Summary
Bu iletişim kuralı CD133 değiştirmek için güvenli ve verimli bir yordam gösterilmektedir+ hematopoietik kök hücre. Sunulan viral sigara, manyetik polyplex dayalı yaklaşım temel terapötik kök hücre etkileri de manyetik rezonans görüntüleme üzerinden yönetilen hücre ürün izleme gelince optimizasyonu için sağlayabilir.
Abstract
Süre CD133+ hematopoietik kök hücre (SCs) rejeneratif tıp alanında yüksek potansiyel sağlamak için kanıtlanmıştır, yaralı doku hem de gözlenen büyük hücre ölüm oranları içine enjeksiyon sonra onların düşük tutma oranları çok yol sınırlı tedavi edici etkileri. Bu sınırlamalarını aşmak için bir viral tabanlı iletişim kuralı uygun hücre mühendisliği önce kendi yönetim için kurmak istedi. İnsan CD133 değişiklik+ yüklenmiş mikroRNA (miR) manyetik polyplexes kullanarak SCs ifade ele alımı verimliliği ve emanet gibi hücreleri hedefleme potansiyeli ile ilgili. Bizim iletişim kuralı üzerinde güvenerek, biz yüksek miR alımı CD133 ise % 80 – 90 oranda elde edebilirsiniz+ kök hücre özellikleri etkilenmemiş kalır. Ayrıca, bu değiştirilmiş hücreler manyetik hedefleme seçeneği sunuyoruz. Biz burada CD133 modifikasyonu için güvenli ve yüksek verimli bir yordam tarif+ SCs. Manyetik rezonans görüntüleme (MRG) üzerinden yönetilen hücre ürün izleme ve tedavi kök hücre etkileri duruma getirilmesi için standart bir teknoloji sağlamak için bu yaklaşım bekliyoruz.
Introduction
CD133+ SCs temsil rejeneratif tıp için potansiyel vaat ile bir türdeş olmayan kök ve progenitör hücre nüfus. Onların hematopoetik, endotel ve myogenic farklılaşma potansiyel1,2,3 CD133 sağlar+ hücreleri, neovaskülarizasyon işlemlere farklılaşma yoluyla katkıda bulunmak için Örneğin, yeni gemiler ve pro-anjiogenik parakrin mekanizmaları4,5,6,7tarafından sinyal aktivasyonu içine şekillendirme.
30'dan fazla onaylanmış klinik denemeler (ClinicalTrails.gov) gösterdi yüksek potansiyellerini rağmen tedavi sonuçlarının hala tartışmalı tartışma4altında olması. Nitekim, SCs bir klinik uygulama düşük saklama faiz ve büyük ilk hücre ölüm5,8,9organı tarafından engel oluyor. Ek CD133 mühendislik+ SCs önceki nakli bu zorlukların üstesinden yardımcı olabilir.
Bir etkin hücre tedavisi için bir ön koşul tedavi ilgili hücre10engraftment geliştirmek için büyük ilk hücre ölümü azalma olacaktır. Mevcut çalışmalar ilk 1-2 h sırasında transplante hücre türü bağımsız bir büyük hücre kaybı 90-%99 beyin ve kalp gibi son derece derin organlarında gösterdi veya uygulama rota11,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21. Manyetik Nano tanecikleri (MNPs) kullanarak SC etiketleme faiz22,23,24,25,26 siteye hedef hücrelere yenilikçi bir non-invaziv strateji sağlar ve aynı anda MRG27 ve Manyetik Parçacık (MPI) Imaging kullanarak hücre izleme sağlar. Uygulanan manyetik hücre hücre rehberlik sonra İntravenöz enjeksiyon23,24,28 yerine yerel yönetim sonra kullanılan hücreye saklama hedefleme en verimli in vivo çalışmalar . Bu nedenle, bizim grup superparamagnetic demir oksit nano tanecikleri29uncu oluşan bir iletim sistemi tasarlanmıştır. Bu teknik, CD133 ile+ SCs ve insan göbek damar endotel hücreleri (HUVECs) verimli hedeflenen, vitro 30,31tarafından gösterildiği gibi çalışır.
SC tedaviler için başka bir engel düşmanca inflamatuar etkilenen doku nakli, ilk hücre ölüm32' ye katkıda sonra ortamıdır. Birçok öncesi Klima Araştırma ek olarak, tedavi edici ilgili miRs uygulama test33vardı; başarılı bir şekilde anti-apoptotik miRs apoptosis vitro inhibe ve hücre engraftment vivo içinde33geliştirmek kanıtlanmıştır. 20 – 25 nükleotit oluşan bu küçük moleküller, haberci RNA (mRNA) posttranscriptional modülatörler olarak çok önemli bir rol oynamak ve böylece kök hücre kader ve davranış34etkiler. Ayrıca, miRs eksojen giriş ana bilgisayar genom34istenmeyen istikrarlı entegrasyon kaçının.
Nükleik asitler (NAs) verimli giriş içine birincil SCs için geçerli girişimleri çoğunlukla rekombinant virüs8,35üzerinde temel alır. Yüksek transfection verimlilik rağmen rekombinant virüs manipülasyon bir tezgah başucu çevirisi, Örneğin, kontrol edilemeyen gen ekspresyonu, patojen, immünojenisite ve insertional mutagenesis35 için büyük bir engel sunar. ,36. Bu nedenle, polimer esaslı yapılarını gibi viral teslim sistemleri geliştirmek için önemlidir. Bu arasında polyethylenimine (PEI) miRs bozulması, hücresel alımı, korumak için NA yoğunlaşma gibi sağlayacağı yararlar sunan bir geçerli teslim araç temsil eder ve endosomal aracılığıyla hücre içi yayın kaçış37,38. Ayrıca, miR-PEI kompleksleri yüksek biyouyumluluk klinik39' gösterdi. Bu nedenle, bir biotinylated bizim teslimat sistemi oluşur dallı 25 kDa PEI bir streptavidin kaplı MNP çekirdekli30,31,40' a bağlı.
Bu makale, biz (i) CD133 el ile izolasyonu açıklayan kapsamlı bir iletişim kuralı mevcut+ SC SC ürün ve (ii) bir verimli ve nazik transfection stratejisi detaylı karakterizasyonu insan kemik iliği (BM) bağış gelen bir manyetik olarak viral polimer tabanlı dağıtım sistemi CD133 genetik mühendisliği için+ SCs miRs kullanarak. CD133+ SCs izole ve manyetik (Mac) sistemi sıralama bir yüzey antikor tabanlı manyetik aktif hücre kullanarak insan sternal BM boğulmadan zenginleştirilmiş. Daha sonra hücre canlılığı hem de hücre saflık akış sitometresi kullanarak analiz edilir. Daha sonra miR/PEI/MNP konut projeleri hazırlanır ve CD133+ SCs transfected. 18 h transfection sonra alımını verimlilik ve transfection SC marker ifade ve hücre canlılığı üzerinde etkisini analiz edilir. Ayrıca, hücre içi dağıtım transfection karmaşık bileşiklerin değerlendirilmesi dört renkli etiketleme ve yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM) kullanılarak gerçekleştirilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hücre izolasyon için sternum insan BM araştırmasına göre Helsinki bildirimi için saldırganın saklanıp örnekleri kullanmak için onların yazılı izni veren bilinçli bağışçılardan elde edildi. Rostock Üniversitesi Etik Komite sunulan çalışma (reg. Hayır ' 2010 23, 2015 yılında uzun süredir devam eden) onayladı.
1. hücre hazırlık
Not: koagülasyon BM muayene için önlemek için heparin sodyum (250 IU/mL BM) kullanın.
- CD133+ SC yalıtım
- Gerekli çözümleri hazırlanması
- Fosfat tamponlu tuz (PBS) hazırlamak / ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) stok çözüm (2 mM) 1 x PBS 996 mL EDTA (0, 5 M) 4 mL ile karıştırılarak. Şiddetle çözüm mix ve 0,45 µm filtre kullanarak filtrate. (RT) Oda sıcaklığında saklayın.
- MAC'ler arabellek 2 mm PBS/EDTA 995 mL Sığır serum albumin (BSA) 5 g ile karıştırarak hazırlayın. Şiddetle çözüm mix ve 0,45 µm filtre kullanarak filtrate. 4 ° C'de mağaza
- Collagenase B hisse senedi çözüm (40 mg/mL) 500 mg collagenase B'den ( Clostridium histolyticum) PBS 12,5 ml sulandrarak hazırlayın. Şiddetle çözüm mix, 350 µL aliquots alın ve -20 ° C'de saklayın
- Deoksiribonükleaz (ben stok çözüm (10 mg/mL) 100 mg DNaz sulandrarak DNaz) hazırlamak ben (dan bovine pankreas) PBS 10 ml. Şiddetle çözüm mix, 350 µL aliquots alın ve -20 ° C'de saklayın
- İnsan BM enzimatik sindirim
- İnsan lenfosit orta RT olarak önceden sıcak ve enzimler (1 aliquot her collagenase B ve DNaz 20 mL BM başı) çözülme.
- BM şırınga 50 mL konik tüp içine toplamak ve karışımı yavaşça. Varolan herhangi bir pıhtı atma.
Not: sonraki akış sitometrik çözümlemesi için 1,5 mL tüp içine su katılmamış BM 200 µL Transfer. 4 ° C'de kullanmak kadar saklamak. - 10 mL BM bir yeni 50 mL konik tüp içine aktarmak, PBS / (2 mM), EDTA insan lenfosit orta, 175 µL Collagenase b (40 mg/mL) ve 175 µL 20 mL 6 mL DNaz ekleyin ben (10 mg/mL). Yavaşça çözüm mix ve RT bir shaker tarih itibariyle 30 dk için kuluçkaya. Kalan BM örnek için yineleyin.
- Yoğunluk gradient Santrifüjü
- 50 mL yoğunluk gradient Santrifüjü tüp insan lenfosit orta 50 mL tüp içine ayıran 15 mL uygulayarak Başbakan. Santrifüj 1000 x g , 30 s.
- Dikkatle seyreltilmiş BM yoğunluk gradient Santrifüjü tüp filtresi ve RT. 35 min için 445 x g , santrifüj en üstünde 35 mL katman
Not: Santrifüj ayarlarıdır düşük ivme (3) ve fren yok (1). - Dikkatle sallayarak olmadan santrifüj tüpü çıkarması. Dikkatle ~ 20 mL üst açık çözüm filtre üzerinde doğrudan bulutlu katmanı dokunmadan atmak.
- Dikkatle (doğrudan filtredir üstüne ve mononükleer hücreler (ÇUŞ 'un) içeren) bulutlu tabakası bir yeni 50 mL konik tüp içine aktarmak ve 50 mL son bir hacim için PBS/EDTA ile doldur.
Not: bir BM hasta örnek gelen tüm ÇUŞ 'un bir yeni tüp içine birleştirmek. - Çok uluslu şirketler 50 mL hücre süspansiyon 10 µL 1,5 mL tüp içine aktararak saymak. Metilen mavisi ile %3 Asetik asitin 10 µL ekleyin. Yavaşça karıştırın ve bir sayım odasına 10 µL uygulayın. Çok uluslu şirketler sayısını hesaplayın.
- 10 dakika süreyle santrifüj MNC süspansiyon 300 x g de süpernatant atmak.
Not: RT gelen santrifüj ile 4 ° c Santrifüjü sırasında sakin
- CD133 manyetik seçimi+ SCs insan CD133 antikor bağlı superparamagnetic demir dextran parçacıkları kullanma
Not: Bu adım sırasında buz üzerinde çalışmaz. Kullanım 4 ° C'de kadar depolama çözümleri MAC'ler Daimi Mıknatıs, ayrılık sütunlar ve ön ayırma filtre 4 ° C'de depolayın- Sütun boyutu seçin. < 1.2 x 108 çok uluslu şirketler, kullanım MS sütunlar ve için > için 1.2 x 108 çok uluslu şirketler, LS sütun (bkz. Tablo reçetesi) kullanın.
- 1 x 108 toplam cep numarası için manyetik seçimi hazırlamak için dikkatli bir şekilde çok uluslu şirketler 300 µL MAC'ler arabellekte (4 ° C) resuspend. 100 µL FcR engelleme reaktif (4 ° C) ve 100 µL CD133 antikor bağlı superparamagnetic demir dextran parçacıklar (4 ° C) ekleyin.
- Yavaşça hücre süspansiyon mix ve 4 ° C'de 30 dk için kuluçkaya Yavaşça hücre süspansiyon sırasında kuluçka (2-3 x) sallamak.
- MAC'ler arabellek (4 ° C) 2 mL 1 x 108 toplam karışımı çok uluslu şirketler. yavaşça hücre süspansiyon ve 300 x g , santrifüj 4 ° C'de 10 dakika başına ekleyin
- MAC'ler Mıknatıs tutucu ayarla ve MAC'ler Daimi Mıknatıs ekleyebilirsiniz. MAC'ler sütun yüklemek ve üst ön ayırma filtreyi uygulayın.
- Ilk MAC'ler MS/LS sütun ve ön ayırma filtre ile 0.5 mL (MS) veya 3 mL (LS) MAC'ler arabellek (4 ° C) equilibrate.
Not: Asla denge sonra kurumaya MAC'ler sütunları izin. - Süpernatant atın ve MAC'ler arabelleği (4 ° C) 500 µL elde edilen Pelet başına 1 x 108 Toplam hücresini miktar resuspend. Hücre süspansiyon ön ayırma filtre uygulayın.
- Üç kez kullanarak, her yıkama 0.5 mL (MS) MAC'ler sütun ve ön ayırma filtresini yıkamak veya 3 mL (LS) MAC'ler tampon (4 ° C).
Not: Üçüncü çamaşır adım sırasında ikinci bir MAC'ler sütun MAC'ler Daimi Mıknatıs yükleyin ve ikinci MAC'ler MS/LS sütun 0.5 mL (MS) veya 3 mL (LS) MAC'ler arabellek (4 ° C) ile equilibrate. - Ön ayırma filtre atmak.
- İkinci MAC'ler sütun üzerine doğrudan hücreye kesir elute: 1 mL (MS) veya 5 mL (LS) MAC'ler arabellek (4 ° C) ilk MAC'ler sütuna eklemek ve MAC'ler Daimi Mıknatıs MAC'ler sütun kaldırmak. Hemen ilk MAC'ler sütun ikinci MAC'ler sütunun üzerindeki aktarım ve hücre süspansiyon üzerinden sağlanan pistonu kullanma MAC'ler sütun itin.
- Her yıkama 0.5 mL (MS) kullanarak üç kez, MAC'ler sütun yıkamak veya 3 mL (LS) MAC'ler (4 ° C) arabellek.
- 1 mL (MS) veya 5 mL (LS) MAC'ler arabellek (4 ° C) ikinci MAC'ler sütuna ekleyerek ve MAC'ler Daimi Mıknatıs MAC'ler sütun kaldırma sütundaki hücre kesir elute. Hemen bir 1,5 mL tüp (MS) veya 15 mL konik tüp (LS) Yukarıdaki ikinci MAC'ler sütunda aktarmak ve hücre süspansiyon üzerinden sağlanan pistonu kullanma MAC'ler sütun itin.
- 4 ° C'de 10 dakika için 300 x g , santrifüj Dikkatle süpernatant atın ve elde edilen Pelet MAC'ler arabellek (4 ° C) 100 µL içinde resuspend.
- CD133 saymak+ hücreleri: transfer 6 µL 1,5 mL tüp içine hücre süspansiyon. 6 µL trypan mavi çözüm (% 0,4) ekleyin. Yavaşça karıştırın ve bir sayım odasına 10 µL uygulayın. CD133 sayısını hesaplamak+ hücreleri.
- CD133 mağaza+ hücreleri buza tohum kadar.
- Gerekli çözümleri hazırlanması
- Taze izole CD133 karakterizasyonu+ SCs
Not: Aşağıdaki iş (loş sadece Aydınlatma) parlak ışıktan korunan bir odada yapılmalıdır. Tüpler, arabellekleri ve antikorlar buz Aksi belirtilmediği sürece tutun.- SCs hazırlanması için akış sitometrik çözümlemesi
- İki örnek (her 10 µL), BM aliquots ve taze izole CD133 bir örneğini kullanın+ SCs (en az, 1 x 104 hücreleri) analiz için. Hücreleri bir 1,5 mL tüp içine aktarın. Reaktif engelleme FcR 10 µL ekleyin ve MAC'ler arabelleğe (4 ° C) 33 µL hacmi ile doldur.
- Aşağıdaki antikorlar ilgili iç tarafında üzerine eklemek (bkz. Tablo 1) tüp: anti-CD34-floresein isothiocyanate (FITC) (klon: AC136), anti-CD133/2-phycoerythrin (PE) (klon: 293C 3), izotip kontrol fare IgG 2b-PE, Anti-CD45-allophycocyanin () APC)-H7 (klon: 2D 1) ve 7-aminoactinomycin (AAD). Tüm antikorlar ekledikten sonra tüp antikorlar yan salla. Yavaşça (son hacim 50 µL) çözüm mix ve 4 ° C'de 10 dakika için kuluçkaya
- 1 mL 1 x kırmızı kan hücresi (RBC) lizis arabellek ekleyin, yavaşça süspansiyon mix ve buz 10 dk santrifüj süspansiyon 300 x g de 4 ° C'de 10 dakika için üzerinde kuluçkaya
- Süpernatant atın ve elde edilen Pelet 100 µL PBS (4 ° C) resuspend. Buz üzerinde akış sitometrik çözümlemesi kadar saklayın.
- Akış sitometrik analizinde CD133+ SCs
- Hücre canlılığı ve CD133 saflığı incelemek için+ SC, bir adapte uluslararası toplum Hematotherapy ve greft mühendislik (ISHAGE) akış sitometresi gating strateji41 (bkz: Şekil 1' deki temsilcisi tasvir) kullanın. Aşağıdaki sırayla kullanın:
1. Adım: seçim hücre nüfus (Şekil 1A)
Adım 2: seçim CD45+ hücreleri (Şekil 1B)
Adım 3: seçim uygun CD45+ hücreleri (Şekil 1 c)
Adım 4: seçim uygun CD45+/CD34+ hücreleri (Şekil 1 d)
Adım 5: seçim uygun CD45+/CD34+/CD133+ hücreleri (1E rakam)
Akış Sitometresi çalıştırmak ( Tablo malzemelerigörmek) üretici yönergelerine göre. - Hücre canlılığı ve saflık aşağıdaki denklemleri kullanarak hesaplar:
- Hücre canlılığı ve CD133 saflığı incelemek için+ SC, bir adapte uluslararası toplum Hematotherapy ve greft mühendislik (ISHAGE) akış sitometresi gating strateji41 (bkz: Şekil 1' deki temsilcisi tasvir) kullanın. Aşağıdaki sırayla kullanın:
- SCs hazırlanması için akış sitometrik çözümlemesi
Denklem 1
Denklem 2
-
Hücre kültürü taze izole CD133+ SCs
- Aliquot 100 rekombinant insan sitokin x 100 µL aliquots ek ve -20 ° C'de depolayın Daha önce Orta hazırlık tezcan bir 100 x aliquot.
- CD133 hazırlamak+ SC Kültür orta, serum-Alerjik hematopoietik hücre genişletme orta rekombinant insan sitokin ek (Son 1 x) ve % 1 penisilin/streptomisin ile desteklenmiştir.
- Tohum 5 x 104 taze izole CD133+ SCs 24-şey plaka 500 µL kültür orta ile transfection için. 37 ° C, % 5 CO2 ve %20 O2hücreleri kuluçkaya.
Not: Tohum 5 x 104 taze CD133 izole+ SCs olarak bir denetim akış sitometrik çözümlemesi için.
2. Transfection konut projeleri hazırlanması
Not: Bu adım sırasında tüm çalışma alanı ribonükleaz (RNAse) tutmak-RNAse dekontaminasyon çözüm kullanarak ücretsiz ve sadece RNAse free sarf malzeme kullanın.
-
MiR hazırlanması
Not: Aşağıdaki iş (loş sadece Aydınlatma) parlak ışıktan korunan bir odada yapılmalıdır.
Not: miR-numune için: kullanım siyanür 3 boya etiketli habercisi miR ve etiketsiz habercisi miR.- MiR hisse senedi çözüm (50 µM) hazırlamak için miR nükleaz ücretsiz su (Örneğin, 100 µL suda miR, seyreltik 5 nmol) uygun hacmine istenilen miktarda oranında seyreltin. Yavaşça çözüm, aliquot miR hisse senedi (5 µL) mix ve -20 ° c altında depolamak
-
PEI hazırlanması
- Aşağıdaki standart protokolleri ve Not PEI hisse senedi toplama31,42 PEI hazırlayın.
-
MNP hazırlanması
- Standart protokolleri takip MNPs hazırlamak ve MNP hisse senedi toplama31,42unutmayın.
-
MiR/PEI konut projeleri hazırlanması
- D-(+) sulandrarak %5 glikoz çözüm hazırlamak-glikoz suda nükleaz ücretsiz. Yavaşça çözüm, aliquot stok (1,5 mL) mix ve 4 ° C'de depolayın
Not: Aşağıdaki iş (loş sadece Aydınlatma) parlak ışıktan korunan bir odada yapılmalıdır. - 20 pmol miR 24-şey plaka30kuyu kullanın. MiR 0,25 pmol miR/µL son bir konsantrasyon için %5 glikoz çözümde sulandırmak.
- PEI gerekli miktarda esas miR tutarı (20 pmol, adım 2.3.1) ve fosfat (miR) Toplam (Toplam PEI) en uygun azot (N/P) oranı PEI hisse senedi toplama göre hesaplamak (2.2.1; adım burada, 7.5 oranında kullanıldı)30. %5 glikoz çözüm üzerinde denklemi dayalı eşit miktarda PEI seyreltik:
Hangi için yeniden düzenler
Denklem 3
PEI birim µL ve [PEI] nerede mM, ve N/P (Bu iletişim kuralı için optimize edilmiş) 0,75. 0.12 miR için belirli bir dönüşüm faktördür. - Önceden seyreltilmiş PEI eklemek önceden seyreltilmiş miR ve 30 için girdap içine s.
- MiR/PEI RT., 30 dk için karmaşık kuluçkaya
- D-(+) sulandrarak %5 glikoz çözüm hazırlamak-glikoz suda nükleaz ücretsiz. Yavaşça çözüm, aliquot stok (1,5 mL) mix ve 4 ° C'de depolayın
-
MiR/PEI/MNP konut projeleri hazırlanması
Not: Aşağıdaki iş (loş sadece Aydınlatma) parlak ışıktan korunan bir odada yapılmalıdır.- MiR/PEI kompleksleri kuluçka sırasında MNPs MNPs RT süspansiyon parçacıkların olduğundan emin olmak için sonicating su banyosu içinde 20 dk 35 kHz için sonicating ve değil toplayarak hazırlanın.
- MNP hisse senedi çözüm (adım 2.3.1) göre gerekli MNPs (3 µg demir/mL) sayısını hesaplayın.
- Sonicated MNPs miR/PEI kompleksleri ve girdap 30 s. Incubate için 30 dk miR/PEI/MNP kompleksleri RT. Ekle
-
Transfection kompleksleri için hazırlanması dört renkli SIM kullanarak etiketleme
Not: etiketsiz habercisi miR kullanın.- MiR siyanür 5 bir siyanür 5 boya miR etiketleme kiti ( Tablo malzemelerigörmek) boya kullanarak etiket üreticinin yönergeleri izleyin. Listelenen spektrofotometre kullanarak son miR konsantrasyon ölçmek ( Tablo malzemelerigörmek) (nükleik asit, RNA-40) üreticisi tarafından sağlanan ön ayarı uygun olarak. MiR (5 µL) ve mağaza-80 ° C'de ışıktan korunan aliquot.
- Bir uygun protein etiketleme kiti ( Tablo malzemelerigörmek) kullanarak bir parlak yeşil floresans boya ile PEI etiket üreticinin yönergeleri izleyin. Son PEI konsantrasyon Ninhydrin tahlil (adım 2.2.1) kullanarak tanımlayın. Aliquot PEI (birimindeki temel alınarak Denklem 3hesaplanır) ve ışıktan korunan 4 ° C'de depolayın.
- 1:1,000 w/w oranında kullanarak biotin Birleşik rodamine boya ile MNPs etiket, MNP için boya. Rodamine boya ve MNPs miR/PEI karmaşık oluşumu hazırlanması ile aynı anda mix ve karanlıkta 30 dk için çözüm kuluçkaya. Doğrudan etiketli MNPs kullanın.
Denklem 33. transfection CD133+ SCs
Not: Bu adım sırasında tüm çalışma alanı ribonükleaz (RNAse) tutmak-RNAse dekontaminasyon çözüm kullanarak ücretsiz ve sadece RNAse free sarf malzeme kullanmak
Not: Aşağıdaki iş (loş sadece Aydınlatma) parlak ışıktan korunan bir odada yapılmalıdır.
- Hazırlanan miRNA/PEI/MNP karmaşık dropwise doğrudan uygun kuyunun içine taze izole CD133 içeren eklemek+ SCs kültür orta.
- Karışımı yavaşça ileri geri plaka Rock yaparak. 18 h 37 ° C, % 5 CO2 ve %20 O2için hücreleri kuluçkaya.
4. miR Transfection Analizi
-
MiR alımını verimlilik ve transfection kompleksleri sitotoksisite incelenmesi
Not: miR-numune için: öncü miR alımını değerlendirme ve sigara transfected CD133 etiketli siyanür 3 boya kullanın+ SCs akış sitometresi denetim giriş kapıları için.
Not: Aşağıdaki iş (loş sadece Aydınlatma) parlak ışıktan korunan bir odada yapılmalıdır.
Not: Aksi belirtilmedikçe tüpler, arabellekleri ve antikorlar buz üzerinde tutun.- Paraformaldehyde hisse senedi çözüm (PFA, % 4) 4 g PFA 100 ml PBS sulandrarak ve çözüm ile 80 ° c Isıtma hazırlayın Şiddetle çözüm mix ve 7.3 pH değerine ayarlayın. Aliquot ise (1,5 mL) stok ve -20 ° C'de depolayın
- 18 h transfection sonra toplamak her şey ayrı bir 1,5 ml tüp. Her biri de bir kez PBS 500 µL yıkama ve bu hücre süspansiyon için aynı tüp aktarmak.
- 4 ° C'de 10 dakika için 300 x g, santrifüj Süpernatant atın ve elde edilen Pelet 4 ° C MAC'ler arabellek 100 µL içinde resuspend.
- Canlı ve ölü hücreleri arasında ayırt etmek, yavaşça süspansiyon karıştırmak ve 4 ° C'de 10 dakika için kuluçkaya bir amin reaktif boya 0.5 µL Ekle 1 mL PBS (4 ° C) ve santrifüj 300 x g 4 ° C'de 10 dakika için ekleyin
- Süpernatant atmak, elde edilen Pelet 100 µL PBS resuspend, 33 µL PFA (% 4) ekleyin ve buz üzerinde veya 4 ° C'de akış sitometrik çözümlemesi kadar saklayın.
- Şekil 2' deki temsilcisi tasvir göre gating strateji düzenleyin. Akış Sitometresi örneklerini çalıştırma ( Tablo malzemelerigörmek) üretici yönergelerine göre.
-
MiR transfected CD133 karakterizasyonu+ SCs
Not: kullanılan etiketlenmemiş habercisi miR yanı sıra sigara transfected CD133+ SCs akış sitometresi denetim giriş kapıları için.- Ve toplamak için her bir ayrı 1,5 mL tüp içinde iyi vasıl 300 x g 4 ° C'de 10 dakika santrifüj kapasitesi
- Perdeleme strateji 1.2. adımda açıklandığı gibi kullanın.
-
Transfection kompleksleri tarafından SIM hücre içi dağıtım incelenmesi
- Konut projeleri hazırlamak ve Bölüm 2 ve Bölüm 3'te açıklandığı gibi hücreleri transfect.
- 18 h transfection sonra toplamak her şey ayrı bir 1,5 ml tüp. Her biri de bir kez PBS 500 µL yıkayın ve yıkama kuyu ilgili tüp içine aktarın. 4 ° C'de 10 dakika için 300 x g , santrifüj
- Süpernatant atmak ve 1 ml % 2 fetal Sığır serum (FBS) elde edilen Pelet PBS içinde resuspend, yavaşça süspansiyon karıştırın ve vasıl 300 x g 4 ° C'de 10 dakika santrifüj kapasitesi
- Süpernatant atmak, elde edilen Pelet PBS 100 µL içinde resuspend ve 20 dk 33 µL PFA (%4) ekleyin.
- Steril cam coverslips ve 4 ° C'de 10 dakika santrifüj 300 x g de içeren yeni bir 24-Kültür plaka içine hücre süspansiyon transfer
- Süpernatant atmak ve PBS 500 µL ekleyin. Yavaşça plaka sallamak ve PBS atın.
- Hazır coverslips floresan korumak ve kuru onları RT en az 1 h için sulu montaj orta kullanarak mikroskobik slaytlar üzerine yerleştirin.
- Görüntüleri bir 100 X yağı daldırma hedefi kullanarak elde. SIM ayarları: 405, 488, 561 ve uyarma ve z-bir 16-bit derinliği 3 açılarda, 4, ızgaralar lazer çizgi başına ortalama ile 3 aşama Baca'ya 633 nm lazer hatları: 23 µm-405, 34 µm-488, 42 µm-561, 51 µm-633.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bir el ile yalıtım ve insan BM kaynaklı CD133 Manyetik Zenginleştirme sunulan protokolünü açıklar+ ile in vitro hücre düzenleme ve için non-invaziv bir teknoloji olarak strateji, mühendislik bir sonraki virüs bağımsız hücre SCs Vivo izleme aracı.
Bu üç adım izolasyon teknolojisi çok uluslu şirketler ayrılması önceden sindirilmiş sternal BM aracılığıyla yoğunluk gradient Santrifüjü üzerinden izin verir. Daha sonra bir CD133+ hücre kesir manyetik olarak zenginleştirilmiş uygun yalıtım teknolojisini kullanarak. Bu CD133 bir zenginlik sağlar+ SCs bir canlılık ve saflık akış sitometresi (Şekil 1) tarafından belirlenen % 80 daha yüksek. Bundan sonra hangi gereksinimleri maç SC ürünleri daha fazla deneyler için kullanılmıştır.
Burada açıklanan transfection yöntemi miR bu son derece etkili bir tanıtım taze insan CD133 izole sağlar+ ile yaklaşık % 80'i uygun bir alımını SCs hücreleri (Şekil 2)30. Buna ek olarak, hiçbir önemli sitotoksik etkileri vardır belirgin 18 h denetimine göre transfection (Şekil 2)30hücreleri sonra. Ayrıca, yeterli teslimat ve transfection karmaşık bileşiklerin (miR, PEI ve MNPs) her zamanki dağıtım SIM (Şekil 3) kullanarak hücre sitoplazma içinde görülebilir.
Resim 1: Temsilcisi CD133 için strateji çoğunluğuna Boole+ SC karakterizasyonu. (A-E) Hücre canlılığı sıkı bir şekilde değerlendirilmesi ve saflık için 5 adım seçim stratejisi tasviri izole CD133+ SC (F) CD133 izotip kontrol uygun tedavi edilmezse BM örnek kullanarak yanı sıra. (A)sağlam hücre popülasyondan ileri/yan dağılım (FSC/SSC) nokta çizim enkaz hariç (B) CD45 ardışık seçime göre takip+ hücre nüfus, (C) uygun CD45+ hücre nüfus, (D) uygun Çift Kişilik olumlu CD45+/CD34+ hücre nüfus ve (E) uygun Üçlü olumlu CD45+/CD34+/CD133+ hücre nüfus. Turuncu: CD45+/CD34+/CD133+ her seçim adım içinde vurgulanan hücre. Gösterge: APC-Cy7: anti-CD45 FITC: anti-CD34, FSC: ileri dağılım kanal, PE: anti-CD133, SSC: yan dağılım kanal, 7-AAD: 7-aminoactinomycin. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: temsilcisi miR alımını verimliliği değerlendirilmesi ve sitotoksisite, karmaşık transfection için strateji geçişi. Perdeleme stratejileri (A, B) transfected CD133+ SCs de (C, D) Sigara-CD133 transfected gibi+ (A, C) analizleri için SCs Cyanine3 boya etiketli habercisi-miRNA alımını verimliliği () Kırmızı: uygun Cy3+ hücreleri) ve (B, D) transfection yordam sitotoksik efekt işaretlenmiş tarafından canlı ve ölü hücreleri arasında ayırt etmek için bir amin reaktif boya (mavi: ölü hücreleri). Gösterge: SSC: yan dağılım kanal, hücreleri sadece: sigara-transfected CD133+ SCs, miRNA/PEI/MNP: CD133+ SCs transfected miR Cy3 etiketli Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: hücre içi görselleştirme karmaşık transfection. CD133+ SCs ile üç renkli miR/PEI/MNP karmaşık etiketli transfected (miR: 20 pmol, PEI: N/P oranı 7.5, MNP: 3 µg/mL). Temsilcisi görselleştirme 18 h yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu kullanılarak transfection sonra gerçekleştirildi. MiR Cyanine5 boya (kırmızı), PEI bir parlak yeşil floresans boya (yeşil), etiketli ve rodamine boya ile MNPs biotin (sarı) Birleşik ve çekirdek DAPI (mavi) ile counterstained. Ölçek çubuğu 5 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| örnek | FCR engelleme reaktif [µL] | MAC'ler arabellek [µL] | antikorlar [µL] | Toplam [µL] | ||||||
| numarası | numune | hücre [µL] | CD133-PE izotip | CD133-PE | CD34-FITC | CD45-APC-Cy7 | EKLE | |||
| 1 | BM | 10 | 10 | 12,5 | 5 | - | 5 | 2.5 | 5 | 50 |
| 2 | BM | 10 | 10 | 12,5 | - | 5 | 5 | 2.5 | 5 | 50 |
| 3 | CD133+ | (1 x 104) | 10 | 12,5 | - | 5 | 5 | 2.5 | 5 | 50 |
Tablo 1: CD133 karakterizasyonu için Pipetting düzen + SCs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Son yıllarda, CD133+ SCs ortaya çıktı umut verici bir hücre nüfus olarak birkaç tarafından kanıtlanan SC tabanlı terapiler aşama için ı, II ve III klinik43,44,45,46, 47 , 48 , 49 , 50 , 51 , 52 , 53 , 54. burada, standart el ile arıtma ve akış sitometrik karakterizasyonu bu hücreler için detaylı bir iletişim kuralı insan sternal BM mevcut. Açıklanan Mac tabanlı yalıtım yordamı son derece saf ve uygun hematopoetik SC kesir elde etmek için hafif, hızlı ve verimli bir strateji temsil etmektedir. Hücre sıralamak için kullanılan ortak enjekte MAC'ler lastikteki hızlı yıkımı ile birlikte iyi uyumluluk daha önce tarafından bizim grup55,56göstermiştir.
Bu yalıtım yordamı insan sternal BM bir kaynak malzeme olarak kullanarak geliştirilmiştir ve bu nedenle, iletişim kuralı şu anda hematopoetik SCs sigara-klinik araştırmalarda kullanılmak üzere tasarlanan arıtma etkinleştirir. Eğer CD133+ SCs diğer dokulara (Örneğin, iliyak kret elde BM) yalıtılmış gibi enzimatik doku sindirim ve yoğunluk Santrifüjü protokol birkaç adımını adaptasyon gerektirebilir. Klinik hücre başvurusunu bizim grubu kurarak daha fazla bir GMP-uyumlu yerinde üretim yordamı kullanarak klinik adına ek taleplerini karşılamak için otomatik bir sistem lüzum-57.
SCs mühendislik onların uygulamadan önce SC terapi, düşük hücre tutma ve büyük hücre ölümü de dahil olmak üzere bazı engelleri aşmak için yeni bir stratejidir. MNPs ve verimli sunulmasından CD133 içine bağlı dallı PEI dayalı bir viral ücretsiz çok fonksiyonlu transfection sistem imalatı için yönergeler geçerli protokol oluşur+ SCs30. Genetik hücre modifiye, manyetik kontrollü hücre rehberlik ve non-invaziv hücre izleme MRI veya MPI30,31,40,42,58 ile bu sistemi sağlar , 59 , 60.
Önemlisi, açıklanan transfection koşulları CD133 geçici genetik değiştirilmesi için optimize edilmiştir+ BM kaynaklı SCs30. Önceki eserlerinde bu transfection sistemi de başarıyla teslim edilmesi plazmid DNA ve miR için diğer hücre türleri31,40,60' a uygulanmıştır. Bu deneyler transfection verimliliği hem de sitotoksisite hücre türü bağımlı olduğunu göstermiştir. Bu nedenle, NAs, PEI ve MNPs en iyi kompozisyon her hücre türü için tanımlanmış olması gerekir.
Yüksek verimlilik nedeniyle, PEI61mühendislik viral genetik hücre için en sık kullanılan polimerler biridir. Ancak, PEI klinik uygulama61,62 nedeniyle onun genel toksisite61,63bugüne kadar çok sınırlıdır. İlginçtir, bizim grup yakın zamanda MNPs zaman içinde transfection sistem31,60dahil PEI toksisite azaltmak gösterdi. Aynı zamanda demir oksit esaslı Nano tanecikleri reaktif oksijen türleri (ROS) üretim tarafından neden mümkün toksisite doz bağımlıdır ve çeşitli superparamagnetic nano tanecikleri MRI64için,65 onaylanır . Ancak, sistem vitro ve içinde vivotoksisite dikkat ödenmelidir.
Genel olarak, oldukça karmaşık, çok dikkatli bir şekilde ele alınması gereken birçok kritik adımları içeren iletişim kuralıdır. Bu amaçla, bu noktaları notları ile protokol bölümünde sermiştir. Özellikle, tamamen RNAse free çevre ve uygulamalı floresan boyalar ele alırken herhangi bir ışığa maruz kaçınarak önemini işaret etmek istiyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir çıkar çatışması beyan ederim.
Acknowledgments
Bu eser Federal Bakanlığı Eğitim ve araştırma Almanya (FKZ 0312138A ve FKZ 316159), devlet Mecklenburg-Western Pomerania AB yapısal fonları (ESF/IVWM-B34-0030/10 ve ESF/IVBM-B35-0010/12) ile ve DFG (DA1296/2-1), tarafından desteklenmiştir Alman Kalp Vakfı (F/01/12), BMBF (VIP + 00240) ve nemli Vakfı. Buna ek olarak, F.H. ve saatleri arasında FORUN Program, Rostock Üniversitesi Tıp Merkezi tarafından (889001) desteklenir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7-AAD | BD Biosciences | 559925 | |
| Acetic Acid with Methylene Blue | Stemcell Technologies | 7060 | 3% |
| anti-CD133/2-PE (clone: 293C3) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-090-853 | |
| anti-CD34-FITC (clone: AC136) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-081-001 | |
| anti-CD45-APC-H7 (clone: 2D1) | BD Biosciences | 560178 | |
| rhodamine dye; Atto 565 dye conjugated to biotin | ATTO-TEC GmbH | AD 565-71 | |
| BD FACS LSRII flow cytometer | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva Software 6.1.2 | BD Biosciences | ||
| BSA | Sigma-Aldrich GmbH | A7906 | |
| CD133 antibody-linked superparamagnetic iron dextran particles; CD133 MicroBead Kit | Miltenyi Biotec GmbH | 130-097-049 | |
| collagenase B | Roche Diagnostics GmbH | 11088831001 | |
| counting chamber | Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | ||
| Cyanine 3 dye labelled precursor miR; Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control #1 | Ambion | AM17120 | |
| Cyanine 5 dye miR labelling kit; Cy5 dye Label IT miRNA Labeling Kit | Mirus Bio | MIR 9650 | |
| DNAse I | Roche Diagnostics GmbH | 10104159001 | (100 U/mL) |
| ELYRA PS.1 LSM 780 confocal microscope | Carl Zeiss Jena GmbH | ||
| FcR Blocking Reagent, human | Miltenyi Biotec GmbH | 130-059-901 | |
| bright green protein labeling kit; Oregon Green 488 Protein Labeling Kit | Thermo Fisher Scientific | O10241 | |
| aqueous mounting medium; Fluoroshield | Sigma-Aldrich GmbH | F6182 | |
| density gradient centrifugation tube; Leukosep Centrifuge Tube | Greiner Bio-One | 89048-932 | |
| MACS magnet holder; MACS MultiStand | Miltenyi Biotec GmbH | 130-042-303 | |
| MACS pre-separation filter | Miltenyi Biotec GmbH | 130-041-407 | 30 µm |
| MACS separation column (MS / LS) | Miltenyi Biotec GmbH | 130-042-201 / 130-042-401 | |
| MACS permanent magnet; MACS Separator | Miltenyi Biotec GmbH | 130-042-302 | |
| Millex-HV PVDF Filter | Merck | SLHV013SL | 0.45 μm |
| mouse IgG 2b-PE | Miltenyi Biotec GmbH | 130-092-215 | |
| amine reactive dye; Near-IR LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit | Thermo Fisher Scientific | L10119 | |
| human lymphocyte separating medium; Pancoll | Pan Biotech GmbH | P04-60500 | density: 1.077 g/mL |
| PBS | Pan Biotech GmbH | P04-53500 | without Ca and Mg |
| PEI | Sigma-Aldrich GmbH | 408727 | branched; 25 kDa |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 100 U/mL, 100 μg/mL |
| PFA | Merck Schuchardt OHG | 1040051000 | |
| unlabelled precursor miR; Pre-miR miRNA Precursor Negative Control #1 | Ambion | AM17110 | |
| RBC lysis buffer | eBioscience | 00-4333-57 | |
| RNAse decontamination solution; RNaseZap | Thermo Fisher Scientific | AM9780 | |
| human lymphocyte medium; Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium | Pan Biotech GmbH | P04-16500 | |
| recombinant human cytokine supplement; StemSpan CC100 | Stemcell Technologies | 2690 | |
| serum-free haematopoietic cell expansion medium; StemSpan H3000 | Stemcell Technologies | 9800 | |
| Streptavidin MagneSphere Paramagnetic Particles | Promega Corporation | Z5481 | |
| Trypan Blue solution | Sigma-Aldrich GmbH | T8154 | 0.4 % |
| UltraPure EDTA | Thermo Fisher Scientific | 15575020 | 0.5 M; pH 8.0 |
| ZEN2011 software | Carl Zeiss Jena GmbH | ||
| NanoDrop 1000 Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| Sonorex RK 100 SH sonicating water bath | Bandelin electronic | Ultrasonic nominal output: 80 W; Ultrasonic frequency: 35 kHz |
References
- Meregalli, M., Farini, A., Belicchi, M., Torrente, Y. CD133(+) cells isolated from various sources and their role in future clinical perspectives. Expert opinion on biological therapy. 10 (11), 1521-1528 (2010).
- Lee, S., Yoon, Y. -S. Revisiting cardiovascular regeneration with bone marrow-derived angiogenic and vasculogenic cells. British journal of pharmacology. 169 (2), 290-303 (2013).
- Beksac, M., Preffer, F. Is it time to revisit our current hematopoietic progenitor cell quantification methods in the clinic? Bone marrow transplantation. 47 (11), 1391-1396 (2012).
- Bongiovanni, D., et al. The CD133+ cell as advanced medicinal product for myocardial and limb ischemia. Stem cells and development. 23 (20), 2403-2421 (2014).
- Wang, X., et al. The Clinical Status of Stem Cell Therapy for Ischemic Cardiomyopathy. Stem cells international. 2015, 135023 (2015).
- Ma, N., et al. Intramyocardial delivery of human CD133+ cells in a SCID mouse cryoinjury model: Bone marrow vs. cord blood-derived cells. Cardiovascular research. 71 (1), 158-169 (2006).
- Rafii, S., Lyden, D. Therapeutic stem and progenitor cell transplantation for organ vascularization and regeneration. Nature medicine. 9 (6), 702-712 (2003).
- Wang, D., Gao, G. State-of-the-art human gene therapy: part I. Gene delivery technologies. Discovery medicine. 18 (97), 67-77 (2014).
- Sart, S., Ma, T., Li, Y. Preconditioning stem cells for in vivo delivery. BioResearch open access. 3 (4), 137-149 (2014).
- Liu, J., et al. Early stem cell engraftment predicts late cardiac functional recovery: preclinical insights from molecular imaging. Circulation. Cardiovascular imaging. 5 (4), 481-490 (2012).
- Lang, C., et al. In vivo comparison of the acute retention of stem cell derivatives and fibroblasts after intramyocardial transplantation in the mouse model. European journal of nuclear medicine and molecular imaging. 41 (12), 2325-2336 (2014).
- Goussetis, E., et al. Intracoronary infusion of CD133+ and CD133-CD34+ selected autologous bone marrow progenitor cells in patients with chronic ischemic cardiomyopathy: cell isolation, adherence to the infarcted area, and body distribution. Stem cells. 24 (10), Dayton, Ohio. 2279-2283 (2006).
- Caveliers, V., et al. In vivo visualization of 111In labeled CD133+ peripheral blood stem cells after intracoronary administration in patients with chronic ischemic heart disease. Q J Nucl Med Mol Imaging. 51 (1), 61-66 (2007).
- Terrovitis, J. V., Smith, R. R., Marbán, E. Assessment and optimization of cell engraftment after transplantation into the heart. Circulation research. 106 (3), 479-494 (2010).
- Rosado-de-Castro, P. H., et al. Biodistribution of bone marrow mononuclear cells after intra-arterial or intravenous transplantation in subacute stroke patients. Regenerative medicine. 8 (2), 145-155 (2013).
- Kang, W. J., Kang, H. -J., Kim, H. -S., Chung, J. -K., Lee, M. C., Lee, D. S. Tissue distribution of 18F-FDG-labeled peripheral hematopoietic stem cells after intracoronary administration in patients with myocardial infarction. Journal of nuclear medicine official publication, Society of Nuclear Medicine. 47 (8), 1295-1301 (2006).
- Blocklet, D., et al. Myocardial homing of nonmobilized peripheral-blood CD34+ cells after intracoronary injection. Stem cells. 24 (2), Dayton, Ohio. 333-336 (2006).
- Penicka, M., et al. One-day kinetics of myocardial engraftment after intracoronary injection of bone marrow mononuclear cells in patients with acute and chronic myocardial infarction. Heart (British Cardiac Society). 93 (7), 837-841 (2007).
- Schächinger, V., et al. Pilot trial on determinants of progenitor cell recruitment to the infarcted human myocardium. Circulation. 118 (14), 1425-1432 (2008).
- Dedobbeleer, C., et al. Myocardial homing and coronary endothelial function after autologous blood CD34+ progenitor cells intracoronary injection in the chronic phase of myocardial infarction. Journal of cardiovascular pharmacology. 53 (6), 480-485 (2009).
- Musialek, P., et al. Randomized transcoronary delivery of CD34(+) cells with perfusion versus stop-flow method in patients with recent myocardial infarction: Early cardiac retention of (m)Tc-labeled cells activity. Journal of nuclear cardiology official publication of the American Society of Nuclear Cardiology. 18 (1), 104-116 (2011).
- Kyrtatos, P. G., et al. Magnetic tagging increases delivery of circulating progenitors in vascular injury. JACC. Cardiovascular interventions. 2 (8), 794-802 (2009).
- Vandergriff, A. C., et al. Magnetic targeting of cardiosphere-derived stem cells with ferumoxytol nanoparticles for treating rats with myocardial infarction. Biomaterials. 35 (30), 8528-8539 (2014).
- Huang, Z., et al. Magnetic targeting enhances retrograde cell retention in a rat model of myocardial infarction. Stem cell research & therapy. 4 (6), 149 (2013).
- Yanai, A., et al. Focused magnetic stem cell targeting to the retina using superparamagnetic iron oxide nanoparticles. Cell transplantation. 21 (6), 1137-1148 (2012).
- Arbab, A. S., Jordan, E. K., Wilson, L. B., Yocum, G. T., Lewis, B. K., Frank, J. A. In vivo trafficking and targeted delivery of magnetically labeled stem cells. Human gene therapy. 15 (4), 351-360 (2004).
- Cores, J., Caranasos, T. G., Cheng, K. Magnetically Targeted Stem Cell Delivery for Regenerative Medicine. Journal of functional biomaterials. 6 (3), 526-546 (2015).
- Cheng, K., et al. Magnetic enhancement of cell retention, engraftment, and functional benefit after intracoronary delivery of cardiac-derived stem cells in a rat model of ischemia/reperfusion. Cell transplant. 21 (6), 1121-1135 (2012).
- Li, W., et al. Enhanced thoracic gene delivery by magnetic nanobead-mediated vector. The journal of gene medicine. 10 (8), 897-909 (2008).
- Müller, P., et al. Magnet-Bead Based MicroRNA Delivery System to Modify CD133+ Stem Cells. Stem cells international. 2016, 7152761 (2016).
- Voronina, N., et al. Non-viral magnetic engineering of endothelial cells with microRNA and plasmid-DNA-An optimized targeting approach. Nanomedicine nanotechnology, biology, and medicine. , (2016).
- Noort, W. A., et al. Mesenchymal stromal cells to treat cardiovascular disease: strategies to improve survival and therapeutic results. Panminerva Med. 52 (1), 27-40 (2010).
- Jakob, P., Landmesser, U. Role of microRNAs in stem/progenitor cells and cardiovascular repair. Cardiovascular Research. 93 (4), 614-622 (2012).
- Sen, C. K. MicroRNAs as new maestro conducting the expanding symphony orchestra of regenerative and reparative medicine. Physiological genomics. 43 (10), 517-520 (2011).
- Papapetrou, E. P., Zoumbos, N. C., Athanassiadou, A. Genetic modification of hematopoietic stem cells with nonviral systems: past progress and future prospects. Gene therapy. 12, Suppl 1. S118-S130 (2005).
- Chira, S., et al. Progresses towards safe and efficient gene therapy vectors. Oncotarget. 6 (31), 30675-30703 (2015).
- Hobel, S., Aigner, A. Polyethylenimines for siRNA and miRNA delivery in vivo. Wiley interdisciplinary reviews. Nanomedicine and nanobiotechnology. 5 (5), 484-501 (2013).
- Villate-Beitia, I., Puras, G., Zarate, J., Agirre, M., Ojeda, E., Pedraz, J. L. First Insights into Non-invasive Administration Routes for Non-viral Gene Therapy. Gene Therapy - Principles and Challenges. Hashad, D. , (2015).
- Cubillos-Ruiz, J. R., Sempere, L. F., Conejo-Garcia, J. R. Good things come in small packages: Therapeutic anti-tumor immunity induced by microRNA nanoparticles. Oncoimmunology. 1 (6), 968-970 (2012).
- Schade, A., et al. Magnetic nanoparticle based nonviral microRNA delivery into freshly isolated CD105(+) hMSCs. Stem Cells Int. 2014, 197154 (2014).
- Sutherland, D. R., Anderson, L., Keeney, M., Nayar, R., Chin-Yee, I. The ISHAGE guidelines for CD34+ cell determination by flow cytometry. International society of hematotherapy and graft engineering. Journal of hematotherapy. 5 (3), 213-226 (1996).
- Voronina, N., et al. Preparation and in vitro characterization of magnetized mir-modified endothelial cells. Journal of visualized experiments. (123), (2017).
- Stamm, C., et al. Intramyocardial delivery of CD133+ bone marrow cells and coronary artery bypass grafting for chronic ischemic heart disease:Safety and efficacy studies. The journal of thoracic and cardiovascular surgery. 133 (3), 717-725 (2007).
- King, A., et al. REpeated AutoLogous Infusions of STem cells In Cirrhosis (REALISTIC): A multicentre, phase II, open-label, randomised controlled trial of repeated autologous infusions of granulocyte colony-stimulating factor (GCSF) mobilised CD133+ bone marrow stem cells in patients with cirrhosis. A study protocol for a randomised controlled trial. BMJ open. 5 (3), e007700 (2015).
- Martinez, H. R., et al. Stem cell transplantation in amyotrophic lateral sclerosis patients: methodological approach, safety, and feasibility. Cell transplantation. 21 (9), 1899-1907 (2012).
- Jimenez-Quevedo, P., et al. Selected CD133(+) progenitor cells to promote angiogenesis in patients with refractory angina: final results of the PROGENITOR randomized trial. Circulation research. 115 (11), 950-960 (2014).
- Raval, A. N., et al. Bilateral administration of autologous CD133+ cells in ambulatory patients with refractory critical limb ischemia: lessons learned from a pilot randomized, double-blind, placebo-controlled trial. Cytotherapy. 16 (12), 1720-1732 (2014).
- Andreone, P., et al. Reinfusion of highly purified CD133+ bone marrow-derived stem/progenitor cells in patients with end-stage liver disease: A phase I clinical trial. Digestive and liver disease. 47 (12), 1059-1066 (2015).
- Arici, V., et al. Autologous immuno magnetically selected CD133+ stem cells in the treatment of no-option critical limb ischemia: clinical and contrast enhanced ultrasound assessed results in eight patients. Journal of translational medicine. 13, 342 (2015).
- Zali, A., et al. Intrathecal injection of CD133-positive enriched bone marrow progenitor cells in children with cerebral palsy: feasibility and safety. Cytotherapy. 17 (2), 232-241 (2015).
- Al-Zoubi, A., et al. Transplantation of purified autologous leukapheresis-derived CD34+ and CD133+ stem cells for patients with chronic spinal cord injuries: long-term evaluation of safety and efficacy. Cell transplantation. 23, Suppl 1. S25-S34 (2014).
- Isidori, A., et al. Positive selection and transplantation of autologous highly purified CD133(+) stem cells in resistant/relapsed chronic lymphocytic leukemia patients results in rapid hematopoietic reconstitution without an adequate leukemic cell purging. Biology of blood and marrow transplantation. 13 (10), 1224-1232 (2007).
- Nasseri, B. A., et al. Autologous CD133+ bone marrow cells and bypass grafting for regeneration of ischaemic myocardium: the Cardio133 trial. European heart journal. 35 (19), 1263-1274 (2014).
- Steinhoff, G., et al. Cardiac Function Improvement and Bone Marrow Response -: Outcome Analysis of the Randomized PERFECT Phase III Clinical Trial of Intramyocardial CD133(+) Application After Myocardial Infarction. EBioMedicine. 22, 208-224 (2017).
- Muller, P., et al. Intramyocardial fate and effect of iron nanoparticles co-injected with MACS(R) purified stem cell products. Biomaterials. 135, 74-84 (2017).
- Müller, P., Gaebel, R., Lemcke, H., Steinhoff, G., David, R. Data on the fate of MACS® MicroBeads intramyocardially co-injected with stem cell products. Data in brief. 13, 569-574 (2017).
- Skorska, A., et al. GMP-conformant on-site manufacturing of a CD133+ stem cell product for cardiovascular regeneration. Stem cell research & therapy. 8 (1), 33 (2017).
- Delyagina, E., Li, W., Ma, N., Steinhoff, G. Magnetic targeting strategies in gene delivery. Nanomedicine (Lond). 6 (9), 1593-1604 (2011).
- Schade, A., et al. Innovative strategy for microRNA delivery in human mesenchymal stem cells via magnetic nanoparticles. International journal of molecular sciences. 14 (6), 10710-10726 (2013).
- Delyagina, E., et al. Improved transfection in human mesenchymal stem cells: Effective intracellular release of pDNA by magnetic polyplexes. Nanomedicine. 9 (7), London, England. 999-1017 (2014).
- Yin, H., Kanasty, R. L., Eltoukhy, A. A., Vegas, A. J., Dorkin, J. R., Anderson, D. G. Non-viral vectors for gene-based therapy. Nature reviews. Genetics. 15 (8), 541-555 (2014).
- Chen, J., Guo, Z., Tian, H., Chen, X. Production and clinical development of nanoparticles for gene delivery. Molecular therapy. Methods & clinical development. 3, 16023 (2016).
- Juliano, R. L. The delivery of therapeutic oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 44 (14), 6518-6548 (2016).
- Soenen, S. J., Rivera-Gil, P., Montenegro, J. -M., Parak, W. J., de Smedt, S. C., Braeckmans, K. Cellular toxicity of inorganic nanoparticles: Common aspects and guidelines for improved nanotoxicity evaluation. Nano today. 6 (5), 446-465 (2011).
- Estelrich, J., Sánchez-Martín, M. J., Busquets, M. A. Nanoparticles in magnetic resonance imaging: From simple to dual contrast agents. International journal of nanomedicine. 10, 1727-1741 (2015).
