Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

بروتوكول لنقل ميكرورنا إلى المشتقة من نخاع العظام المكونة للدم الخلايا الجذعية البالغة لتمكينها هندسة الخلايا جنبا إلى جنب مع استهداف المغناطيسي

Published: June 18, 2018 doi: 10.3791/57474
Automatic Translation
*1,2, *1,2, *1, 1,2, 1,2
1Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Department of Cardiac Surgery, Rostock University Medical Center, 2Department Life, Light and Matter of the Interdisciplinary Faculty, Rostock University
* These authors contributed equally

Summary

ويوضح هذا البروتوكول إجراء أمن وفعال لتعديل CD133+ الخلايا الجذعية المكونة للدم. قدم غير الفيروسية والمغناطيسية بوليبليكس النهج القائم الذي قد توفر أساسا للاستفادة المثلى آثار الخلايا الجذعية العلاجية، وكذلك فيما يتعلق بمراقبة المنتج الخلية التي تدار عن طريق التصوير بالرنين المغناطيسي.

Abstract

بينما CD133+ الخلايا الجذعية المكونة للدم (المنبوذة) قد ثبت لتوفير إمكانات عالية في مجال الطب التجديدي، ومعدلات استبقاء منخفضة بعد حقن الأنسجة المتضررة، فضلا عن أن معدلات الوفيات الملاحظة الخلية ضخمة تؤدي إلى الغاية الآثار العلاجية المقيدة. للتغلب على هذه القيود، سعينا إلى وضع بروتوكول يستند إلى غير فيروسية للهندسة الخلية المناسبة قبل إدارتها. تعديل CD133 البشرية+ الإعراب عن الطوائف المنبوذة باستخدام ميكرورنا (مير) تحميل بوليبليكسيس المغناطيسي وعولجت فيما يتعلق بالاقبال على الكفاءة والسلامة، فضلا عن إمكانية استهداف الخلايا. الاعتماد على أن البروتوكول، يمكن أن نحقق معدلات الإقبال على مير عالية من 80 – 90% في حين CD133+ خصائص الخلية الجذعية تظل غير متأثرة. وعلاوة على ذلك، تقدم هذه الخلايا المحورة خيار استهداف المغناطيسية. يصف لنا هنا إجراء آمنة وذات كفاءة عالية لتعديل CD133+ المنبوذة. ونحن نتوقع هذا النهج لتوفير تقنية قياسية لتعظيم الاستفادة آثار العلاجية من الخلايا الجذعية والرصد للمنتج الخلية التي تدار عن طريق التصوير بالرنين المغناطيسي (التصوير بالرنين المغناطيسي).

Introduction

CD133+ المنبوذة تمثل سكان خلية الجذعية والسلف غير متجانسة مع واعدة يمكن للطب التجديدي. على التمايز المكونة للدم، وبطانية، وشذوذ محتمل1،2،3 يمكن CD133 الخلايا+ ، مثلاً، للمساهمة في العمليات نيوفاسكولاريزيشن من خلال التمايز في حديثا تشكيل السفن وتنشيط برو-الأوعية مما يشير إلى جانب paracrine آليات4،5،،من67.

وعلى الرغم من إمكانياتها عالية أثبتت في التجارب السريرية المعتمدة أكثر من 30 (ClinicalTrails.gov)، نتائجها العلاجية لا تزال قيد المناقشة المثيرة للجدل4. في الواقع، يعوقها تطبيق السريري للطوائف المنبوذة استبقاء منخفضة في الجهاز للفائدة وخلية أولية ضخمة وفاة5،،من89. هندسة CD133 إضافية+ زرع المنبوذة السابقة يمكن أن يساعد التغلب على هذه التحديات.

وسيكون شرط واحد لخلية كفاءة علاج الحد موت الخلايا الأولية الضخمة لتعزيز engraftment العلاجية الخلايا ذات الصلة10. أثبتت الدراسات الحالية خسارة هائلة خلية 90 – 99% في الأجهزة عالية perfused مثل الدماغ والقلب أثناء أول ح 1 – 2، مستقلة عن نوع الخلايا المزروعة أو تطبيق توجيه11،،من1213 ،15،14،،من1618،17،19،،من2021. اتفاقية استكهولم وضع العلامات باستخدام جسيمات نانوية مغناطيسية (منبس) تمكن استراتيجية مبتكرة غير الغازية للخلايا المستهدفة للموقع لفائدة22،،من2324،25،26 وفي نفس الوقت يسمح برصد خلية باستخدام التصوير بالرنين المغناطيسي27 والمغناطيسي الجسيمات التصوير (MPI). الأكثر كفاءة في فيفو الدراسات تطبيق الخلية ممغنط تستهدف الإبقاء على الخلية المستخدمة بعد الإدارة المحلية بدلاً من توجيه الخلية بعد الحقن الوريدي23،24،28 . ولذلك، تهدف مجموعتنا نظام التسليم يتكون من أكسيد الحديد سوبيرباراماجنيتيك جسيمات نانوية29. مع هذا الأسلوب، CD133+ كفاءة إمكانية استهداف الطوائف المنبوذة والخلايا البطانية البشرية الوريد السري (هوفيكس)، والذي تجلى في المختبر محاولات30،31.

عقبة أخرى لاتفاقية استكهولم العلاجات هو البيئة تحريضية معادية للأنسجة المتضررة بعد الزرع، مما يسهم في موت الخلية الأولى32. بالإضافة إلى العديد من الدراسات السابقة تكييف تطبيق ميرس العلاجية ذات الصلة باختبار33؛ وقد ثبت بنجاح أن ميرس apoptotic المضادة تمنع المبرمج في المختبر ، وتعزيز خلية engraftment في فيفو33. هذه الجزيئات الصغيرة، وتتألف من 20-25 النيوكليوتيدات، تلعب دوراً حاسما المغيرون بوسترانسكريبشونال من الكشف رسول (مرناس)، ومما يؤثر على مصير وسلوك الخلايا الجذعية34. وعلاوة على ذلك، تجنب إدخال خارجية ميرس دمج جينوم المضيف34مستقرة غير مرغوب فيها.

المحاولات الجارية لكفاءة إدخال الأحماض النووية (NAs) في الابتدائي المنبوذة تستند معظمها فيروسات المؤتلف8،35. وعلى الرغم من كفاءة عالية تعداء، التلاعب الفيروس المؤتلف عقبة رئيسية لترجمة مقعد على السرير، مثلاً، التعبير الجيني لا يمكن السيطرة عليها، الإمراضية، الاستمناع، والطفرات إينسيرشونال35 ،36. ولذلك، نظم التسليم غير الفيروسية مثل البوليمر القائم بنيات بالغة الأهمية لتطوير. ومن بين هذه بولييثيلينيميني (جزيرة الأمير إدوارد) يمثل وسيلة إيصال صالح تقدم فوائد ميرس مثل التكثيف نا لحماية من تدهور، والإقبال على الهاتف الخلوي، وإطلاق سراح داخل الخلايا عن طريق اندوسومال الهروب37،38. وعلاوة على ذلك، أثبتت مجمعات مير-برينس توافق مع الحياة عالية في التجارب السريرية39. لذلك، لدينا نظام التسليم يتكون من بيوتينيلاتيد كاتشين 25 تشعبت بي منضمة إلى المغلفة streptavidin MNP النواة30،31،40.

في هذه المخطوطة، نقدم بروتوكول شامل يصف (ط) دليل عزلة CD133+ اتفاقية استكهولم من التبرع بنخاع العظام البشرية (بي أم) مع وصف مفصل المنتج اتفاقية استكهولم واستراتيجية تعداء كفاءة ولطيف (ثانيا) نظام التسليم على أساس البوليمر مغناطيسيا غير الفيروسية للهندسة الوراثية من CD133+ SCs استخدام ميرس. CD133+ المنبوذة وتعزل وإثراء مغناطيسيا من البشرية تبين BM القصية استخدام سطح جسم المغناطيسي تنشيط خلية مقرها الفرز نظام (ماك). بعد ذلك، يتم تحليل جدوى الخليوي فضلا عن نقاء الخلية استخدام التدفق الخلوي. بعد ذلك، يتم إعداد مجمعات مير/برينس/حركة الأشخاص الطبيعيين و CD133+ المنبوذة هي ترانسفيكتيد. ويتم تحليل ح 18 بعد تعداء وكفاءة امتصاص وتأثير تعداء على سلامة التعبير وخلية علامة اتفاقية استكهولم. وعلاوة على ذلك، هو إجراء تقييم التوزيع داخل الخلايا من المركبات المعقدة تعداء استخدام تسمية أربعة ألوان وإضاءة منظم مجهرية (SIM).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

BM البشرية القصية لعزل خلية تم الحصول عليها من الجهات المانحة مستنيرة، الذين أعطوا موافقتهم الخطية باستخدام العينات الخاصة بهم للبحوث وفقا "إعلان هلسنكي". ثم وافقت اللجنة الأخلاقية من جامعة روستوك الدراسة المقدمة (reg. رقم أ 23 2010، لفترات طويلة في عام 2015).

1-إعداد الخلية

ملاحظة: استخدام الهيبارين الصوديوم (250 وحدة دولية/مل BM) لمنع تخثر الدم لفحص BM.

  1. CD133+ SC العزلة
    1. إعداد الحلول المطلوبة
      1. إعداد الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)/حمض الإيثيلين (يدتا) الأسهم الحل (2 مم) بمخالطة مل 996 من برنامج تلفزيوني 1 x 4 مل يدتا (0.5 م). مزيج الحل وفيلتراتي باستخدام عامل تصفية 0.45 ميكرومتر بشدة. تخزين في درجة حرارة الغرفة (RT).
      2. إعداد المخزن المؤقت أجهزة ماكينتوش بخلط مل 995 مم 2 برنامج تلفزيوني/يدتا مع 5 غ ألبومين المصل البقري (BSA). مزيج الحل وفيلتراتي باستخدام عامل تصفية 0.45 ميكرومتر بشدة. مخزن في 4 درجات مئوية.
      3. تحضير حل الأسهم كولاجيناز ب (40 مغ/مل) بإذابة 500 ملغ كولاجيناز ب (من Clostridium هيستوليتيكوم) في 12.5 مل من برنامج تلفزيوني. قوة في مزيج الحل وجعل مختبرين من 350 ميليلتر وتخزينها في-20 درجة مئوية.
      4. إعداد ديوكسيريبونوكليسي (الدناز) أنا الأسهم الحل (10 مغ/مل) بإذابة 100 مغ الدناز أنا (من بنكرياس البقر) في 10 مل من برنامج تلفزيوني. قوة في مزيج الحل وجعل مختبرين من 350 ميليلتر وتخزينها في-20 درجة مئوية.
    2. الهضم الأنزيمي للبشرية BM
      1. قبل الحارة على المديين المتوسط واللمفاويات البشرية RT وذوبان الجليد الإنزيمات (1 قاسمة كل كولاجيناز ب والدناز كل 20 مل BM).
      2. جمع BM من المحاقن في أنبوب 50 مل مخروطية وتخلط بلطف. تجاهل أي الجلطات الموجودة.
        ملاحظة: نقل 200 ميليلتر من BM غير مخفف في أنبوب 1.5 مل لتحليل سيتوميتريك تدفق اللاحقة. تخزين في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
      3. نقل 10 مل BM في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل جديد، وإضافة 6 مل من برنامج تلفزيوني/يدتا (2 مم)، 20 مل من اللمفاويات البشرية المتوسطة و 175 ميليلتر من "كولاجيناز ب" (40 مغ/مل) ميليلتر 175 من الدناز أنا (10 ملغ/مل). بلطف مزيج الحل واحتضان لمدة 30 دقيقة في RT على شاكر. كرر العينة BM المتبقية.
    3. الكثافة المتدرجة الطرد المركزي
      1. رئيس الوزراء أنبوب الطرد المركزي تدرج كثافة 50 مل بتطبيق 15 مل لمفاويات البشرية فصل المتوسطة في أنبوب 50 مل. أجهزة الطرد المركزي في 1,000 س ز لمدة 30 ثانية.
      2. طبقة بعناية 35 مل BM المخفف على أعلى كثافة الطرد المركزي التدرج أنبوب تصفية وأجهزة الطرد المركزي في 445 x ز لمدة 35 دقيقة في الرايت
        ملاحظة: إعدادات أجهزة الطرد المركزي تسارع منخفضة (3) ولا الفرامل (1).
      3. بعناية إزالة الأنبوب من أجهزة الطرد المركزي دون اهتزاز. تجاهل بعناية ~ 20 مل من الحل واضح العلوي دون لمس الطبقة غائم مباشرة على رأس عامل التصفية.
      4. نقل طبقة غائمة (الذي هو مباشرة على رأس عامل التصفية ويحتوي على الخلايا وحيدات النوى (الشركات المتعددة الجنسيات)) في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل جديد وملء مع برنامج تلفزيوني/أدتا إلى وحدة تخزين نهائي من 50 مل بعناية.
        ملاحظة: دمج جميع الشركات المتعددة الجنسيات من عينة المريض BM واحدة في أنبوب جديد واحد.
      5. الاعتماد الشركات المتعددة الجنسيات بنقل 10 ميليلتر من تعليق خلية 50 مل في أنبوب 1.5 مل. إضافة 10 ميليلتر من 3% حمض الخليك مع الميثيلين الأزرق. بلطف المزيج وتطبيق 10 ميليلتر في غرفة الفرز. حساب العدد من الشركات المتعددة الجنسيات.
      6. أجهزة الطرد المركزي بتعليق الشركات متعددة الجنسيات في 300 x ز للحد الأدنى 10 تجاهل المادة طافية.
        ملاحظة: أثناء الطرد المركزي، تهدئة النابذة من الرايت إلى 4 درجات مئوية.
    4. التحديد المغناطيسي من CD133+ SCs استخدام جسيمات ديكستران الحديد سوبيرباراماجنيتيك المرتبطة بجسم CD133 البشرية
      ملاحظة: أثناء هذه الخطوة، تعمل على الجليد. حلول تخزين حتى الاستخدام عند 4 درجة مئوية. تخزين أجهزة ماكينتوش مغناطيس دائم والفصل بين الأعمدة، والتصفية قبل الفصل في 4 درجات مئوية.
      1. اختر حجم العمود. < 1.2 x8 10 الشركات المتعددة الجنسيات، استخدام مرض التصلب العصبي المتعدد الأعمدة، وعن > 1.2 x 108 الشركات المتعددة الجنسيات، استخدم أعمدة ليرة سورية (انظر الجدول للمواد).
      2. لإعداد للتحديد المغناطيسي لعدد الخلايا الإجمالي8 1 × 10، ريسوسبيند بعناية الشركات المتعددة الجنسيات في المخزن المؤقت لأجهزة ماكينتوش ميليلتر 300 (4 درجات مئوية). إضافة 100 ميليلتر FcR كاشف الحظر (4 درجة مئوية) وجزيئات 100 ميليلتر CD133، مرتبطة بجسم الحديد سوبيرباراماجنيتيك ديكستران (4 درجات مئوية).
      3. مزيج تعليق خلية بلطف واحتضان لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية. بلطف يهز تعليق الخلية أثناء الحضانة (2 – 3 س).
      4. إضافة 2 مل من المخزن المؤقت لأجهزة ماكينتوش (4 درجة مئوية) لكل 1 × 108 مجموع الشركات المتعددة الجنسيات. المزيج بلطف بتعليق خلية وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية.
      5. إعداد صاحب المغناطيس أجهزة ماكينتوش وإرفاق أجهزة ماكينتوش المغناطيس الدائم. تثبيت العمود أجهزة ماكينتوش وتطبيق عامل التصفية قبل الانفصال في الأعلى.
      6. حجته العمود الأول من أجهزة ماكينتوش MS/ليرة سورية وفصل ما قبل تصفية مع 0.5 مل (مللي ثانية) أو 3 مل (LS) لأجهزة ماكينتوش المخزن المؤقت (4 درجات مئوية).
        ملاحظة: لم تسمح الأعمدة أجهزة ماكينتوش لتجف بعد الموازنة.
      7. تجاهل المادة طافية وريسوسبيند بيليه التي تم الحصول عليها في 500 ميليلتر من المخزن المؤقت لأجهزة ماكينتوش (4 درجة مئوية) الواحدة 1 × 108 خلية إجمالي المبلغ. تطبيق تعليق خلية في عامل التصفية قبل الانفصال.
      8. تغسل أجهزة ماكينتوش العمود وفصل ما قبل التصفية باستخدام ثلاث مرات، لكل غسل، 0.5 مل (مللي ثانية) أو 3 مل (LS) لأجهزة ماكينتوش المخزن المؤقت (4 درجات مئوية).
        ملاحظة: أثناء الغسيل-الخطوة الثالثة، تثبيت أجهزة ماكينتوش عمود ثاني في أجهزة ماكينتوش المغناطيس الدائم وحجته العمود الثاني من أجهزة ماكينتوش MS/ليرة سورية مع 0.5 مل (مللي ثانية) أو المخزن المؤقت لأجهزة ماكينتوش 3 مل (LS) (4 درجات مئوية).
      9. تجاهل عامل التصفية قبل الانفصال.
      10. الوت الكسر الخلية مباشرة على أجهزة ماكينتوش العمود الثاني: إضافة 1 مل (مللي ثانية) أو 5 مل (LS) أجهزة ماكينتوش المخزن المؤقت (4 درجة مئوية) إلى العمود الأول من أجهزة ماكينتوش وإزالة العمود أجهزة ماكينتوش من أجهزة ماكينتوش المغناطيس الدائم. نقل أجهزة ماكينتوش أول عمود فوق العمود الثاني في أجهزة ماكينتوش على الفور ودفع تعليق خلية عن طريق أجهزة ماكينتوش العمود باستخدام المكبس المزود.
      11. أغسل العمود أجهزة ماكينتوش ثلاث مرات، باستخدام لكل غسل 0.5 مل (مللي ثانية) أو أجهزة ماكينتوش 3 مل (LS) المخزن المؤقت (4 درجات مئوية).
      12. الوت الكسر خلية من العمود بإضافة 1 مل (مللي ثانية) أو 5 مل (LS) أجهزة ماكينتوش المخزن المؤقت (4 درجة مئوية) إلى العمود الثاني في أجهزة ماكينتوش وإزالة العمود أجهزة ماكينتوش من أجهزة ماكينتوش المغناطيس الدائم. نقل العمود أجهزة ماكينتوش الثاني أعلاه 1.5 مل أنبوب (MS) أو 15 مل الأنبوبة المخروطية (LS) على الفور ودفع تعليق خلية عن طريق أجهزة ماكينتوش العمود باستخدام المكبس المزود.
      13. أجهزة الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. عناية تجاهل المادة طافية وريسوسبيند بيليه التي تم الحصول عليها في 100 ميليلتر من المخزن المؤقت لأجهزة ماكينتوش (4 درجات مئوية).
      14. عد CD133+ الخلايا: نقل 6 ميليلتر من تعليق خلية في أنبوب 1.5 مل. إضافة 6 حل تريبان الأزرق ميليلتر (0.4 في المائة). بلطف المزيج وتطبيق 10 ميليلتر في غرفة الفرز. حساب عدد CD133+ الخلايا.
      15. تخزين في CD133+ الخلايا على الجليد حتى البذر.
  2. وصف CD133 طازجة المعزولة+ المنبوذة
    ملاحظة: ينبغي الاضطلاع العمل التالية في غرفة محمية من الضوء الساطع (خافت الإضاءة فقط). الاحتفاظ بأنابيب، والمخازن، والأجسام المضادة على الجليد ما لم ينص على خلاف ذلك.
    1. إعداد الطوائف المنبوذة لتحليل تدفق سيتوميتريك
      1. استخدام عينتين (كل 10 ميليلتر) من مختبرين BM وعينه واحدة من CD133 طازجة المعزولة+ المنبوذة (الحد الأدنى، 1 × 104 خلايا) للتحليل. نقل الخلايا في أنبوب 1.5 مل. إضافة 10 ميليلتر من FcR حجب الكاشف وملء مع المخزن المؤقت لأجهزة ماكينتوش (4 درجة مئوية) إلى حجم 33 ميليلتر.
      2. إضافة الأضداد التالية على الجانب الداخلي لكل منهما أنبوب (انظر الجدول 1): مكافحة-CD34-fluorescein isothiocyanate (فيتك) (استنساخ: AC136)، مكافحة-CD133/2-فيكوريثرين (PE) (استنساخ: 3 293)، ايستب مراقبة 2b مفتش الماوس-PE، مكافحة--CD45-اللوفيكوسيانين (APC)-H7 (استنساخ: 2 د 1)، و 7-أمينواكتينوميسين (الإغراق). بعد أن تم إضافة جميع الأجسام المضادة، اهتز أسفل الجانب الأجسام المضادة من الأنبوب. مزيج الحل (الحجم النهائي 50 ميليلتر) بلطف واحتضان لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية.
      3. أضف 1 مل من خلايا الدم الحمراء (RBC) x 1 تحلل المخزن المؤقت، بلطف مزيج التعليق، واحتضان على الجليد 10 دقيقة الطرد المركزي بتعليق على 300 x ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية.
      4. تجاهل المادة طافية وريسوسبيند بيليه التي تم الحصول عليها في برنامج تلفزيوني 100 ميليلتر (4 درجات مئوية). تخزين على الجليد حتى تحليل تدفق سيتوميتريك.
    2. تحليل سيتوميتريك من CD133 تدفق+ المنبوذة
      1. لدراسة جدوى الخلية ونقاء CD133+ اتفاقية استكهولم، استخدام تكييف "المجتمع الدولي من هيماتوثيرابي" والاختلاس الهندسية (إيشاجي) التدفق الخلوي النابضة استراتيجية41 (انظر تصوير الممثل في الشكل 1). استخدم الأمر التالي:
        الخطوة 1: اختيار خلية السكان (الشكل 1A)
        الخطوة 2: اختيار CD45 الخلايا+ (الشكل 1B)
        الخطوة 3: اختيار CD45 قابلة للحياة+ الخلايا (الشكل 1)
        الخطوة 4: اختيار CD45 قابلة للحياة+/CD34+ الخلايا (الشكل 1)
        الخطوة 5: اختيار CD45 قابلة للحياة+/CD34+/CD133+ الخلايا (الشكل 1E)
        تشغيل تدفق سيتوميتير (انظر الجدول للمواد) وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
      2. حساب بقاء الخلية ونقاء باستخدام المعادلات التالية:

Equation 1   معادلة 1

Equation 2   المعادلة 2

  1. خلية ثقافة CD133 طازجة المعزولة+ المنبوذة
    1. الكوة 100 × سيتوكين الإنسان المؤتلف تكملة في 100 ميليلتر مختبرين وتخزينها في-20 درجة مئوية. ذوبان الجليد واحد قاسمة 100 x قبل إعداد متوسطة.
    2. إعداد CD133+ SC الثقافة المتوسطة، متوسطة التوسع في الخلايا المكونة للدم خالية من المصل تستكمل مع الملحق سيتوكين البشري الماشوب (س 1 النهائي) والبنسلين/ستربتوميسين 1%.
    3. عزل البذور 5 × 104 طازجة CD133+ المنبوذة تعداء في صفيحة 24-جيدا مع 500 ميليلتر الثقافة المتوسطة. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية و 5% CO2% 20 س2.
      ملاحظة: البذور 5 × 104 طازجة معزولة CD133+ المنبوذة كعنصر تحكم لتحليل تدفق سيتوميتريك.

2-إعداد مجمعات تعداء

ملاحظة: أثناء هذه الخطوة، تبقى ribonuclease مساحة العمل الكامل (رناسي)-مجاناً باستخدام حل تطهير رناسي واستخدام خالية رناسي المواد القابلة للاستهلاك فقط.

  1. إعداد مير
    ملاحظة: ينبغي الاضطلاع العمل التالية في غرفة محمية من الضوء الساطع (خافت الإضاءة فقط).
    ملاحظة: بالنسبة مير-العينة: صبغ Cyanine 3 استخدام المسمى مير السلائف والسلائف غير مسمى مير.
    1. إعداد الحل مير الأسهم (50 ميكرومتر)، يؤدي إلى تمييع المبلغ المطلوب من مير في مناسبة حجم المياه خالية من نوكلاس (مثلاً، نمول 5 مخفف من مير في 100 ميليلتر المياه). بلطف مزيج الحل، الكوة الأسهم مير (5 ميليلتر)، وتخزين دون-20 درجة مئوية.
  2. إعداد برينس
    1. إعداد بي عقب البروتوكولات القياسية وعلما بي تركيز المخزون31،42 .
  3. إعداد حركة الأشخاص الطبيعيين
    1. إعداد منبس عقب البروتوكولات القياسية وملاحظة حركة الأشخاص الطبيعيين تركيز المخزون31،42.
  4. إعداد مجمعات مير/برينس
    1. تحضير محلول جلوكوز 5% بتمييع د-(+)-الجلوكوز في المياه خالية من نوكلاس. بلطف مزيج الحل، اليكووت الأسهم (1.5 مل)، وتخزينها في 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: ينبغي الاضطلاع العمل التالية في غرفة محمية من الضوء الساطع (خافت الإضاءة فقط).
    2. استخدام 20 pmol مير كل من30لوحة 24-جيدا جيدا. تمييع مير في حل جلوكوز 5% بتركيز نهائي من 0.25 مير pmol/ميليلتر.
    3. حساب مقدار بي المطلوبة استناداً إلى مقدار مير (20 pmol، خطوة 2.3.1) والنيتروجين الأمثل (في بي) للفوسفات (من مير) نسبة (N/P) استناداً إلى تركيز بي الأسهم (الخطوة 2.2.1؛ واستخدمت هنا، أي بنسبة 7.5)30. تمييع برينس في مبلغ مساو من حل الجلوكوز 5% استناداً إلى المعادلة:
      Equation 3
      الذي يعيد ترتيب إلى
      Equation 4    المعادلة 3
      حيث يكون حجم برينس في ميليلتر و [برينس] مم، و N/P (الأمثل لهذا البروتوكول) هو 0.75. 0.12 عامل التحويل محددة إلى محطة مير.
    4. إضافة بي قبل المخفف إلى مير قبل المخفف ودوامه لمدة 30 ثانية.
    5. احتضان معقدة لمدة 30 دقيقة في الرايت مير/برينس
  5. إعداد المجمعات مير/برينس/حركة الأشخاص الطبيعيين
    ملاحظة: ينبغي الاضطلاع العمل التالية في غرفة محمية من الضوء الساطع (خافت الإضاءة فقط).
    1. حين تفرخ مجمعات مير/برينس، إعداد منبس سونيكاتينج منبس لمدة 20 دقيقة في 35 كيلو هرتز في حوض ماء سونيكاتينج على RT التأكد من الجسيمات في تعليق وليس تجميع.
    2. حساب عدد منبس المطلوبة (الحديد 3 ميكروغرام/مل) على أساس حل الأسهم حركة الأشخاص الطبيعيين (الخطوة 2.3.1).
    3. إضافة منبس سونيكاتيد في المجمعات مير/برينس ودوامه ل 30 س. إينكوباتي المجمعات مير/برينس/حركة الأشخاص الطبيعيين لمدة 30 دقيقة في الرايت
  6. إعداد المجمعات تعداء لتسمية أربعة ألوان باستخدام سيم
    ملاحظة: استخدم مير السليفة غير مسمى.
    1. قم بتسمية مير مع استخدام 5 سينين صبغ صبغ 5 سينين مير وسم كيت (انظر الجدول للمواد) اتباع إرشادات الشركة المصنعة. قياس تركيز مير النهائي باستخدام جهاز المطياف الضوئي المدرجة في (انظر الجدول للمواد) وفقا للإعداد قبل توفيرها من قبل الشركة المصنعة (الحمض النووي الريبي-40). قاسمة مير (5 ميليلتر) ومخزن في-80 درجة مئوية محمية من الضوء.
    2. قم بتسمية بي مع صبغ fluorescence الأخضر الساطع باستخدام البروتين المناسبة وصفها كيت (انظر الجدول للمواد) اتباع إرشادات الشركة المصنعة. تعريف تركيز بي النهائي باستخدام مقايسة نينهيدرين (الخطوة 2.2.1). قاسمة بي (في الحجم محسوبة على أساس المعادلة 3) وتخزينها في 4 درجات مئوية محمية من الضوء.
    3. تسمية منبس مع صبغ والرودامين مترافق إلى البيوتين استخدام نسبة من 1:1,000 ث/ث، وصبغ لحركة الأشخاص الطبيعيين. مزيج صبغ والرودامين ومنبس التزامن مع إعداد تكوين مجمع مير/برينس واحتضان الحل لمدة 30 دقيقة في الظلام. مباشرة استخدام المسمى منبس.

3-تعداء CD133+ المنبوذة

ملاحظة: أثناء هذه الخطوة، تبقى ribonuclease مساحة العمل الكامل (رناسي)-مجاناً باستخدام حل تطهير رناسي واستخدام خالية رناسي المواد الاستهلاكية فقط
ملاحظة: ينبغي الاضطلاع العمل التالية في غرفة محمية من الضوء الساطع (خافت الإضاءة فقط).

  1. إضافة مجمع ميرنا/برينس/MNP استعداد dropwise مباشرة في البئر المناسبة التي تحتوي على CD133 طازجة معزولة+ المنبوذة في الثقافة المتوسطة.
  2. المزيج بلطف هزاز لوحة ذهابا وإيابا. احتضان الخلايا ح 18 في 37 درجة مئوية و 5% CO2% 20 س2.

4-تحليل مير تعداء

  1. دراسة كفاءة امتصاص مير وسيتوتوكسيسيتي من مجمعات تعداء
    ملاحظة: بالنسبة مير-العينة: استخدام صبغ Cyanine 3 المسمى مير السلائف لتقييم الإقبال وغير transfected CD133+ المنبوذة لبوابات التحكم التدفق الخلوي.
    ملاحظة: ينبغي الاضطلاع العمل التالية في غرفة محمية من الضوء الساطع (خافت الإضاءة فقط).
    ملاحظة: الاحتفاظ أنابيب، والمخازن، والأجسام المضادة على الجليد ما لم ينص على خلاف ذلك.
    1. إعداد الحل بارافورمالدهيد الأسهم (منهاج عمل بيجين، 4 في المائة) بتمييع ز 4 منهاج عمل بيجين في 100 مل برنامج تلفزيوني وتدفئة الحل إلى 80 درجة مئوية. مزيج الحل وضبط قيمة pH إلى 7.3 بشدة. الكوة منهاج عمل بيجين الأسهم (1.5 مل) وتخزينها في-20 درجة مئوية.
    2. ح 18 بعد تعداء، جمع كل بئر في مل 1.5 منفصلة الأنبوبة. تغسل كل مرة جيدا مع 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني ونقل هذا تعليق خلية للأنبوب نفسه.
    3. أجهزة الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل المادة طافية وريسوسبيند بيليه التي تم الحصول عليها في 100 ميليلتر من المخزن المؤقت لأجهزة ماكينتوش 4 درجات مئوية.
    4. إضافة 0.5 ميليلتر صبغة أمين رد الفعل التمييز بين الخلايا الحية والميتة، ولطف مزيج التعليق، واحتضان لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. أضف 1 مل برنامج تلفزيوني (4 درجة مئوية) وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية.
    5. تجاهل المادة طافية وريسوسبيند بيليه التي تم الحصول عليها في 100 ميليلتر PBS، إضافة ميليلتر 33 منهاج عمل بيجين (4 في المائة) وتخزينها على الجليد أو عند 4 درجة مئوية حتى تحليل تدفق سيتوميتريك.
    6. ترتيب استراتيجية النابضة وفقا لتصوير الممثل في الشكل 2. تشغيل العينات على cytometer تدفق (انظر الجدول للمواد) وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
  2. وصف CD133 transfected مير+ المنبوذة
    ملاحظة: تستخدم مير السليفة غير مسمى، فضلا عن عدم transfected CD133+ المنبوذة للتدفق الخلوي بوابات التحكم.
    1. جمع كل خير في أنبوب منفصل 1.5 مل والطرد المركزي في 300 x ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية.
    2. استخدام استراتيجية النابضة كما هو موضح في الخطوة 1.2.
  3. النظر في التوزيع داخل الخلايا من مجمعات تعداء سيم
    1. إعداد المجمعات وترانسفيكت الخلايا كما هو موضح في القسم 2، والقسم 3.
    2. ح 18 بعد تعداء، جمع كل بئر في مل 1.5 منفصلة الأنبوبة. يغسل كل مرة جيدا مع 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني ونقل الغسيل في أنبوب البئر كل منهما. أجهزة الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية.
    3. تجاهل المادة طافية وريسوسبيند بيليه التي تم الحصول عليها في 1 مل من 2% مصل بقرى الجنين (FBS) في برنامج تلفزيوني بلطف مزيج التعليق والطرد المركزي في 300 x ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية.
    4. تجاهل المادة طافية، ريسوسبيند بيليه التي تم الحصول عليها في 100 ميليلتر من برنامج تلفزيوني، وإضافة ميليلتر 33 منهاج عمل بيجين (4 في المائة) لمدة 20 دقيقة.
    5. نقل تعليق خلية في لوحة 24-الثقافة جديدة التي تحتوي على كوفيرسليبس زجاج معقمة وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية.
    6. تجاهل المادة طافية وإضافة 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني. بلطف يهز اللوحة وتجاهل برنامج تلفزيوني.
    7. ضع كوفيرسليبس المعدة على الشرائح المجهرية استخدام المتوسطة تصاعد مائي للمحافظة على الأسفار وتجفيفها في RT على الأقل 1 ح.
    8. الحصول على الصور باستخدام هدفا غمر نفط X 100. إعدادات سيم: 405، 488، 561، و 633 نانومتر الليزر خطوط الإثارة ومداخن z مع عمق 16-بت في زوايا 3، 3 مراحل، مع متوسط 4، شبكات كل سطر الليزر: 23 ميكرون – 405، 34 ميكرومتر – 488، 42 ميكرون – 561، 51 ميكرومتر – 633.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يصف البروتوكول المقدم من العزلة اليدوي وإثراء البشرية CD133 المستمدة من BM المغناطيسية+ المنبوذة مع خلية مستقلة فيروس لاحقة الهندسية الاستراتيجية، كتكنولوجيا غير الغازية للتلاعب الخلايا في المختبر و في فيفو أداة رصد.

تسمح التكنولوجيا العزلة ثلاث خطوات هذا فصل بين الشركات المتعددة الجنسيات من BM القصية ما قبل هضمها من خلال الكثافة المتدرجة الطرد المركزي. بعد ذلك، CD133+ يمكن إثراء جزء الخلية مغناطيسيا باستخدام تكنولوجيا العزل المناسبة. وهذا ما يسمح إثراء CD133+ المنبوذة مع بقاء ونقاء أعلى من 80%، والذي يمكن تحديده من خلال التدفق الخلوي (الشكل 1). فيما يلي، استخدمت منتجات SC فقط التي تتطابق مع المتطلبات لإجراء مزيد من التجارب.

يسمح الأسلوب تعداء الموصوفة هنا مقدمة فعالة للغاية من مير في هذه العزلة طازجة CD133 البشرية+ المنبوذة الإقبال على ما يقرب من 80 في المائة من قابلة للبقاء مع الخلايا (الشكل 2)30. وبالإضافة إلى ذلك، هناك لا الآثار السامة للخلايا الكبيرة يتجلى ح 18 بعد تعداء مقارنة بمراقبة الخلايا (الشكل 2)30. وعلاوة على ذلك، يمكن ملاحظة يكفي التسليم والتوزيع المعتاد من المركبات المعقدة تعداء (مير، جزيرة الأمير إدوارد، ومنبس) داخل السيتوبلازم للخلايا باستخدام سيم (الشكل 3).

Figure 1
الشكل 1: الممثل منطقية النابضة استراتيجية ل CD133+ SC توصيف. (ألف-هاء) تصوير لاختيار 5-خطوة استراتيجية لإجراء تقييم صارم لبقاء الخلية ونقاء معزولة CD133+ اتفاقية استكهولم فضلا عن مراقبة ايستب CD133 (F) باستخدام عينة بي أم غير المعالجة المناسبة. (أ) باستثناء الحطام من السكان خلية سليمة في مؤامرة نقطة جانبية الأمام مبعثر (منتدى التعاون الأمني/SSC)، تليها مجموعة متعاقبة من CD45 (ب)+ الخلية السكان، CD45 قابلة للتطبيق (ج)+ الخلية السكان، (د) CD45 إيجابية مزدوجة قابلة للحياة+/CD34+ سكان الخلية، و (ﻫ) قابلة للحياة ثلاثية CD45 الإيجابية+/CD34+/CD133+ خلية السكان. البرتقالي: CD45+/CD34+/CD133+ الخلايا التي أبرزت في كل خطوة من خطوات التحديد. أسطورة: آسيا والمحيط الهادئ--Cy7: مكافحة-CD45، فيتك: المضادة-CD34، منتدى التعاون الأمني: قناة المبعثر إلى الأمام، PE: مكافحة-CD133، التعاون بين بلدان الجنوب: قناة مبعثر من جانب، وعاد 7: 7-أمينواكتينوميسين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: الممثل النابضة استراتيجية لتقييم كفاءة امتصاص مير وسيتوتوكسيسيتي من تعداء المعقدة. استراتيجيات النابضة (أ، ب) transfected CD133+ الطوائف المنبوذة، وكذلك حسب (ج، د) غير-transfected CD133+ المنبوذة للتحليلات (أ، ج) صبغ Cyanine3 المسمى (كفاءة امتصاص السلائف-ميرنا أحمر: Cy3 قابلة للحياة+ الخلايا) و (ب، د) الآثار السامة للخلايا للإجراء تعداء تميزت صبغة أمين رد الفعل للتمييز بين الخلايا الحية والميتة (الأزرق: الخلايا الميتة). أسطورة: التعاون بين بلدان الجنوب: الخلايا الجانب مبعثر القناة، فقط: غير transfected CD133+ المنبوذة، ميرنا/برينس/حركة الأشخاص الطبيعيين: CD133+ المنبوذة transfected مع مير المسمى Cy3 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: التصور داخل الخلايا من تعداء المعقدة. CD133+ SCs تم transfected مع ألوان المسمى مير/برينس/MNP المعقدة (مير: 20 بمول، جزيرة الأمير إدوارد: N/P نسبة 7.5، وحركة الأشخاص الطبيعيين: 3 ميكروغرام/مل). أنجز الممثل التصور ح 18 بعد تعداء استخدام إضاءة المركبة مجهرية. وصفت محطة مير مع صبغة Cyanine5 (أحمر)، بي مع صبغة مشرق فلورية خضراء (أخضر)، ومترافق منبس مع صبغ والرودامين إلى البيوتين (أصفر)، والنواة كان كونتيرستينيد مع DAPI (أزرق). شريط المقياس = 5 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

عينة FCR كاشف حظر [ميليلتر] المخزن المؤقت لأجهزة ماكينتوش [ميليلتر] الأجسام المضادة [ميليلتر] مجموع [ميليلتر]
عدد العينة خلايا [ميليلتر] ايستب CD133-PE CD133-PE CD34-فيتك CD45-آسيا والمحيط الهادئ--Cy7 إضافة
1 بي أم 10 10 12.5 5 - 5 2.5 5 50
2 بي أم 10 10 12.5 - 5 5 2.5 5 50
3 CD133+ (1 × 104) 10 12.5 - 5 5 2.5 5 50

الجدول 1: التخطيط بيبيتينج لتوصيف CD133 + SCs-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في السنوات الأخيرة، CD133+ المنبوذة ظهرت كمحتوى خلية واعدة للعلاجات المستندة إلى اتفاقية استكهولم كما يتضح من عدة المرحلة الأولى، والثانية، والثالثة التجارب السريرية43،،من4445،46، 47 , 48 , 49 , 50 , 51 , 52 , 53 , 54-نقدم هنا، بروتوكول مفصل للموحد دليل تنقية وتدفق سيتوميتريك توصيف هذه الخلايا من BM القصية البشرية. الإجراء وصف العزلة المستندة إلى أجهزة ماكينتوش يمثل استراتيجية لطيف وسريع وفعال للحصول على كسر اتفاقية استكهولم المكونة للدم النقي للغاية وقابلة للحياة. قد أثبتت التوافق جيدة جنبا إلى جنب مع التدهور السريع لحقن شاركت أجهزة ماكينتوش ميكروبيدس استخدامها لفرز الخلايا سابقا لدينا مجموعة55،56.

تم تطوير هذا الإجراء العزل باستخدام BM القصية البشرية كمصدر مواد، وذلك، يتيح البروتوكول حاليا تنقية المنبوذة المكونة للدم للاستخدام في البحوث غير السريرية. إذا CD133+ المنبوذة المعزولة من الأنسجة الأخرى (مثل بي أم التي تم الحصول عليها من الحرقفي) العديد من الخطوات للبروتوكول مثل الأنسجة الانزيمية الهضم، وكثافة استخدام الطرد المركزي قد تتطلب التكيف. لتطبيق الخلية السريرية، أنشأ مجموعتنا كذلك إجراء تصنيع في الموقع متوافقة مع برنامج الرصد العالمي باستخدام نظام تلقائي لتلبية مطالب إضافية باسم السريرية يحتاج57.

الهندسة للطوائف المنبوذة قبل تطبيقها وضع استراتيجية مبتكرة للتغلب على بعض العقبات في العلاج باتفاقية استكهولم، بما في ذلك الاحتفاظ بخلية منخفض وموت الخلايا الضخمة. يتضمن البروتوكول الحالي تعليمات لإنتاج نظام تعداء خالية من الفيروسات المتعددة الوظائف استناداً إلى تشعبت بي منضمة إلى منبس ومقدمته كفاءة إلى CD133+ المنبوذة30. ويتيح تطبيق هذا النظام تعديل الخلايا الوراثية وتوجيه الخلية التي تسيطر عليها مغناطيسيا، وتتبع الخلية غير الغازية عن طريق التصوير بالرنين المغناطيسي أو معهد ماكس بلانك30،،من3140،،من4258 , 59 , 60.

الأهم من ذلك، وقد تم تحسين شروط تعداء وصف للتعديل الوراثي عابرة من CD133+ المستمدة من BM المنبوذة30. في الأعمال السابقة، طبق هذا النظام تعداء أيضا بنجاح لإيصال بلازميد الحمض النووي ومير إلى آخر خلية أنواع31،،من4060. وقد أثبتت هذه التجارب أن الكفاءة تعداء، فضلا عن سيتوتوكسيسيتي هي الخلية تعتمد على نوع. ولذلك، التراكيب الأمثل لناس، وجزيرة الأمير إدوارد، ومنبس بحاجة إلى تعريف لكل نوع من الخلايا.

بسبب كفاءتها العالية، بي أحد البوليمرات الأكثر استخداماً للخلايا الوراثية غير الفيروسية الهندسة61. 61،التطبيق السريري62 من بي غير محدودة جداً حتى الآن بسبب أن61،السمية العامة63. من المثير للاهتمام، أن مجموعتنا أظهرت مؤخرا أن منبس تقليل سمية بي عندما تدرج في31،نظام تعداء60. في الوقت نفسه، سمية ممكن من أكسيد الحديد على أساس جسيمات نانوية الناجمة عن إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية (روس) تعتمد على الجرعة وتتم الموافقة على عدة أنواع من جسيمات نانوية سوبيرباراماجنيتيك للتصوير بالرنين المغناطيسي64،65 . ومع ذلك، يجب إيلاء اهتمام لسمية للنظام في المختبر و في فيفو.

عموما، البروتوكول معقدة جداً، التي تحتوي على العديد من الخطوات الحاسمة التي تحتاج إلى معالجتها بعناية فائقة. لهذا الغرض، وقد ابرزنا هذه النقاط في المقطع بروتوكول مع الملاحظات. على وجه الخصوص، نود أن نشير إلى أهمية بيئة خالية من رناسي تماما وتجنب أي التعرض للضوء عند التعامل مع الأصباغ الفلورية التطبيقية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب يعلن لا تضارب في المصالح.

Acknowledgments

هذا العمل كان تدعمها الوزارة الاتحادية للتعليم والبحوث ألمانيا (فكز 0312138A و 316159 فكز)، بوميرانيا الغربية ميكلينبورغ الدولة مع "صناديق الاتحاد الأوروبي الهيكلية" (كلية العلوم التربوية/إيفوم-B34-0030/10 وكلية العلوم التربوية/إيفبم-B35-0010/12)، و DFG (DA1296/2-1)، مؤسسة القلب الألمانية (F/01/12) والألمانية (كبار الشخصيات + 00240) ومؤسسة رطبة. وباﻹضافة إلى ذلك، تدعمها F.H. ومساء "فرون البرنامج من روستوك المركز الطبي الجامعي" (889001).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
7-AAD BD Biosciences 559925
Acetic Acid with Methylene Blue Stemcell Technologies 7060 3%
anti-CD133/2-PE (clone: 293C3) Miltenyi Biotec GmbH 130-090-853
anti-CD34-FITC (clone: AC136) Miltenyi Biotec GmbH 130-081-001
anti-CD45-APC-H7 (clone: 2D1) BD Biosciences 560178
rhodamine dye; Atto 565 dye conjugated to biotin ATTO-TEC GmbH AD 565-71
BD FACS LSRII flow cytometer BD Biosciences
BD FACSDiva Software 6.1.2 BD Biosciences
BSA Sigma-Aldrich GmbH A7906
CD133 antibody-linked superparamagnetic iron dextran particles; CD133 MicroBead Kit Miltenyi Biotec GmbH 130-097-049
collagenase B Roche Diagnostics GmbH 11088831001
counting chamber Paul Marienfeld GmbH & Co. KG
Cyanine 3 dye labelled precursor miR; Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control #1 Ambion AM17120
Cyanine 5 dye miR labelling kit; Cy5 dye Label IT miRNA Labeling Kit Mirus Bio MIR 9650
DNAse I Roche Diagnostics GmbH 10104159001 (100 U/mL)
ELYRA PS.1 LSM 780 confocal microscope Carl Zeiss Jena GmbH
FcR Blocking Reagent, human Miltenyi Biotec GmbH 130-059-901
bright green protein labeling kit; Oregon Green 488 Protein Labeling Kit Thermo Fisher Scientific O10241
aqueous mounting medium; Fluoroshield Sigma-Aldrich GmbH F6182
density gradient centrifugation tube; Leukosep Centrifuge Tube Greiner Bio-One 89048-932
MACS magnet holder; MACS MultiStand Miltenyi Biotec GmbH 130-042-303
MACS pre-separation filter Miltenyi Biotec GmbH 130-041-407 30 µm
MACS separation column (MS / LS) Miltenyi Biotec GmbH 130-042-201 / 130-042-401
MACS permanent magnet; MACS Separator Miltenyi Biotec GmbH 130-042-302
Millex-HV PVDF Filter Merck SLHV013SL 0.45 μm
mouse IgG 2b-PE Miltenyi Biotec GmbH 130-092-215
amine reactive dye; Near-IR LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit Thermo Fisher Scientific L10119
human lymphocyte separating medium; Pancoll Pan Biotech GmbH P04-60500 density: 1.077 g/mL
PBS Pan Biotech GmbH P04-53500 without Ca and Mg
PEI Sigma-Aldrich GmbH 408727 branched; 25 kDa
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 100 U/mL, 100 μg/mL
PFA Merck Schuchardt OHG 1040051000
unlabelled precursor miR; Pre-miR miRNA Precursor Negative Control #1 Ambion AM17110
RBC lysis buffer eBioscience 00-4333-57
RNAse decontamination solution; RNaseZap Thermo Fisher Scientific AM9780
human lymphocyte medium; Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium Pan Biotech GmbH P04-16500
recombinant human cytokine supplement; StemSpan CC100 Stemcell Technologies 2690
serum-free haematopoietic cell expansion medium; StemSpan H3000 Stemcell Technologies 9800
Streptavidin MagneSphere Paramagnetic Particles Promega Corporation Z5481
Trypan Blue solution Sigma-Aldrich GmbH T8154 0.4 %
UltraPure EDTA Thermo Fisher Scientific 15575020 0.5 M; pH 8.0
ZEN2011 software Carl Zeiss Jena GmbH
NanoDrop 1000 Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific
Sonorex RK 100 SH sonicating water bath Bandelin electronic Ultrasonic nominal output: 80 W; Ultrasonic frequency: 35 kHz

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Meregalli, M., Farini, A., Belicchi, M., Torrente, Y. CD133(+) cells isolated from various sources and their role in future clinical perspectives. Expert opinion on biological therapy. 10 (11), 1521-1528 (2010).
  2. Lee, S., Yoon, Y. -S. Revisiting cardiovascular regeneration with bone marrow-derived angiogenic and vasculogenic cells. British journal of pharmacology. 169 (2), 290-303 (2013).
  3. Beksac, M., Preffer, F. Is it time to revisit our current hematopoietic progenitor cell quantification methods in the clinic? Bone marrow transplantation. 47 (11), 1391-1396 (2012).
  4. Bongiovanni, D., et al. The CD133+ cell as advanced medicinal product for myocardial and limb ischemia. Stem cells and development. 23 (20), 2403-2421 (2014).
  5. Wang, X., et al. The Clinical Status of Stem Cell Therapy for Ischemic Cardiomyopathy. Stem cells international. 2015, 135023 (2015).
  6. Ma, N., et al. Intramyocardial delivery of human CD133+ cells in a SCID mouse cryoinjury model: Bone marrow vs. cord blood-derived cells. Cardiovascular research. 71 (1), 158-169 (2006).
  7. Rafii, S., Lyden, D. Therapeutic stem and progenitor cell transplantation for organ vascularization and regeneration. Nature medicine. 9 (6), 702-712 (2003).
  8. Wang, D., Gao, G. State-of-the-art human gene therapy: part I. Gene delivery technologies. Discovery medicine. 18 (97), 67-77 (2014).
  9. Sart, S., Ma, T., Li, Y. Preconditioning stem cells for in vivo delivery. BioResearch open access. 3 (4), 137-149 (2014).
  10. Liu, J., et al. Early stem cell engraftment predicts late cardiac functional recovery: preclinical insights from molecular imaging. Circulation. Cardiovascular imaging. 5 (4), 481-490 (2012).
  11. Lang, C., et al. In vivo comparison of the acute retention of stem cell derivatives and fibroblasts after intramyocardial transplantation in the mouse model. European journal of nuclear medicine and molecular imaging. 41 (12), 2325-2336 (2014).
  12. Goussetis, E., et al. Intracoronary infusion of CD133+ and CD133-CD34+ selected autologous bone marrow progenitor cells in patients with chronic ischemic cardiomyopathy: cell isolation, adherence to the infarcted area, and body distribution. Stem cells. 24 (10), Dayton, Ohio. 2279-2283 (2006).
  13. Caveliers, V., et al. In vivo visualization of 111In labeled CD133+ peripheral blood stem cells after intracoronary administration in patients with chronic ischemic heart disease. Q J Nucl Med Mol Imaging. 51 (1), 61-66 (2007).
  14. Terrovitis, J. V., Smith, R. R., Marbán, E. Assessment and optimization of cell engraftment after transplantation into the heart. Circulation research. 106 (3), 479-494 (2010).
  15. Rosado-de-Castro, P. H., et al. Biodistribution of bone marrow mononuclear cells after intra-arterial or intravenous transplantation in subacute stroke patients. Regenerative medicine. 8 (2), 145-155 (2013).
  16. Kang, W. J., Kang, H. -J., Kim, H. -S., Chung, J. -K., Lee, M. C., Lee, D. S. Tissue distribution of 18F-FDG-labeled peripheral hematopoietic stem cells after intracoronary administration in patients with myocardial infarction. Journal of nuclear medicine official publication, Society of Nuclear Medicine. 47 (8), 1295-1301 (2006).
  17. Blocklet, D., et al. Myocardial homing of nonmobilized peripheral-blood CD34+ cells after intracoronary injection. Stem cells. 24 (2), Dayton, Ohio. 333-336 (2006).
  18. Penicka, M., et al. One-day kinetics of myocardial engraftment after intracoronary injection of bone marrow mononuclear cells in patients with acute and chronic myocardial infarction. Heart (British Cardiac Society). 93 (7), 837-841 (2007).
  19. Schächinger, V., et al. Pilot trial on determinants of progenitor cell recruitment to the infarcted human myocardium. Circulation. 118 (14), 1425-1432 (2008).
  20. Dedobbeleer, C., et al. Myocardial homing and coronary endothelial function after autologous blood CD34+ progenitor cells intracoronary injection in the chronic phase of myocardial infarction. Journal of cardiovascular pharmacology. 53 (6), 480-485 (2009).
  21. Musialek, P., et al. Randomized transcoronary delivery of CD34(+) cells with perfusion versus stop-flow method in patients with recent myocardial infarction: Early cardiac retention of (m)Tc-labeled cells activity. Journal of nuclear cardiology official publication of the American Society of Nuclear Cardiology. 18 (1), 104-116 (2011).
  22. Kyrtatos, P. G., et al. Magnetic tagging increases delivery of circulating progenitors in vascular injury. JACC. Cardiovascular interventions. 2 (8), 794-802 (2009).
  23. Vandergriff, A. C., et al. Magnetic targeting of cardiosphere-derived stem cells with ferumoxytol nanoparticles for treating rats with myocardial infarction. Biomaterials. 35 (30), 8528-8539 (2014).
  24. Huang, Z., et al. Magnetic targeting enhances retrograde cell retention in a rat model of myocardial infarction. Stem cell research & therapy. 4 (6), 149 (2013).
  25. Yanai, A., et al. Focused magnetic stem cell targeting to the retina using superparamagnetic iron oxide nanoparticles. Cell transplantation. 21 (6), 1137-1148 (2012).
  26. Arbab, A. S., Jordan, E. K., Wilson, L. B., Yocum, G. T., Lewis, B. K., Frank, J. A. In vivo trafficking and targeted delivery of magnetically labeled stem cells. Human gene therapy. 15 (4), 351-360 (2004).
  27. Cores, J., Caranasos, T. G., Cheng, K. Magnetically Targeted Stem Cell Delivery for Regenerative Medicine. Journal of functional biomaterials. 6 (3), 526-546 (2015).
  28. Cheng, K., et al. Magnetic enhancement of cell retention, engraftment, and functional benefit after intracoronary delivery of cardiac-derived stem cells in a rat model of ischemia/reperfusion. Cell transplant. 21 (6), 1121-1135 (2012).
  29. Li, W., et al. Enhanced thoracic gene delivery by magnetic nanobead-mediated vector. The journal of gene medicine. 10 (8), 897-909 (2008).
  30. Müller, P., et al. Magnet-Bead Based MicroRNA Delivery System to Modify CD133+ Stem Cells. Stem cells international. 2016, 7152761 (2016).
  31. Voronina, N., et al. Non-viral magnetic engineering of endothelial cells with microRNA and plasmid-DNA-An optimized targeting approach. Nanomedicine nanotechnology, biology, and medicine. , (2016).
  32. Noort, W. A., et al. Mesenchymal stromal cells to treat cardiovascular disease: strategies to improve survival and therapeutic results. Panminerva Med. 52 (1), 27-40 (2010).
  33. Jakob, P., Landmesser, U. Role of microRNAs in stem/progenitor cells and cardiovascular repair. Cardiovascular Research. 93 (4), 614-622 (2012).
  34. Sen, C. K. MicroRNAs as new maestro conducting the expanding symphony orchestra of regenerative and reparative medicine. Physiological genomics. 43 (10), 517-520 (2011).
  35. Papapetrou, E. P., Zoumbos, N. C., Athanassiadou, A. Genetic modification of hematopoietic stem cells with nonviral systems: past progress and future prospects. Gene therapy. 12, Suppl 1. S118-S130 (2005).
  36. Chira, S., et al. Progresses towards safe and efficient gene therapy vectors. Oncotarget. 6 (31), 30675-30703 (2015).
  37. Hobel, S., Aigner, A. Polyethylenimines for siRNA and miRNA delivery in vivo. Wiley interdisciplinary reviews. Nanomedicine and nanobiotechnology. 5 (5), 484-501 (2013).
  38. Villate-Beitia, I., Puras, G., Zarate, J., Agirre, M., Ojeda, E., Pedraz, J. L. First Insights into Non-invasive Administration Routes for Non-viral Gene Therapy. Gene Therapy - Principles and Challenges. Hashad, D. , (2015).
  39. Cubillos-Ruiz, J. R., Sempere, L. F., Conejo-Garcia, J. R. Good things come in small packages: Therapeutic anti-tumor immunity induced by microRNA nanoparticles. Oncoimmunology. 1 (6), 968-970 (2012).
  40. Schade, A., et al. Magnetic nanoparticle based nonviral microRNA delivery into freshly isolated CD105(+) hMSCs. Stem Cells Int. 2014, 197154 (2014).
  41. Sutherland, D. R., Anderson, L., Keeney, M., Nayar, R., Chin-Yee, I. The ISHAGE guidelines for CD34+ cell determination by flow cytometry. International society of hematotherapy and graft engineering. Journal of hematotherapy. 5 (3), 213-226 (1996).
  42. Voronina, N., et al. Preparation and in vitro characterization of magnetized mir-modified endothelial cells. Journal of visualized experiments. (123), (2017).
  43. Stamm, C., et al. Intramyocardial delivery of CD133+ bone marrow cells and coronary artery bypass grafting for chronic ischemic heart disease:Safety and efficacy studies. The journal of thoracic and cardiovascular surgery. 133 (3), 717-725 (2007).
  44. King, A., et al. REpeated AutoLogous Infusions of STem cells In Cirrhosis (REALISTIC): A multicentre, phase II, open-label, randomised controlled trial of repeated autologous infusions of granulocyte colony-stimulating factor (GCSF) mobilised CD133+ bone marrow stem cells in patients with cirrhosis. A study protocol for a randomised controlled trial. BMJ open. 5 (3), e007700 (2015).
  45. Martinez, H. R., et al. Stem cell transplantation in amyotrophic lateral sclerosis patients: methodological approach, safety, and feasibility. Cell transplantation. 21 (9), 1899-1907 (2012).
  46. Jimenez-Quevedo, P., et al. Selected CD133(+) progenitor cells to promote angiogenesis in patients with refractory angina: final results of the PROGENITOR randomized trial. Circulation research. 115 (11), 950-960 (2014).
  47. Raval, A. N., et al. Bilateral administration of autologous CD133+ cells in ambulatory patients with refractory critical limb ischemia: lessons learned from a pilot randomized, double-blind, placebo-controlled trial. Cytotherapy. 16 (12), 1720-1732 (2014).
  48. Andreone, P., et al. Reinfusion of highly purified CD133+ bone marrow-derived stem/progenitor cells in patients with end-stage liver disease: A phase I clinical trial. Digestive and liver disease. 47 (12), 1059-1066 (2015).
  49. Arici, V., et al. Autologous immuno magnetically selected CD133+ stem cells in the treatment of no-option critical limb ischemia: clinical and contrast enhanced ultrasound assessed results in eight patients. Journal of translational medicine. 13, 342 (2015).
  50. Zali, A., et al. Intrathecal injection of CD133-positive enriched bone marrow progenitor cells in children with cerebral palsy: feasibility and safety. Cytotherapy. 17 (2), 232-241 (2015).
  51. Al-Zoubi, A., et al. Transplantation of purified autologous leukapheresis-derived CD34+ and CD133+ stem cells for patients with chronic spinal cord injuries: long-term evaluation of safety and efficacy. Cell transplantation. 23, Suppl 1. S25-S34 (2014).
  52. Isidori, A., et al. Positive selection and transplantation of autologous highly purified CD133(+) stem cells in resistant/relapsed chronic lymphocytic leukemia patients results in rapid hematopoietic reconstitution without an adequate leukemic cell purging. Biology of blood and marrow transplantation. 13 (10), 1224-1232 (2007).
  53. Nasseri, B. A., et al. Autologous CD133+ bone marrow cells and bypass grafting for regeneration of ischaemic myocardium: the Cardio133 trial. European heart journal. 35 (19), 1263-1274 (2014).
  54. Steinhoff, G., et al. Cardiac Function Improvement and Bone Marrow Response -: Outcome Analysis of the Randomized PERFECT Phase III Clinical Trial of Intramyocardial CD133(+) Application After Myocardial Infarction. EBioMedicine. 22, 208-224 (2017).
  55. Muller, P., et al. Intramyocardial fate and effect of iron nanoparticles co-injected with MACS(R) purified stem cell products. Biomaterials. 135, 74-84 (2017).
  56. Müller, P., Gaebel, R., Lemcke, H., Steinhoff, G., David, R. Data on the fate of MACS® MicroBeads intramyocardially co-injected with stem cell products. Data in brief. 13, 569-574 (2017).
  57. Skorska, A., et al. GMP-conformant on-site manufacturing of a CD133+ stem cell product for cardiovascular regeneration. Stem cell research & therapy. 8 (1), 33 (2017).
  58. Delyagina, E., Li, W., Ma, N., Steinhoff, G. Magnetic targeting strategies in gene delivery. Nanomedicine (Lond). 6 (9), 1593-1604 (2011).
  59. Schade, A., et al. Innovative strategy for microRNA delivery in human mesenchymal stem cells via magnetic nanoparticles. International journal of molecular sciences. 14 (6), 10710-10726 (2013).
  60. Delyagina, E., et al. Improved transfection in human mesenchymal stem cells: Effective intracellular release of pDNA by magnetic polyplexes. Nanomedicine. 9 (7), London, England. 999-1017 (2014).
  61. Yin, H., Kanasty, R. L., Eltoukhy, A. A., Vegas, A. J., Dorkin, J. R., Anderson, D. G. Non-viral vectors for gene-based therapy. Nature reviews. Genetics. 15 (8), 541-555 (2014).
  62. Chen, J., Guo, Z., Tian, H., Chen, X. Production and clinical development of nanoparticles for gene delivery. Molecular therapy. Methods & clinical development. 3, 16023 (2016).
  63. Juliano, R. L. The delivery of therapeutic oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 44 (14), 6518-6548 (2016).
  64. Soenen, S. J., Rivera-Gil, P., Montenegro, J. -M., Parak, W. J., de Smedt, S. C., Braeckmans, K. Cellular toxicity of inorganic nanoparticles: Common aspects and guidelines for improved nanotoxicity evaluation. Nano today. 6 (5), 446-465 (2011).
  65. Estelrich, J., Sánchez-Martín, M. J., Busquets, M. A. Nanoparticles in magnetic resonance imaging: From simple to dual contrast agents. International journal of nanomedicine. 10, 1727-1741 (2015).

Tags

الهندسة الحيوية، 136 قضية، والخلايا الجذعية، CD133، التعديل الوراثي، تعداء غير الفيروسية، ميكرورنا، استهداف المغناطيسي، جسيمات نانوية مغناطيسية، بولييثيلينيميني
بروتوكول لنقل ميكرورنا إلى المشتقة من نخاع العظام المكونة للدم الخلايا الجذعية البالغة لتمكينها هندسة الخلايا جنبا إلى جنب مع استهداف المغناطيسي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hausburg, F., Müller, P.,… More

Hausburg, F., Müller, P., Voronina, N., Steinhoff, G., David, R. Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting. J. Vis. Exp. (136), e57474, doi:10.3791/57474 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter