины покрыты с алюминиевой фольги для этого шага.
  8. Передача корковых газа в третьем колодец, содержащий 4 мл раствора (BTS с 0,1 моль/Л сахарозы, подготовленную на этапе 4.2.2).
  9. Инкубируйте на вращающуюся для нежный агитации на 4 ° C за 5 мин.
  10. Перевести корковых газа в четвертый хорошо содержащие 4 мл раствора (BTS, подготовленную на этапе 4.2.1).
  11. Инкубируйте на вращающуюся для нежный агитации на 4 ° C за 5 мин.
  12. Перевести корковых газа в последний хорошо содержащие 4 мл холодной среды (подготовленных на шаге 2.1.1). Держите талой тканей яичника на льду до выполнения трансплантации.

6. Инкапсуляция ткани яичников

  1. Подготовить следующие решения
    1. Подготовка 25 мл 20 ммоль/Л HEPES буфера в 0,9% физиологического раствора. Фильтр и хранить при 4 ° C.
    2. Подготовка 1 мл2 CaCl на концентрации 1 моль/л фильтр и хранить при 4 ° C.
  2. Подготовка 50 мг/мл раствор фибриногена
    1. Добавить 1 g фибриногена в 20 мл 20 ммоль/Л HEPES буфера в 0,9% физиологического раствора, медленно смешивая фибриногена в HEPES буфер солевой раствор в течение нескольких часов при 37 ° C.
    2. Ярлык 1,7 мл микро-пробирок.
    3. Фильтр решение через фильтр шприц 0,45 мкм, а затем через фильтр шприц 0,2 мкм.
    4. Алиготе раствора в 200 мкл в микро пластиковых пробирок и хранить при температуре от-20 ° C.
  3. Подготовить Раствор тромбина 100 ед/мл
    Примечание: Тромбин решения адсорбируются к стеклу, аликвота решение в пластиковые трубы/флаконов.
    1. Добавьте 2,5 мл стерильного 0,9% физиологического раствора 250 U тромбина.
    2. Нежный встряхнуть до решения полностью раствориться.
    3. Ярлык 1,7 мл микро-пробирок.
    4. Фильтрация через фильтр 0.2 мкм шприц, аликвота 50 мкл в микро-пробирок и хранить при температуре-80 ° C.
  4. Сделать сгусток фибрина 70 мкл, получение конечной концентрации фибриногена 10 мг/мл и 5 ед/мл тромбина
    Примечание: Убедитесь, что работать быстро, решение сгустки в течение нескольких секунд. Кроме того Избегайте добавлением пузырей смеси.
    1. Приготовляют раствор фибриногена в 1,7 мл микро пластиковых пробирок.
      1. Добавить 360 мкл 20 ммоль/Л HEPES буфер в физиологический раствор 0,9% для aliquoted 200 мкл фибриноген акций, подготовленную на этапе 6.2.4.
      2. Смешайте нежно закупорить.
      3. Держите его на льду.
    2. Приготовляют раствор тромбина в втором микро пластиковых пробирок.
      1. 148.7 мкл DMEM к aliquoted 50 мкл тромбина акций, подготовленную на этапе 6.3.4.
      2. Смешайте нежно закупорить.
      3. 1.3 мкл 1 моль/Л CaCl2.
      4. Смешайте нежно закупорить.
      5. Держите его на льду.
    3. Подготовьте одну ячейку подвеска, в третьем микро пластиковых пробирок.
      1. Отсоедините инженерии эндотелиальных клеток от пластины с помощью среды отряд клеток фермент.
      2. Спин вниз и подсчитать количество ячеек с помощью Горяева с покровным стеклом.
      3. Используйте 20 000 ячеек на каждый 1 мм2 тканей яичника. Вычислите площадь 20000 x тканей яичника в мм2.
      4. Спин вниз инженерии эндотелиальных клеток и вновь приостановить его в основной среде (DMEM) для достижения общего объема 16.8 мкл.
      5. Держите его на льду.
    4. Поместите кусочек ткани яичников на стерильные марлевые губкой, чтобы высушить в течение нескольких секунд.
    5. Поместите кусок ткани яичников на верхней части пластиковой парафин фильм в пределах 50 мм Петри.
    6. 39.2 мкл раствора фибриноген, подготовлен на шаге 6.4.1.2, в суспензии клеток, подготовленный на шаге 6.4.3.4, микс, нежный закупорить. Держите его на льду.
    7. 14 мкл раствора тромбина, подготовлен в шаге 6.4.2.4. Смешайте нежно закупорить один раз. Работе быстро.
    8. Поместите смесь на вершине тканей яичника, накапайте его в форме вытянутых капли.
    9. Место Петри с сгусток в инкубаторе при 37 ° C.

7. двусторонние придатками и Сопредседатель трансплантация человеческих тканей яичника с инженерии эндотелиальных клеток к ГЯП мышей

Примечание: Десять женщин ГЯП четырнадцать week-old мышей21 были использованы (Джексон Labs).

  1. Подготовить все хирургические инструменты, разработанные в шаге 2.1.3, убедитесь, что у вас есть все швы, колодки и хирургическое ленты под рукой.
  2. Анестезировать мыши, с помощью системы анестезии с изофлюрановая.
    1. Поместите указатель мыши в зале индукции, закройте крышкой и открыть соответствующий краном.
    2. Открытые расходомер до 1000 мл/мин включите испаритель и установите его для доставки 2-3,5%.
    3. Наблюдать последствия анестезии; потеря сознания, медленно и обычных вдохов.
    4. Переезд в носовой конус для поддержания анестезии. Поверните испаритель для доставки 1-3%, в зависимости от жизненно важных признаков.
    5. Проверьте отсутствие педали или хвост рефлекс. Если присутствует рефлекс, увеличивайте изофлюрановая до тех пор, пока она отсутствует.
  3. Трим мыши назад волосами, от хвоста до линии ключиц, используя электрические машинки.
  4. Поместите указатель мыши в лежачем положении на платформе хирургической.
  5. Исправление носовой конус на хирургические платформу, с помощью Хирургическое ленты.
  6. Лента мыши конечностей нежно хирургического платформы с использованием 1,25 см общесистемной хирургические бумажной лентой.
  7. Используйте стерильные смазка желе и вставьте термометр PR. Fix термометр лентой на хирургические платформу, с помощью 1,25 см шириной перфорированные пластиковые Хирургическое ленты.
  8. Лента хвост на хирургические платформу с помощью широко хирургического бумажная лента 2,5 см.
  9. Тепла, с помощью инфракрасной или горячей воды, грелка и контролировать температуру тела мыши на протяжении всей процедуры. Держать температуру тела в диапазоне 35-37 ° C.
  10. Очистить область обреза с палкой стерильным тампоном повидон-йод раствор и протереть с помощью стерильных алкоголя преп.
  11. Повторите шаг 6.9 вдвое больше.
  12. Поместите капли Стерильные глазные смазочных ветеринар мазь каждый из мыши глаза для защиты от обезвоживания и повреждение роговицы.
  13. Покрытие мыши, используя стерильные хирургические пелерина.
  14. Придать подкожной бупренорфин (1 мг/кг) (S/C).
  15. Выполните продольный разрез медиальной спины, с помощью скальпеля (лезвие #21).
  16. Выполнение двусторонних овариэктомия, использовать спинной подход.
    1. Освободите подкожной соединительной ткани, тупым Рассечение ножницами.
    2. Щепотка фасции боков к срединной надрезают и добраться до брюшной полости с помощью острых ножниц.
    3. Grab яичников жировой ткани и завязи аккуратно с помощью пинцета и вытащите его из брюшной полости.
    4. Захватите завязи и жировой ткани с сосудистый зажим.
    5. Перевязать жировой ткани с помощью 4/0 леска рассасывающиеся шовные на базе завязи, дистальнее фаллопиевых труб и яичников.
    6. Клип дистальнее галстука яичнике. Убедитесь, что существует не кровотечение от основания пня.
    7. Место ткани обратно в брюшной полости и шовные фасции, используя плетеные рассасывающиеся шовные 6/0.
    8. Повторите этапы 7.15.1-7.15.7 на контралатеральную сторону.
  17. Совместное пересадки тканей яичника.
    1. Выполните горизонтальный разрез в фасции выше ягодичная, на длину, который соответствует размеры сгустки. Создайте карман в этом виртуальном пространстве, открыв ножницы под фасции.
    2. Подобрать один кусок инкапсулированные кортикального слоя ткани, как в шаге 6.4.8 подготовлен и поместите его в этом кармане.
    3. Шовный материал фасции, используя 6/0 плетеный рассасывающиеся шовные.
  18. Повторите этапы 7.16.1-7.16.3 на контралатеральную сторону также.
  19. Закройте спинной стены с помощью простых Прерванный швы с 4/0 леска рассасывающиеся шовные.
  20. Вводить лидокаин 0,5% (1,2 мл/кг) S/C в месте разреза.
  21. Используйте стерильные алкоголя prep для очистки кожи.
  22. Выключите изофлюрановая во время мониторинга температуры мыши.
  23. Предоставить 1-2 мин O2, без изофлюрановая. Держите на потепление мыши до тех пор, пока он начинает двигаться и возвращение в сознание.
  24. Поместите курсор мыши в клетке чистого восстановления и позднее домовая мышь в отдельной клетке до полного заживления хирургической раны.
  25. Придать бупренорфин (1 мг/кг) S/C при необходимости каждые 8-12 ч, за 24 часа после операции.
  26. Держите мышей в отдельных клетках, когда все продовольствием, водой, постельными принадлежностями и клетки газобетона, до конечной точки эксперимента. Держите клетки в проветриваемом помещении под давлением. Использование средств индивидуальной защиты при обработке мышей.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Чтобы определить, обеспечивает ли совместное трансплантация ExECs пособие для пациентов ткани, талой яичников корковых полосы были разделены на равные куски размера и прижившимися на двусторонней основе в иммуно взломана, NOD scid гамма (ГЯП), мышей. С одной стороны, встроенный в сгусток фибрина в одиночку (без ECs) и других содержащих ExECs (рис. 1а) каждая мышь служил своего собственного управления. ExECs были получены посредством изоляции первичных эндотелия из человека пуповины и последующее лечение с фрагментом аденовирусных гена Е4-ORF1, как описано в22,23. В рамках проходы человека пупочную вену ECs (hUVEC), 2-5 лечили лентивирусные частицы, которые кодируют учредительный выражения cDNA кодировку фрагмента аденовирусных гена Е4-ORF1. Эта процедура улучшает выживание и потенциал ангиогенных эндотелия как описано22,23. После двух недель функционально перфузии судов были сформированы из GFP-меченых exECs на стыке ткани макроорганизма и трансплантата (рис. 1b). Для того чтобы маркировать функциональных кровеносных сосудов, мышей вводили с 100 мл Лектин (0.5 мг/мл) под изофлюрановая наркозом 10 минут до сбора урожая в ткани. Количественная оценка фолликулов на 2 недели, следующие трансплантации продемонстрировали значительное преимущество относительной фолликула рассчитывать в помощь ExECs имплантатов, которые было очевидно в две недели (рис. 1С). Экзогенные ECs образуется функциональная судов, когда совместно пересаженных тканей яичника (рис. 1b) и корковые куски совместно пересаженные с помощью мыши или человека ExECs увеличил количество сохранившихся фолликулов относительно управления графтов (Рисунок 1 c ). Это пособие было связано с области снижение фиброзных в содействии ExECs графтов (рис. 1 d) — от каждого пересаженных трансплантата, 3 секции окрашивали Trichrome, установленные средства разграничения фиброзных тканей24, чтобы оценить фиброзных площадь: средней секции и секции Глубина 600 мкм с верхней и нижней сторон трансплантата. Окрашенных разделы были отсканированы и анализируются с помощью ImageJ для количественного определения площади поверхности и фиброзных район вручную изложил и количественно как процент от всей трансплантат области (ImageJ программное обеспечение). Конечные значения были рассчитаны для каждого лоскута как среднее 3 секции анализа. Главное имплантатов, которые были совместно пересаженных с фибробластов человека плоть показали жизнеспособность бедных ткани и относительно нескольких фолликулов. (Рисунок 1e).

Далее мы оценивали долгосрочные функции яичников Tканевые трансплантаты с и без ExECs (Рисунок 2ad, f, h). После 14 недель мышей были стимулировали ежедневно с menotropins для переменной длины времени прежде чем приносили в жертву животных, с прогрессированием фолликул, отслеживаемого в двух мышей через МРТ (Рисунок 2b-c). Развивающихся фолликулов были отмечены в управления (Рисунок 2e) и при содействии ExECs графтов (Рисунок 2 g, я). Все больше и больше размера фолликулов были замечены в содействии ExECs графтов (рис. 2 g, я). По сравнению с полостная фолликулов вытекает из той же пациентки ткани, стимулируется с menotropins и совместно пересаженные с ExECs, слоя клеток гранулезы в более продвинутых фолликул отображается увеличение выражение Овуляторная маркеры CD4425 и HABP126, а также увеличение смерть клетки (Caspase) и снижение распространения (Ki67) (Рисунок 2j).

Несколько исследований показали, что пул фолликулов преждевременно активируется после лоскута тканей яичника27,28,29,30. Мы наблюдали аналогичные тенденции в нескольких имплантатов из одного пациента на 2, 3 и 14 недель (рис. 3a). Извлечь выгоду из предполагаемой функции AMH в подавление активации и/или рост фолликулов17,31, мы инженерии ExECs с человека конститутивно выразить и таким образом обеспечить источник прямой паракринными выделяют AMH для пересаженных тканей яичника (рис. 3b). Лентивирусные трансдукции увеличилась 100-кратного выше GC в ExEC, которая в противном случае выразил обнаружить количество AMH. Клетки опухоли клетки гранулезы, с другой стороны, секретируемых базальный уровень AMH в клеточной культуре супернатант. (Рис. 3 c). Через две недели после совместного трансплантации, судов, производный от ExECs были замечены на интерфейс хост трансплантата и иммуноокрашивания показал обильные AMH белка в просвет сосудов, производный от AMH-ExECs (рис. 3d) относительно судов, образуются из Управление ExECs. Чтобы протестировать функции AMH независимо от влияния про ангиогенных ExECs, мы использовали мезенхимальных стволовых клеток (МСК), которые были изолированы от фрагментов яичников продолговатого мозга. Эти клетки были преобразованы с лентивирусные частицы кодирования AMH и расширена в культуре для использования при трансплантации совместно. После совместного трансплантации с AMH-ExECs 2 раза увеличение наблюдалось в доли первичных фолликулов. Это, однако, приводит к снижению доли первичных фолликулов. Отель AMH MSCs привести к увеличению хранения первичных фолликулов десятикратного относительно управления MSCs (Рисунок 3f, h). Наиболее значительные выгоды для сохранения покоя фолликулярной бассейн был предусмотренных AMH-ECs, когда было проведено сопоставление между MSCs, ExECs, непористые графтов (Ctl), ExEC AMH-MSCs и AMH-ExECs (Рисунок 3i).

Figure 1
Рисунок 1: Сопредседатель трансплантации яичника корковых полос с ExECs повышает жизнеспособность и сохраняет фолликулярной бассейн. () схема экспериментального дизайна. Деконсервированных человеческих тканей яичника был инкапсулирован в сгусток фибрина, с или без ExECs. Сгустки были пересажены в oophorectomized мышей ГЯП и собирают в конечной точке эксперимента. (b) человека корковых графтов совместно пересаженные с hUVEC производные ExECs (зеленый); красные кровяные клетки помечены Тер-119 и пределах трансплантата изложены в белом. (c) средний процент всего фолликулов от пересадки с и без мыши или человека exECs + MAD. * P < 0,05. (d) средний процент фиброзных области от пересадки с и без мыши или человека ExECs + MAD. ** P < 0,001. (e) представитель Секции яичников графтов, пересаженные совместно с ExECs, без клеток и фибробластов человека крайней плоти. Этот показатель был изменен с человеком и др. Sci Rep. 2017 15 августа; 7 (1): 8203. DOI: 10.1038/s41598-017-08491-z. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: повышение долгосрочной жизнеспособности и функции яичников Tканевые трансплантаты, exECs. В фигуры b, c, d, f и h графтов на левой стороне являются ECs управления нет, в то время как на правой стороне графтов пересаженные совместно с ExECs. () экспериментальной схемы для долгосрочного ксенотрансплантата яичников кортикального слоя ткани. (b) в данных b и c, звездочка (правая сторона) представляет совместно пересаженные с ECs, в то время как стрелки (слева) представляет тканей яичника, пересаженные с не клеток тканей яичника. Мышь #1 был xenografted с ткани от 6-летняя донора и под контролем МРТ в начале стимуляции (14 недель, слева) и снова после десяти дней стимуляции (15,5 недели, справа). (c) мыши #3 был xenografted с ткани от 19-летняя донора и под контролем МРТ в 6 (20 недель после пересадки), 7 (21 w) и 8 (22 Вт) недель после начала стимуляции. (d) макроскопических изображение прижившимися тканей человека яичников, собирают в 15,5 недель трансплантата на правой стороне мыши #1 при содействии ExEC трансплантата и гистологической вид трансплантата управления показан на (e). Макроскопические изображение (f) графтов, мыши #2 был пожертвован после 20 недель и управления и при содействии exEC графтов собирали для гистологического анализа; ExEC помощь трансплантата показано в (g). (h) в (i) показано макроскопических изображение графтов в мышь #3, которая была принесена в жертву после 22 недель, гистологический анализ при содействии ExEC трансплантата. (j) секций при содействии ExEC графтов из мыши #2 и #3 мыши были витражи для молекулярных маркеров и увеличены в соответствующем поле. Масштаб баров = 100 мкм. Этот показатель был изменен с человеком и др. Sci Rep. 2017 15 августа; 7 (1): 8203. DOI: 10.1038/s41598-017-08491-z. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: ExECs инженерии выразить AMH сохранить пул покоя фолликулярной. () доля фолликулов был количественно для нескольких фрагментов тканей яичника из той же пациентки, которые были совместно пересаженных с ECs для краткосрочных и долгосрочных интервалов; n = 3 на 2 недели, n = 4 на 3 недели и n = 2 в 14 недель. (b) схема экспериментальный дизайн. Деконсервированных человеческих тканей яичника был инкапсулированный в сгусток фибрина с ExECs/MSCs преобразованы с ЗП лентивирусные частиц, выступающей в качестве элемента управления, либо преобразованы с AMH-mCherry лентивирусные частиц генерации AMH-ECs/MSCs ExECs/MSCs. Сгустки были пересажены в oophorectomized мышей ГЯП и собирают на 2 недели. (c) ExECs были преобразованы с человека кодирования секретируемые человека AMH; клетки культуры супернатант преобразованы AMH exECs был по сравнению с линии опухоли клеток гранулезы COV-434 культуры и управления ExECs. (d) через две недели после пересадки, фрагменты тканей яичника, совместно были пересажены с либо ECs (слева) или AMH-ExECs (справа) окрашивали антител, специфичных для AMH белка. (e) относительная доля фолликулов в ксенотрасплантатов совместно пересаженные с контролем и AMH-ExECs был количественно после 2 недель (n = 6). (f) относительная доля фолликулов в ксенотрасплантатов совместно пересаженные с контролем и AMH MSCs был количественно после 2 недель (n = 6). (g) средний + MAD относительной доли фолликулов сравнивали в ксенотрасплантатов, пересаженные с контролем и преобразованы AMH ExECs (n = 6) после 2 недель. (h) средний + MAD относительная доля фолликулов сравнивали в ксенотрасплантатов, пересаженные с контролем и преобразованы AMH MSCs (n = 6) после 2 недель. (i) средний процент наблюдаемых первичных фолликулов за графт в ксенотрасплантатов, пересаженные с MSCs (n = 6), ExECs (n = 6), AMH-MSCs (n = 6) и AMH-ExECs (n = 6) сравнивали в совокупности условий управления (без клетки, n = 15). Вставки в (d) увеличены в полях справа для AMH-ExECs и дабы для Ctl ExECs; красный и синий обводки линии в (d) описываются тканей яичника тканей и узлов, соответственно. Планки погрешностей в (c) представляют собой стандартное отклонение между 3 реплицирует. Ошибка бары в (а, g-i) представляют собой MAD между количество реплицирует перечисленные или показано на графике. Шкалы бар = 100 мкм (d). * P < 0,05, ** P < 0,005. Этот показатель был изменен с человеком и др. Sci Rep. 2017 15 августа; 7 (1): 8203. DOI: 10.1038/s41598-017-08491-z. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Решение Сахарозы-BTS (подготовленных на шаге 4.2.2) в мкл ДМСО в мкл
Сахарозы-BTS с 1 моль/Л ДМСО 2787 213
Сахарозы-BTS с 0,5 моль/Л ДМСО 2894 106

Таблица 1: Приготовления раствора сахарозы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Здесь мы показываем, что Сопредседатель трансплантации exECs дает существенные преимущества для жизнеспособности тканей яичника и функции после ксенотрансплантата мышей. Стандарты для клинического применения тканей яичника Авто трансплантации для сохранения плодородия не был набор и оптимальные параметры (размер, трансплантация сайт, продолжительность трансплантата, и т.д.) 32 , 33 , 34 для расширения восстановления фолликулярной бассейна остаются неопределенными. При Авто трансплантации, аваскулярный прививки талой кортикального слоя тканей яичника осуществляется главным образом в тазовой сайты, такие как остальные завязи, яичников ямки или широкой связки35,36. Поскольку не конец в конец анастомоза происходит, этот метод трансплантации приводит волна ишемии тканей потери и преждевременной активации фолликулов, проживающих в пределах трансплантата. Таким образом, в то время как сопредседатель трансплантации с exECs влечет за собой доставки пролиферативной эндотелиальных клеток, которые требуют много дальнейшего изучения, прежде чем рассматривать для клинического применения, этот подход может ускорить реваскуляризации ткани и может спасти надежный доля фолликулов в пределах яичников графтов.

Эти выводы выдвинул Роман сосудистой клеток-стратегию на основе оптимизации жизнеспособность тканей яичника и функции после трансплантации. Учитывая растущий пул пациенты выбирают для криоконсервации тканей яичника и недавние призывы к трансплантации тканей яичника перейти от экспериментальный статус открыть клинического применения37,38, этот метод может предложить лечебный стратегия, которая обеспечивает большую жизнеспособность графтов, тем самым уменьшая количество яичников корковых полоски, которые должны быть трансплантированы и повышение их долговечности и/или функции.

Преждевременная вербовки, или «выгорания», также связан с истощение фолликулярной бассейна во время химиотерапии39, а также следующих Авто-трансплантации тканей яичника34. Многочисленные исследования выявили сигнальных путей этой функции для того чтобы активировать подавления фолликулярной мобилизации, и нарушение этой функции регулирования может привести к массовой активации фолликулярного резерва при критической ишемии окна при метаболических потребностей зарождающейся фолликулов не смогут быть выполнены. Применение exECs в этом контексте не только ускорит реперфузии, но из-за их потенциальной приживления exECs также могут быть спроектированы для обеспечения прямого паракринными поставок факторов что прямой фолликулярной мобилизации. Понятие использования AMH как модулятор фолликулярного роста был применен другими группами. Кано и др. поставленный AMH через либо осмотических насосов, содержащие Рекомбинантный белок или инъекции IP40вирусных частиц. Эти подходы привели к аналогичной тенденцией в сохранение первичных фолликулов, но поставка была системных. В качестве альтернативы exECs секреции AMH обеспечивают местные и устойчивого источника AMH, однако, включение инженерии сосудистой клеток яичников Tканевые трансплантаты ограничивается множества рисков, связанных с терапии на основе ячеек. Иммунный ответ на иностранных антигены на exECs возможен и использование пролиферативной клеток повышает возможность клеток циркулирующих, имплантации и развития неопластических роста в других местах тела. Хотя эти ограничения запрещают перевод этого подхода для нынешних пациентов, перенесших Авто трансплантации, эти эксперименты обосновать потенциал для про ангиогенных влияний и репрессии в отношении преждевременной фолликулярной мобилизации для увеличения производства тканей яичника графтов и создать надежную ксенотрансплантата модель механистический исследования физиологии человека яичников.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Майкл Гинсберг является сотрудником Angiocrine Biosciences, Inc, Сан-Диего, штат Калифорния, 92130, Соединенные Штаты, что изолированные, transfected Е4-ORF-1 и помечены эндотелиальных клеток, которые мы использовали.

Acknowledgments

Омар Александр человек для иллюстрации.
Л.м. была поддержана пилот награду от Корнелл клинических и переводческая научный центр и ASRM исследовательских грантов.
Авторы хотели бы поблагодарить членов лаборатории Джеймс для критических чтении рукописи.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Leibovitz’s L-15 medium Gibco 11415064
Antibiotic-Antimycotic Gibco 15240062 Anti-Anti X100
Sucrose Sigma S 1888
Fibrinogen Sigma F 8630 from bovine plasma
Thrombin Sigma T 1063 from human plasma
DMSO Sigma D 2650
DMEM Gibco 12491015
Enzyme Cell Detachment Medium Invitrogen 00-4555-56 Accutase
Plastic paraffin film Bemis NA Parafilm M
Surgical paper tape 2.5 cm 3M 1530-1 Micropore
Surgical Paper tape 1.25 cm 3M 1530-0 Micropore
Perforated plastic Surgical tape 1.25 cm 3M 1527-0 Transpore
Monofilament Absorbable Suture Covidien UM-203 Biosyn
Braided Absorbable Suture Covidien GL-889 Polysorb
Povidone-iodine Solution USP 10% Purdue Products 67618-153-01 Betadine Solution Swab Stick
Cryoviales Nunc 377267 CryoTube
sterile ocular lubricant Dechra 17033-211-38 Puralube
1.7 ml micro-centrifuge tube Denville C-2172 Eppendorf
Anasthesia system VetEquip V-1 table top system with scavenging
Endothelial cells Angiocrine Biosciences, Inc., San Diego, CA, USA Isolated, transfected with E4-ORF- 1 and labeled endothelial cells
Trichrome stain Sigma HT15-1kt Trichrome Stain (Masson) Kit
Isolectin Invitrogen I32450 isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor™ 647 Conjugate

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer Statistics, 2017. CA Cancer J Clin. 67, (1), 7-30 (2017).
  2. Magelssen, H., Melve, K. K., Skjaerven, R., Fossa, S. D. Parenthood probability and pregnancy outcome in patients with a cancer diagnosis during adolescence and young adulthood. Hum Reprod. 23, (1), 178-186 (2008).
  3. Donnez, J., Dolmans, M. M., Diaz, C., Pellicer, A. Ovarian cortex transplantation: time to move on from experimental studies to open clinical application. Fertil Steril. 104, (5), 1097-1098 (2015).
  4. Stoop, D., Cobo, A., Silber, S. Fertility preservation for age-related fertility decline. Lancet. 384, (9950), 1311-1319 (2014).
  5. Aubard, Y., et al. Orthotopic and heterotopic autografts of frozen-thawed ovarian cortex in sheep. Hum Reprod. 14, (8), 2149-2154 (1999).
  6. Newton, H., Aubard, Y., Rutherford, A., Sharma, V., Gosden, R. Low temperature storage and grafting of human ovarian tissue. Hum Reprod. 11, (7), 1487-1491 (1996).
  7. Van Eyck, A. S., et al. Electron paramagnetic resonance as a tool to evaluate human ovarian tissue reoxygenation after xenografting. Fertil Steril. 92, (1), 374-381 (2009).
  8. Nugent, D., Newton, H., Gallivan, L., Gosden, R. G. Protective effect of vitamin E on ischaemia-reperfusion injury in ovarian grafts. J Reprod Fertil. 114, (2), 341-346 (1998).
  9. Kim, S. S., et al. Quantitative assessment of ischemic tissue damage in ovarian cortical tissue with or without antioxidant (ascorbic acid) treatment. Fertil Steril. 82, (3), 679-685 (2004).
  10. Abir, R., et al. Improving posttransplantation survival of human ovarian tissue by treating the host and graft. Fertil Steril. 95, (4), 1205-1210 (2011).
  11. Friedman, O., et al. Possible improvements in human ovarian grafting by various host and graft treatments. Hum Reprod. 27, (2), 474-482 (2012).
  12. Shikanov, A., et al. Fibrin encapsulation and vascular endothelial growth factor delivery promotes ovarian graft survival in mice. Tissue Eng Part A. 17, (23-24), 3095-3104 (2011).
  13. Soleimani, R., Heytens, E., Oktay, K. Enhancement of neoangiogenesis and follicle survival by sphingosine-1-phosphate in human ovarian tissue xenotransplants. PLoS One. 6, (4), e19475 (2011).
  14. Israely, T., Dafni, H., Nevo, N., Tsafriri, A., Neeman, M. Angiogenesis in ectopic ovarian xenotransplantation: multiparameter characterization of the neovasculature by dynamic contrast-enhanced MRI. Magn Reson Med. 52, (4), 741-750 (2004).
  15. Buratini, J., Price, C. A. Follicular somatic cell factors and follicle development. Reprod Fertil Dev. 23, (1), 32-39 (2011).
  16. Dunlop, C. E., Anderson, R. A. The regulation and assessment of follicular growth. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 244, discussion 17 13-17 (2014).
  17. Durlinger, A. L., et al. Control of primordial follicle recruitment by anti-Müllerian hormone in the mouse ovary. Endocrinology. 140, (12), 5789-5796 (1999).
  18. Schmidt, K. L., Ernst, E., Byskov, A. G., Nyboe Andersen, A., Yding Andersen, C. Survival of primordial follicles following prolonged transportation of ovarian tissue prior to cryopreservation. Hum Reprod. 18, (12), 2654-2659 (2003).
  19. Jensen, A. K., et al. Outcomes of transplantations of cryopreserved ovarian tissue to 41 women in Denmark. Hum Reprod. 30, (12), 2838-2845 (2015).
  20. Oktay, K., Newton, H., Aubard, Y., Salha, O., Gosden, R. G. Cryopreservation of immature human oocytes and ovarian tissue: an emerging technology? Fertil Steril. 69, (1), 1-7 (1998).
  21. Shultz, L. D., et al. Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2R gamma null mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells. J Immunol. 174, (10), 6477-6489 (2005).
  22. Ramalingam, R., Rafii, S., Worgall, S., Brough, D. E., Crystal, R. G. E1(-)E4(+) adenoviral gene transfer vectors function as a "pro-life" signal to promote survival of primary human endothelial cells. Blood. 93, (9), 2936-2944 (1999).
  23. Seandel, M., et al. Generation of a functional and durable vascular niche by the adenoviral E4ORF1 gene. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, (49), 19288-19293 (2008).
  24. Meirow, D., et al. Cortical fibrosis and blood-vessels damage in human ovaries exposed to chemotherapy. Potential mechanisms of ovarian injury. Hum Reprod. 22, (6), 1626-1633 (2007).
  25. Assidi, M., et al. Identification of potential markers of oocyte competence expressed in bovine cumulus cells matured with follicle-stimulating hormone and/or phorbol myristate acetate in vitro. Biol Reprod. 79, (2), 209-222 (2008).
  26. Thakur, S. C., Datta, K. Higher expression of hyaluronan binding protein 1 (HABP1/p32/gC1qR/SF2) during follicular development and cumulus oocyte complex maturation in rat. Mol Reprod Dev. 75, (3), 429-438 (2008).
  27. Dolmans, M. M., et al. Short-term transplantation of isolated human ovarian follicles and cortical tissue into nude mice. Reproduction. 134, (2), 253-262 (2007).
  28. Amorim, C. A., et al. Impact of freezing and thawing of human ovarian tissue on follicular growth after long-term xenotransplantation. J Assist Reprod Genet. 28, (12), 1157-1165 (2011).
  29. Kawamura, K., et al. Hippo signaling disruption and Akt stimulation of ovarian follicles for infertility treatment. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, (43), 17474-17479 (2013).
  30. Suzuki, N., et al. Successful fertility preservation following ovarian tissue vitrification in patients with primary ovarian insufficiency. Hum Reprod. 30, (3), 608-615 (2015).
  31. Campbell, B. K., Clinton, M., Webb, R. The role of anti-Müllerian hormone (AMH) during follicle development in a monovulatory species (sheep). Endocrinology. 153, (9), 4533-4543 (2012).
  32. Donnez, J., et al. Restoration of ovarian activity and pregnancy after transplantation of cryopreserved ovarian tissue: a review of 60 cases of reimplantation. Fertil Steril. 99, (6), 1503-1513 (2013).
  33. Ferreira, M., et al. The effects of sample size on the outcome of ovarian tissue cryopreservation. Reprod Domest Anim. 45, (1), 99-102 (2010).
  34. Gavish, Z., Peer, G., Roness, H., Cohen, Y., Meirow, D. Follicle activation and 'burn-out' contribute to post-transplantation follicle loss in ovarian tissue grafts: the effect of graft thickness. Hum Reprod. 30, (4), 1003 (2015).
  35. Donnez, J., Dolmans, M. M. Fertility Preservation in Women. N Engl J Med. 377, (17), 1657-1665 (2017).
  36. Salama, M., Woodruff, T. K. New advances in ovarian autotransplantation to restore fertility in cancer patients. Cancer Metastasis Rev. 34, (4), 807-822 (2015).
  37. Donnez, J., Dolmans, M. M. Ovarian cortex transplantation: 60 reported live births brings the success and worldwide expansion of the technique towards routine clinical practice. J Assist Reprod Genet. 32, (8), 1167-1170 (2015).
  38. Meirow, D., et al. Transplantations of frozen-thawed ovarian tissue demonstrate high reproductive performance and the need to revise restrictive criteria. Fertil Steril. 106, (2), 467-474 (2016).
  39. Kalich-Philosoph, L., et al. Cyclophosphamide triggers follicle activation and "burnout"; AS101 prevents follicle loss and preserves fertility. Sci Transl Med. 5, (185), 185ra162 (2013).
  40. Kano, M., et al. AMH/MIS as a contraceptive that protects the ovarian reserve during chemotherapy. Proc Natl Acad Sci U S A. 114, (9), E1688-E1697 (2017).
Совместное трансплантация человеческих тканей яичника с инженерии эндотелиальных клеток: несамостоятельных Cell-based стратегии ускоренного перфузии с паракринными прямой доставки
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Man, L., Park, L., Bodine, R., Ginsberg, M., Zaninovic, N., Schattman, G., Schwartz, R. E., Rosenwaks, Z., James, D. Co-transplantation of Human Ovarian Tissue with Engineered Endothelial Cells: A Cell-based Strategy Combining Accelerated Perfusion with Direct Paracrine Delivery. J. Vis. Exp. (135), e57472, doi:10.3791/57472 (2018).More

Man, L., Park, L., Bodine, R., Ginsberg, M., Zaninovic, N., Schattman, G., Schwartz, R. E., Rosenwaks, Z., James, D. Co-transplantation of Human Ovarian Tissue with Engineered Endothelial Cells: A Cell-based Strategy Combining Accelerated Perfusion with Direct Paracrine Delivery. J. Vis. Exp. (135), e57472, doi:10.3791/57472 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter