Summary
Questo protocollo viene illustrata una procedura sicura ed efficace per modificare CD133+ cellule staminali ematopoietiche. L'approccio non-virale, magnetico presentato basato su polyplex può fornire una base per l'ottimizzazione degli effetti terapeutici delle cellule staminali anche per quanto riguarda il monitoraggio del prodotto somministrato cella tramite risonanza magnetica.
Abstract
CD133, mentre+ cellule staminali ematopoietiche (SCs) hanno dimostrate di fornire alto potenziale nel campo della medicina rigenerativa, loro tariffe bassa ritenzione dopo iniezione nei tessuti danneggiati, così come i tassi di mortalità osservati massiccia delle cellule portano a molto limitato gli effetti terapeutici. Per superare queste limitazioni, abbiamo cercato di stabilire un protocollo di base non-virali per l'ingegneria cellulare adeguata prima della loro somministrazione. La modifica di CD133 umano+ esprimendo SCs utilizzando polyplexes magnetico microRNA (miR) caricato è stato risolto per quanto riguarda l'efficienza di assorbimento e sicurezza, nonché il potenziale targeting delle cellule. Basandosi sul nostro protocollo, possiamo raggiungere velocità di assorbimento di miR alta di 80 – 90% mentre il CD133+ proprietà delle cellule staminali rimangono inalterate. Inoltre, queste cellule modificate offrono l'opzione di targeting magnetico. Descriviamo qui una procedura sicura ed altamente efficace per la modifica di CD133+ SCs. Ci aspettiamo che questo approccio per fornire una tecnologia standard per l'ottimizzazione degli effetti terapeutici delle cellule staminali e per il monitoraggio del prodotto somministrato cella tramite risonanza magnetica (MRI).
Introduction
CD133+ SCs rappresentano una popolazione eterogenea di cellule staminali e progenitrici con promettenti potenzialità per la medicina rigenerativa. Loro potenziale di2,di1,di differenziamento ematopoietico, endoteliale e miogenico3 consente il CD133+ cellule, per esempio, a contribuire ai processi di neovascolarizzazione attraverso la differenziazione nel formare nuovi vasi e l'attivazione di pro-angiogenica segnalazione di paracrine meccanismi4,5,6,7.
Nonostante il loro elevato potenziale dimostrato in più di 30 studi clinici approvati (ClinicalTrails.gov), il loro risultato terapeutico è ancora sotto discussione discutibile4. Infatti, un'applicazione clinica di SCs è ostacolata dalla bassa ritenzione nell'organo di interesse e voluminosa iniziale delle cellule morte5,8,9. Ingegneria del CD133 addizionale+ SCs precedente trapianto potrebbe aiutare a superare queste sfide.
Un prerequisito per una terapia cellulare efficiente sarebbe la riduzione della morte massiccia delle cellule iniziali di attecchimento delle cellule terapeutiche rilevanti10. Studi attuali hanno dimostrato una perdita immensa cella del 90-99% in organi altamente perfusi come il cervello e il cuore durante i primi 1-2 h, indipendentemente dal tipo delle cellule trapiantate o applicazione route11,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21. SC di etichettatura usando nanoparticelle magnetiche (MNPs) consente una strategia innovativa non invasiva alle cellule bersaglio al sito di interesse22,23,24,25,26 e contemporaneamente consente il cellulare monitoraggio utilizzando MRI27 e particelle magnetiche (MPI) di imaging. Il più efficiente in vivo studi applicando magnetizzata cella cella utilizzata ritenzione di targeting dopo amministrazione locale anziché orientamento di cella dopo iniezione endovenosa23,24,28 . Di conseguenza, il nostro gruppo progettato un sistema di consegna costituito da nanoparticelle di ossido di ferro superparamagnetico29. Con questa tecnica, CD133+ SCs e cellule endoteliali di vena ombelicale umana (HUVECs) potrebbero essere efficientemente orientate, come dimostrato da in vitro tentativi30,31.
Un altro ostacolo per terapie SC è l'ostile ambiente infiammatorio del tessuto colpito dopo trapianto, che contribuisce al iniziale delle cellule morte32. Oltre a diversi studi di pre-condizionamento, l'applicazione di terapeutici rilevanti Mir era testata33; è stato dimostrato con successo che anti-apoptotiche miRs inibire l'apoptosi in vitro e che permettono di migliorare il engraftment delle cellule in vivo33. Queste piccole molecole, composti da 20-25 nucleotidi, svolgono un ruolo cruciale come modulatori di posttranscriptional di RNA messaggeri (mRNA) e quindi influenzano il destino e il comportamento di cellule staminali34. Inoltre, l'introduzione esogena di miRs evitare l'integrazione stabile indesiderato nel genoma ospite34.
Tentativi in corso per introduzione efficiente degli acidi nucleici (NAs) nella primaria SCs sono principalmente basati su virus ricombinante8,35. Nonostante l'efficienza di trasfezione alta, manipolazione del virus ricombinante presenta un grosso ostacolo per una traduzione in panchina al capezzale, per esempio, espressione genica incontrollabile, patogenicità, immunogenicità e mutagenesi inserzionale35 ,36. Di conseguenza, sistemi di erogazione non virali come costrutti a base di polimeri sono fondamentali per sviluppare. Tra quelli, polyethylenimine (PEI) rappresenta un veicolo di consegna valido che offre vantaggi per miRs quali condensa NA di proteggere dalla degradazione, l'assorbimento cellulare, e rilascio intracellulare attraverso endosomal fuga37,38. Inoltre, complessi di miR-PEI ha dimostrato un'elevata biocompatibilità in studi clinici39. Di conseguenza, il nostro sistema di consegna è costituito da un biotinilati ramificati 25 kDa PEI associato a un rivestite con streptavidina MNP-core30,31,40.
In questo manoscritto, presentiamo un protocollo completo che descrive (i) l'isolamento manuale di CD133+ SC da umane del midollo osseo (BM) donazione con una dettagliata caratterizzazione del prodotto SC e (ii) una strategia efficace e delicata la transfezione di un sistema di consegna a base di polimeri magneticamente non-virali per l'ingegneria genetica del CD133+ SCs utilizzando miRs. CD133+ SCs sono isolati e magneticamente arricchita da aspira BM umano sternale utilizzando una superficie anticorpo-basato magnetico-attivato delle cellule (MACS) sistema di smistamento. In seguito, l'attuabilità delle cellule come pure la purezza delle cellule è analizzata mediante citometria a flusso. Successivamente, miR/PEI/MNP complessi sono preparati e CD133+ SCs transfected. 18 ore dopo la trasfezione, l'efficienza di assorbimento e l'impatto della transfezione sulla vitalità delle cellule e l'espressione marcatore di SC sono analizzati. Inoltre, la valutazione della distribuzione intracellulare dei composti complessi transfezione viene eseguita utilizzando etichettatura quadricromia e microscopia strutturata di illuminazione (SIM).
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Protocol
BM umano sternale per isolamento delle cellule è stata ottenuta da donatori informati, che hanno dato il loro consenso scritto di utilizzare i loro campioni per la ricerca secondo la dichiarazione di Helsinki. Il comitato etico dell'Università di Rostock ha approvato lo studio presentato (reg. n. A 23 2010, prolungato nel 2015).
1. cella preparazione
Nota: Utilizzare eparina sodica (BM 250 IU/mL) per impedire la coagulazione per esame di BM.
- CD133+ SC isolamento
- Preparazione delle soluzioni richieste
- Preparare il tampone fosfato salino (PBS) / acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) stock soluzione (2 mM) mescolando 996 mL di PBS 1x con 4 mL di EDTA (0,5 M). Vigorosamente miscelare la soluzione e filtrato con un filtro da 0,45 µm. Conservare a temperatura ambiente (TA).
- Preparare il tampone di MACS mescolando 995 mL di PBS/EDTA da 2 millimetri con 5 g di albumina di siero bovino (BSA). Vigorosamente miscelare la soluzione e filtrato con un filtro da 0,45 µm. Conservare a 4 ° C.
- Preparare soluzione di riserva della collagenosi B (40 mg/mL) diluendo 500 mg di collagenasi B (da Clostridium histolyticum) in 12,5 mL di PBS. Miscelare la soluzione vigorosamente, rendere le aliquote di 350 µ l e conservare a-20 ° C.
- Preparare deossiribonucleasi (DNAse) stock soluzione (10 mg/mL) diluendo 100 mg di dnasi I (dal pancreas bovino) in 10 mL di PBS. Miscelare la soluzione vigorosamente, rendere le aliquote di 350 µ l e conservare a-20 ° C.
- Digestione enzimatica di BM umano
- Pre-riscaldare il mezzo di linfociti umani a RT e scongelare gli enzimi (1 aliquota ogni di collagenasi B e dnasi / 20 mL BM).
- Raccogliere il BM da siringhe in una provetta conica da 50 mL e mescolare delicatamente. Eliminare eventuali coaguli esistenti.
Nota: Trasferire 200 µ l di BM non diluito in una provetta da 1,5 mL per l'analisi citofluorimetrica. Conservare a 4 ° C fino all'utilizzo. - Trasferire 10 mL BM in una nuova provetta conica 50 mL, aggiungere 6 mL di PBS/EDTA (2 mM), 20 mL di mezzo di linfociti umani, 175 µ l di collagenasi B (40 mg/mL) e 175 µ l della dnasi I (10 mg/mL). Delicatamente mescolare la soluzione e incubare per 30 min a RT su un agitatore. Ripetere per il restante campione di BM.
- Centrifugazione in gradiente di densità
- Adescare un tubo di centrifugazione su gradiente di densità 50 mL applicando 15ml del linfocita umano medio la separazione in una provetta da 50 mL. Centrifugare a 1.000 x g per 30 s.
- Strato con attenzione 35 mL di diluito BM in cima al filtro tubo mediante centrifugazione in gradiente di densità e centrifugare a 445 x g per 35 minuti a TA.
Nota: Le impostazioni della centrifuga sono bassa accelerazione (3) e nessun freno (1). - Rimuovere con cautela il tubo da centrifuga senza agitazione. Eliminare attentamente ~ 20 mL di soluzione limpida superiore senza toccare lo strato nuvoloso direttamente sopra il filtro.
- Attentamente trasferire lo strato nuvoloso (che è direttamente sopra il filtro e contiene le cellule mononucleari (MNCs)) in una nuova provetta conica 50 mL e riempire con PBS/EDTA ad un volume finale di 50 mL.
Nota: Combinare tutti i MNCs da un campione clinico di BM in una nuova provetta. - Contare i MNCs trasferendo 10 µ l di sospensione cellulare 50 mL in una provetta da 1,5 mL. Aggiungere 10 µ l di acido acetico al 3% con blu di metilene. Delicatamente mescolare e applicare 10 µ l in una camera di conteggio. Calcolare il numero di multinazionali.
- Centrifugare la sospensione MNC a 300 x g per 10 min. eliminare il supernatante.
Nota: Durante la centrifugazione, raffreddare la centrifuga da RT a 4 ° C.
- Selezione magnetica di CD133+ SCs utilizzando umano CD133 anticorpo-collegato superparamagnetiche ferro destrano particelle
Nota: Durante questa fase, lavorare sul ghiaccio. Soluzioni di Store fino all'utilizzo a 4 ° C. Negozio Mac a magnete permanente e colonne di separazione pre-separazione filtro a 4 ° C.- Scegliere la dimensione della colonna. Per < 1.2 x 108 MNCs, utilizzo di colonne di MS e per > 1.2 x 108 MNCs, utilizzare colonne di LS (Vedi Tabella materiali).
- Per preparare della selezione magnetica per numero totale delle cellule di 1 x 108 , Risospendere accuratamente MNCs in 300 µ l di tampone di MACS (4 ° C). Aggiungere 100 µ l di FcR reagente di blocco (4 ° C) e particelle di 100 µ l CD133 anticorpo-collegato superparamagnetiche ferro destrano (4 ° C).
- Delicatamente mescolare la sospensione cellulare ed incubare per 30 min a 4 ° C. Agitare delicatamente la sospensione cellulare durante l'incubazione (2 – 3 volte).
- Aggiungere 2 mL di buffer di MACS (4 ° C) 1 x 108 totale che MNCs. mescolare delicatamente la sospensione cellulare e centrifugare a 300 x g per 10 min a 4 ° C.
- Impostare il magnet holder MACS e fissare il magnete permanente di MACS. Installare la colonna MACS e applicare il filtro pre-separazione sulla parte superiore.
- Equilibrare la prima colonna di MACS MS/LS e filtro pre-separazione con 0,5 mL (MS) o (LS) da 3 mL di tampone di MACS (4 ° C).
Nota: Non lasciare le colonne MACS per asciugarsi dopo l'equilibratura. - Eliminare il supernatante e risospendere il pellet ottenuto in 500 µ l di tampone di MACS (4 ° C) per la quantità totale delle cellule di 1 x 108 . Applicare la sospensione cellulare nel filtro pre-separazione.
- Lavare il filtro di colonna e pre-separazione di MACS tre volte utilizzando, per ogni lavaggio, 0,5 mL (MS) o 3 mL (LS) di MACS tampone (4 ° C).
Nota: Durante la terza fase di lavaggio, installare una seconda colonna di MACS nel magnete permanente MACS ed equilibrare la seconda colonna di MACS MS/LS con 0,5 mL (MS) o da 3 mL (LS) MACS buffer (4 ° C). - Gettare il filtro pre-separazione.
- Eluire la frazione di cella direttamente sulla seconda colonna MACS: aggiungere 1 mL (MS) o buffer di MACS 5ml (LS) (4 ° C) nella prima colonna MACS e rimuovere la colonna di MACS dal magnete permanente MACS. Immediatamente trasferire la prima colonna di MACS sopra la seconda colonna di MACS e spingere la sospensione cellulare attraverso la colonna Mac utilizzando lo stantuffo fornito.
- Lavare la colonna di MACS tre volte, utilizzando per ogni lavaggio 0,5 mL (MS) o Mac (LS) da 3 mL Tampone (4 ° C).
- Eluire la frazione di cella dalla colonna aggiungendo 1 mL (MS) o buffer di MACS 5ml (LS) (4 ° C) nella seconda colonna di MACS e rimuovendo la colonna MACS dal magnete permanente MACS. Immediatamente trasferire la seconda colonna di MACS sopra una provetta da 1,5 mL (MS) o la provetta conica da 15 mL (LS) e spingere la sospensione cellulare attraverso la colonna Mac utilizzando lo stantuffo fornito.
- Centrifugare a 300 x g per 10 min a 4 ° C. Attentamente, scartare il surnatante e risospendere il pellet ottenuto in 100 µ l di tampone di MACS (4 ° C).
- Contare il CD133+ cellule: trasferire 6 µ l della sospensione delle cellule in una provetta da 1,5 mL. Aggiungere 6 µ l di soluzione di blu di trypan (0,4%). Delicatamente mescolare e applicare 10 µ l in una camera di conteggio. Calcolare il numero di CD133+ cellule.
- Memorizzare il CD133+ celle su ghiaccio fino alla semina.
- Preparazione delle soluzioni richieste
- Caratterizzazione di recente isolate CD133+ SCs
Nota: Il lavoro seguente dovrebbe essere svolto in una sala protetta dalla luce brillante (solo illuminazione dim). Mantenere i tubi, buffer e anticorpi su ghiaccio salvo diversa indicazione.- Preparazione di SCs per l'analisi cytometric di flusso
- Utilizzare due campioni (ogni 10 µ l) di aliquote di BM e un campione di recente isolate CD133+ SCs (minimo, 1 x 104 cellule) per l'analisi. Trasferire le cellule in una provetta da 1,5 mL. Aggiungere 10 µ l di Reagente Bloccante FcR e riempire con buffer di MACS (4 ° C) per un volume di 33 µ l.
- Aggiungere i seguenti anticorpi sul lato interno del rispettivo tubo (vedere tabella 1): anti-CD34-isotiocianato di fluoresceina (FITC) (clone: AC136), anti-CD133/2-ficoeritrina (PE) (clone: 293 3), isotype controllare mouse IgG 2b-PE, anti-CD45-allophycocyanin (APC)-H7 (clone: 2D 1) e 7-aminoactinomycin (AAD). Dopo aver aggiunto tutti gli anticorpi, agitare giù il lato di anticorpi del tubo. Delicatamente mescolare la soluzione (volume finale 50 µ l) e incubare per 10 min a 4 ° C.
- Aggiungere 1 mL di buffer di lisi di globuli rossi (RBC) x 1, delicatamente mescolare la sospensione e incubare in ghiaccio 10 min. Centrifugare la sospensione a 300 x g per 10 min a 4 ° C.
- Eliminare il supernatante e risospendere il pellet ottenuto in 100 µ l PBS (4 ° C). Conservare il ghiaccio fino a quando l'analisi cytometric di flusso.
- Analisi citofluorimetrica del CD133+ SCs
- Per esaminare la vitalità cellulare e la purezza del CD133+ SC, utilizzare un adattato della società internazionale di Hematotherapy e innesto Engineering (ISHAGE) flusso cytometry gating strategia41 (vedere la raffigurazione rappresentanza nella Figura 1). Utilizzare il seguente ordine:
Passaggio 1: selezione della popolazione delle cellule (Figura 1A)
Fase 2: selezione di CD45+ cellule (Figura 1B)
Passo 3: selezione di CD45 vitali+ cellule (Figura 1)
Passaggio 4: selezione di CD45 vitali+/CD34+ cellule (Figura 1)
Fase 5: selezione di CD45 vitali+/CD34+/CD133+ cellule (Figura 1E)
Eseguire cytometer di flusso (Vedi Tabella materiali) secondo le istruzioni del produttore. - Calcolare l'attuabilità delle cellule e la purezza utilizzando le seguenti equazioni:
- Per esaminare la vitalità cellulare e la purezza del CD133+ SC, utilizzare un adattato della società internazionale di Hematotherapy e innesto Engineering (ISHAGE) flusso cytometry gating strategia41 (vedere la raffigurazione rappresentanza nella Figura 1). Utilizzare il seguente ordine:
- Preparazione di SCs per l'analisi cytometric di flusso
Equazione 1
Equazione 2
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Colture cellulari di recente isolate CD133+ SCs
- Aliquotare 100x ricombinante umana di citochina supplemento in aliquote di 100 µ l e conservare a-20 ° C. Disgelo uno 100 x aliquota prima della preparazione media.
- Preparare il CD133+ SC cultura medium, medium di espansione di cellule ematopoietiche privo di siero completate con supplemento di citochina umana ricombinante (1x finale) e 1% di penicillina/streptomicina.
- Seme 5 x 104 appena isolato CD133+ SCs per la transfezione in una piastra a 24 pozzetti con 500 µ l di coltura. Incubare le cellule a 37 ° C, 5% CO2 e 20% O2.
Nota: Seme 5 x 104 appena isolato CD133+ SCs come controllo per analisi cytometric di flusso.
2. preparazione di complessi di transfezione
Nota: Durante questa fase, tenere la ribonucleasi di spazio di lavoro intero (RNasi)-gratuitamente utilizzando la soluzione di decontaminazione di RNAsi e utilizzare solo RNAsi-libera materiale di consumo.
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Preparazione di miR
Nota: Il lavoro seguente dovrebbe essere svolto in una sala protetta dalla luce brillante (solo illuminazione dim).
Nota: per l'esemplare di miR: uso cianina 3 tingere contrassegnati precursore miR e miR precursore senza etichetta.- Per preparare la soluzione di riserva di miR (50 µM), diluire la quantità desiderata di miR nel volume appropriato di acqua esente da nucleasi (ad es., diluire 5 nmol di miR in acqua di 100 µ l). Delicatamente mescolare la soluzione, aliquota il brodo di miR (5 µ l) e conservare a temperatura inferiore a-20 ° C.
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Preparazione di PEI
- Preparare il PEI seguendo protocolli standard e nota il PEI concentrazione stock31,42 .
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Preparazione di MNP
- Preparare l'allontaneranno seguendo protocolli standard e notare la MNP concentrazione stock31,42.
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Preparazione di complessi di miR/PEI
- Preparare soluzione glucosata al 5% diluendo D-(+)-glucosio in acqua priva di nucleasi. Delicatamente mescolare la soluzione, aliquota il brodo (1,5 mL) e conservare a 4 ° C.
Nota: Il lavoro seguente dovrebbe essere svolto in una sala protetta dalla luce brillante (solo illuminazione dim). - Utilizzare 20 pmol miR per pozzetto di una piastra a 24 pozzetti30. Diluire miR della soluzione di glucosio 5% ad una concentrazione finale di 0,25 pmol miR / µ l.
- Calcolare la quantità di PEI necessaria basata sulla quantità di miR (20 pmol, punto 2.3.1) e azoto ottima (di PEI) al fosfato (di miR) rapporto (N/P) sulla base della concentrazione di stock di PEI (punto 2.2.1; qui, un rapporto di 7.5 è stato usato)30. Diluire il PEI in una quantità uguale di soluzione glucosata al 5% basati sull'equazione:
che riorganizza per
Equazione 3
dove PEI volume è in µ l e [PEI] è in mM e N/P (ottimizzato per questo protocollo) è di 0,75. 0.12 è un fattore di conversione specifico a miR. - Aggiungere il PEI pre-diluito nella pre-diluito miR e vortexare per 30 s.
- Incubare il miR/PEI complessi per 30 minuti a TA.
- Preparare soluzione glucosata al 5% diluendo D-(+)-glucosio in acqua priva di nucleasi. Delicatamente mescolare la soluzione, aliquota il brodo (1,5 mL) e conservare a 4 ° C.
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Preparazione dei complessi miR/PEI/MNP
Nota: Il lavoro seguente dovrebbe essere svolto in una sala protetta dalla luce brillante (solo illuminazione dim).- Mentre incubando i complessi di miR/PEI, preparare l'allontaneranno sonicating allontaneranno per 20 min a 35 kHz nel bagno d'acqua sonicating a RT affinché che siano le particelle in sospensione e non aggregando.
- Calcolare il numero di richieste allontaneranno (ferro 3 µ g/mL) basato sulla soluzione stock MNP (punto 2.3.1).
- Aggiungere l'allontaneranno lisati mediante nella complessi di miR/PEI e vortex per 30 s. Incubare i complessi di miR/PEI/MNP per 30 minuti a TA.
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Preparazione dei complessi di transfezione per etichettatura quadricromia utilizzando SIM
Nota: Utilizzare miR precursore senza etichetta.- Etichettare la miR con cianina 5 tintura utilizzando un'etichettatura per la miR della tintura di cianina 5 kit (Vedi Tabella materiali) seguendo le istruzioni del produttore. Misurare la concentrazione di miR finale utilizzando lo spettrofotometro elencato (Vedi Tabella materiali) in accordo con pre-l'impostazione fornito dal produttore (acido nucleico, RNA-40). Aliquota che del miR (5 µ l) e conservare a-80 ° C al riparo dalla luce.
- Etichettare il PEI con una brillante fluorescenza verde colorante mediante un'etichettatura appropriata della proteina kit (Vedi Tabella materiali) seguendo le istruzioni del produttore. Definire la concentrazione finale di PEI usando l'analisi di ninidrina (punto 2.2.1). Aliquota del PEI (nel volume calcolato sulla base equazione 3) e conservare a 4 ° C al riparo dalla luce.
- Etichetta l'allontaneranno con rodamina colorante coniugato alla biotina utilizzando un rapporto di 1:1,000 w/w, tingere a MNP. Mescolare la tintura di rodamina e allontaneranno in concomitanza con la preparazione della formazione del complesso di miR/PEI e incubare la soluzione per 30 min al buio. Utilizzare direttamente con etichetta allontaneranno.
Equazione 33. la transfezione di CD133+ SCs
Nota: Durante questa fase, tenere la ribonucleasi di spazio di lavoro intero (RNasi)-gratuitamente utilizzando la soluzione di decontaminazione di RNAsi e utilizzare solo RNAsi-libera materiale di consumo
Nota: Il lavoro seguente dovrebbe essere svolto in una sala protetta dalla luce brillante (solo illuminazione dim).
- Aggiungere goccia a goccia il complesso miRNA/PEI/MNP preparato direttamente nel pozzetto corrispondente contenente il CD133 appena isolate+ SCs in terreno di coltura.
- Mescolare delicatamente a dondolo avanti e indietro la piastra. Incubare le cellule per 18 h a 37 ° C, 5% CO2 e 20% O2.
4. analisi del miR transfezione
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Esame dell'efficienza di assorbimento di miR e la citotossicità dei complessi di transfezione
Nota: per l'esemplare di miR: uso della tintura di cianina 3 etichettata miR precursore per la valutazione di assorbimento e non trasfettate CD133+ SCs per i cancelli di controllo di flusso cytometry.
Nota: Il lavoro seguente dovrebbe essere svolto in una sala protetta dalla luce brillante (solo illuminazione dim).
Nota: Mantenere i tubi, buffer e anticorpi il ghiaccio se non diversamente specificato.- Preparare la soluzione di riserva di paraformaldeide (PFA, 4%) diluendo 4G PFA in 100 mL di PBS e riscaldando la soluzione a 80 ° C. Vigorosamente miscelare la soluzione e regolare il pH a 7,3. Aliquotare il PFA stock (1,5 mL) e conservare a-20 ° C.
- 18 ore dopo la trasfezione, raccogliere ogni pozzetto in un separato da 1,5 mL tubo. Lavare ogni bene una volta con 500 µ l di PBS e trasferire la sospensione cellulare al tubo stesso.
- Centrifugare a 300 x g per 10 min a 4 ° C. Eliminare il supernatante e risospendere il pellet ottenuto in 100 µ l di tampone di MACS di 4 ° C.
- Aggiungere 0,5 µ l di un colorante reattivo di ammina per distinguere tra cellule vivi e morte, delicatamente mescolare la sospensione e incubare per 10 min a 4 ° C. Aggiungere 1 mL di PBS (4 ° C) e centrifugare a 300 x g per 10 min a 4 ° C.
- Eliminare il supernatante, risospendere il pellet ottenuto in 100 µ l PBS, µ l 33 PFA (4%) e conservare in ghiaccio o a 4 ° C fino a quando l'analisi cytometric di flusso.
- Organizzare la strategia di gating secondo la rappresentazione rappresentativa nella Figura 2. Eseguire gli esempi sul citofluorimetro (Vedi Tabella materiali) secondo le istruzioni del produttore.
-
Caratterizzazione del CD133 miR-transfettate+ SCs
Nota: Usato miR precursore senza etichetta come pure non trasfettate CD133+ SCs per cancelli di controllo di flusso cytometry.- Raccogliere ogni bene in un tubo separato 1,5 mL e centrifugare a 300 x g per 10 min a 4 ° C.
- Utilizzare la strategia di gating come descritto al punto 1.2.
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Esame della distribuzione intracellulare di complessi di transfezione di SIM
- Preparare i complessi e transfect le celle come descritto nella sezione 2 e sezione 3.
- 18 ore dopo la trasfezione, raccogliere ogni pozzetto in un separato da 1,5 mL tubo. Lavare ogni bene una volta con 500 µ l di PBS e trasferire il lavaggio nel rispettivo tubo del pozzo. Centrifugare a 300 x g per 10 min a 4 ° C.
- Eliminare il supernatante e risospendere il pellet ottenuto in 1 mL di 2% siero bovino fetale (FBS) in PBS, delicatamente mescolare la sospensione e centrifugare a 300 x g per 10 min a 4 ° C.
- Scartare il surnatante e risospendere il pellet ottenuto in 100 µ l di PBS aggiungere µ l 33 PFA (4%) per 20 min.
- Trasferire la sospensione cellulare in una nuova piastra 24-cultura contenente lamelle di vetro sterile e centrifugare a 300 x g per 10 min a 4 ° C.
- Scartare il surnatante e aggiungere 500 µ l di PBS. Agitare la piastra delicatamente e scartare PBS.
- Posizionare i coprioggetti preparati sui vetrini al microscopio utilizzando montaggio acquoso mantenere fluorescenza e asciugare a temperatura ambiente per almeno 1 h.
- Acquisire immagini utilizzando un obiettivo a immersione in olio X 100. Impostazioni SIM: 405, 488, 561 e 633 nm laser linee per eccitazione e z-pile con una profondità di 16 bit a 3 angolazioni, 3 fasi, con una media di 4, griglie per linea laser: 23 µm – 405, 34 µm – 488, 42 µm – 561, 51 µm – 633.
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Representative Results
Il protocollo presentato descrive un isolamento manuale e arricchimento magnetico del CD133 BM-derivati umani+ SCs con una cellula indipendente virus successivi ingegneria strategia, come una tecnologia non invasiva per in vitro manipolazione cellulare e in vivo strumento di monitoraggio.
Questa tecnologia di isolamento di tre fasi consente una separazione delle MNCs da BM sternal pre-digeriti mediante centrifugazione in gradiente di densità. In seguito, un CD133+ frazione delle cellule può essere magneticamente arricchito utilizzando la tecnologia di isolamento appropriato. Questo consente un arricchimento del CD133+ SCs con una vitalità e una purezza supera al 80%, che può essere determinato mediante citometria a flusso (Figura 1). In seguito, solo prodotti di SC che corrispondono ai requisiti sono stati utilizzati per ulteriori esperimenti.
Il metodo di transfezione qui descritto consente un'introduzione molto efficace di miR in questi appena isolato umano CD133+ SCs con un assorbimento di circa il 80% di vitali delle cellule (Figura 2)30. Inoltre, non ci sono nessun effetto citotossico significativo evidente 18 h dopo trasfezione rispetto al controllo le cellule (Figura 2)30. Inoltre, una consegna sufficiente e la consueta distribuzione dei composti complessi transfezione (miR, PEI e MNPs) può essere osservati all'interno del citoplasma delle cellule usando SIM (Figura 3).
Figura 1: Rappresentante Boolean gating strategia per CD133+ SC caratterizzazione. (A-E) Raffigurazione di una strategia di selezione 5 Step per una rigorosa valutazione di attuabilità delle cellule e la purezza di isolato CD133+ SC così come (F) CD133 isotipo controllo utilizzando l'appropriato esempio BM non trattato. (A) escludere detriti dalla popolazione di cellule intatte in una trama di punti avanti/side scatter (FSC/SSC), seguita da successivi selezione di CD45 (B)+ popolazione, CD45 vitali (C)+ popolazione, (D) praticabile CD45 positivo doppio+/CD34+ popolazione delle cellule e (E) valida tripla CD45 positivo+/CD34+/CD133+ popolazione. Arancione: CD45+/CD34+/CD133+ celle evidenziate all'interno di ogni fase di selezione. Leggenda: APC-Cy7: anti-CD45, FITC: anti-CD34, FSC: Forward Scatter canale, PE: anti-CD133, SSC: Side Scatter canale, 7-AAD: 7-aminoactinomycin. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: rappresentante gating strategia per la valutazione dell'efficienza di assorbimento di miR e citotossicità di transfezione complessa. Gate strategie di (A, B) transfected CD133 + SCs pure come (C, D) non trasfettate CD133+ SCs per le analisi di (A, C) Cyanine3 tingere contrassegnati precursore-miRNA assorbimento efficienza ( rosso: Cy3 vitali+ cellule) e (B, D) effetti citotossici della procedura transfezione segnata da un colorante reattivo di ammina per distinguere tra cellule vivi e morte (blu: le cellule morte). Leggenda: SSC: Side Scatter canale, cellule solo: non-transfettate CD133+ SCs, miRNA/PEI/MNP: CD133+ SCs trasfettate con Cy3-labeled miR Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: visualizzazione intracellulare di transfezione complessa. CD133+ SCs transfected con tre colori etichettato miR/PEI/MNP complesse (miR: 20 pmol, PEI: rapporto N/P 7.5, MNP: 3 µ g/mL). Visualizzazione rappresentativo è stato effettuato 18 h dopo trasfezione usando microscopia strutturata di illuminazione. Il miR è stato etichettato con Cyanine5 colorante (rosso), PEI con una tintura brillante fluorescenza verde (verde) e allontaneranno con tintura di rodamina coniugato alla biotina (gialla), e il nucleo era controcolorato con DAPI (blu). Barra della scala = 5 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| campione | Reagente Bloccante FCR [µ l] | Buffer di MACS [µ l] | anticorpi [µ l] | totale [µ l] | ||||||
| numero | esemplare | cellule [µ l] | CD133-PE isotipo | CD133-PE | CD34-FITC | CD45-APC-Cy7 | AGGIUNGERE | |||
| 1 | BM | 10 | 10 | 12.5 | 5 | - | 5 | 2.5 | 5 | 50 |
| 2 | BM | 10 | 10 | 12.5 | - | 5 | 5 | 2.5 | 5 | 50 |
| 3 | CD133+ | (1 x 104) | 10 | 12.5 | - | 5 | 5 | 2.5 | 5 | 50 |
Tabella 1: layout di pipettaggio per la caratterizzazione di CD133 + SCs.
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Discussion
Negli ultimi anni, CD133+ SCs sono emersi come una popolazione di cellule promettente per terapie basate su SC come evidenziato da diversi di fase I, II e III studi clinici43,44,45,46, 47 , 48 , 49 , 50 , 51 , 52 , 53 , 54. qui, presentiamo un protocollo dettagliato per la manuale caratterizzazione standardizzata del cytometric di flusso e di purificazione di queste cellule da BM sternal umano. La procedura descritta isolamento basati su Mac rappresenta una strategia gentile, veloce ed efficiente per ottenere una frazione SC ematopoietica altamente pura e vitale. La buona compatibilità combinata con la rapida degradazione del co-iniettate microsfere di MACS utilizzato per l'ordinamento delle cellule è stata dimostrata in precedenza dal nostro gruppo55,56.
Questa procedura di isolamento è stata sviluppata utilizzando BM sternal umana come una fonte di materiale, e di conseguenza, il protocollo consente attualmente purificazione di SCs ematopoietiche destinato all'utilizzo nella ricerca non-clinici. Se CD133+ SCs sono isolati da altri tessuti (ad es., BM ottenute dalla cresta iliaca) diversi passaggi del protocollo come la centrifugazione di densità e digestione enzimatica del tessuto possono richiedere adattamento. Per l'applicazione clinica delle cellule, il nostro gruppo ha inoltre stabilito un processo di fabbricazione in loco GMP-conformant utilizzando il57ha bisogno di un sistema automatico al fine di soddisfare ulteriori richieste per conto di clinica.
Ingegneria di SCs prima della loro applicazione è una nuova strategia per superare alcuni ostacoli nella terapia di SC, compresa la conservazione delle cellule bassa e massiccia delle cellule morte. L'attuale protocollo comprende le istruzioni per la produzione di un sistema di trasfezione virale-free multifunzionale basato su PEI ramificato associato a MNPs e la sua introduzione efficiente nel CD133+ SCs30. Applicazione di questo sistema consente di modificazione genetica delle cellule, guida magneticamente controllata delle cellule e l'analisi non invasiva delle cellule tramite MRI o MPI30,31,40,42,58 , 59 , 60.
Cosa importante, le condizioni di transfezione descritto sono state ottimizzate per transitoria modificazione genetica del CD133+ SCs derivate dal BM30. In precedenti lavori, questo sistema di transfezione è stato applicato con successo anche per la consegna del DNA del plasmide e miR a altri cellulari tipi31,40,60. Questi esperimenti hanno dimostrato che l'efficienza di trasfezione, nonché a citotossicità è cellule a seconda del tipo. Di conseguenza, le composizioni ottimale di NAs, PEI e allontaneranno devono essere definiti per ogni tipo di cellula.
Grazie alla sua elevata efficienza, PEI è uno dei polimeri più comunemente usati per non-virale cellule genetiche61di ingegneria. Tuttavia, l'applicazione clinica61,62 di PEI è molto limitato fino ad oggi a causa della sua tossicità generale61,63. È interessante notare che, il nostro gruppo ha recentemente dimostrato che allontaneranno ridurre la tossicità di PEI quando incluso nella transfezione sistema31,60. Allo stesso tempo, la possibile tossicità delle nanoparticelle di ossido di ferro basato causate dalla produzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) è dose-dipendente e diversi tipi di nanoparticelle superparamagnetiche sono approvati per MRI64,65 . Tuttavia, si deve prestare attenzione alla tossicità del sistema in vitro e in vivo.
Nel complesso, il protocollo è abbastanza complesso, contenente molti passaggi critici che devono essere affrontate con molta attenzione. Per questo scopo, abbiamo evidenziato questi punti nella sezione protocollo con note. In particolare, desideriamo sottolineare l'importanza di un ambiente completamente privo di RNasi ed evitando qualsiasi esposizione alla luce quando si maneggia le tinture fluorescenti applicate.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal Ministero federale dell'educazione e ricerca Germania (FKZ 0312138A e FKZ 316159), la Pomerania Mecklenburg-occidentale dello stato con fondi strutturali (FSE/IVWM-B34-0030/10 e FSE/IVBM-B35-0010/12) e il DFG (DA1296/2-1), la Fondazione tedesca del cuore (F/01/12), BMBF (VIP + 00240) e la Fondazione umida. Inoltre, F.H. e P.M. sono supportati dal foro con. rar programma di Rostock University Medical Centre (889001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7-AAD | BD Biosciences | 559925 | |
| Acetic Acid with Methylene Blue | Stemcell Technologies | 7060 | 3% |
| anti-CD133/2-PE (clone: 293C3) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-090-853 | |
| anti-CD34-FITC (clone: AC136) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-081-001 | |
| anti-CD45-APC-H7 (clone: 2D1) | BD Biosciences | 560178 | |
| rhodamine dye; Atto 565 dye conjugated to biotin | ATTO-TEC GmbH | AD 565-71 | |
| BD FACS LSRII flow cytometer | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva Software 6.1.2 | BD Biosciences | ||
| BSA | Sigma-Aldrich GmbH | A7906 | |
| CD133 antibody-linked superparamagnetic iron dextran particles; CD133 MicroBead Kit | Miltenyi Biotec GmbH | 130-097-049 | |
| collagenase B | Roche Diagnostics GmbH | 11088831001 | |
| counting chamber | Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | ||
| Cyanine 3 dye labelled precursor miR; Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control #1 | Ambion | AM17120 | |
| Cyanine 5 dye miR labelling kit; Cy5 dye Label IT miRNA Labeling Kit | Mirus Bio | MIR 9650 | |
| DNAse I | Roche Diagnostics GmbH | 10104159001 | (100 U/mL) |
| ELYRA PS.1 LSM 780 confocal microscope | Carl Zeiss Jena GmbH | ||
| FcR Blocking Reagent, human | Miltenyi Biotec GmbH | 130-059-901 | |
| bright green protein labeling kit; Oregon Green 488 Protein Labeling Kit | Thermo Fisher Scientific | O10241 | |
| aqueous mounting medium; Fluoroshield | Sigma-Aldrich GmbH | F6182 | |
| density gradient centrifugation tube; Leukosep Centrifuge Tube | Greiner Bio-One | 89048-932 | |
| MACS magnet holder; MACS MultiStand | Miltenyi Biotec GmbH | 130-042-303 | |
| MACS pre-separation filter | Miltenyi Biotec GmbH | 130-041-407 | 30 µm |
| MACS separation column (MS / LS) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-042-201 / 130-042-401 | |
| MACS permanent magnet; MACS Separator | Miltenyi Biotec GmbH | 130-042-302 | |
| Millex-HV PVDF Filter | Merck | SLHV013SL | 0.45 μm |
| mouse IgG 2b-PE | Miltenyi Biotec GmbH | 130-092-215 | |
| amine reactive dye; Near-IR LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit | Thermo Fisher Scientific | L10119 | |
| human lymphocyte separating medium; Pancoll | Pan Biotech GmbH | P04-60500 | density: 1.077 g/mL |
| PBS | Pan Biotech GmbH | P04-53500 | without Ca and Mg |
| PEI | Sigma-Aldrich GmbH | 408727 | branched; 25 kDa |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 100 U/mL, 100 μg/mL |
| PFA | Merck Schuchardt OHG | 1040051000 | |
| unlabelled precursor miR; Pre-miR miRNA Precursor Negative Control #1 | Ambion | AM17110 | |
| RBC lysis buffer | eBioscience | 00-4333-57 | |
| RNAse decontamination solution; RNaseZap | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
| human lymphocyte medium; Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Pan Biotech GmbH | P04-16500 | |
| recombinant human cytokine supplement; StemSpan CC100 | Stemcell Technologies | 2690 | |
| serum-free haematopoietic cell expansion medium; StemSpan H3000 | Stemcell Technologies | 9800 | |
| Streptavidin MagneSphere Paramagnetic Particles | Promega Corporation | Z5481 | |
| Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich GmbH | T8154 | 0.4 % |
| UltraPure EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | 0.5 M; pH 8.0 |
| ZEN2011 software | Carl Zeiss Jena GmbH | ||
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| Sonorex RK 100 SH sonicating water bath | Bandelin electronic | Ultrasonic nominal output: 80 W; Ultrasonic frequency: 35 kHz |
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