Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Protokol for mikroRNA overførsel i knoglemarv-afledte hæmatopoietisk stamceller til at aktivere celle Engineering kombineret med magnetisk målretning

Published: June 18, 2018 doi: 10.3791/57474
Automatic Translation
*1,2, *1,2, *1, 1,2, 1,2
1Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Department of Cardiac Surgery, Rostock University Medical Center, 2Department Life, Light and Matter of the Interdisciplinary Faculty, Rostock University
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokol illustrerer en sikker og effektiv procedure for at ændre CD133+ hæmatopoietisk stamceller. Den præsenteres ikke-virale, magnetiske polyplex-baserede tilgang kan danne grundlag for optimering af terapeutisk stamceller følger så godt som overvågning administreret celle produkt via magnetisk resonans.

Abstract

Mens CD133+ hæmatopoietisk stamceller (SCs) har vist sig for at give store potentiale inden for regenerativ medicin, deres lave opbevaring satser efter indsprøjtning i skadet væv samt de observerede massive celle død priser føre til meget begrænset terapeutiske virkninger. For at overvinde disse begrænsninger, forsøgte vi at etablere et ikke-virale baseret protokol for egnet celle engineering forud for deres administration. Ændring af menneskelig CD133+ udtrykker SCs ved hjælp af mikroRNA (miR) indlæses magnetiske polyplexes blev behandlet med hensyn til optagelsen effektivitet og sikkerhed samt målretning potentialet i cellerne. Afhængige af vores protokol, vi kan opnå høj miR optagelse priser af 80-90%, mens CD133+ stamceller egenskaber forbliver upåvirket. Desuden tilbyder disse modificerede celler mulighed for magnetisk målretning. Vi beskriver her en sikker og meget effektiv procedure for ændring af CD133+ SCs. Vi forventer, at denne fremgangsmåde til at give en standardteknologi for optimering af terapeutisk stamceller effekter og for overvågning af administreret celle produktet via magnetisk resonans imaging (MR).

Introduction

CD133+ SCs repræsenterer en heterogen stilk og stamfader celle population med lovende potentiale for regenerativ medicin. Deres hæmatopoietisk, endotel og myogenic differentiering potentielle1,2,3 sætter CD133+ -celler, f.eks., at bidrage til neovascularization processer gennem differentiering i nyligt danner fartøjer og aktivering af pro-angiogene signalering af paracrine mekanismer4,5,6,7.

Trods deres store potentiale demonstreret i mere end 30 godkendte kliniske forsøg (ClinicalTrails.gov), er deres terapeutiske resultat stadig under kontroversiel diskussion4. Faktisk, en klinisk anvendelse af SCs er hæmmet af lav fastholdelse i orgel af interesse og massive oprindelige celle død5,8,9. Yderligere engineering af CD133+ SCs forudgående transplantation kunne hjælpe med at overvinde disse udfordringer.

En forudsætning for en effektiv celleterapi ville være en reduktion af den massive indledende celledød at forbedre engraftment terapeutiske relevante celler10. Aktuelle undersøgelser viste en enorm celletab 90-99% i stærkt perfunderet organer som hjerne og hjerte i løbet af de første 1-2 h, uafhængigt af den transplanterede celletype eller ansøgning rute11,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21. SC mærkning ved hjælp af magnetiske nanopartikler (MNPs) gør det muligt for en nyskabende non-invasiv strategi til target-cellerne til webstedet af interesse22,23,24,25,26 og samtidig tillader celle overvågning ved hjælp af Mr27 og magnetiske partikel imaging (MPI). Den mest effektive i vivo undersøgelser udlignende magnetiseret celle målretning brugte celle opbevaring efter lokal administration frem for celle vejledning efter intravenøs injektion23,24,28 . Derfor designet vores gruppe en levering system bestående af superparamagnetisk jernoxid nanopartikler29. Med denne teknik, CD133+ SCs og menneskelige umbilical vene endothelial celler (HUVECs) kunne effektivt være målrettet, som det fremgår af in vitro- forsøg30,31.

En anden hurdle for SC terapier er fjendtlige inflammatoriske miljøet i de berørte væv efter transplantation, som bidrager til den første celle død32. Ud over flere præ conditioning undersøgelser blev anvendelsen af terapeutiske relevante miRs testet33; Det er blevet med held påvist, at anti-apoptotiske miRs hæmme apoptose i vitro og øge celle engraftment i vivo33. Disse små molekyler, der består af 20 – 25 nukleotider, spiller en afgørende rolle som posttranskriptionelle modulatorer af messenger RNA'er (mRNAs), og dermed påvirke stamcelle skæbne og opførsel34. Derudover eksogen indførelsen af miRs undgå uønskede stabile integration i vært genom34.

Nuværende forsøg for effektiv indførelse af nukleinsyrer (NAs) i primære SCs er hovedsagelig baseret på rekombinant virus8,35. Trods den høje Transfektion effektivitet præsenterer rekombinant virus manipulation en væsentlig hindring for en bænken til bedside oversættelse, fx, ukontrollabel genekspression, patogenicitet, immunogenicitet og pattedyrsceller mutagenese35 ,36. Ikke-viral levering systemer såsom polymer-baserede konstruktioner er derfor kritisk at udvikle. Blandt dem, polyethylenimine (PEI) repræsenterer en gyldig levering køretøj tilbyder fordele for miRs som NA kondens at beskytte mod nedbrydning, cellulære optagelse, og intracellulære frigivelse gennem endosomal undslippe37,38. Desuden demonstreret miR-PEI komplekser en høj biokompatibilitet i kliniske forsøg39. Derfor vores levering system består af en biotinylated forgrenet 25 kDa PEI bundet til en streptavidin-belagt MNP-core30,31,40.

I dette manuskript, præsenterer vi en omfattende protokol beskriver de manuelle isolation af CD133+ SC fra menneskelige knoglemarv (BM) donation med en detaljeret beskrivelse af produktets SC og (ii) en effektiv og blid Transfektion strategi af en magnetisk ikke-virale polymer-baserede levering system for gensplejsning af CD133+ SCs bruger miRs. CD133+ SCs er isoleret og magnetisk beriget fra menneskelige brystbenet BM aspirates ved hjælp af en overflade antistof-baserede magnetiske-aktiveret celle sortering (MLA) system. Bagefter, cellernes levedygtighed samt celle renhed er analyseret ved hjælp af flowcytometri. Efterfølgende, PEI-miR-MNP komplekser er forberedt og CD133+ SCs er transfekteret. 18 h efter Transfektion, optagelse effektiviteten og virkningen af Transfektion på SC markør udtryk og celle levedygtighed er analyseret. Desuden udføres evaluering af intracellulær fordelingen af Transfektion komplekse forbindelser, ved hjælp af firefarvet mærkning og struktureret belysning mikroskopi (SIM).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Brystbenet menneskelige BM for celle isolation blev indhentet fra informeret donorerne, der gav deres skriftlige samtykke til at bruge deres prøver til forskning efter Helsinki-erklæringen. Det etiske udvalg af Universitet i Rostock har godkendt den præsenteres undersøgelse (reg. nr. A 2010 23, forlænget i 2015).

1. celle forberedelse

Bemærk: Brug heparin natrium (250 IU/mL BM) at forhindre koagulation for BM undersøgelse.

  1. CD133+ SC isolation
    1. Forberedelse af nødvendige løsninger
      1. Forberede fosfatbufferet saltopløsning (PBS) / ethylendiamintetra syre (EDTA) bestand løsning (2 mM) ved at blande 996 mL 1 x PBS med 4 mL af EDTA (0,5 M). Bland løsningen og filtratet ved hjælp af et 0,45 µm filter. Opbevares ved stuetemperatur (RT).
      2. Forberede MACS buffer ved at blande 995 mL af 2 mM PBS/EDTA med 5 g af bovint serumalbumin (BSA). Bland løsningen og filtratet ved hjælp af et 0,45 µm filter. Opbevares ved 4 ° C.
      3. Forberede collagenase B stamopløsning (40 mg/mL) ved fortynding 500 mg af collagenase B (fra Clostridium histolyticum) i 12,5 mL PBS. Energisk Bland løsningen, gøre delprøver af 350 µL, og opbevares ved-20 ° C.
      4. Forberede deoxyribonuclease (DNAse) jeg lagerfører løsning (10 mg/mL) ved fortynding af 100 mg af DNase jeg (fra kvæg bugspytkirtlen) i 10 mL PBS. Energisk Bland løsningen, gøre delprøver af 350 µL, og opbevares ved-20 ° C.
    2. Enzymatisk nedbrydning af menneskelige BM
      1. Pre varm menneskelige lymfocyt mellemlang RT og tø enzymer (1 alikvot hver af collagenase B og DNAse pr. 20 mL BM).
      2. Indsamle BM fra sprøjter ind i et 50 mL konisk rør og bland forsigtigt. Kassér eventuelle eksisterende blodpropper.
        Bemærk: Overføre 200 µL af ufortyndet BM i 1,5 mL tube for efterfølgende flow cytometric analyse. Opbevares ved 4 ° C indtil brug.
      3. 10 mL BM overføres til en ny 50 mL konisk slange, tilsættes 6 mL PBS/EDTA (2 mM), 20 mL af human lymfocyt medium, 175 µL af Collagenase B (40 mg/mL) og 175 µL af DNAse jeg (10 mg/mL). Forsigtigt blandes løsningen og Inkuber i 30 min. ved RT på en shaker. Gentag for de resterende BM eksempel.
    3. Tæthed gradient centrifugering
      1. Prime en 50 mL tæthed gradient centrifugering rør ved at anvende 15 mL af human lymfocyt udskille medium i en 50 mL tube. Der centrifugeres ved 1.000 x g i 30 s.
      2. Omhyggeligt lag 35 mL fortyndet BM på toppen af tæthed gradient centrifugering tube filter og centrifugeres ved 445 x g i 35 min på RT.
        Bemærk: Centrifuge indstillinger er lav acceleration (3) og ingen bremse (1).
      3. Fjern forsigtigt røret fra centrifugen uden rystelser. Omhyggeligt kassere ~ 20 mL fra den øverste klare løsning uden at røre det overskyede lag direkte på toppen af filteret.
      4. Omhyggeligt overføre det overskyede lag, (som er direkte på toppen af filteret og indeholder de mononukleære celler (multinationale selskaber)) ind i en ny 50 mL konisk rør og fyld med PBS/EDTA til en endelige rumfang paa 50 mL.
        Bemærk: Kombinere alle multinationale selskaber fra en BM patienten prøve til en ny tube.
      5. Tælle de multinationale selskaber ved at overføre 10 µL af 50 mL cellesuspension til en 1,5 mL tube. Tilsæt 10 µL af 3% eddikesyre med methylenblåt. Forsigtigt blandes og Anvend 10 µL i en optælling kammer. Beregne antallet af multinationale selskaber.
      6. Centrifuge MNC suspension på 300 x g i 10 min. supernatanten.
        Bemærk: Under centrifugering, køle ned centrifuge fra RT til 4 ° C.
    4. Magnetiske udvalg af CD133+ SCs ved hjælp af menneskelige CD133 antistof-knyttet superparamagnetisk jern dextran partikler
      Bemærk: Under dette trin skal arbejde på is. Butiksløsninger til brug ved 4 ° C. Gemme MACS permanent magnet, adskillelse kolonner og før adskillelse filter ved 4 ° C.
      1. Vælg den kolonne størrelse. For < 1,2 x 108 Middelhavstredjelandene, brug MS kolonner, og for > 1,2 x 108 Middelhavstredjelandene, bruge LS kolonner (Se Tabel af materialer).
      2. For at forberede af magnetiske udvælgelse til 1 x 108 cellen total antal, omhyggeligt resuspend multinationale selskaber i 300 µL MACS buffer (4 ° C). Tilsæt 100 µL FcR blokerende reagens (4 ° C) og 100 µL CD133 antistof-knyttet superparamagnetisk jern dextran partikler (4 ° C).
      3. Forsigtigt blandes cellesuspension og Inkuber i 30 min. ved 4 ° C. Ryst forsigtigt cellesuspension under inkubationen (2 – 3 x).
      4. Der tilsættes 2 mL MACS buffer (4 ° C) pr. 1 x 108 alt Middelhavstredjelandene. forsigtigt blandes cellesuspension og centrifugeres ved 300 x g i 10 min. ved 4 ° C.
      5. Oprette MACS magnet indehaveren og vedhæfte MACS permanent magnet. Installere kolonnen MACS og anvende filteret før adskillelse på toppen.
      6. Reagensglasset første MACS MS/LS kolonne og før adskillelse filter med 0,5 mL (MS) eller 3 mL (LS) MACS buffer (4 ° C).
        Bemærk: Aldrig tillade MACS kolonner til at tørre ud efter ækvilibrering.
      7. Supernatanten og resuspenderes fremstillet i 500 µL af MACS buffer (4 ° C) pr. 1 x 108 cellen total beløb. Anvende cellesuspension til filteret før adskillelse.
      8. Vaske MACS kolonne og før adskillelse filter tre gange med for hver vask, 0,5 mL (MS) eller 3 mL (LS) af MACS buffer (4 ° C).
        Bemærk: Under det tredje vask-trin, installere en anden MACS kolonne i MACS permanent magnet og Blandingen henstår kolonnen anden MACS MS/LS med 0,5 mL (MS) eller 3 mL (LS) MACS buffer (4 ° C).
      9. Kassér filteret før adskillelse.
      10. Elueres celle brøkdel direkte på den anden MACS kolonne: tilføje 1 mL (MS) eller 5 mL (LS) MACS buffer (4 ° C) på kolonnen første MACS og fjerne kolonnen MAC'ER fra MACS permanent magnet. Straks overføre den første MACS kolonne ovenfor den anden MACS kolonne og skubbe cellesuspension gennem kolonnen MLA ved hjælp af den medfølgende stemplet.
      11. Vask kolonnen MACS tre gange, ved hver vask 0,5 mL (MS) eller 3 mL (LS) MACS buffer (4 ° C).
      12. Elueres celle fraktion fra kolonnen ved tilføjelse af 1 mL (MS) eller 5 mL (LS) MACS buffer (4 ° C) på den anden MACS kolonne og fjerne kolonnen MAC'ER fra MACS permanent magnet. Straks overføre den anden MACS kolonne ovenfor en 1,5 mL tube (MS) eller 15 mL konisk tube (LS) og skubbe cellesuspension gennem kolonnen MLA ved hjælp af den medfølgende stemplet.
      13. Der centrifugeres ved 300 x g i 10 min. ved 4 ° C. Omhyggeligt supernatanten og opnåede resuspenderes i 100 µL af MACS buffer (4 ° C).
      14. Tæller CD133+ celler: overførsel 6 µL af cellesuspension til en 1,5 mL tube. Tilføj 6 µL trypan blå løsning (0,4%). Forsigtigt blandes og Anvend 10 µL i en optælling kammer. Beregne antallet af CD133+ celler.
      15. Gemme CD133+ celler på is indtil såning.
  2. Karakterisering af frisk isoleret CD133+ SCs
    Bemærk: Følgende arbejder skal udføres i et beskyttet fra skarpt lys (dæmpet belysning kun). Holde rør, buffere og antistoffer på is, medmindre andet er angivet.
    1. Forberedelse af SCs for flow cytometric analyse
      1. Bruge to prøver (hver 10 µL) af BM delprøver og en stikprøve af frisk isoleret CD133+ SCs (minimum, 1 x 104 celler) til analyse. Overføre cellerne i en 1,5 mL tube. Tilsæt 10 µL af FcR blokering reagens og fyld med MACS buffer (4 ° C) til et volumen på 33 µL.
      2. Tilføj de følgende antistoffer på den indvendige side af de respektive tube (Se tabel 1): anti-CD34-fluorescein isothiocyanat (FITC) (klon: AC136), anti-CD133/2-phycoerythrin (PE) (klon: 293C 3), isotype styre musen IgG 2b-PE, anti-CD45-allophycocyanin () APC)-H7 (klon: 2D 1), og 7-aminoactinomycin (AAD). Efter alle antistoffer er blevet tilføjet, ryste ned antistoffer side af røret. Forsigtigt blandes løsning (endelige rumfang 50 µL) og inkuberes i 10 min. ved 4 ° C.
      3. Tilsættes 1 mL af 1 x røde blodlegemer (RBC) lysisbuffer, forsigtigt blandes suspension og Ruger på is 10 min. Centrifuge suspension på 300 x g i 10 min. ved 4 ° C.
      4. Supernatanten og opnåede resuspenderes i 100 µL PBS (4 ° C). Opbevares på is indtil flow cytometric analyse.
    2. Flow cytometric analyse af CD133+ SCs
      1. At undersøge cellers levedygtighed og renheden af CD133+ SC, bruge en tilpasset internationale samfund af Hematotherapy og Graft Engineering (ISHAGE) flow flowcytometri gating strategi41 (Se repræsentative skildringen i figur 1). Brug følgende rækkefølge:
        Trin 1: udvælgelse af cellen befolkningen (figur 1A)
        Trin 2: udvalg af CD45+ celler (figur 1B)
        Trin 3: valg af levedygtige CD45+ celler (figur 1 c)
        Trin 4: udvalg af levedygtige CD45+/CD34+ celler (fig. 1 d)
        Trin 5: udvalg af levedygtige CD45+/CD34+/CD133+ celler (figur 1E)
        Køre flow forskellige (Se Tabel af materialer) ifølge producentens anvisninger.
      2. Beregne cellernes levedygtighed og renhed ved hjælp af følgende ligninger:

Equation 1   Ligning 1

Equation 2   Ligning 2

  1. Celle kultur af frisk isoleret CD133+ SCs
    1. Alikvot 100 x rekombinant humant cytokin supplere i 100 µL delprøver og opbevares ved-20 ° C. Tø en 100 x alikvot før den medium forberedelse.
    2. Forberede CD133+ SC næringssubstrat, serumfrit hæmatopoietisk celle ekspansion medium suppleret med rekombinant humant cytokin supplement (endelige 1 x) og 1% penicillin/streptomycin.
    3. Frø 5 x 104 frisk isoleret CD133+ SCs for Transfektion i en 24-godt plade med 500 µL næringssubstratet. Inkuber cellerne ved 37 ° C, 5% CO2 og 20% O2.
      Bemærk: Frø 5 x 104 frisk isoleret CD133+ SCs som kontrol for flow cytometric analyse.

2. forberedelse af Transfektion komplekser

Bemærk: Under dette trin skal holde hele arbejde plads ribonuklease (RNAse)-gratis brug af RNAse dekontaminering løsning og bruger kun RNAse-fri forbrugsmaterialer materiale.

  1. Forberedelse af miR
    Bemærk: Følgende arbejder skal udføres i et beskyttet fra skarpt lys (dæmpet belysning kun).
    Bemærk: For miR-modellen: Brug Cyanine 3 farvestof mærket forløber miR og umærkede forløber miR.
    1. For at forberede miR stamopløsningen (50 µM), fortyndes den ønskede mængde af miR i den passende mængde nukleasen-gratis vand (f.eks.fortyndet 5 nmol af miR i 100 µL vand). Forsigtigt blandes løsning, alikvot miR stock (5 µL), og gemme under-20 ° C.
  2. Forberedelse af PEI
    1. Forberede PEI efter standardprotokoller og Bemærk PEI stock koncentration31,42 .
  3. Forberedelse af MNP
    1. Forberede MNPs efter standardprotokoller og Bemærk MNP stock koncentration31,42.
  4. Forberedelse af miR/PEI komplekser
    1. Forberede 5% glukose løsning ved at fortynde D-(+)-glucose i nukleasen-gratis vand. Forsigtigt blandes løsning, alikvot stock (1,5 mL), og opbevares ved 4 ° C.
      Bemærk: Følgende arbejder skal udføres i et beskyttet fra skarpt lys (dæmpet belysning kun).
    2. Bruge 20 pmol miR pr. brønd af en 24-godt plade30. Fortynd miR i 5% glukose løsning til en endelig koncentration på 0,25 pmol miR/µL.
    3. Beregne mængden af PEI kræves baseret på miR beløb (20 pmol, trin 2.3.1) og optimale kvælstof (af PEI) til fosfat (af miR) (N/P) forhold baseret på PEI stock koncentration (trin 2.2.1; her, forholdet mellem 7,5 blev brugt)30. Fortynd PEI i en lige stor del af 5% glukose løsning baseret på ligningen:
      Equation 3
      som omarrangerer til
      Equation 4    Ligning 3
      hvor PEI volumen er i µL og [PEI] er i mM, og N/P (optimeret til denne protokol) er 0,75. 0,12 er en omregningsfaktor, der er specifikke for miR.
    4. Tilføj den forud fortyndede PEI til den forud fortyndede miR og vortex for 30 s.
    5. Inkuber miR/PEI komplekse for 30 min på RT.
  5. Forberedelse af PEI-miR-MNP komplekser
    Bemærk: Følgende arbejder skal udføres i et beskyttet fra skarpt lys (dæmpet belysning kun).
    1. Mens inkubere forberede miR/PEI komplekser, MNPs af sonicating MNPs til 20 min. ved 35 kHz i den sonicating vandbad på RT for at sikre partiklerne i suspension og ikke sammenlægning.
    2. Beregne antallet af påkrævede MNPs (3 µg jern/mL) baseret på MNP stamopløsningen (trin 2.3.1).
    3. Tilføje sonicated MNPs til miR/PEI komplekser og vortex for 30 s. Incubate PEI-miR-MNP komplekser i 30 min på RT.
  6. Forberedelse af Transfektion komplekser til firefarvet mærkning ved hjælp af SIM
    Bemærk: Brug umærkede forløber miR.
    1. Label miR med Cyanine 5 farvestof ved hjælp af en Cyanine 5 farvestof miR mærkning kit (Se Tabel af materialer) efter fabrikantens anvisninger. Måle den endelige miR koncentration ved hjælp af den børsnoterede Spektrofotometer (Se Tabel af materialer) i henhold til den indstilling fra producenten (nukleinsyre, RNA-40). Alikvot miR (5 µL) og opbevares ved-80 ° C beskyttet mod lys.
    2. Label PEI med en lys grøn fluorescens dye ved hjælp en passende protein mærkning kit (Se Tabel af materialer) efter fabrikantens anvisninger. Definere den endelige PEI koncentration med Ninhydrin assay (trin 2.2.1). Alikvot af PEI (i volumen beregnet på grundlag af ligning 3) og opbevares ved 4 ° C beskyttet mod lys.
    3. Mærke MNPs med rodamin farvestof konjugeret med biotin ved hjælp af et forhold på 1:1,000 w/w, farvestof til MNP. Bland rodamin farvestof og MNPs sideløbende med udarbejdelsen af miR/PEI kompleks dannelse og inkuberes løsning i 30 min. i mørke. Direkte brug mærket MNPs.

3. Transfektion af CD133+ SCs

Bemærk: Under dette trin skal holde hele arbejde plads ribonuklease (RNAse)-gratis brug af RNAse dekontaminering løsning og bruger kun RNAse-fri forbrugsmaterialer materiale
Bemærk: Følgende arbejder skal udføres i et beskyttet fra skarpt lys (dæmpet belysning kun).

  1. Tilføj forberedt PEI-miRNA-MNP komplekset dråbevis direkte i passende brønden indeholdende frisk isoleret CD133+ SCs i dyrkningsmediet.
  2. Bland forsigtigt af vuggende plade frem og tilbage. Inkuber celler i 18 timer ved 37 ° C, 5% CO2 og 20% O2.

4. analyse af miR Transfektion

  1. Undersøgelse af miR optagelse effektivitet og cytotoksicitet af Transfektion komplekser
    Bemærk: For miR-modellen: Brug Cyanine 3 farvestof mærket forløber miR for optagelsen evaluering og ikke-transfekteret CD133+ SCs for flow flowcytometri kontrol gates.
    Bemærk: Følgende arbejder skal udføres i et beskyttet fra skarpt lys (dæmpet belysning kun).
    Bemærk: Holde rør, buffere og antistoffer på is, medmindre andet er angivet.
    1. Forbered PARAFORMALDEHYD stamopløsningen (PFA, 4%) ved fortynding 4 g PFA i 100 mL PBS og varme løsning til 80 ° C. Energisk Bland opløsningen og justere pH-værdien til 7,3. Alikvot af PFA lager (1,5 mL) og opbevares ved-20 ° C.
    2. 18 h efter Transfektion, indsamle hver brønd i en separat 1,5 mL tube. Vask hver godt en gang med 500 µL af PBS og overføre denne cellesuspension til det samme rør.
    3. Der centrifugeres ved 300 x g i 10 min. ved 4 ° C. Supernatanten og opnåede resuspenderes i 100 µL af 4 ° C MACS buffer.
    4. Tilsæt 0,5 µL af en Amin reaktive farvestof til at skelne mellem levende og døde celler, forsigtigt blandes suspension og inkuberes i 10 min. ved 4 ° C. Tilsæt 1 mL PBS (4 ° C) og centrifugeres ved 300 x g i 10 min. ved 4 ° C.
    5. Supernatanten, opnåede resuspenderes i 100 µL PBS, tilføje 33 µL PFA (4%), og gemme på is eller ved 4 ° C indtil flow cytometric analyse.
    6. Arrangere den gating strategi efter den repræsentative skildring i figur 2. Køre prøverne på flow-Flowcytometret (Se Tabel af materialer) ifølge producentens anvisninger.
  2. Karakterisering af miR-transfekteret CD133+ SCs
    Bemærk: Brugt umærkede forløber miR samt ikke-transfekteret CD133+ SCs for flow flowcytometri kontrol gates.
    1. Indsamle hver godt i en separat 1,5 mL tube og centrifugeres ved 300 x g i 10 min. ved 4 ° C.
    2. Bruge den gating strategi, som beskrevet i trin 1.2.
  3. Undersøgelse af de intracellulære distribution af Transfektion komplekser af SIM-
    1. Forberede komplekser og transfect celler som beskrevet i afsnit 2 og afsnit 3.
    2. 18 h efter Transfektion, indsamle hver brønd i en separat 1,5 mL tube. Vask hver godt en gang med 500 µL af PBS og overføre vask i well's respektive tube. Der centrifugeres ved 300 x g i 10 min. ved 4 ° C.
    3. Supernatanten resuspenderes opnåede i 1 mL 2% føtal bovint serum (FBS) i PBS, forsigtigt blandes suspension og centrifugeres ved 300 x g i 10 min. ved 4 ° C.
    4. Supernatanten, opnåede resuspenderes i 100 µL af PBS, og tilføje 33 µL PFA (4%) i 20 min.
    5. Overføre cellesuspension til en ny 24-kultur plade der indeholder sterilt glas coverslips og centrifugeres ved 300 x g i 10 min. ved 4 ° C.
    6. Supernatanten og tilsættes 500 µL af PBS. Forsigtigt ryste pladen og kassér PBS.
    7. Placer forberedt coverslips på de mikroskopiske dias ved hjælp af vandige montering medium at bevare fluorescens og tør dem på RT for mindst 1 h.
    8. Erhverve billeder ved hjælp af en 100 X oliebestandighedsobjektet. SIM-indstillinger: 405, 488, 561 og 633 nm laser linjer for excitation og z-stakke med en 16-bit dybde på 3 hjørner, 3 faser, med i gennemsnit 4, gitre pr. laser linje: 23 µm-405, 34 µm-488, 42 µm-561, 51 µm-633.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den præsenterede protokol beskriver en manuel isolation og magnetiske berigelse af menneskelige BM-afledt CD133+ SCs med en efterfølgende virus uafhængige celle engineering strategi, som en non-invasiv teknologi til i vitro celle manipulation og i vivo overvågning værktøj.

Denne tre-trins afsondrethed teknologi tillader en adskillelse af multinationale selskaber fra de præ-fordøjet brystbenet BM gennem tæthed gradient centrifugering. Bagefter, en CD133+ celle brøkdel magnetisk kan forbedres ved hjælp af passende afsondrethed teknologi. Dette giver mulighed for en berigelse af CD133+ SCs med levedygtighed og renhed højere end 80%, hvilket kan afgøres ved flowcytometri (figur 1). Herefter blev kun SC produkter, som svarer til kravene brugt til yderligere forsøg.

Transfektion metoden her giver mulighed for en meget effektiv indførelse af miR i disse frisk isolerede menneskelige CD133+ SCs med en optagelse af ca. 80% af levedygtige celler (figur 2)30. Derudover, er der ingen væsentlige cytotoksiske virkninger tydeligt 18 h efter Transfektion sammenlignet med kontrol celler (figur 2)30. Desuden kan en tilstrækkelig levering og sædvanlige fordeling af Transfektion komplekse forbindelser (miR, PEI og MNPs) observeres i cytoplasma af celler ved hjælp af SIM (figur 3).

Figure 1
Figur 1: Repræsentant boolesk gating strategi for CD133+ SC karakterisering. (A-E) Skildring af en 5-trins udvalg strategi for en streng evaluering af cellernes levedygtighed og renhed af isolerede CD133+ SC og (F) CD133 isotype kontrol ved hjælp af passende ubehandlet BM prøven. (A) undtagen vragrester fra intakt celle befolkning i en frem/side scatter (FSC/SSC) dot plot, efterfulgt af successive udvalg af (B) CD45+ celle population, (C) levedygtige CD45+ celle population, (D) levedygtige dobbelt positive CD45+/CD34+ celle befolkning, og (E) levedygtige tredobbelt positive CD45+/CD34+/CD133+ celle befolkning. Orange: CD45+/CD34+/CD133+ celler fremhævet i hvert udvalg trin. Legende: APC-Cy7: anti-CD45, FITC: anti-CD34, FSC: Forward Scatter kanal, PE: anti-CD133, SSC: Side Scatter kanal, 7-ald: 7-aminoactinomycin. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: repræsentative gating strategi for evaluering af miR optagelse effektivitet og cytotoksicitet af komplekse Transfektion. Gating strategier (A, B) transfekteret CD133+ SCs såvel som (C, D) ikke-transfekteret CD133+ SCs for analyser af (A, C) Cyanine3 farvestof mærket forløber-miRNA optagelse effektivitet () rød: levedygtige Cy3+ celler) og (B, D) cytotoksiske virkninger af proceduren Transfektion præget af en Amin reaktive farvestof til at skelne mellem levende og døde celler (blå: døde celler). Legende: SSC: Side Scatter kanal, celler kun: ikke-transfekteret CD133+ SCs, PEI-miRNA-MNP: CD133+ SCs transfekteret med Cy3-mærket miR venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: intracellulære visualisering af den komplekse Transfektion. CD133+ SCs var transfekteret med trefarvet mærket PEI-miR-MNP komplekse (miR: 20 pmol, PEI: N/P forhold 7.5, MNP: 3 µg/mL). Repræsentative visualisering blev udført 18 h efter Transfektion ved hjælp af strukturerede belysning mikroskopi. MiR var mærket med Cyanine5 farve (rød), PEI med en lys grøn fluorescens dye (grøn), og MNPs med rodamin farvestof konjugeret med biotin (gul), og kernen var counterstained med DAPI (blå). Skalalinjen = 5 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

stikprøve FK blokerende reagens [µL] MACS buffer [µL] antistoffer [µL] alt [µL]
antallet modellen celler [µL] CD133-PE isotype CD133-PE CD34-FITC CD45-APC-Cy7 TILFØJ
1 BM 10 10 12.5 5 - 5 2.5 5 50
2 BM 10 10 12.5 - 5 5 2.5 5 50
3 CD133+ (1 x 104) 10 12.5 - 5 5 2.5 5 50

Tabel 1: pipettering layout til karakterisering af CD133 + SCs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I de seneste år, CD133+ SCs er opstået som en lovende celle population for SC-baserede behandlinger som det fremgår af flere fase I, II og III kliniske forsøg43,44,45,46, 47 , 48 , 49 , 50 , 51 , 52 , 53 , 54. vi præsenterer her, en detaljeret protokol for den standardiserede Manuel rensning og flow cytometric karakterisering af disse celler fra menneskelige brystbenet BM. Proceduren beskrevet Mac-baserede isolering repræsenterer en blid, hurtig og effektiv strategi til at opnå en meget ren og levedygtige hæmatopoietisk SC brøkdel. God kompatibilitet kombineret med den hurtige forringelse af co injiceres MACS MicroBeads bruges til celle sortering er påvist tidligere ved vores gruppe55,56.

Denne isolation procedure blev udviklet ved hjælp af menneskelige brystbenet BM som udgangsmateriale, og derfor protokollen i øjeblikket gør rensning af hæmatopoietisk SCs beregnet til brug i ikke-kliniske forskning. Hvis CD133+ SCs er isoleret fra andre væv (f.eks, BM fremstillet af crista crest) flere trin i protokollen såsom enzymatisk væv fordøjelse og tæthed centrifugering kan kræve tilpasning. For klinisk celle ansøgning, vores gruppe yderligere etableret en on-site fremstillingsmetode som GMP-importsætninger, så bruger de et automatisk system for at imødekomme yderligere krav for kliniske behov57.

Engineering af SCs forud for deres anvendelse er en roman strategi at overvinde visse hindringer i SC terapi, herunder lav celle fastholdelse og massiv celledød. Den nuværende protokol omfatter anvisninger til fremstilling af en viral-gratis multifunktionelle Transfektion system baseret på forgrenede PEI bundet til MNPs og dens effektiv Introduktion til CD133+ SCs30. Anvendelsen af dette system gør det muligt for genetiske celle modifikation, magnetisk kontrolleret celle vejledning og non-invasiv celle vektorisering via Mr eller MPI30,31,40,42,58 , 59 , 60.

Vigtigere, beskrevet Transfektion betingelser er blevet optimeret til forbigående genetisk modifikation af CD133+ BM-afledte SCs30. I tidligere værker, har denne Transfektion system også med held udlignet for levering af plasmid DNA og miR andre celler typer31,40,60. Disse eksperimenter viste, at Transfektion effektivitet samt cytotoksicitet er celle type-afhængige. De optimale kompositioner af NAs, PEI og MNPs skal derfor defineres for hver celle.

På grund af dens høje effektivitet er PEI en af de mest almindeligt anvendte polymerer til ikke-virale genetiske celle engineering61. Den kliniske anvendelse61,62 af PEI er dog meget begrænset til dato på grund af dens generelle toksicitet61,63. Det er interessant, viste vores gruppe for nylig, at MNPs reducere PEI toksicitet når inkluderet i Transfektion system31,60. På samme tid, den mulige toksicitet af jernoxid baseret nanopartikler forårsaget af produktion af reaktive ilt arter (ROS) er dosisafhængig og flere typer af superparamagnetisk nanopartikler er godkendt til Mr64,65 . Dog skal være opmærksom toksicitet af system in vitro- og in vivo.

Samlet set er protokollen ganske kompleks, der indeholder mange vigtige skridt, der skal behandles meget omhyggeligt. Til dette formål, har vi fremhævet disse punkter i afsnittet protokol med noter. Vi vil især påpege vigtigheden af en fuldstændig RNAse-frit miljø og undgå enhver lys eksponering ved håndtering af de anvendte fluorescerende farvestoffer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer nogen interessekonflikt.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af det føderale ministerium for uddannelse og forskning Tyskland (FKZ 0312138A og FKZ 316159), den stat Mecklenburg-Vorpommern med EU 's strukturfonde (ESF/IVWM-B34-0030/10 og ESF/IVBM-B35-0010/12) og DFG (DA1296/2-1), den Tyske Heart Foundation (F/01/12), BMBF (VIP + 00240) og den FUGTIGE Foundation. Derudover understøttes F.H. og P.M. af FORUN Program af Rostock University Medical Centre (889001).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
7-AAD BD Biosciences 559925
Acetic Acid with Methylene Blue Stemcell Technologies 7060 3%
anti-CD133/2-PE (clone: 293C3) Miltenyi Biotec GmbH 130-090-853
anti-CD34-FITC (clone: AC136) Miltenyi Biotec GmbH 130-081-001
anti-CD45-APC-H7 (clone: 2D1) BD Biosciences 560178
rhodamine dye; Atto 565 dye conjugated to biotin ATTO-TEC GmbH AD 565-71
BD FACS LSRII flow cytometer BD Biosciences
BD FACSDiva Software 6.1.2 BD Biosciences
BSA Sigma-Aldrich GmbH A7906
CD133 antibody-linked superparamagnetic iron dextran particles; CD133 MicroBead Kit Miltenyi Biotec GmbH 130-097-049
collagenase B Roche Diagnostics GmbH 11088831001
counting chamber Paul Marienfeld GmbH & Co. KG
Cyanine 3 dye labelled precursor miR; Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control #1 Ambion AM17120
Cyanine 5 dye miR labelling kit; Cy5 dye Label IT miRNA Labeling Kit Mirus Bio MIR 9650
DNAse I Roche Diagnostics GmbH 10104159001 (100 U/mL)
ELYRA PS.1 LSM 780 confocal microscope Carl Zeiss Jena GmbH
FcR Blocking Reagent, human Miltenyi Biotec GmbH 130-059-901
bright green protein labeling kit; Oregon Green 488 Protein Labeling Kit Thermo Fisher Scientific O10241
aqueous mounting medium; Fluoroshield Sigma-Aldrich GmbH F6182
density gradient centrifugation tube; Leukosep Centrifuge Tube Greiner Bio-One 89048-932
MACS magnet holder; MACS MultiStand Miltenyi Biotec GmbH 130-042-303
MACS pre-separation filter Miltenyi Biotec GmbH 130-041-407 30 µm
MACS separation column (MS / LS) Miltenyi Biotec GmbH 130-042-201 / 130-042-401
MACS permanent magnet; MACS Separator Miltenyi Biotec GmbH 130-042-302
Millex-HV PVDF Filter Merck SLHV013SL 0.45 μm
mouse IgG 2b-PE Miltenyi Biotec GmbH 130-092-215
amine reactive dye; Near-IR LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit Thermo Fisher Scientific L10119
human lymphocyte separating medium; Pancoll Pan Biotech GmbH P04-60500 density: 1.077 g/mL
PBS Pan Biotech GmbH P04-53500 without Ca and Mg
PEI Sigma-Aldrich GmbH 408727 branched; 25 kDa
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 100 U/mL, 100 μg/mL
PFA Merck Schuchardt OHG 1040051000
unlabelled precursor miR; Pre-miR miRNA Precursor Negative Control #1 Ambion AM17110
RBC lysis buffer eBioscience 00-4333-57
RNAse decontamination solution; RNaseZap Thermo Fisher Scientific AM9780
human lymphocyte medium; Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium Pan Biotech GmbH P04-16500
recombinant human cytokine supplement; StemSpan CC100 Stemcell Technologies 2690
serum-free haematopoietic cell expansion medium; StemSpan H3000 Stemcell Technologies 9800
Streptavidin MagneSphere Paramagnetic Particles Promega Corporation Z5481
Trypan Blue solution Sigma-Aldrich GmbH T8154 0.4 %
UltraPure EDTA Thermo Fisher Scientific 15575020 0.5 M; pH 8.0
ZEN2011 software Carl Zeiss Jena GmbH
NanoDrop 1000 Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific
Sonorex RK 100 SH sonicating water bath Bandelin electronic Ultrasonic nominal output: 80 W; Ultrasonic frequency: 35 kHz

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Meregalli, M., Farini, A., Belicchi, M., Torrente, Y. CD133(+) cells isolated from various sources and their role in future clinical perspectives. Expert opinion on biological therapy. 10 (11), 1521-1528 (2010).
  2. Lee, S., Yoon, Y. -S. Revisiting cardiovascular regeneration with bone marrow-derived angiogenic and vasculogenic cells. British journal of pharmacology. 169 (2), 290-303 (2013).
  3. Beksac, M., Preffer, F. Is it time to revisit our current hematopoietic progenitor cell quantification methods in the clinic? Bone marrow transplantation. 47 (11), 1391-1396 (2012).
  4. Bongiovanni, D., et al. The CD133+ cell as advanced medicinal product for myocardial and limb ischemia. Stem cells and development. 23 (20), 2403-2421 (2014).
  5. Wang, X., et al. The Clinical Status of Stem Cell Therapy for Ischemic Cardiomyopathy. Stem cells international. 2015, 135023 (2015).
  6. Ma, N., et al. Intramyocardial delivery of human CD133+ cells in a SCID mouse cryoinjury model: Bone marrow vs. cord blood-derived cells. Cardiovascular research. 71 (1), 158-169 (2006).
  7. Rafii, S., Lyden, D. Therapeutic stem and progenitor cell transplantation for organ vascularization and regeneration. Nature medicine. 9 (6), 702-712 (2003).
  8. Wang, D., Gao, G. State-of-the-art human gene therapy: part I. Gene delivery technologies. Discovery medicine. 18 (97), 67-77 (2014).
  9. Sart, S., Ma, T., Li, Y. Preconditioning stem cells for in vivo delivery. BioResearch open access. 3 (4), 137-149 (2014).
  10. Liu, J., et al. Early stem cell engraftment predicts late cardiac functional recovery: preclinical insights from molecular imaging. Circulation. Cardiovascular imaging. 5 (4), 481-490 (2012).
  11. Lang, C., et al. In vivo comparison of the acute retention of stem cell derivatives and fibroblasts after intramyocardial transplantation in the mouse model. European journal of nuclear medicine and molecular imaging. 41 (12), 2325-2336 (2014).
  12. Goussetis, E., et al. Intracoronary infusion of CD133+ and CD133-CD34+ selected autologous bone marrow progenitor cells in patients with chronic ischemic cardiomyopathy: cell isolation, adherence to the infarcted area, and body distribution. Stem cells. 24 (10), Dayton, Ohio. 2279-2283 (2006).
  13. Caveliers, V., et al. In vivo visualization of 111In labeled CD133+ peripheral blood stem cells after intracoronary administration in patients with chronic ischemic heart disease. Q J Nucl Med Mol Imaging. 51 (1), 61-66 (2007).
  14. Terrovitis, J. V., Smith, R. R., Marbán, E. Assessment and optimization of cell engraftment after transplantation into the heart. Circulation research. 106 (3), 479-494 (2010).
  15. Rosado-de-Castro, P. H., et al. Biodistribution of bone marrow mononuclear cells after intra-arterial or intravenous transplantation in subacute stroke patients. Regenerative medicine. 8 (2), 145-155 (2013).
  16. Kang, W. J., Kang, H. -J., Kim, H. -S., Chung, J. -K., Lee, M. C., Lee, D. S. Tissue distribution of 18F-FDG-labeled peripheral hematopoietic stem cells after intracoronary administration in patients with myocardial infarction. Journal of nuclear medicine official publication, Society of Nuclear Medicine. 47 (8), 1295-1301 (2006).
  17. Blocklet, D., et al. Myocardial homing of nonmobilized peripheral-blood CD34+ cells after intracoronary injection. Stem cells. 24 (2), Dayton, Ohio. 333-336 (2006).
  18. Penicka, M., et al. One-day kinetics of myocardial engraftment after intracoronary injection of bone marrow mononuclear cells in patients with acute and chronic myocardial infarction. Heart (British Cardiac Society). 93 (7), 837-841 (2007).
  19. Schächinger, V., et al. Pilot trial on determinants of progenitor cell recruitment to the infarcted human myocardium. Circulation. 118 (14), 1425-1432 (2008).
  20. Dedobbeleer, C., et al. Myocardial homing and coronary endothelial function after autologous blood CD34+ progenitor cells intracoronary injection in the chronic phase of myocardial infarction. Journal of cardiovascular pharmacology. 53 (6), 480-485 (2009).
  21. Musialek, P., et al. Randomized transcoronary delivery of CD34(+) cells with perfusion versus stop-flow method in patients with recent myocardial infarction: Early cardiac retention of (m)Tc-labeled cells activity. Journal of nuclear cardiology official publication of the American Society of Nuclear Cardiology. 18 (1), 104-116 (2011).
  22. Kyrtatos, P. G., et al. Magnetic tagging increases delivery of circulating progenitors in vascular injury. JACC. Cardiovascular interventions. 2 (8), 794-802 (2009).
  23. Vandergriff, A. C., et al. Magnetic targeting of cardiosphere-derived stem cells with ferumoxytol nanoparticles for treating rats with myocardial infarction. Biomaterials. 35 (30), 8528-8539 (2014).
  24. Huang, Z., et al. Magnetic targeting enhances retrograde cell retention in a rat model of myocardial infarction. Stem cell research & therapy. 4 (6), 149 (2013).
  25. Yanai, A., et al. Focused magnetic stem cell targeting to the retina using superparamagnetic iron oxide nanoparticles. Cell transplantation. 21 (6), 1137-1148 (2012).
  26. Arbab, A. S., Jordan, E. K., Wilson, L. B., Yocum, G. T., Lewis, B. K., Frank, J. A. In vivo trafficking and targeted delivery of magnetically labeled stem cells. Human gene therapy. 15 (4), 351-360 (2004).
  27. Cores, J., Caranasos, T. G., Cheng, K. Magnetically Targeted Stem Cell Delivery for Regenerative Medicine. Journal of functional biomaterials. 6 (3), 526-546 (2015).
  28. Cheng, K., et al. Magnetic enhancement of cell retention, engraftment, and functional benefit after intracoronary delivery of cardiac-derived stem cells in a rat model of ischemia/reperfusion. Cell transplant. 21 (6), 1121-1135 (2012).
  29. Li, W., et al. Enhanced thoracic gene delivery by magnetic nanobead-mediated vector. The journal of gene medicine. 10 (8), 897-909 (2008).
  30. Müller, P., et al. Magnet-Bead Based MicroRNA Delivery System to Modify CD133+ Stem Cells. Stem cells international. 2016, 7152761 (2016).
  31. Voronina, N., et al. Non-viral magnetic engineering of endothelial cells with microRNA and plasmid-DNA-An optimized targeting approach. Nanomedicine nanotechnology, biology, and medicine. , (2016).
  32. Noort, W. A., et al. Mesenchymal stromal cells to treat cardiovascular disease: strategies to improve survival and therapeutic results. Panminerva Med. 52 (1), 27-40 (2010).
  33. Jakob, P., Landmesser, U. Role of microRNAs in stem/progenitor cells and cardiovascular repair. Cardiovascular Research. 93 (4), 614-622 (2012).
  34. Sen, C. K. MicroRNAs as new maestro conducting the expanding symphony orchestra of regenerative and reparative medicine. Physiological genomics. 43 (10), 517-520 (2011).
  35. Papapetrou, E. P., Zoumbos, N. C., Athanassiadou, A. Genetic modification of hematopoietic stem cells with nonviral systems: past progress and future prospects. Gene therapy. 12, Suppl 1. S118-S130 (2005).
  36. Chira, S., et al. Progresses towards safe and efficient gene therapy vectors. Oncotarget. 6 (31), 30675-30703 (2015).
  37. Hobel, S., Aigner, A. Polyethylenimines for siRNA and miRNA delivery in vivo. Wiley interdisciplinary reviews. Nanomedicine and nanobiotechnology. 5 (5), 484-501 (2013).
  38. Villate-Beitia, I., Puras, G., Zarate, J., Agirre, M., Ojeda, E., Pedraz, J. L. First Insights into Non-invasive Administration Routes for Non-viral Gene Therapy. Gene Therapy - Principles and Challenges. Hashad, D. , (2015).
  39. Cubillos-Ruiz, J. R., Sempere, L. F., Conejo-Garcia, J. R. Good things come in small packages: Therapeutic anti-tumor immunity induced by microRNA nanoparticles. Oncoimmunology. 1 (6), 968-970 (2012).
  40. Schade, A., et al. Magnetic nanoparticle based nonviral microRNA delivery into freshly isolated CD105(+) hMSCs. Stem Cells Int. 2014, 197154 (2014).
  41. Sutherland, D. R., Anderson, L., Keeney, M., Nayar, R., Chin-Yee, I. The ISHAGE guidelines for CD34+ cell determination by flow cytometry. International society of hematotherapy and graft engineering. Journal of hematotherapy. 5 (3), 213-226 (1996).
  42. Voronina, N., et al. Preparation and in vitro characterization of magnetized mir-modified endothelial cells. Journal of visualized experiments. (123), (2017).
  43. Stamm, C., et al. Intramyocardial delivery of CD133+ bone marrow cells and coronary artery bypass grafting for chronic ischemic heart disease:Safety and efficacy studies. The journal of thoracic and cardiovascular surgery. 133 (3), 717-725 (2007).
  44. King, A., et al. REpeated AutoLogous Infusions of STem cells In Cirrhosis (REALISTIC): A multicentre, phase II, open-label, randomised controlled trial of repeated autologous infusions of granulocyte colony-stimulating factor (GCSF) mobilised CD133+ bone marrow stem cells in patients with cirrhosis. A study protocol for a randomised controlled trial. BMJ open. 5 (3), e007700 (2015).
  45. Martinez, H. R., et al. Stem cell transplantation in amyotrophic lateral sclerosis patients: methodological approach, safety, and feasibility. Cell transplantation. 21 (9), 1899-1907 (2012).
  46. Jimenez-Quevedo, P., et al. Selected CD133(+) progenitor cells to promote angiogenesis in patients with refractory angina: final results of the PROGENITOR randomized trial. Circulation research. 115 (11), 950-960 (2014).
  47. Raval, A. N., et al. Bilateral administration of autologous CD133+ cells in ambulatory patients with refractory critical limb ischemia: lessons learned from a pilot randomized, double-blind, placebo-controlled trial. Cytotherapy. 16 (12), 1720-1732 (2014).
  48. Andreone, P., et al. Reinfusion of highly purified CD133+ bone marrow-derived stem/progenitor cells in patients with end-stage liver disease: A phase I clinical trial. Digestive and liver disease. 47 (12), 1059-1066 (2015).
  49. Arici, V., et al. Autologous immuno magnetically selected CD133+ stem cells in the treatment of no-option critical limb ischemia: clinical and contrast enhanced ultrasound assessed results in eight patients. Journal of translational medicine. 13, 342 (2015).
  50. Zali, A., et al. Intrathecal injection of CD133-positive enriched bone marrow progenitor cells in children with cerebral palsy: feasibility and safety. Cytotherapy. 17 (2), 232-241 (2015).
  51. Al-Zoubi, A., et al. Transplantation of purified autologous leukapheresis-derived CD34+ and CD133+ stem cells for patients with chronic spinal cord injuries: long-term evaluation of safety and efficacy. Cell transplantation. 23, Suppl 1. S25-S34 (2014).
  52. Isidori, A., et al. Positive selection and transplantation of autologous highly purified CD133(+) stem cells in resistant/relapsed chronic lymphocytic leukemia patients results in rapid hematopoietic reconstitution without an adequate leukemic cell purging. Biology of blood and marrow transplantation. 13 (10), 1224-1232 (2007).
  53. Nasseri, B. A., et al. Autologous CD133+ bone marrow cells and bypass grafting for regeneration of ischaemic myocardium: the Cardio133 trial. European heart journal. 35 (19), 1263-1274 (2014).
  54. Steinhoff, G., et al. Cardiac Function Improvement and Bone Marrow Response -: Outcome Analysis of the Randomized PERFECT Phase III Clinical Trial of Intramyocardial CD133(+) Application After Myocardial Infarction. EBioMedicine. 22, 208-224 (2017).
  55. Muller, P., et al. Intramyocardial fate and effect of iron nanoparticles co-injected with MACS(R) purified stem cell products. Biomaterials. 135, 74-84 (2017).
  56. Müller, P., Gaebel, R., Lemcke, H., Steinhoff, G., David, R. Data on the fate of MACS® MicroBeads intramyocardially co-injected with stem cell products. Data in brief. 13, 569-574 (2017).
  57. Skorska, A., et al. GMP-conformant on-site manufacturing of a CD133+ stem cell product for cardiovascular regeneration. Stem cell research & therapy. 8 (1), 33 (2017).
  58. Delyagina, E., Li, W., Ma, N., Steinhoff, G. Magnetic targeting strategies in gene delivery. Nanomedicine (Lond). 6 (9), 1593-1604 (2011).
  59. Schade, A., et al. Innovative strategy for microRNA delivery in human mesenchymal stem cells via magnetic nanoparticles. International journal of molecular sciences. 14 (6), 10710-10726 (2013).
  60. Delyagina, E., et al. Improved transfection in human mesenchymal stem cells: Effective intracellular release of pDNA by magnetic polyplexes. Nanomedicine. 9 (7), London, England. 999-1017 (2014).
  61. Yin, H., Kanasty, R. L., Eltoukhy, A. A., Vegas, A. J., Dorkin, J. R., Anderson, D. G. Non-viral vectors for gene-based therapy. Nature reviews. Genetics. 15 (8), 541-555 (2014).
  62. Chen, J., Guo, Z., Tian, H., Chen, X. Production and clinical development of nanoparticles for gene delivery. Molecular therapy. Methods & clinical development. 3, 16023 (2016).
  63. Juliano, R. L. The delivery of therapeutic oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 44 (14), 6518-6548 (2016).
  64. Soenen, S. J., Rivera-Gil, P., Montenegro, J. -M., Parak, W. J., de Smedt, S. C., Braeckmans, K. Cellular toxicity of inorganic nanoparticles: Common aspects and guidelines for improved nanotoxicity evaluation. Nano today. 6 (5), 446-465 (2011).
  65. Estelrich, J., Sánchez-Martín, M. J., Busquets, M. A. Nanoparticles in magnetic resonance imaging: From simple to dual contrast agents. International journal of nanomedicine. 10, 1727-1741 (2015).

Tags

Bioteknologi sag 136 stamceller CD133 genetisk modifikation ikke-virale Transfektion mikroRNA magnetiske målretning magnetiske nanopartikler polyethylenimine
Protokol for mikroRNA overførsel i knoglemarv-afledte hæmatopoietisk stamceller til at aktivere celle Engineering kombineret med magnetisk målretning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hausburg, F., Müller, P.,… More

Hausburg, F., Müller, P., Voronina, N., Steinhoff, G., David, R. Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting. J. Vis. Exp. (136), e57474, doi:10.3791/57474 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter