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Bioengineering

MicroRNA 移植成人骨髓造血干细胞促进细胞工程与磁性靶向结合的协议

Published: June 18, 2018 doi: 10.3791/57474
Automatic Translation
*1,2, *1,2, *1, 1,2, 1,2
1Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Department of Cardiac Surgery, Rostock University Medical Center, 2Department Life, Light and Matter of the Interdisciplinary Faculty, Rostock University
* These authors contributed equally

Summary

该协议说明了一个安全和有效的程序, 以修改 CD133+造血干细胞。所提出的非病毒, 磁性 polyplex 公司的方法可以为优化治疗干细胞效应, 并通过磁共振成像监测所管理的细胞产品提供了依据。

Abstract

虽然 CD133+造血干细胞 (SCs) 已被证明在再生医学领域提供了很高的潜力, 他们注射到受伤的组织后保持率低, 以及观察到的大量细胞死亡率导致非常限制治疗效果。为了克服这些限制, 我们寻求在其管理之前为合适的细胞工程学建立一个非病毒基础的协议。microRNA (和平号) 加载的磁性 polyplexes 对人体 CD133+表达 SCs 的修饰涉及吸收效率和安全性, 以及细胞的靶向电位。依靠我们的协议, 我们可以达到高和平号的80–90% 吸收率, 而 CD133+干细胞的性质仍然不受影响。此外, 这些修饰的细胞提供了磁性靶向的选择。我们在这里描述一个安全和高效的程序, 以修改 CD133+ SCs。我们期望这种方法提供一个标准的技术, 以优化治疗干细胞效应, 并通过磁共振成像 (MRI) 监测所管理的细胞产品。

Introduction

CD133是一种异种茎和祖细胞种群, 具有良好的再生医学潜力。他们的造血, 内皮和肌分化电位1,2,3使 CD133+细胞,例如, 通过分化促进血管新生过程通过分泌机制4,5,6,7进入新形成的血管和激活支持血管生成信号。

尽管在30多项经批准的临床试验 (ClinicalTrails.gov) 中表现出很高的潜力, 但其治疗结果仍处于争议性讨论4。事实上, 临床应用的 SCs 是阻碍了低滞留在器官的利益和大规模的初始细胞死亡5,8,9。额外的工程 CD133+ SCs 前移植可以帮助克服这些挑战。

有效细胞治疗的一个先决条件是减少大量的初始细胞死亡, 以提高治疗相关细胞的植入10。目前的研究表明, 在高度灌注的器官, 如大脑和心脏在第一 90–99%, 独立于移植细胞类型或应用路线11,12,13 , 巨大的细胞损失。,14,15,16,17,18,19,20,21。SC 标记使用磁性纳米粒子 (MNPs), 使一个创新的无创战略的目标细胞到感兴趣的地点22,23,24,25,26同时允许使用 MRI27和磁性粒子成像 (MPI) 进行细胞监测。最有效的体内研究应用磁化细胞靶向使用的细胞保留在地方管理以后倾向于细胞教导在静脉注射以后23,24,28.因此, 我们的小组设计了一个交付系统由超顺磁性氧化铁纳米粒子29组成。通过这种技术, CD133+ SCs 和人脐静脉内皮细胞 (血管内皮细胞) 可以有效地被靶向, 如在体外尝试30,31证明。

SC 疗法的另一个障碍是被影响的组织的敌对炎症环境在移植以后, 导致最初的细胞死亡32。除几项预适应研究外, 对治疗相关的大鹏湾的应用进行了33项试验;成功地证明, 抗凋亡的大鹏湾抑制体外凋亡, 增强细胞植入在体内33。这些由20–25核苷酸组成的小分子, 扮演信使 rna 转录后水平调制器 (基因) 的关键角色, 从而影响干细胞的命运和行为34。此外, 对大鹏湾的外源引入避免了不理想的稳定集成到宿主基因组34。

目前试图有效地引入核酸 (NAs) 到初级 SCs 主要是基于重组病毒8,35。尽管高转染效率, 重组病毒操作是一个主要的障碍, 对床边的翻译,例如, 无法控制的基因表达, 致病性, 免疫原学, 和插入诱变35 ,36。因此, 非病毒传递系统, 如聚合物基结构是至关重要的发展。其中, 聚乙烯亚胺 (裴) 代表了一个有效的运载工具, 为大鹏湾提供好处, 如 NA 冷凝, 以防止退化, 细胞摄取, 并通过细胞膜逃逸37,38的胞内释放。此外, 和平号配合物在临床试验中表现出高度的生物相容性39。因此, 我们的交付系统包括一个生物素化分支 25 kDa 裴绑定到一个链亲和素涂层的自然人-核心30,31,40。

在这篇手稿中, 我们提出了一个全面的协议, 描述 (i) 人工隔离 CD133+ sc 从人骨髓 (BM) 捐赠与 sc 产品的详细描述和 (ii) 一个有效和温和的转染策略的基于磁性非病毒聚合物的 CD133 遗传工程输送系统的应用.CD133+ SCs 是孤立和磁性丰富的人胸骨 BM 吸出物使用表面抗体为基础的磁性活化细胞分拣 (mac) 系统。然后利用流式细胞仪对细胞活力和细胞纯度进行分析。随后, 和平号/裴/自然人流动综合体已准备就绪, CD133+ SCs 被转染。18 h 转染后, 分析了其吸收效率和转染对 SC 标记表达和细胞活力的影响。此外, 利用四色标记和结构光照显微镜 (SIM) 对转染复合物的胞内分布进行了评价。

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Protocol

胸骨人类细胞分离是从知情的捐赠者那里获得的, 他们书面同意使用他们的样本进行研究, 根据《赫尔辛基宣言》。罗斯托克大学的道德委员会批准了这项研究 (注册号: 2010 23, 延长于 2015年)。

1. 细胞制剂

注: 使用肝素钠 (250 毫升) 防止凝固的 bm 检查。

  1. CD133+ SC 隔离
    1. 准备所需的解决方案
      1. 将996毫升 1x PBS 与4毫升 EDTA (0.5 米) 混合, 制备磷酸盐缓冲盐水 (PBS)/乙二胺二乙酸 (EDTA) 库存溶液 (2 毫米)。用0.45 µm 过滤器大力混合溶液和滤液。贮存在室温下 (RT)。
      2. 将995毫升2毫米 PBS/EDTA 与5克牛血清白蛋白 (BSA) 混合, 制备 mac 缓冲液。用0.45 µm 过滤器大力混合溶液和滤液。存储在4摄氏度。
      3. 在12.5 毫升的 PBS 中稀释500毫克胶原酶 b (从histolyticum 梭菌中), 制备胶原酶 b 库存溶液 (40 毫克/毫升)。大力搅拌解决方案, 使整除数350µL, 并存储在-20 摄氏度。
      4. 准备脱氧核糖核酸酶 (DNAse) 我的股票溶液 (10 毫克/毫升) 稀释100毫克的 DNAse I (从牛胰腺) 在10毫升的 PBS。大力搅拌解决方案, 使整除数350µL, 并存储在-20 摄氏度。
    2. 酶法消化人类 BM 的研究
      1. 预热的人淋巴细胞培养基到 RT 和解冻酶 (1 整除每一个胶原酶 B 和 DNAse 每20毫升)。
      2. 收集从注射器到50毫升锥形管, 并轻轻混合。丢弃任何现有的血块。
        注: 将200µL 未稀释的 BM 转化为1.5 毫升管, 用于随后的流细胞分析。存储在4°c, 直到使用。
      3. 将10毫升 BM 移植到一个新的50毫升圆锥管中, 加入6毫升的 PBS/EDTA (2 毫米), 20 毫升人淋巴细胞培养基, 175 µL 胶原酶 B (40 毫克/毫升) 和175µL DNAse I (10 毫克/毫升)。轻轻地混合溶液和孵化30分钟在 RT 上的振动筛。对剩余的 BM 样本重复。
    3. 密度梯度离心
      1. 50毫升密度梯度离心管, 应用15毫升的人淋巴细胞分离培养基成50毫升管。离心机在 1000 x g三十年代。
      2. 小心地35毫升稀释的 BM 在密度梯度离心管过滤器之上和离心机在 445 x g在 RT 35 分钟。
        注: 离心机设置为低加速度 (3), 无制动器 (1)。
      3. 小心地从离心机上取下管子而不摇晃。小心地从上清溶液中丢弃 ~ 20 毫升, 而不直接触及过滤器顶部的混浊层。
      4. 仔细转移多云层 (这是直接在过滤器的顶部, 并包含单个核细胞 (跨国公司)) 成一个新的50毫升圆锥管, 并填补了 PBS/EDTA 到最后的体积50毫升。
        注: 将所有跨国公司从一个 BM 患者样本合并为一个新的管。
      5. 通过将50毫升细胞悬浮液的10µL 转移到1.5 毫升管中, 对跨国公司进行计数。添加10µL 3% 乙酸与亚甲基蓝。轻轻地混合和应用10µL 到一个计数室。计算跨国公司的数量。
      6. 离心机的跨国公司悬浮在 300 x g 10 分钟. 弃上清。
        注: 离心过程中, 冷却离心机从 RT 到4°c。
    4. 人 CD133 抗体联用超顺磁性铁葡聚糖粒子 CD133+ SCs 的磁选
      注意: 在这一步, 在冰上工作。存储解决方案, 直到使用4摄氏度。将 mac 永磁体、分离柱和预分离过滤器存放在摄氏4摄氏度。
      1. 选择列大小。对于 < 1.2 x 108跨国公司, 使用 MS 列, 并为 > 1.2 x 108跨国公司, 使用 LS 列 (见材料表)。
      2. 要准备 1 x 108总细胞数的磁选, 小心地并用重悬跨国公司在300µL mac 缓冲器 (4 °c)。添加100µL FcR 阻断试剂 (4 °c) 和100µL CD133 抗体挂钩超顺磁性铁葡聚糖颗粒 (4 °c)。
      3. 轻轻地混合细胞悬浮和孵育30分钟在4摄氏度。在孵化期间轻轻摇动细胞悬浮液 (2–3x)。
      4. 添加2毫升的 mac 缓冲器 (4 °c) 每 1 x 108全跨国公司. 在300摄氏度时, 将细胞悬浮液和离心机在 10 x g处轻轻混合, 4 分钟。
      5. 设置 mac 磁铁持有人, 并附上 mac 永磁。安装 mac 列并在顶部应用预分离过滤器。
      6. 平衡第一个 mac/LS 柱和预分离过滤器, 其0.5 毫升 (MS) 或3毫升 (LS) 的 mac 缓冲器 (4 °c)。
        注: 不允许 mac 列在平衡后干燥。
      7. 在500µL 的 mac 缓冲器 (4 °c) 中, 去掉上清和并用重悬的颗粒, 每 1 x 108个总细胞量。将电池悬浮液应用于预分离过滤器。
      8. 清洗 mac 柱和预分离过滤器三次使用, 每洗, 0.5 毫升 (MS) 或3毫升 (LS) 的 mac 缓冲器 (4 °c)。
        注: 在第三次洗涤步骤中, 将第二个 mac 列安装到 mac 永磁体中, 并平衡第二个 mac/ls 列, 其0.5 毫升 (ms) 或3毫升 (ls) mac 缓冲器 (4 °c)。
      9. 丢弃预分离过滤器。
      10. 将单元分数直接洗脱到第二个 mac 列上: 在第一个 mac 列上添加1毫升 (MS) 或5毫升 (LS) mac 缓冲器 (4 °c), 并从 mac 永磁体中取出 mac 列。立即将第一个 mac 列转移到第二个 mac 列上方, 然后使用所提供的柱塞将电池悬浮通过 mac 列。
      11. 清洗 mac 柱三次, 每个洗涤0.5 毫升 (MS) 或3毫升 (LS) mac 缓冲器 (4 °c) 使用。
      12. 洗脱将1毫升 (MS) 或5毫升 (LS) mac 缓冲器 (4 °c) 添加到第二个 mac 列上, 并从 mac 永磁体中移除 mac 列, 从而将单元格分数从该列中剔除。立即将第二个 mac 列转移到1.5 毫升管 (MS) 或15毫升圆锥管 (LS) 上, 然后使用所提供的柱塞将电池悬浮通过 mac 柱。
      13. 离心机在 300 x g 10 分钟在4摄氏度。小心丢弃上清液, 并用重悬100µL 中获得的颗粒 (4 °c)。
      14. 数 CD133+细胞: 将细胞悬浮液的6µL 转移到1.5 毫升管中。添加6µL 台盼蓝溶液 (0.4%)。轻轻地混合和应用10µL 到一个计数室。计算 CD133+单元格的数目。
      15. 将 CD133+细胞储存在冰上直到播种。
  2. 新鲜隔离 CD133 的表征
    注: 以下工作应在一个房间内进行保护, 从明亮的灯光 (仅昏暗照明)。在冰上保留管子、缓冲器和抗体, 除非另有说明。
    1. 用于流细胞分析的 SCs 的制备
      1. 使用两个样本 (每10µL) 的 BM 整除数和一个样本的新鲜隔离 CD133+ SCs (最小, 1 x 104细胞) 进行分析。把细胞转移到1.5 毫升的管子里。添加10µL 的 FcR 阻断试剂, 并填写与 mac 缓冲器 (4 °c) 的体积33µL。
      2. 将下列抗体添加到各自管的内侧 (见表 1): anti-CD34-fluorescein 异硫氰酸酯 (FITC) (克隆: AC136), anti-CD133/2-phycoerythrin (PE) (克隆: 293C3), 同种控制小鼠 IgG 2 b-PE,anti-CD45-allophycocyanin (APC)-H7 (克隆: 2D1) 和 7-aminoactinomycin (反倾销)。在所有的抗体添加后, 摇下管的抗体侧。轻轻混合溶液 (最终体积50µL) 和孵化10分钟在4摄氏度。
      3. 添加1毫升的1x 红细胞 (红细胞) 裂解缓冲液, 轻轻混合悬浮液, 在冰上孵育10分钟. 离心机悬浮在 300 x g在4°c 10 分钟。
      4. 在100µL PBS (4 °c) 中丢弃上清和并用重悬得到的颗粒。储存在冰上直到流细胞分析。
    2. CD133 的流细胞分析
      1. 为了检查 CD133+ SC 的细胞活力和纯度, 使用一个适应国际社会的 Hematotherapy 和接枝工程 (ISHAGE) 流式细胞术门策略41 (见图 1中的代表性描述)。使用以下顺序:
        步骤 1: 单元格填充的选择 (图 1A)
        步骤 2: 选择 CD45+单元格 (图 1B)
        步骤 3: 选择可行的 CD45+单元格 (图 1C)
        步骤 4: 选择可行的 CD45+/CD34+单元格 (图 1D)
        步骤 5: 选择可行的 CD45+/CD34+/CD133+单元格 (图 1E)
        根据制造商的说明运行流式细胞仪 (见材料表)。
      2. 使用以下等式计算细胞的生存能力和纯度:

Equation 1   等式1

Equation 2   等式2

  1. 新鲜分离 CD133 的细胞培养
    1. 整除100x 重组人细胞因子补充在100µL 整除数和存储在-20 摄氏度。在培养基准备前解冻一100x 整除。
    2. 制备 CD133+ SC 培养基, 无血清造血细胞扩张培养基, 辅以重组人细胞因子补充剂 (最终 1x) 和1% 青霉素/链霉素。
    3. 种子 5 x 104新鲜隔离 CD133+ SCs 转染在24井板与500µL 培养基。孵育细胞在37°c, 5% CO2和 20% O2。
      注: 种子 5 x 104新鲜隔离 CD133+ SCs 作为控制流细胞分析。

2. 转染复合物的制备

注意: 在这一步, 保持整个工作空间核糖核酸 (RNAse) 免费使用 RNAse 净化解决方案, 并只使用无 RNAse 耗材。

  1. 和平号的准备工作
    注: 以下工作应在一个房间内进行保护, 从明亮的灯光 (仅昏暗照明)。
    注: 对于和平号-标本: 使用菁3染料标记的前体和平号和未标记的前体和平号。
    1. 要准备和平号库存解决方案 (50 µM), 请在适当数量的无核酸酶水中稀释所需数量的和平号 (例如, 在100µL 水中稀释 5 nmol 和平号)。轻轻地混合解决方案, 整除和平号股票 (5 µL), 并存储在-20 摄氏度以下。
  2. 培贝的制备
    1. 按照标准协议准备裴, 并注意裴库存浓度31,42 。
  3. 准备自然人流动
    1. 按照标准协议准备 MNPs, 并注意自然人流动库存浓度31,42。
  4. 制备和平号/培配合物
    1. 在无核酸酶的水中稀释 d-(+) 葡萄糖, 制备5% 葡萄糖溶液。轻轻地混合溶液, 整除的股票 (1.5 毫升), 并存储在4摄氏度。
      注: 以下工作应在一个房间内进行保护, 从明亮的灯光 (仅昏暗照明)。
    2. 使用 20 pmol 和平号每井24井板30。在5% 葡萄糖溶液中稀释和平号, 最终浓度为 0.25 pmol 和平号/µL。
    3. 根据裴库存浓度 (步骤 2.2.1, 计算基于和平号 (20 pmol、步进 2.3.1) 和最佳氮气 (pei) 与磷酸 (N/P) 比值的 pei 所需量; 在这里, 7.5 的比率被使用了)30。根据等式稀释5% 葡萄糖溶液中的裴:
      Equation 3
      重新排列以
      Equation 4    等式3
      其中裴体积在µL 和 [裴] 是毫米, 和 N/P (为本协议优化) 是0.75。0.12 是一个特定于和平号的转换因子。
    4. 将预稀释的裴加入预稀释的和平号和涡旋三十年代。
    5. 在 RT 中孵化30分钟的和平号/裴复合体。
  5. 准备和平号/裴/自然人流动综合体
    注: 以下工作应在一个房间内进行保护, 从明亮的灯光 (仅昏暗照明)。
    1. 在孵化和平号/裴配合物时, 在 sonicating 的 sonicating 水浴中, 用 MNPs 20 分钟的时间准备 MNPs, 以确保粒子悬浮而不聚集。
    2. 根据自然人流动库存解决方案 (步骤 2.3.1) 计算所需 MNPs (3 µg 铁/毫升) 的数量。
    3. 将微气泡 MNPs 加入和平号/裴配合物和漩涡三十年代. 在 RT 中孵化30分钟的和平号/裴/自然人流动综合体。
  6. 基于 SIM 的四色标记转染复合物的制备
    注: 使用未标记的前体和平号。
    1. 按照制造商的说明, 使用菁5染料色标套件 (见材料表), 用菁5染料标记和平号。使用列出的分光光度计 (见材料表), 按照制造商 (核酸, RNA-40) 提供的预先设定量测量最终的和平号浓度。整除和平号 (5 µL) 和存储在-80 摄氏度保护免受光。
    2. 根据制造商的说明, 使用合适的蛋白质标签套件 (见材料表) 将裴与明亮的绿色荧光染料贴上标签。使用茚检测 (步骤 2.2.1) 定义最终的裴浓度。整除 (在根据等式 3计算的容量) 和存放在4°c 保护免受光。
    3. 用 1:1, 000 瓦特/w, 染料和自然人的比例来标记 MNPs 与生物素共轭的罗丹明染料。同时混合罗丹明染料和 MNPs, 同时配合和平号/裴复杂地层的制备, 在黑暗中孵化出30分钟的溶液。直接使用标记的 MNPs。

3. CD133+ SCs 的转染

注意: 在这一步, 保持整个工作空间核糖核酸 (RNAse) 免费使用 RNAse 净化解决方案和使用仅 RNAse 耗材材料
注: 以下工作应在一个房间内进行保护, 从明亮的灯光 (仅昏暗照明)。

  1. 将准备好的 miRNA/裴/自然人流动的复合物直接放入适当的井中, 在培养基中含有新鲜隔离的 CD133+ SCs。
  2. 轻轻地摇动盘子来回搅拌。孵育细胞为18小时在37°c, 5% CO2和 20% O2。

4. 对和平号转染的分析

  1. 对转染复合物的吸附效率和细胞毒性的检测
    注: 对于和平号标本: 使用菁3染料标记的前体和平号的吸收评价和非转染 CD133+ SCs 为流式细胞术控制门。
    注: 以下工作应在一个房间内进行保护, 从明亮的灯光 (仅昏暗照明)。
    注意: 除非另有说明, 否则将管子、缓冲器和抗体放在冰上。
    1. 在100毫升 PBS 中稀释4克粉煤灰, 并将溶液加热至80摄氏度, 以制备多聚甲醛溶液 (粉煤灰, 4%)。大力搅拌溶液, 将 pH 值调整为7.3。整除的粉煤灰 (1.5 毫升) 和存储在-20 摄氏度。
    2. 18小时后转染, 收集每个井在一个单独的1.5 毫升管。用500µL 的 PBS 冲洗一次井, 将这个细胞悬浮液转移到同一管上。
    3. 离心机在 300 x g 10 分钟在4摄氏度。在100µL 的4°c mac 缓冲器中, 丢弃上清和并用重悬得到的颗粒。
    4. 添加0.5 µL 胺反应染料, 以区分活细胞和死体细胞, 轻轻混合悬浮, 并孵化10分钟4摄氏度。增加1毫升 PBS (4 °c) 和离心机在 300 x g 10 分钟在4°c。
    5. 丢弃上清, 并用重悬在100µL PBS 中获得的颗粒, 加入33µL 粉煤灰 (4%), 并贮存在冰上或4摄氏度, 直至流细胞分析。
    6. 根据图 2中的代表性描述安排浇口策略。根据制造商的说明, 在流式细胞仪上运行样品 (见材料表)。
  2. 和平号转染 CD133+ SCs 的表征
    注: 使用未标记的前体和平号和非转染 CD133+ SCs 用于流式细胞术控制门。
    1. 收集每个井在一个单独的1.5 毫升管和离心机在 300 x g 10 分钟在4摄氏度。
    2. 按照步骤1.2 中的说明使用浇口策略。
  3. 模拟转染复合物细胞内分布的检测
    1. 准备配合物并染2节和第3节所述的细胞。
    2. 18小时后转染, 收集每个井在一个单独的1.5 毫升管。每次用500µL 的 PBS 冲洗一次, 然后把洗好的管子转移到井的各自管里。离心机在 300 x g 10 分钟在4摄氏度。
    3. 在 PBS 中丢弃上清和并用重悬1毫升2% 胎牛血清 (血清) 中获得的颗粒, 轻轻混合悬浮液, 离心机在 300 x g处为10分钟, 4 摄氏度。
    4. 放弃上清, 并用重悬100µL 中获得的颗粒, 并添加33µL 粉煤灰 (4%) 20 分钟。
    5. 将细胞悬浮液转移到含有无菌玻璃盖玻片的新的24培养板中, 离心机在 300 x g处为10分钟, 4 摄氏度。
    6. 丢弃上清, 并添加500µL 的 PBS。轻轻摇动盘子, 丢弃 PBS。
    7. 将准备好的盖玻片放在显微幻灯片上, 使用水上安装培养基保存荧光, 并在 RT 上干燥至少1小时。
    8. 使用100X 油浸泡目标获取图像。SIM 设置: 405、488、561和633毫微米激光线为励磁和 z 栈以16位深度在3个角度, 3 个阶段, 以平均 4, 网格每激光线:23 µm-405, 34 µm – 488, 42 µm-561, 51 µm-633。

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Representative Results

提出的协议描述了人工隔离和磁性丰富的人 BM 衍生 CD133+ SCs 与随后的病毒独立细胞工程战略, 作为一种非侵入性技术的体外细胞操作和在体内监测工具。

这三步隔离技术允许跨国公司从预消化的胸骨 BM 通过密度梯度离心分离。然后, 使用适当的隔离技术, CD133+细胞分数可以被磁性丰富。这允许丰富的 CD133+ SCs 的生存能力和纯度高于 80%, 这可以确定的流式细胞术 (图 1)。以下, 仅有符合要求的 SC 产品用于进一步试验。

这里描述的转染方法允许在这些新鲜隔离的人类 CD133+ SCs 中高效地引入和平号, 吸收大约80% 的存活细胞 (图 2)30。此外, 与对照细胞相比, 转染后18小时无明显的细胞毒性效应 (图 2)30。此外, 使用 SIM (图 3) 可以在细胞的细胞质内观察到转染复合物 (和平号、裴和 MNPs) 的充足交付和通常分布情况。

Figure 1
图 1: CD133+ SC 特性的典型布尔浇口策略.(E)描述一个5步选择战略, 严格评估孤立 CD133+ SC 的细胞活力和纯度, 以及 (F) CD133 同种控制使用适当的未经治疗的 BM 样品。(A) 在前/旁散布 (FSC/SSC) 点图中不包括完整的细胞种群的碎片, 其次是连续选择 (B) CD45+细胞种群, (C) 可行的 CD45+细胞种群, (D)可行的双阳性 CD45+/CD34+细胞群, (E) 可行的三重阳性 CD45+/CD34+/CD133+细胞数量。橙色: CD45+/CD34+/CD133+在每个选择步骤中突出显示的单元格。图例: APC-Cy7: anti-CD45, FITC: anti-CD34, FSC: 正向散射通道, PE: anti-CD133, SSC: 侧向散射通道, 7-反: 7-aminoactinomycin。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: 具有代表性的门控策略, 用于评估转染复合体的吸收效率和细胞毒性.(a、 B) 转染 CD133+ scs 的门控策略以及 (c、 D) 未转染的 CD133+ scs 分析 (a、 C) Cyanine3 染料标记的前体-miRNA 吸收效率 (红色: 可行的 Cy3+细胞) 和 (B, D) 由胺反应染料标记的转染程序的细胞毒性效应, 以区分活细胞和死体细胞 (蓝色: 死细胞)。图例: 侧向散射通道, 仅限细胞: 未转染的 CD133+ scs, miRNA/裴/自然人: CD133+ scs 转染 Cy3-labeled 和平号请单击此处查看此图的更大版本.

Figure 3
图 3: 转染复合物的胞内可视化.CD133+ SCs 转染了三色标记的和平号/裴/自然人流动综合体 (和平号:20 pmol, 裴: N/P 比率 7.5, 自然人流动: 3 µg/毫升)。用结构化光照显微术进行转染后18小时进行代表性可视化。和平号被标记为 Cyanine5 染料 (红色), 裴与明亮的绿色荧光染料 (绿色), 和 MNPs 与罗丹明染料共轭到生物素 (黄色), 和细胞核复染与 DAPI (蓝色)。刻度条 = 5 µm.请点击这里查看这个数字的大版本.

样品 FCR 阻断试剂 [µL] mac 缓冲器 [µL] 抗体 [µL] 总计 [µL]
数量 标本 单元格 [µL] CD133-PE 同种 CD133-PE CD34-FITC CD45-APC-Cy7 添加
1 Bm 10 10 12。5 5 - 5 2。5 5 50
2 Bm 10 10 12。5 - 5 5 2。5 5 50
3 CD133+ (1x104) 10 12。5 - 5 5 2。5 5 50

表 1: CD133 特性的吹打布局+SCs.

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Discussion

近年来, CD133+ SCs 已成为一个有希望的细胞群体的 SC 为基础的治疗, 证明了几个阶段 I, II 和 III 临床试验43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53,54. 在这里, 我们提出了一个详细的协议, 标准化手工纯化和流动细胞的特征, 这些细胞从人胸骨 BM。所描述的基于 mac 的隔离程序是一种温和、快速和有效的策略, 可以获得高度纯净和可行的造血 SC 分数。我们的55、56组先前已经证明了良好的相容性, 结合了用于细胞分选的共注入 mac 微球的快速降解。

这种隔离程序是以人胸骨 BM 为源材料开发的, 因此, 该协议目前允许纯化造血 SCs, 用于非临床研究。如果 CD133+ SCs 与其他组织 (如从髂嵴获得的 BM) 分离, 则该协议的几个步骤, 如酶组织消化和密度离心可能需要适应。为临床细胞应用, 我们集团进一步建立了符合 GMP 的现场制造程序使用自动系统, 以满足额外的需求, 代表临床需要57。

在其应用之前, SCs 工程是一种新的策略, 以克服某些障碍的 SC 治疗, 包括低细胞保留和大规模细胞死亡。本协议包括有关生产无病毒多功能转染系统的指令, 其基础是 MNPs 的分枝裴和它的有效引入 CD133+ SCs30。该系统的应用使基因细胞修饰, 磁控细胞引导, 和无侵袭细胞追踪通过 MRI 或 MPI30,31,40,42,58,59,60。

重要的是, 所描述的转染条件已被优化的 CD133的瞬态遗传改性的 SCs30。在以前的著作中, 这种转染系统也成功地应用于向其他细胞类型31、40、60提供质粒 DNA 和和平号。这些实验表明, 转染效率和细胞毒性都依赖于胞型。因此, 需要为每个单元格类型定义 NAs、PEI 和 MNPs 的最佳组合。

由于其高效性, 裴是一种最常用的聚合物为非病毒性遗传细胞工程61。然而, 临床应用61,62的裴是非常有限的迄今为止, 因为它的一般毒性61,63。有趣的是, 我们的小组最近表明, MNPs 减少裴毒性时, 包括在转染系统31,60。同时, 活性氧 (ROS) 产生的氧化铁基纳米粒子的可能毒性是剂量依赖性的, 几种超顺磁性纳米粒子被批准用于 MRI64、65.但是, 在体外和体内, 必须注意系统的毒性。

总的来说, 该议定书相当复杂, 包含许多需要非常认真处理的关键步骤。为此, 我们在《议定书》一节中用注释突出了这些要点。特别是, 我们希望指出一个完全 RNAse 的环境的重要性, 并避免在处理应用荧光染料的任何光暴露。

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Disclosures

作者声明没有利益冲突。

Acknowledgments

这项工作得到了德国联邦教育和研究部 (FKZ 0312138A 和 FKZ 316159)、国家与欧盟结构基金 (ESF/IVWM-B34-0030/10 和 ESF/IVBM-B35-0010/12) 和 DFG (DA1296/2-1) 的联合。德国心脏基础 (F/01/12), BMBF (VIP + 00240) 和潮湿的基础。此外, 卡尔亨利和下午还得到了罗斯托克大学医疗中心的 FORUN 计划 (889001) 的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
7-AAD BD Biosciences 559925
Acetic Acid with Methylene Blue Stemcell Technologies 7060 3%
anti-CD133/2-PE (clone: 293C3) Miltenyi Biotec GmbH 130-090-853
anti-CD34-FITC (clone: AC136) Miltenyi Biotec GmbH 130-081-001
anti-CD45-APC-H7 (clone: 2D1) BD Biosciences 560178
rhodamine dye; Atto 565 dye conjugated to biotin ATTO-TEC GmbH AD 565-71
BD FACS LSRII flow cytometer BD Biosciences
BD FACSDiva Software 6.1.2 BD Biosciences
BSA Sigma-Aldrich GmbH A7906
CD133 antibody-linked superparamagnetic iron dextran particles; CD133 MicroBead Kit Miltenyi Biotec GmbH 130-097-049
collagenase B Roche Diagnostics GmbH 11088831001
counting chamber Paul Marienfeld GmbH & Co. KG
Cyanine 3 dye labelled precursor miR; Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control #1 Ambion AM17120
Cyanine 5 dye miR labelling kit; Cy5 dye Label IT miRNA Labeling Kit Mirus Bio MIR 9650
DNAse I Roche Diagnostics GmbH 10104159001 (100 U/mL)
ELYRA PS.1 LSM 780 confocal microscope Carl Zeiss Jena GmbH
FcR Blocking Reagent, human Miltenyi Biotec GmbH 130-059-901
bright green protein labeling kit; Oregon Green 488 Protein Labeling Kit Thermo Fisher Scientific O10241
aqueous mounting medium; Fluoroshield Sigma-Aldrich GmbH F6182
density gradient centrifugation tube; Leukosep Centrifuge Tube Greiner Bio-One 89048-932
MACS magnet holder; MACS MultiStand Miltenyi Biotec GmbH 130-042-303
MACS pre-separation filter Miltenyi Biotec GmbH 130-041-407 30 µm
MACS separation column (MS / LS) Miltenyi Biotec GmbH 130-042-201 / 130-042-401
MACS permanent magnet; MACS Separator Miltenyi Biotec GmbH 130-042-302
Millex-HV PVDF Filter Merck SLHV013SL 0.45 μm
mouse IgG 2b-PE Miltenyi Biotec GmbH 130-092-215
amine reactive dye; Near-IR LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit Thermo Fisher Scientific L10119
human lymphocyte separating medium; Pancoll Pan Biotech GmbH P04-60500 density: 1.077 g/mL
PBS Pan Biotech GmbH P04-53500 without Ca and Mg
PEI Sigma-Aldrich GmbH 408727 branched; 25 kDa
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 100 U/mL, 100 μg/mL
PFA Merck Schuchardt OHG 1040051000
unlabelled precursor miR; Pre-miR miRNA Precursor Negative Control #1 Ambion AM17110
RBC lysis buffer eBioscience 00-4333-57
RNAse decontamination solution; RNaseZap Thermo Fisher Scientific AM9780
human lymphocyte medium; Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium Pan Biotech GmbH P04-16500
recombinant human cytokine supplement; StemSpan CC100 Stemcell Technologies 2690
serum-free haematopoietic cell expansion medium; StemSpan H3000 Stemcell Technologies 9800
Streptavidin MagneSphere Paramagnetic Particles Promega Corporation Z5481
Trypan Blue solution Sigma-Aldrich GmbH T8154 0.4 %
UltraPure EDTA Thermo Fisher Scientific 15575020 0.5 M; pH 8.0
ZEN2011 software Carl Zeiss Jena GmbH
NanoDrop 1000 Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific
Sonorex RK 100 SH sonicating water bath Bandelin electronic Ultrasonic nominal output: 80 W; Ultrasonic frequency: 35 kHz

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References

  1. Meregalli, M., Farini, A., Belicchi, M., Torrente, Y. CD133(+) cells isolated from various sources and their role in future clinical perspectives. Expert opinion on biological therapy. 10 (11), 1521-1528 (2010).
  2. Lee, S., Yoon, Y. -S. Revisiting cardiovascular regeneration with bone marrow-derived angiogenic and vasculogenic cells. British journal of pharmacology. 169 (2), 290-303 (2013).
  3. Beksac, M., Preffer, F. Is it time to revisit our current hematopoietic progenitor cell quantification methods in the clinic? Bone marrow transplantation. 47 (11), 1391-1396 (2012).
  4. Bongiovanni, D., et al. The CD133+ cell as advanced medicinal product for myocardial and limb ischemia. Stem cells and development. 23 (20), 2403-2421 (2014).
  5. Wang, X., et al. The Clinical Status of Stem Cell Therapy for Ischemic Cardiomyopathy. Stem cells international. 2015, 135023 (2015).
  6. Ma, N., et al. Intramyocardial delivery of human CD133+ cells in a SCID mouse cryoinjury model: Bone marrow vs. cord blood-derived cells. Cardiovascular research. 71 (1), 158-169 (2006).
  7. Rafii, S., Lyden, D. Therapeutic stem and progenitor cell transplantation for organ vascularization and regeneration. Nature medicine. 9 (6), 702-712 (2003).
  8. Wang, D., Gao, G. State-of-the-art human gene therapy: part I. Gene delivery technologies. Discovery medicine. 18 (97), 67-77 (2014).
  9. Sart, S., Ma, T., Li, Y. Preconditioning stem cells for in vivo delivery. BioResearch open access. 3 (4), 137-149 (2014).
  10. Liu, J., et al. Early stem cell engraftment predicts late cardiac functional recovery: preclinical insights from molecular imaging. Circulation. Cardiovascular imaging. 5 (4), 481-490 (2012).
  11. Lang, C., et al. In vivo comparison of the acute retention of stem cell derivatives and fibroblasts after intramyocardial transplantation in the mouse model. European journal of nuclear medicine and molecular imaging. 41 (12), 2325-2336 (2014).
  12. Goussetis, E., et al. Intracoronary infusion of CD133+ and CD133-CD34+ selected autologous bone marrow progenitor cells in patients with chronic ischemic cardiomyopathy: cell isolation, adherence to the infarcted area, and body distribution. Stem cells. 24 (10), Dayton, Ohio. 2279-2283 (2006).
  13. Caveliers, V., et al. In vivo visualization of 111In labeled CD133+ peripheral blood stem cells after intracoronary administration in patients with chronic ischemic heart disease. Q J Nucl Med Mol Imaging. 51 (1), 61-66 (2007).
  14. Terrovitis, J. V., Smith, R. R., Marbán, E. Assessment and optimization of cell engraftment after transplantation into the heart. Circulation research. 106 (3), 479-494 (2010).
  15. Rosado-de-Castro, P. H., et al. Biodistribution of bone marrow mononuclear cells after intra-arterial or intravenous transplantation in subacute stroke patients. Regenerative medicine. 8 (2), 145-155 (2013).
  16. Kang, W. J., Kang, H. -J., Kim, H. -S., Chung, J. -K., Lee, M. C., Lee, D. S. Tissue distribution of 18F-FDG-labeled peripheral hematopoietic stem cells after intracoronary administration in patients with myocardial infarction. Journal of nuclear medicine official publication, Society of Nuclear Medicine. 47 (8), 1295-1301 (2006).
  17. Blocklet, D., et al. Myocardial homing of nonmobilized peripheral-blood CD34+ cells after intracoronary injection. Stem cells. 24 (2), Dayton, Ohio. 333-336 (2006).
  18. Penicka, M., et al. One-day kinetics of myocardial engraftment after intracoronary injection of bone marrow mononuclear cells in patients with acute and chronic myocardial infarction. Heart (British Cardiac Society). 93 (7), 837-841 (2007).
  19. Schächinger, V., et al. Pilot trial on determinants of progenitor cell recruitment to the infarcted human myocardium. Circulation. 118 (14), 1425-1432 (2008).
  20. Dedobbeleer, C., et al. Myocardial homing and coronary endothelial function after autologous blood CD34+ progenitor cells intracoronary injection in the chronic phase of myocardial infarction. Journal of cardiovascular pharmacology. 53 (6), 480-485 (2009).
  21. Musialek, P., et al. Randomized transcoronary delivery of CD34(+) cells with perfusion versus stop-flow method in patients with recent myocardial infarction: Early cardiac retention of (m)Tc-labeled cells activity. Journal of nuclear cardiology official publication of the American Society of Nuclear Cardiology. 18 (1), 104-116 (2011).
  22. Kyrtatos, P. G., et al. Magnetic tagging increases delivery of circulating progenitors in vascular injury. JACC. Cardiovascular interventions. 2 (8), 794-802 (2009).
  23. Vandergriff, A. C., et al. Magnetic targeting of cardiosphere-derived stem cells with ferumoxytol nanoparticles for treating rats with myocardial infarction. Biomaterials. 35 (30), 8528-8539 (2014).
  24. Huang, Z., et al. Magnetic targeting enhances retrograde cell retention in a rat model of myocardial infarction. Stem cell research & therapy. 4 (6), 149 (2013).
  25. Yanai, A., et al. Focused magnetic stem cell targeting to the retina using superparamagnetic iron oxide nanoparticles. Cell transplantation. 21 (6), 1137-1148 (2012).
  26. Arbab, A. S., Jordan, E. K., Wilson, L. B., Yocum, G. T., Lewis, B. K., Frank, J. A. In vivo trafficking and targeted delivery of magnetically labeled stem cells. Human gene therapy. 15 (4), 351-360 (2004).
  27. Cores, J., Caranasos, T. G., Cheng, K. Magnetically Targeted Stem Cell Delivery for Regenerative Medicine. Journal of functional biomaterials. 6 (3), 526-546 (2015).
  28. Cheng, K., et al. Magnetic enhancement of cell retention, engraftment, and functional benefit after intracoronary delivery of cardiac-derived stem cells in a rat model of ischemia/reperfusion. Cell transplant. 21 (6), 1121-1135 (2012).
  29. Li, W., et al. Enhanced thoracic gene delivery by magnetic nanobead-mediated vector. The journal of gene medicine. 10 (8), 897-909 (2008).
  30. Müller, P., et al. Magnet-Bead Based MicroRNA Delivery System to Modify CD133+ Stem Cells. Stem cells international. 2016, 7152761 (2016).
  31. Voronina, N., et al. Non-viral magnetic engineering of endothelial cells with microRNA and plasmid-DNA-An optimized targeting approach. Nanomedicine nanotechnology, biology, and medicine. , (2016).
  32. Noort, W. A., et al. Mesenchymal stromal cells to treat cardiovascular disease: strategies to improve survival and therapeutic results. Panminerva Med. 52 (1), 27-40 (2010).
  33. Jakob, P., Landmesser, U. Role of microRNAs in stem/progenitor cells and cardiovascular repair. Cardiovascular Research. 93 (4), 614-622 (2012).
  34. Sen, C. K. MicroRNAs as new maestro conducting the expanding symphony orchestra of regenerative and reparative medicine. Physiological genomics. 43 (10), 517-520 (2011).
  35. Papapetrou, E. P., Zoumbos, N. C., Athanassiadou, A. Genetic modification of hematopoietic stem cells with nonviral systems: past progress and future prospects. Gene therapy. 12, Suppl 1. S118-S130 (2005).
  36. Chira, S., et al. Progresses towards safe and efficient gene therapy vectors. Oncotarget. 6 (31), 30675-30703 (2015).
  37. Hobel, S., Aigner, A. Polyethylenimines for siRNA and miRNA delivery in vivo. Wiley interdisciplinary reviews. Nanomedicine and nanobiotechnology. 5 (5), 484-501 (2013).
  38. Villate-Beitia, I., Puras, G., Zarate, J., Agirre, M., Ojeda, E., Pedraz, J. L. First Insights into Non-invasive Administration Routes for Non-viral Gene Therapy. Gene Therapy - Principles and Challenges. Hashad, D. , (2015).
  39. Cubillos-Ruiz, J. R., Sempere, L. F., Conejo-Garcia, J. R. Good things come in small packages: Therapeutic anti-tumor immunity induced by microRNA nanoparticles. Oncoimmunology. 1 (6), 968-970 (2012).
  40. Schade, A., et al. Magnetic nanoparticle based nonviral microRNA delivery into freshly isolated CD105(+) hMSCs. Stem Cells Int. 2014, 197154 (2014).
  41. Sutherland, D. R., Anderson, L., Keeney, M., Nayar, R., Chin-Yee, I. The ISHAGE guidelines for CD34+ cell determination by flow cytometry. International society of hematotherapy and graft engineering. Journal of hematotherapy. 5 (3), 213-226 (1996).
  42. Voronina, N., et al. Preparation and in vitro characterization of magnetized mir-modified endothelial cells. Journal of visualized experiments. (123), (2017).
  43. Stamm, C., et al. Intramyocardial delivery of CD133+ bone marrow cells and coronary artery bypass grafting for chronic ischemic heart disease:Safety and efficacy studies. The journal of thoracic and cardiovascular surgery. 133 (3), 717-725 (2007).
  44. King, A., et al. REpeated AutoLogous Infusions of STem cells In Cirrhosis (REALISTIC): A multicentre, phase II, open-label, randomised controlled trial of repeated autologous infusions of granulocyte colony-stimulating factor (GCSF) mobilised CD133+ bone marrow stem cells in patients with cirrhosis. A study protocol for a randomised controlled trial. BMJ open. 5 (3), e007700 (2015).
  45. Martinez, H. R., et al. Stem cell transplantation in amyotrophic lateral sclerosis patients: methodological approach, safety, and feasibility. Cell transplantation. 21 (9), 1899-1907 (2012).
  46. Jimenez-Quevedo, P., et al. Selected CD133(+) progenitor cells to promote angiogenesis in patients with refractory angina: final results of the PROGENITOR randomized trial. Circulation research. 115 (11), 950-960 (2014).
  47. Raval, A. N., et al. Bilateral administration of autologous CD133+ cells in ambulatory patients with refractory critical limb ischemia: lessons learned from a pilot randomized, double-blind, placebo-controlled trial. Cytotherapy. 16 (12), 1720-1732 (2014).
  48. Andreone, P., et al. Reinfusion of highly purified CD133+ bone marrow-derived stem/progenitor cells in patients with end-stage liver disease: A phase I clinical trial. Digestive and liver disease. 47 (12), 1059-1066 (2015).
  49. Arici, V., et al. Autologous immuno magnetically selected CD133+ stem cells in the treatment of no-option critical limb ischemia: clinical and contrast enhanced ultrasound assessed results in eight patients. Journal of translational medicine. 13, 342 (2015).
  50. Zali, A., et al. Intrathecal injection of CD133-positive enriched bone marrow progenitor cells in children with cerebral palsy: feasibility and safety. Cytotherapy. 17 (2), 232-241 (2015).
  51. Al-Zoubi, A., et al. Transplantation of purified autologous leukapheresis-derived CD34+ and CD133+ stem cells for patients with chronic spinal cord injuries: long-term evaluation of safety and efficacy. Cell transplantation. 23, Suppl 1. S25-S34 (2014).
  52. Isidori, A., et al. Positive selection and transplantation of autologous highly purified CD133(+) stem cells in resistant/relapsed chronic lymphocytic leukemia patients results in rapid hematopoietic reconstitution without an adequate leukemic cell purging. Biology of blood and marrow transplantation. 13 (10), 1224-1232 (2007).
  53. Nasseri, B. A., et al. Autologous CD133+ bone marrow cells and bypass grafting for regeneration of ischaemic myocardium: the Cardio133 trial. European heart journal. 35 (19), 1263-1274 (2014).
  54. Steinhoff, G., et al. Cardiac Function Improvement and Bone Marrow Response -: Outcome Analysis of the Randomized PERFECT Phase III Clinical Trial of Intramyocardial CD133(+) Application After Myocardial Infarction. EBioMedicine. 22, 208-224 (2017).
  55. Muller, P., et al. Intramyocardial fate and effect of iron nanoparticles co-injected with MACS(R) purified stem cell products. Biomaterials. 135, 74-84 (2017).
  56. Müller, P., Gaebel, R., Lemcke, H., Steinhoff, G., David, R. Data on the fate of MACS® MicroBeads intramyocardially co-injected with stem cell products. Data in brief. 13, 569-574 (2017).
  57. Skorska, A., et al. GMP-conformant on-site manufacturing of a CD133+ stem cell product for cardiovascular regeneration. Stem cell research & therapy. 8 (1), 33 (2017).
  58. Delyagina, E., Li, W., Ma, N., Steinhoff, G. Magnetic targeting strategies in gene delivery. Nanomedicine (Lond). 6 (9), 1593-1604 (2011).
  59. Schade, A., et al. Innovative strategy for microRNA delivery in human mesenchymal stem cells via magnetic nanoparticles. International journal of molecular sciences. 14 (6), 10710-10726 (2013).
  60. Delyagina, E., et al. Improved transfection in human mesenchymal stem cells: Effective intracellular release of pDNA by magnetic polyplexes. Nanomedicine. 9 (7), London, England. 999-1017 (2014).
  61. Yin, H., Kanasty, R. L., Eltoukhy, A. A., Vegas, A. J., Dorkin, J. R., Anderson, D. G. Non-viral vectors for gene-based therapy. Nature reviews. Genetics. 15 (8), 541-555 (2014).
  62. Chen, J., Guo, Z., Tian, H., Chen, X. Production and clinical development of nanoparticles for gene delivery. Molecular therapy. Methods & clinical development. 3, 16023 (2016).
  63. Juliano, R. L. The delivery of therapeutic oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 44 (14), 6518-6548 (2016).
  64. Soenen, S. J., Rivera-Gil, P., Montenegro, J. -M., Parak, W. J., de Smedt, S. C., Braeckmans, K. Cellular toxicity of inorganic nanoparticles: Common aspects and guidelines for improved nanotoxicity evaluation. Nano today. 6 (5), 446-465 (2011).
  65. Estelrich, J., Sánchez-Martín, M. J., Busquets, M. A. Nanoparticles in magnetic resonance imaging: From simple to dual contrast agents. International journal of nanomedicine. 10, 1727-1741 (2015).

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