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Bioengineering

Co el trasplante de tejido ovárico humano con células endoteliales Ingeniería: una combinación de estrategia basado en la célula acelerada perfusión con entrega directa paracrina

Published: May 16, 2018 doi: 10.3791/57472
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 3, 1, 4, 1,3, 1,3
1Center for Reproductive Medicine and Infertility, Weill Cornell Medical College, 2Angiocrine Biosciences, Inc., 3Tri-Institutional Stem Cell Derivation Laboratory, Weill Cornell Medical College, 4Joan and Sanford I. Weill Department of Medicine, Weill Cornell Medical College

Summary

Para algunos pacientes, la única opción para la preservación de la fertilidad es la criopreservación de tejido ovárico. Desafortunadamente, la revascularización tardía socava la viabilidad folicular. Aquí, presentamos un protocolo de co trasplante de tejido ovárico humano con células endoteliales para utilización como una estrategia basada en celda combinando acelerada la perfusión con una entrega de paracrina directa de moléculas bioactivas.

Abstract

La infertilidad es un efecto secundario frecuente de la quimioterapia o la radioterapia y para algunos pacientes, criopreservación de ovocitos o embriones no es una opción. Como alternativa, un número creciente de estos pacientes se decide criopreservar tejido ovárico para autoinjerto después de la recuperación y remisión. A pesar de mejoras en los resultados entre los pacientes sometidos a auto-trasplante de tejido ovárico criopreservado, revascularización eficaz del tejido injertado sigue siendo un obstáculo importante. Para reducir la isquemia y mejorar así los resultados en pacientes sometidos a trasplante de auto, desarrollamos una estrategia basadas en células vascular para acelerar la perfusión del tejido ovárico. Se describe un método para el trasplante de co de las células endoteliales exógenos (ejecutivos) con tejido ovárico criopreservado en un modelo de xenoinjerto murino. Extendemos este enfoque para emplear a ejecutivos que han sido diseñados para expresar constitutivamente hormona Anti-Mullerian (AMH), permitiendo así sostenido paracrina señalización de entrada a los injertos de ovarianos. Trasplante junto con ejecutivos de mayor volumen folicular y desarrollo del mayor folículo antral, y ejecutivos de AMH-expresión promovieron retención de folículos primordiales quietos. Esta estrategia combinada puede ser una herramienta útil para mitigar la isquemia y la modulación de la activación folicular en el contexto de preservación de fertilidad o infertilidad en general.

Introduction

Cáncer sigue siendo entre las principales causas de muerte en el mundo desarrollado, sin embargo, décadas de investigación han producido avances significativos para la mayoría de los tipos de cáncer y en algunos casos casi se duplicó la supervivencia tasas1. Lamentablemente, los agentes quimioterapéuticos son a menudo gonadotóxica, agotamiento de la reserva de folículos primordiales en los ovarios y reducción de la fertilidad2. Este crecimiento de la población puede beneficiarse de varios métodos de preservación de la fertilidad incluyendo criopreservación de ovocitos o embriones, sin embargo, los pacientes que requieren la pronta iniciación de la terapia del cáncer y los pacientes prepuberales son elegibles para estas opciones. Como alternativa, algunos pacientes han decidido criopreservar tejido ovárico antes de emprender su régimen terapéutico y a la recuperación y la remisión, auto-transplante de tejido para restaurar la fertilidad3. Sin embargo, hasta la fecha, la supervivencia del trasplante y folicular salida auto-trasplante de siguiente siguen siendo relativamente bajos4, principalmente debido a tejido isquemia e hipoxia5,6,7. A pesar de numerosos esfuerzos para mejorar la viabilidad de los injertos corticales ováricas utilizando antioxidantes8,9, pro-angiogénicos citoquinas10,11,12,1 3o manipulaciones mecánicas14, isquemia del injerto en un trasplante después de 5 a 7 días ventana socava la viabilidad y supervivencia del injerto7. Para hacer frente a esto, hemos desarrollado una estrategia basada en la célula para facilitar la anastomosis de vasos de anfitrión y del injerto y así acelerar la reperfusión del tejido ovárico.

Además del insulto isquémico a tejido ovárico injertado en la ventana posterior al trasplante, la alteración de la señalización inter folicular puede contribuir al agotamiento de la piscina15,16. Porque las células endoteliales exógenas (ejecutivos) contribuyen al estables y en funcionamiento los vasos en la periferia del injerto, presentan una oportunidad única para transmitir una entrada molecular definida al tejido trasplantado. Como una prueba del principio, ejecutivos fueron manipulados a niveles express súper fisiológicos de hormona Anti-Mullerian (AMH), un miembro de la superfamilia de beta (TGFβ) factor de crecimiento transformante que se ha demostrado que restringir el crecimiento folicular17. Comparación de la distribución folicular en los injertos trasplantados conjuntamente con control y células de AMH-expresión comprueba si la actividad biológica y potencia de ejecutivos de ingeniería.

En Resumen, mediante la mejora de injerto viabilidad y supresión de la movilización precoz del grupo folicular, este enfoque puede aumentar la productividad de auto trasplanta tejido ovárico en pacientes sometidos a la preservación de la fertilidad. Por otra parte, la plataforma basada en ExEC permite interrogatorio experimental de reguladores moleculares que han sido implicados en el desarrollo folicular.

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Protocol

Todos los procedimientos con animales sujetos han sido aprobados por el institucional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) en el Weill Cornell Medical College. Todos los experimentos de xenotrasplante con tejido ovárico se realizaron conforme a las normas y directrices pertinentes. Tejido ovárico humano se obtuvo de pacientes programados para quimioterapia o radioterapia para el tratamiento del cáncer o trasplante de médula ósea previo. La Junta de revisión institucional (IRB) Comité de Weill Cornell Medical College aprobó la colección de tejidos para uso autólogo y con el consentimiento informado del paciente que se realizó una donación de hasta un 10% de su tejido ovárico para uso de la investigación.

1. colección de tejido ovárico humano

Nota: Cuando un tejido ovárico es transportada de un tránsito de instalación remota, tiempo no debe exceder 5 h18,19.

  1. Recoger el tejido ovárico y enjuague con una solución salina estéril.
  2. Lugar el ovario en un recipiente estéril.
  3. Vierta el medio de Leibovitz L-15 hasta que el ovario está completamente inmerso en el medio.
  4. Cerrar y sellar el contenedor.
  5. Transporte el recipiente sobre hielo.

2. procesar el tejido ovárico adquirido, adaptado de Schmidt et al. 18

  1. Preparados para el procesamiento y congelación ovárica
    1. Preparar 100 mL de medio para el proceso: solución antibiótico-antimicótico de Leibovitz L-15 medio 99 mL + 1 mL. Filtro de los medios de comunicación con filtro de 0.2 μm. Mantener el medio refrigerado.
    2. Preparar 100 mL de solución de congelación utilizando DMSO como un crio-protector. Añadir L-15 medio, 17,66 mL suero bovino fetal de 69,64 mL Leibovitz (FBS), 3,42 g de sacarosa (para crear una concentración final de 0.1 mol/L), 10,65 mL DMSO (para crear una concentración final de 1,5 mol/L) y 1 mL de solución de antibiótico-antimicótico. Filtrar el medio utilizando una unidad de filtro de 150 mL, 0,2 μm. Almacene el medio a 4 ° C.
    3. Esterilizar las herramientas quirúrgicas utilizando un autoclave programado para un ciclo de esterilización de sólidos envueltos.
  2. A la llegada del tejido
    1. Establecer las herramientas quirúrgicas estériles en la bioseguridad gabinete: bisturí con número 21, de la hoja agudo bien curvada tijeras y fórceps en variaban tamaños: largo (150 mm de longitud) y 2 tamaño mediano (alrededor de 110 mm de longitud).
    2. Guantes estériles, abra el contenedor dentro del gabinete de seguridad de la biotecnología. Tomar el ovario y colocar en una placa de Petri de 150 mm y medio frío preparado en el paso 2.1.1 sobre el ovario para evitar la deshidratación del tejido ovárico.
    3. Aislar el ovario de cualquier tejido residual y enjuague con medio frío hasta que esté desprovisto de tejido y sangre.
    4. El ovario en un limpio 150 mm plato de Petri, añadir frío medio, preparado en el paso 2.1.1 hasta que el ovario es la mitad sumergido en él.
  3. Disección del tejido ovárico
    1. Biseca el ovario y sacar la médula primera disección cortante, con unas tijeras finas curvas. Luego raspar la médula, con un bisturí estéril con un número de la lámina 21. Preceden hasta que el tejido cortical es 1-1.5 mm de espesor.
    2. Cortar el tejido cortical en astillas de 2-3 mm de ancho, la longitud de la tira será toda la longitud de la pieza ovárica que fue procesada.

3. ovario tejido de congelación lenta, adaptado de Newton et al. y Oktay et al. 6 , 20

  1. Preparación para la congelación
    1. Crioviales de etiqueta (1,8 mL).
    2. Añadir 1,5 mL de la solución congelada preparada en el paso 2.1.2 a cada frasco.
    3. Transferencia de una tira cortical por vial criogénico que contiene la solución congelada.
    4. Equilibre la franja cortical por 20 min en una placa giratoria, aplique suave agitación a 4 ° C.
  2. Lento de congelación de tejido ovárico
    1. Cargar los crioviales en un congelador programable cepillo a partir de 0 ° C.
    2. Enfriar en 2 ° C/min hasta-7 ° C.
    3. Mantener los tejidos en esta temperatura constante durante 10 minutos.
    4. Realizar siembra manual para la inducción de nucleación de hielo cristal, tocando cada cryovial con una punta de algodón sumergida en nitrógeno líquido (LN2).
    5. Seguir a enfriar a 0.3 ° C/min hasta que la temperatura de la muestra alcanza los-40 ° C.
    6. Enfriar a una velocidad mayor de 10 ° C/min hasta-140 º C.
    7. Crioviales de transferencia a dewar para almacenamiento en LN2 (-196 ° C).

4. preparación para la cirugía (ooforectomía Bilateral y el trasplante Co)

  1. Preparación de placas
    1. Un día antes de descongelar el tejido ovárico para el trasplante
      1. Coloque un trozo de una película de plástico de la parafina en el fondo de un plato de Petri de 50 mm, aerosol con 70% etanol hasta que será totalmente cubierto.
      2. Deje los platos de Petri durante la noche en la bioseguridad gabinete. Preparar 2 platos Petri por ratón.
    2. En la jornada de cirugías
      1. Aspire el etanol a partir de la placa de Petri que contiene la película de parafina plástica dentro del gabinete de seguridad de la biotecnología.
      2. Deje el plomo de la placa de Petri medio abierta hasta que el etanol se evapora completamente.
      3. Cierre la tapa de la caja Petri cuando la película de plástico de la parafina esté completamente seca. Mantenerlo dentro de la bioseguridad gabinete.
      4. Pozos de la etiqueta de un 6 placa bien por consiguiente, 0,1 mol/L de sacarosa + 1 mol/L de DMSO, 0.1 mol/L de sacarosa + 0,5 mol/L de DMSO, 0.1 mol/L de sacarosa, básica descongelación solución (BTS), medio.
  2. Preparación de las soluciones
    1. Preparar 100 mL de BTS: L-15 de Leibovitz medio mL 79 + FBS 20 mL de solución de antibiótico-antimicótico 1 mL. Filtro con un sistema de filtro de 0,22 μm.
    2. Preparar 10 mL de BTS con 0.1 mol/L de sacarosa. Escala 0,342 g de sacarosa y añadir 10 mL de BTS preparado en el paso 4.2.1, agite suavemente hasta que se disuelva completamente la sacarosa. Filtro de la solución usando una jeringa filtro de 0,22 μm.
    3. Preparar las soluciones según la tabla 1. Cubierta de tubos que contiene DMSO con papel de aluminio. Mantener refrigerado hasta su uso.

5. ovario tejido rápido deshielo

  1. Sacar el LN2 dewar un frasco que contiene congelado el tejido ovárico y mantenerlo a temperatura ambiente durante 30 s.
  2. Limpiar el frasco con un papel de tejido.
  3. Sumergir el frasco en un baño de agua de 30 ° C durante 1-2 minutos hasta su ' contenido es descongelado.
  4. Abra el frasco y coloque la franja cortical en el primer pozo que contiene 3ml de la primera solución (0.1 mol/L de sacarosa + 1 mol/L de DMSO, preparado en el paso 4.2.3).
    Nota: Todos los pasos que implica abrir la tapa de la placa se hará bajo flujo laminar.
  5. Incube la placa bien 6 en una placa giratoria a 4 ° C por 5 min mantenga la placa cubierta con papel de aluminio para este paso.
  6. Transferir la franja cortical en el segundo pozo que contiene 3 mL de la segunda solución (0.1 mol/L de sacarosa + 0,5 mol/L de DMSO, preparado en el paso 4.2.3).
  7. Incube la placa bien 6 en un plato giratorio para agitación suave a 4 ° C por 5 min mantenga la placa cubierta con papel de aluminio para este paso.
  8. Transferir la franja cortical en el tercer pozo, que contiene 4 mL de solución (BTS con 0.1 mol/L de sacarosa, preparado en el paso 4.2.2).
  9. Incubar en una placa giratoria para agitación suave a 4 ° C durante 5 minutos.
  10. Transferir la franja cortical en el cuarto así que contiene 4 mL de solución (BTS, preparado en el paso 4.2.1).
  11. Incubar en una placa giratoria para agitación suave a 4 ° C durante 5 minutos.
  12. Transferir la franja cortical en el último bien que contiene 4 mL de medio frío (preparado en el paso 2.1.1). No tejido ovárico descongelado el hielo hasta realizar el trasplante.

6. encapsulado de tejido ovárico

  1. Preparar las siguientes soluciones
    1. Preparar 25 mL de 20 mmol/L de tampón HEPES en solución salina al 0.9%. Filtrar y almacenar a 4 ° C.
    2. Preparar 1 mL de CaCl2 en la concentración de 1 mol/L. filtro y almacenar a 4 ° C.
  2. Preparar una solución madre de 50 mg/mL de fibrinógeno
    1. Añadir 1 g de fibrinógeno en 20 mL de 20 mmol/L de tampón HEPES en solución salina al 0.9% mezclando lentamente el fibrinógeno en el HEPES tamponada con solución salina durante varias horas a 37 ° C.
    2. Etiqueta de 1,7 mL tubos de microcentrífuga.
    3. Filtrar la solución a través de un filtro de jeringa de 0.45 μm y luego a través de un filtro de jeringa de 0,2 μm.
    4. Alícuota de la solución en 200 μL en el tubo de microcentrífuga y almacenar a-20 ° C.
  3. Preparar una solución stock de trombina 100 U/mL
    Nota: Soluciones de trombina por adsorción al vidrio, alícuota la solución en frascos de tubos de plástico.
    1. Añadir 2,5 mL de solución salina estéril 0,9% a 250 U de la trombina.
    2. Agitar suavemente hasta la solución para disolver completamente.
    3. Etiqueta de 1,7 mL tubos de microcentrífuga.
    4. Filtrar con un filtro de jeringa de 0,2 μm, alícuotas de 50 μL en tubos de microcentrífuga y tienda a-80 ° C.
  4. Hacer un coágulo de fibrina de 70 μl, obteniendo una concentración final de 10 mg/mL fibrinógeno y trombina U/mL 5
    Nota: Asegúrese de trabajar rápido, la solución coagula en unos segundos. También, evitar la adición de burbujas a la mezcla.
    1. Preparar una solución de fibrinógeno en un tubo de microcentrífuga de 1,7 mL.
      1. Añadir 360 μl de 20 mmol/L de tampón HEPES en solución salina 0.9% a la alícuotas de 200 μL de los valores de fibrinógeno, preparado en el paso 6.2.4.
      2. Mezclar mediante pipeteo suave.
      3. Mantener en hielo.
    2. Preparar una solución de trombina en un segundo tubo de microcentrífuga.
      1. Añadir 148.7 μl de DMEM a las alícuotas de 50 μl de la acción de la trombina, preparado en el paso 6.3.4.
      2. Mezclar mediante pipeteo suave.
      3. Añade el 1.3 μl de 1 mol/L de CaCl2.
      4. Mezclar mediante pipeteo suave.
      5. Mantener en hielo.
    3. Preparar una suspensión unicelular, en un tercer tubo de microcentrífuga.
      1. Separar las ingeniería de las células endoteliales de la placa utilizando un medio de separación celular enzima.
      2. Girar hacia abajo la y contar las células usando un hemocitómetro con una cubierta de vidrio.
      3. Utilizar 20.000 células por cada 1 mm2 de tejido ovárico. Calcula 20.000 x área de tejido ovárico en mm2.
      4. Desactivación de las células endoteliales ingeniería y resuspender en medio básico (DMEM) para alcanzar un volumen total de 16.8 μl.
      5. Mantener en hielo.
    4. Coloque un pedazo de tejido ovárico en una esponja de gasa estéril para secar durante unos segundos.
    5. Coloque el pedazo de tejido ovárico sobre la película de parafina plástica dentro de la caja de Petri de 50 mm.
    6. Añadir 39.2 μl de la solución de fibrinógeno, preparada en el paso 6.4.1.2, en la suspensión preparada en el paso 6.4.3.4, mezclar mediante pipeteo suave. Mantener en hielo.
    7. Añadir 14 μl de la solución de trombina preparada en el paso 6.4.2.4. Mezclar suavemente transfiriendo una vez. Trabajar rápido.
    8. Coloque la mezcla en la parte superior el tejido ovárico, pipeta en forma de una gota alargada.
    9. Coloque la placa de Petri con el coágulo en la incubadora a 37 ° C.

7. bilateral ooforectomía y co el trasplante de tejido ovárico humano con células endoteliales ingeniería NSG ratones

Nota: Diez a catorce semanas de edad hembra NSG ratones21 fueron utilizados (laboratorios de Jackson).

  1. Preparar herramientas todo quirúrgicas, como elaborada en el paso 2.1.3, asegúrese de que tener todas las suturas, almohadillas y cintas quirúrgicas prácticas.
  2. Anestesiar el ratón mediante un sistema de anestesia con isoflurano.
    1. Colocar el ratón en la cámara de inducción, cierre la tapa y abra la llave de paso correspondiente.
    2. Medidor de caudal abierto a 1.000 mL/min encienda el vaporizador y configurarlo para entregar 2-3.5%.
    3. Observar los efectos de la anestesia; pérdida de conciencia, lento y respiraciones regulares.
    4. Traslado al cono de nariz para mantener la anestesia. Gire el vaporizador para entregar 1-3%, dependiendo de los signos vitales.
    5. Verificar ausencia de reflejo pedal o cola. Si el reflejo está presente, aumente isoflurano hasta que está ausente.
  3. Recortar el pelo del ratón, desde la cola hasta la línea de las clavículas, con un cortapelos eléctrico.
  4. Coloque el ratón en una posición prona en la plataforma quirúrgica.
  5. Fijar el cono de la nariz a la plataforma quirúrgica usando una cinta quirúrgica.
  6. Extremidades del ratón suavemente a la plataforma quirúrgica usando una cinta de papel quirúrgica de 1.25 cm de ancho de cinta.
  7. Usar una jalea lubricante estéril e inserte un termómetro PR. fijar el termómetro por grabar a la plataforma quirúrgica usando un esparadrapo plástico perforado de 1,25 cm de ancho.
  8. Cinta la cola a la plataforma quirúrgica usando una cinta de papel quirúrgica amplia de 2.5 cm.
  9. Calor, mediante un infrarrojo o un cojín, de calefacción por agua caliente y controlar la temperatura corporal del ratón durante todo el procedimiento. Mantener temperatura corporal dentro del rango de 35-37 ° C.
  10. Limpie el área recortado con un palo de escobillón estéril solución de povidona-yodo y limpie con preparación de alcohol estéril.
  11. Repita el paso dos veces más de 6.9.
  12. Coloque una gota de ungüento veterinario lubricante ocular estéril sobre cada uno de los ojos del ratón para proteger de la deshidratación y daño a la córnea.
  13. Cubre el ratón con un paño quirúrgico estéril.
  14. Inyección sub cutánea (buprenorfina (1 mg/Kg) de S/C).
  15. Realizar una incisión dorsal medial longitudinal con bisturí (hoja #21).
  16. Realizar una ooforectomía bilateral, utilizar un enfoque dorsal.
    1. Libre de tejido conectivo subcutáneo por disección Roma utilizando las tijeras.
    2. Pellizque la fascia lateralmente al hacer midline incisión y llegar a la cavidad peritoneal con las tijeras afiladas.
    3. Coge el cojín gordo ovario y el ovario suavemente con una pinza y tire de ella fuera de la cavidad abdominal.
    4. Tome el ovario y la almohadilla de grasa con una pinza vascular.
    5. Ligar el ovario y la almohadilla de grasa utilizando una sutura absorbible de monofilamento de 4/0 en la base del ovario, distal a la trompa de Falopio.
    6. Clip del ovario distal a la ligadura. Asegúrese de que no hay ningún sangrado desde la base del muñón.
    7. Coloque el tejido en la cavidad abdominal y sutura la fascia con una sutura absorbible trenzada 6/0.
    8. Repita las etapas 7.15.1-7.15.7 en el lado contralateral.
  17. Co del trasplante del tejido ovárico.
    1. Realizar una incisión horizontal en la fascia sobre el Maximus del glúteo, en la longitud que se adapta a las dimensiones de los coágulos. Para crear un bolsillo dentro de este espacio virtual, abrir las tijeras debajo de la fascia.
    2. Recoger una pieza de tejido cortical encapsulado, como preparado en el paso 6.4.8 y colóquela en este bolsillo.
    3. Sutura la fascia con un 6/0 Sutura absorbible trenzada.
  18. Repetir etapas 7.16.1-7.16.3 en el lado contralateral.
  19. Cerca de la pared dorsal con puntos interrumpidos simples con una sutura absorbible de monofilamento de 4/0.
  20. Inyectar la lidocaína 0.5% (1,2 mL/Kg) S/C en el sitio de la incisión.
  21. Usar una preparación de alcohol estéril para limpiar la piel.
  22. Apague el isoflurano mientras monitorea la temperatura del ratón.
  23. Proporcionar 1-2 min de O2, sin isoflurano. Mantener por calentamiento el ratón hasta que comience a mover y volver a la conciencia.
  24. Coloque el ratón en una jaula de recuperación limpia y más tarde de la casa del ratón en una jaula separada hasta la completa curación de la herida quirúrgica.
  25. Inyectar la buprenorfina (1 mg/Kg) S/C según sea necesario cada 8-12 h, 24 h después de la operación.
  26. Mantener los ratones en jaulas separadas cuando todos los alimentos, agua, ropa de cama y jaulas son autoclave, hasta el punto final del experimento. Mantener las jaulas en un espacio ventilado a presión. Utilizar equipo de protección personal cuando maneje los ratones.

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Representative Results

Para determinar si co trasplante de ejecutivos proporciona un beneficio al tejido de pacientes, tiras corticales ováricas descongeladas se divide en trozos iguales de tamaño y engrafted bilateralmente en inmuno-comprometidos, gamma NOD scid (NSG), ratones. Con un lado encajado en un coágulo de fibrina solo (no ECs) y los otros ejecutivos que contienen (Figura 1a), cada ratón fue su propio control. Ejecutivos se obtuvieron mediante aislamiento de primaria endotelio de cordón umbilical humano y posterior tratamiento con el fragmento del gene Adenoviral E4-ORF1, como se describió anteriormente22,23. En pasos 2-5, ECs de la vena umbilical humana (hUVEC) fueron tratados con partículas lentivirales que codifican cDNA de la expresión constitutiva del fragmento del gene adenoviral E4-ORF1 de codificación. Este tratamiento mejora la supervivencia y el potencial angiogénico del endotelio como describió anteriormente22,23. Después de dos semanas, los vasos perfundidos funcionalmente se formaron de ejecutivos GFP marcado en la interfase del tejido huésped y el injerto (Figura 1b). Para etiqueta de vasos sanguíneos funcionales, ratones fueron inyectados con lectinas de 100 mL (0,5 mg/mL) bajo anestesia isoflurano 10 minutos antes de la cosecha el tejido. Cuantificación de los folículos a las 2 semanas siguiente trasplante demostró un beneficio significativo al folículo relativa cuenta en injertos asistida por ejecutivos que fue evidente en dos semanas (figura 1C). ECs exógenos forman vasos funcionales cuando Co trasplantado con tejido ovárico (Figura 1b) y cortical trasplantado junto con el ratón o humano ejecutivos aumentaron el número de folículos sobrevivientes en comparación con injertos de control (figura 1 c ). Este beneficio estaba ligado a la zona fibrótica disminución en asistencia de ejecutivos de injertos (figura 1 d), de cada injerto trasplantado, 3 secciones fueron teñidas con TRICROMICA, un medio establecido de delinear el tejido fibrótico24, para evaluar área fibrosa: una sección central y una sección de profundidad 600 μm de los lados superiores e inferiores del injerto. Las secciones manchadas se examinaron y analizaron mediante ImageJ para cuantificar la superficie y el área fibrosa fue descrito y cuantificado como porcentaje del área total del injerto (software ImageJ) manualmente. Valores finales se calcularon para cada injerto como la media de las 3 secciones analizadas. Lo importante, injertos eran trasplantados conjuntamente con fibroblastos de prepucio humano demostraron tejido pobre viabilidad y relativamente pocos folículos. (Figura 1e).

A continuación determinamos la función a largo plazo de los injertos de tejido ovárico con y sin ejecutivos (Figura 2ad, f, h). Después de 14 semanas, los ratones fueron estimulados diariamente con menotropins para longitudes variables de tiempo antes de que los animales fueron sacrificados, con la progresión de crecimiento del folículo, siendo supervisado en dos ratones mediante MRI (figura 2b-c). Los folículos en desarrollo se observaron en injertos de ejecutivos-asistida (figura 2 g, i) y control (figura 2e). Folículos de tamaño más y más grandes fueron notados en los injertos de ejecutivos-asistida (figura 2 g, ). En comparación con folículos antrales deriva el mismo tejido del paciente, estimulado con menotropins y trasplantado junto con ejecutivos, la capa de células de la granulosa en el folículo más avanzado muestra aumento de la expresión de los marcadores ovulatoria CD4425 y HABP126, así como aumenta la muerte celular (caspasas) y reduce la proliferación (Ki67) (figura 2j).

Varios estudios han demostrado que el pool de folículos prematuramente se activa después del injerto de tejido ovárico27,28,29,30. Se observó una tendencia similar en los injertos múltiples de un solo paciente en 2, 3 y 14 semanas (figura 3a). Para aprovechar la supuesta función de AMH en la represión de activación o crecimiento de los folículos17,31, nos ingeniería ejecutivos con lentivirus a expresar constitutivamente y proporcionan así una fuente directa paracrina de segregan AMH a tejido ovárico transplantado (figura 3b). Lentivirales transducción aumentó 100-fold GC anterior en ExEC que expresan cantidades indetectables de AMH. Células de tumor de células granulosas, secretan por el contrario, un nivel basal de AMH en el sobrenadante de cultivo celular. (Figura 3C). Dos semanas después del trasplante Co, vasos derivados de ejecutivos fueron observados en la interfaz de host-injerto y immunostaining reveló abundante proteína AMH en el lumen de los vasos derivada de AMH-ejecutivos (Figura 3d) en relación con los vasos formados de control de ejecutivos. Para probar la función de AMH independientemente de la influencia de la pro-angiogénica de ejecutivos, se utilizaron células madre mesenquimales (MSC) que fueron aisladas a partir de los fragmentos de la médula ovárica. Estas células transduced con partículas lentivirales codificación AMH y ampliadas en la cultura para el uso en el trasplante de Co. A trasplante junto con ejecutivos de AMH, se observó un aumento de 2 dobleces en la proporción de folículos primordiales. Esto, sin embargo, conduce a una disminución en el porcentaje de folículos primarios. AMH-MSCs conducen a mayor retención de folículos primordiales por 10 veces en relación a control de MSCs (figura 3f, h). El beneficio más importante para el mantenimiento de la piscina folicular quieto fue conferido por AMH-ECs cuando se hizo una comparación entre MSCs, ejecutivos, los injertos no celular (Ctl), ExEC AMH-MSCs y AMH-ejecutivos (figura 3i).

Figure 1
Figura 1: trasplante conjunto de tiras corticales ováricas con Ejecutivos de mejora la viabilidad y conserva la piscina folicular. (a) esquema del diseño experimental. Congelado el tejido ovárico humano fue encapsulado en un coágulo de fibrina, con o sin ejecutivos. Los coágulos fueron trasplantados en ratones NSG ooforectomizadas y cosechados en el punto final del experimento. (b) injertos corticales humanos trasplantados conjuntamente con ejecutivos derivados de hUVEC (verdes); células de sangre rojas son etiquetadas por TER-119 y límites del injerto están en blanco. (c) el porcentaje promedio de folículos total del trasplante con y sin el ratón o humanos ejecutivos + MAD. * P < 0.05. (d) el porcentaje promedio de la zona fibrótica del trasplante con y sin el ratón o humano ejecutivos + MAD. ** P < 0.001. (e) secciones representativas de los injertos ovarianos trasplantados junto con ejecutivos, sin las células y fibroblastos de prepucio humano. Esta figura ha sido modificada desde hombre et al. Representante de SCI 2017 15 de ago; 1:8203. doi: 10.1038/s41598-017-08491-z. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: función de injertos de tejido ovárico y viabilidad a largo plazo se mejoran por ejecutivos de. En h, c, d, f y b figuras los injertos de la izquierda son los ECs no de control, mientras que en el lado derecho los injertos trasplantaron conjuntamente con ejecutivos. (a) esquema Experimental para xenoinjerto a largo plazo del tejido cortical ovárico. (b) en las figuras b y c, el asterisco (lado derecho) representa el tejido ovárico trasplantado junto con ECs, mientras que la punta de la flecha (lado izquierdo) representa el tejido ovárico trasplantado sin las células. Ratón #1 era investigaciones con tejidos de un donante 6 de años y supervisado por MRI en el inicio de la estimulación (14 semanas, a la izquierda) y otra vez después de diez días de estimulación (15,5 semanas, derecha). (c) ratón #3 fue investigaciones con tejidos de un donante 19 de años y supervisado por MRI en 6 (20 semanas postrasplante), 7 (21 w) y 8 (22 w) semanas después del inicio de la estimulación. (d) imagen macroscópica del tejido ovárico humano implantado cosechado en 15,5 semanas ratón #1, el injerto en el lado derecho es el injerto de ExEC-asistida y vista histológico del injerto de control se muestra en (e). imagen macroscópica (f) de los injertos, ratón #2 fue sacrificado después de 20 semanas y control e injertos exEC-asistida se cosecharon para análisis histológico; el injerto de ExEC-asistida se muestra en la (g). (h) imagen macroscópica de los injertos en ratón #3 que fue sacrificado después de 22 semanas, el análisis histológico del injerto ExEC-asistida se muestra en (i). (j) las secciones de los injertos de ExEC-asistida de ratón #2 y #3 de ratón fueron manchadas para marcadores moleculares y se agrandan en el cuadro de asociados. Barras de escala = 100 μm. Esta figura ha sido modificada desde hombre et al. Representante de SCI 2017 15 de ago; 1:8203. doi: 10.1038/s41598-017-08491-z. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: ejecutivos diseñados para expresar AMH preservar un pool folicular quieto. (a) la proporción de los folículos se cuantificó para múltiples fragmentos de tejido ovárico del mismo paciente que fueron trasplantados conjuntamente con ECs para intervalos de largos y corto plazo; n = 3 en 2 semanas, números = 4 en 3 semanas y n = 2 en 14 semanas. (b) esquema del diseño experimental. Congelado el tejido ovárico humano fue encapsulado en un coágulo de fibrina, con ejecutivos/MSCs transduced con una partícula lentivirales de RFP que sirve como un control o ejecutivos/MSCs transduced con una partícula lentivirales AMH mCherry generando AMH-ECs/MSCs. Los coágulos fueron trasplantados en ratones NSG ooforectomizadas y cosechados en 2 semanas. (c) ejecutivos fueron transduced con lentivirus codifican AMH humana secretada; sobrenadante de cultivo celular de AMH-transduced ejecutivos se comparó con la línea de tumor de células de granulosa de COV-434 cultura y control ejecutivos. (d) dos semanas después del trasplante, fragmentos de tejido ovárico que se trasplantaron conjuntamente con cualquiera de los dos ECs (izquierdas) o AMH-ejecutivos (derecha) fueron teñidas con un anticuerpo específico para la proteína de la AMH. (e) la proporción relativa de los folículos en xenoinjertos trasplantados junto con control y ejecutivos de AMH se cuantificó después de 2 semanas (n = 6). (f) la proporción relativa de los folículos en xenoinjertos trasplantados junto con control y AMH-MSCs se cuantificó después de 2 semanas (n = 6). (g) la mediana + MAD de la relativa proporción de los folículos se comparó en xenoinjertos transplantados con control y ejecutivos de AMH-transduced (n = 6) después de 2 semanas. (h) la proporción relativa mediana + MAD de folículos se comparó en xenoinjertos transplantados con control y MSCs AMH-transduced (n = 6) después de 2 semanas. (i) el mediano porcentaje de los folículos primordiales observados por injerto en xenoinjertos transplantados con MSCs (n = 6), ejecutivos (n = 6), AMH-MSCs (n = 6) y ejecutivos de AMH (n = 6) se comparó en conjunto a las condiciones de control (no hay células, números = 15). Inserciones en (d) se agrandan en los cuadros a la derecha para ejecutivos de AMH y al no para ejecutivos de Ctl; líneas de trazo rojo y azul en (d) esquema tejido ovárico del tejido y anfitrión, respectivamente. Barras de error en la letra c representan la desviación estándar entre 3 repeticiones. Barras de error en (a, g-i) representan MAD entre el número de repeticiones aparece o se muestra en el gráfico. Barra de escala = 100 μm (d). * P < 0.05, ** P < 0.005. Esta figura ha sido modificada desde hombre et al. Representante de SCI 2017 15 de ago; 1:8203. doi: 10.1038/s41598-017-08491-z. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Solución Sacarosa-BTS (preparado en el paso 4.2.2) en μL DMSO en μL
Sacarosa-BTS con 1 mol/L de DMSO 2787 213
Sacarosa-BTS con 0,5 mol/L de DMSO 2894 106

Tabla 1: Preparación de solución de sacarosa.

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Discussion

Aquí demostramos que la trasplante de ejecutivos ofrece un beneficio significativo para la viabilidad del tejido ovárico y la función después de xenoinjerto en ratones. Normas para la aplicación clínica de la auto-trasplante de tejido ovárico para la preservación de la fertilidad no han sido conjunto y los parámetros óptimos (tamaño, sitio de trasplante, duración del injerto, etcetera.) 32 , 33 , 34 para mayor recuperación de la piscina folicular sigue siendo indefinido. Cuando se realiza la auto-trasplante, injerto avascular de tejido ovárico cortical descongelado se realiza principalmente en sitios pélvicos como el ovario restante, fosa ovárica o ligamento ancho35,36. Puesto que no hay anastomosis de extremo a extremo ocurre, este método de trasplante resulta en una onda de la pérdida de tejido isquémico y activación prematura de los folículos que se encuentra en el injerto. Por lo tanto, mientras que co trasplante con ejecutivos implica entrega de células endoteliales proliferativas que requieren mucho más escrutinio antes de ser teniendo en cuenta para el uso clínico, este enfoque puede acelerar la revascularización del tejido y puede salvar una fuerte proporción de folículos en ovarianos injertos.

Estos resultados plantea una nueva estrategia de basadas en células vascular para optimizar la viabilidad de tejido ovárico y la función después del trasplante. Dado el número creciente de pacientes optan por criopreservar tejido ovárico y llamadas recientes para el trasplante de tejido ovárico para pasar de estado experimental para abrir aplicación clínica37,38, este método puede ofrecer una terapéutica estrategia que permite una mayor viabilidad de los injertos, reduciendo así el número de tiras corticales ováricas que debe trasplantarse y aumentar su longevidad o función.

Reclutamiento prematuro o "burnout", también ha sido relacionada con el agotamiento de la piscina folicular durante la quimioterapia39y siguientes del trasplante de tejido ovárico34auto. Numerosos estudios han identificado vías de señalización que funcionan para activar de la supresión folicular movilización, y la alteración de esta función reguladora puede provocar una activación masiva de la piscina folicular durante una ventana isquémica crítica cuando la las necesidades metabólicas de los folículos nacientes son incapaces de cumplir. Aplicación de ejecutivos en este contexto no sólo aceleraría la reperfusión pero debido a su potencial el engraftment, ejecutivos también pueden ser diseñados para proporcionar un suministro directo paracrina de factores esa movilización directa folicular. La idea de utilizar AMH como modulador del crecimiento folicular ha sido aplicada por otros grupos. Kano et al. AMH entregado a través de cualquiera de los dos bombas osmóticas que contiene la proteína recombinante o IP inyección de partículas virales40. Estos enfoques dio lugar a una tendencia similar en la retención de los folículos primordiales, pero la entrega era sistémica. Como alternativa, ejecutivos de secreción de AMH proporcionan una fuente local y sostenida de AMH, sin embargo, la incorporación de las células vasculares Ingeniería en injertos de tejido ovárico está limitada por múltiples riesgos asociados con las terapias basadas en células. Respuesta inmune a antígenos extraños en ejecutivos es posible y el uso de las células proliferativas plantea la posibilidad de células circulantes, implantar y fomentar el crecimiento neoplásico en otros lugares en el cuerpo. Mientras estas limitaciones impiden la traducción de este enfoque en actuales pacientes sometidos a trasplante de auto, estos experimentos fundamentar la posibilidad de influencias pro-angiogénica y la represión de la movilización folicular prematura para aumentar la salida de tejido ovárico injertos y establecer un modelo de xenoinjerto robusto para el estudio mecanicista de la fisiología ovárica humana.

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Disclosures

Michael Ginsberg es un empleado de Angiocrine Biosciences, Inc., San Diego, CA, 92130, Estados Unidos, que aislado, transfected con E4-ORF-1 y etiquetado como las células endoteliales que utilizamos.

Acknowledgments

Omar Alexander Man para las ilustraciones.
L.M. fue apoyada por un premio de piloto de la clínica de Cornell y beca de investigación traslacional Science Center y un ASRM.
Los autores desean agradecer a James miembros de laboratorio para la lectura crítica del manuscrito.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Leibovitz’s L-15 medium Gibco 11415064
Antibiotic-Antimycotic Gibco 15240062 Anti-Anti X100
Sucrose Sigma S 1888
Fibrinogen Sigma F 8630 from bovine plasma
Thrombin Sigma T 1063 from human plasma
DMSO Sigma D 2650
DMEM Gibco 12491015
Enzyme Cell Detachment Medium Invitrogen 00-4555-56 Accutase
Plastic paraffin film Bemis NA Parafilm M
Surgical paper tape 2.5 cm 3M 1530-1 Micropore
Surgical Paper tape 1.25 cm 3M 1530-0 Micropore
Perforated plastic Surgical tape 1.25 cm 3M 1527-0 Transpore
Monofilament Absorbable Suture Covidien UM-203 Biosyn
Braided Absorbable Suture Covidien GL-889 Polysorb
Povidone-iodine Solution USP 10% Purdue Products 67618-153-01 Betadine Solution Swab Stick
Cryoviales Nunc 377267 CryoTube
sterile ocular lubricant Dechra 17033-211-38 Puralube
1.7 ml micro-centrifuge tube Denville C-2172 Eppendorf
Anasthesia system VetEquip V-1 table top system with scavenging
Endothelial cells Angiocrine Biosciences, Inc., San Diego, CA, USA Isolated, transfected with E4-ORF- 1 and labeled endothelial cells
Trichrome stain Sigma HT15-1kt Trichrome Stain (Masson) Kit
Isolectin Invitrogen I32450 isolectin GS-IB4 From Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor™ 647 Conjugate

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Bioingeniería número 135 preservación de la fertilidad criopreservación de tejido ovárico ovario auto-trasplante trasplante Co las células endoteliales exógenos (ejecutivos) revascularización movilización folicular prematura anti-Mullerian hormona (AMH)
Co el trasplante de tejido ovárico humano con células endoteliales Ingeniería: una combinación de estrategia basado en la célula acelerada perfusión con entrega directa paracrina
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Man, L., Park, L., Bodine, R., Ginsberg, M., Zaninovic, N., Schattman, G., Schwartz, R. E., Rosenwaks, Z., James, D. Co-transplantation of Human Ovarian Tissue with Engineered Endothelial Cells: A Cell-based Strategy Combining Accelerated Perfusion with Direct Paracrine Delivery. J. Vis. Exp. (135), e57472, doi:10.3791/57472 (2018).

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