Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Protocol voor MicroRNA overdracht naar volwassen beenmerg-afgeleide hematopoietische stamcellen om cel Engineering gecombineerd met magnetische Targeting

Published: June 18, 2018 doi: 10.3791/57474
Automatic Translation
*1,2, *1,2, *1, 1,2, 1,2
1Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Department of Cardiac Surgery, Rostock University Medical Center, 2Department Life, Light and Matter of the Interdisciplinary Faculty, Rostock University
* These authors contributed equally

Summary

Dit protocol illustreert een veilige en efficiënte procedure voor het wijzigen van de CD133+ hematopoietische stamcellen. De voorgestelde niet-virale, magnetische polyplex gebaseerde benadering verschaffen een basis voor de optimalisatie van de cel van de stam van de therapeutische effecten ook monitoring van het product door de overheid gereguleerde cel via magnetische resonantie beeldvorming.

Abstract

Terwijl CD133+ hematopoietische stamcellen (gcv) zijn bewezen om hoog potentieel op het gebied van regeneratieve geneeskunde, hun lage retentie tarieven na injectie in benadeelde weefsels, alsmede de waargenomen massale cel dood tarieven leiden tot zeer beperkte therapeutische effecten. Deze beperkingen wilt opheffen, we geprobeerd om een niet-virale gebaseerd protocol voor geschikt cel engineering voorafgaand aan hun administratie. De wijziging van menselijke CD133+ uiten van SCs met behulp van magnetische polyplexes microRNA (miR) geladen werd behandeld met betrekking tot de opname efficiëntie en veiligheid alsmede de targeting mogelijkheden van de cellen. Een beroep op ons protocol, kunnen wij hoge miR opname tarieven van 80-90% terwijl de CD133+ stamcel eigenschappen blijven onaangetast. Bovendien, deze gewijzigde cellen bieden de mogelijkheid van magnetische targeting. Hier beschrijven we een veilige en zeer efficiënte procedure voor de wijziging van de CD133+ SCs. Wij verwachten dat deze aanpak om een standaardtechnologie voor optimalisatie van de cel van de stam van de therapeutische effecten en voor de controle van het product door de overheid gereguleerde cel via magnetische resonantie beeldvorming (MRI).

Introduction

CD133+ SCs vertegenwoordigen een heterogene stam en progenitor cel bevolking met het veelbelovende potentieel voor regeneratieve geneeskunde. Hun hematopoietische, endotheel en myogenic differentiatie potentiële1,2,3 maakt de CD133+ cellen, bijvoorbeeldbij te dragen tot neovascularization processen door middel van differentiatie in nieuw vorming van vaartuigen en activering van pro-angiogenic signalering door paracrine mechanismen4,5,6,7.

Ondanks hun hoge potentieel aangetoond in meer dan 30 erkende klinische proeven (ClinicalTrails.gov), is hun therapeutische resultaat nog steeds onder de controversiële discussie4. Inderdaad, een klinische toepassing van SCs wordt belemmerd door lage retentie in het orgel van belang en massale eerste cel dood5,8,9. Extra engineering van CD133+ SCs voorafgaande transplantatie kan helpen deze uitdagingen.

Een voorwaarde voor een efficiënte celtherapie zou de verlaging van de massale eerste celdood ter verbetering van de engraftment van therapeutische relevante cellen10. Huidige studies aangetoond een immense cel verlies van 90-99% in zeer geperfundeerd organen zoals de hersenen en het hart tijdens de eerste 1-2 h, onafhankelijk van de getransplanteerde celtype of toepassing route11,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21. SC labelen met behulp van magnetische nanodeeltjes (MNPs) kan een niet-invasieve innovatiestrategie op target cellen op de site van belang22,23,24,25,26 en tegelijkertijd zorgt voor de cel opvolging met behulp van MRI27 en magnetische deeltjes imaging (MPI). De meest efficiënte in vivo studies toepassen gemagnetiseerde cel gericht op behoud van de gebruikte cel na lokale toediening boven cel begeleiding na intraveneuze injectie23,24,28 . Daarom is onze fractie ontworpen een levering systeem bestaande uit superparamagnetische ijzeroxide nanodeeltjes29. Met deze techniek, CD133+ SCs en menselijke navelstreng ader endotheliale cellen (HUVECs) kunnen efficiënt worden gericht, zoals blijkt uit in vitro probeert30,31.

Een andere hindernis voor SC therapieën is de vijandige inflammatoire omgeving van het getroffen weefsel na de transplantatie, die tot de eerste cel dood32 bijdraagt. Naast verschillende studies van de pre-conditionering was de toepassing van therapeutische relevante miRs geteste33; succesvol is gebleken dat anti-apoptotic miRs apoptosis in vitro remmen en cel engraftment in vivo33 verbeteren. Deze kleine molecules, samengesteld uit de 20-25 nucleotiden, spelen een cruciale rol als posttranscriptional modulatoren van messenger RNAs (mRNAs) en dus beïnvloeden stamcel lot en gedrag34. Bovendien voorkomen de exogene invoering van miRs de ongewenste stabiele integratie in de host genoom34.

Huidige pogingen voor efficiënte binnenbrengen van nucleic zuren (NAs) primaire SCs zijn meestal gebaseerd op recombinante virussen8,35. Ondanks de hoge transfectie efficiëntie presenteert recombinante virus manipulatie een groot obstakel voor een vertaling van de Bank-naar-bed, bijvoorbeeld, oncontroleerbare genexpressie, pathogeniteit, immunogeniciteit en dat mutagenese35 ,,36. Dus, niet-virale levering systemen zoals polymeer gebaseerde constructies zijn kritisch te ontwikkelen. Onder degenen, polyethylenimine (PEI) vertegenwoordigt een geldige leveringsvoertuig biedt voordelen voor miRs zoals nb condensatie te behoeden voor degradatie, cellulaire opname, en intracellulaire release via endosomal ontsnappen37,,38. MiR-PEI complexen blijkt bovendien een hoge biocompatibiliteit in klinische proeven39. Daarom onze levering systeem bestaat uit een biotinyleerd vertakte 25 kDa PEI gebonden aan een daar beklede MNP-core30,31,40.

In dit manuscript, presenteren wij een uitgebreide protocol beschrijven (i) de handmatige Isolatievan CD133+ SC van de donatie van menselijke beenmerg (BM) met een gedetailleerde karakterisering van het product van de SC en (ii) een efficiënte en zachte transfectie strategie van een Magnetisch niet-virale polymeer gebaseerde expresbezorgingssysteem voor genetische manipulatie van CD133+ SCs miRs gebruiken. CD133+ SCs zijn geïsoleerd en magnetisch verrijkt van menselijke sternale BM aangeblazen met behulp van een oppervlakte antilichaam gebaseerde magnetische-geactiveerde cel sorteren (MACS) systeem. Daarna worden de levensvatbaarheid van de cellen, alsook de zuiverheid van de cel geanalyseerd met behulp van stroom cytometry. Vervolgens, miR/PEI/MNP complexen zijn bereid en CD133+ SCs zijn transfected. 18 h na transfectie, de opname doeltreffendheid en het effect van transfectie op SC marker expressie en cel levensvatbaarheid worden geanalyseerd. Bovendien is evaluatie van de intracellulaire verdeling van de transfectie complexe verbindingen wordt uitgevoerd met behulp van vierkleuren labeling en gestructureerde verlichting microscopie (SIM).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Sternale menselijke BM voor cel isolatie is verkregen uit op de hoogte van donoren, die gaf hun schriftelijke toestemming gebruiken hun monsters voor onderzoek volgens de verklaring van Helsinki. De ethische commissie van de Universiteit van Rostock heeft goedgekeurd de gepresenteerde studie (reg. No. A 2010 23, verlengd in 2015).

1. cel voorbereiding

Opmerking: Gebruik heparine natrium (250 IU/mL BM) om te voorkomen dat coagulatie voor BM onderzoek.

  1. CD133+ SC isolatie
    1. Voorbereiding van vereiste oplossingen
      1. Bereiden fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) / ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) stockoplossing (2 mM) door het mengen van 996 mL 1 x PBS met 4 mL EDTA (0,5 M). Krachtig Meng de oplossing en filtraat met behulp van een 0,45 µm filter. Bewaren bij kamertemperatuur (RT).
      2. Bereid de MACS buffer door het mengen van 995 mL van 2 mM PBS/EDTA met 5 g bovien serumalbumine (BSA). Krachtig Meng de oplossing en filtraat met behulp van een 0,45 µm filter. Bewaren bij 4 ° C.
      3. Collagenase B stockoplossing (40 mg/mL) bereid door verdunning van 500 mg van collagenase B (van Clostridium histolyticum) in 12,5 mL PBS. Krachtig Meng de oplossing, aliquots van 350 µL maken en opslaan bij-20 ° C.
      4. Bereiden van deoxyribonuclease (DNAse) ik stockoplossing (10 mg/mL) door verder verdunnen van 100 mg DNase ik (uit het pancreas van runderen) in 10 mL PBS. Krachtig Meng de oplossing, aliquots van 350 µL maken en opslaan bij-20 ° C.
    2. Enzymatische vertering van menselijke BM
      1. Vooraf warm de menselijke lymfocyt middellange tot RT en ontdooien enzymen (1 hoeveelheid elke collagenase B en DNAse per 20 mL BM).
      2. De BM verzamelen van spuiten in een conische buis van 50 mL en meng voorzichtig. Gooi alle bestaande stolsels.
        Opmerking: Breng 200 µL van onverdunde BM in een 1,5 mL-buis voor latere flow cytometrische analyse. Bewaren bij 4 ° C tot gebruik.
      3. Pipetteer 10 mL BM in een nieuwe conische tube van 50 mL en voeg 6 mL PBS/EDTA (2 mM), 20 mL van menselijke lymfocyt medium, 175 µL van Collagenase B (40 mg/mL) en 175 µL van DNAse ik (10 mg/mL). Zachtjes Meng de oplossing en incubeer gedurende 30 min op RT op een shaker. Herhaal voor het resterende BM monster.
    3. Dichtheid kleurovergang centrifugeren
      1. Prime een tube van 50 mL dichtheid kleurovergang centrifugeren door menselijke lymfocyt scheiden medium in een tube van 50 mL 15 mL toe te passen. Centrifugeer bij 1.000 x g gedurende 30 s.
      2. Zorgvuldig laag 35 mL verdunde BM bovenop de buis-opaciteitsfilter kleurovergang centrifugeren en centrifuge op 445 x g gedurende 35 min. op RT.
        Opmerking: Centrifuge instellingen zijn lage versnelling (3) en geen rem (1).
      3. Verwijder voorzichtig de buis van de centrifuge zonder schudden. Zorgvuldig gooi ~ 20 mL van de bovenste heldere oplossing zonder te raken de bewolkt laag boven op het filter.
      4. Zorgvuldig de bewolkt laag (die boven op het filter bevat de mononucleaire cellen (MDL)) overbrengen naar een nieuwe conische tube van 50 mL en opvullen met PBS/EDTA tot een eindvolume van 50 mL.
        Opmerking: Alle MDL uit één BM patiënt monster samenvoegen in één nieuwe buis.
      5. Tellen de MDL door 10 µL van de 50 mL celsuspensie overbrengen naar een 1,5 mL-buis. Voeg 10 µL van 3% azijnzuur met methyleenblauw. Zacht mengen en 10 µL van toepassing in een tellen kamer. Bereken het aantal multinationals.
      6. Centrifugeer de MNC schorsing bij 300 x g gedurende 10 min. Verwijder het supernatant.
        Opmerking: Tijdens centrifugeren, koelen de centrifuge van RT tot 4 ° C.
    4. Magnetische selectie van CD133+ SCs met behulp van menselijke CD133 antilichaam-verbonden superparamagnetische dextran ijzerdeeltjes
      Opmerking: Tijdens deze stap werk op ijs. Oplossingen te bewaren tot gebruik bij 4 ° C. Opslaan van MACS permanente magneet, scheiding kolommen en pre scheiding filter bij 4 ° C.
      1. De kolomgrootte kiezen. Voor < 1.2 x 108 MDL, gebruik MS kolommen, en voor > 1.2 x 108 MDL, kolomsgewijs LS (Zie Tabel van materialen).
      2. Ter voorbereiding van magnetische selectie voor 1 x 108 totale celaantal, zorgvuldig resuspendeer MDL in 300 µL MACS buffer (4 ° C). Voeg 100 µL FcR blokkerende reagens (4 ° C) en 100 µL CD133 antilichaam-verbonden superparamagnetische dextran ijzerdeeltjes (4 ° C).
      3. Voorzichtig mengen van de celsuspensie en incubeer gedurende 30 minuten bij 4 ° C. Voorzichtig schudden de celsuspensie tijdens de incubatie (2 – 3 x).
      4. Voeg 2 mL MACS buffer (4 ° C) per 1 x 108 totaal die MDL. zachtjes Meng de celsuspensie en centrifugeer bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
      5. De MACS-Magneethouder instellen en bevestig de MACS permanente magneet. Installeer de MACS kolom en de pre scheiding filter toepassen op de top.
      6. Equilibreer de eerste kolom van de MACS MS/LS en pre scheiding filter met 0,5 mL (MS) of 3 mL (LS) MACS buffer (4 ° C).
        Opmerking: Nooit toestaan de kolommen van de MACS te drogen na evenwichtsinstelling.
      7. Verwijder het supernatant en resuspendeer de verkregen pellet in 500 µL van MACS buffer (4 ° C) per 1 x 108 cel totaal bedrag. Toepassing van de celsuspensie in de scheiding van de pre-filter.
      8. Wassen van de MACS kolom en pre scheiding filter driemaal gebruikt, voor elke wassen, 0,5 mL (MS) of 3 mL (LS) MACS buffer (4 ° C).
        Opmerking: Tijdens de derde wassen-stap, installeer een tweede kolom van de MACS in de MACS permanente magneet en equilibreer de tweede kolom van de MACS MS/LS met 0,5 mL (MS) of 3 mL (LS) MACS buffer (4 ° C).
      9. Gooi het pre scheiding filter.
      10. De Fractie van de cel rechtstreeks op de tweede kolom van de MACS Elueer: Voeg 1 mL (MS) of 5 mL (LS) MACS buffer (4 ° C) op de eerste kolom van de MACS en verwijder de MACS kolom uit de MACS permanente magneet. Onmiddellijk overdracht van de eerste kolom van de MACS boven de tweede kolom van de MACS en druk op de celsuspensie door de kolom van de MACS met behulp van de meegeleverde zuiger.
      11. Spoel de MACS kolom driemaal, met voor elke wassen 0,5 mL (MS) of 3 mL (LS) MACS buffer (4 ° C).
      12. Elueer de breuk van de cel van de kolom door toevoeging van 1 mL (MS) of 5 mL (LS) MACS buffer (4 ° C) op de tweede kolom van de MACS en de MACS kolom verwijderen uit de MACS permanente magneet. Onmiddellijk overdracht van de tweede kolom van de MACS boven een tube van 1,5 mL (MS) of conische tube van 15 mL (LS) en druk op de celsuspensie door de kolom van de MACS met behulp van de meegeleverde zuiger.
      13. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Zorgvuldig Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet verkregen in 100 µL van MACS buffer (4 ° C).
      14. Tellen van de CD133+ cellen: overdracht 6 µL van de celsuspensie in een 1,5 mL-buis. Voeg 6 µL trypan blauwe oplossing (0,4%). Zacht mengen en 10 µL van toepassing in een tellen kamer. Berekenen van het aantal CD133+ cellen.
      15. Opslaan van de CD133+ cellen op ijs tot zaaien.
  2. Karakterisering van vers geïsoleerde CD133+ SCs
    Opmerking: De volgende werkzaamheden moet worden uitgevoerd in een kamer die beschermd tegen fel licht (dim verlichting alleen). Houd buizen, buffers, en antilichamen op ijs, tenzij anders vermeld.
    1. Voorbereiding van de SCs flow cytometrische analyse
      1. Gebruik twee monsters (elke 10 µL) van BM aliquots en één monster van vers geïsoleerde CD133+ SCs (minimum, 1 x 104 cellen) voor analyse. Breng de cellen in een 1,5 mL-buis. Voeg 10 µL van FcR blokkeren reagens en opvullen met MACS buffer (4 ° C) met een volume van 33 µL.
      2. Voeg de volgende antistoffen op de binnenzijde van de respectieve buis (Zie tabel 1): anti-CD34-fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) (kloon: AC136), anti-CD133/2-phycoerythrin (PE) (kloon: 293C 3), isotype controle muis IgG 2b-PE, anti-CD45-allophycocyanin () APC)-H7 (kloon: 2D 1), en 7-aminoactinomycin (AAD). Nadat alle antilichamen zijn toegevoegd, schud langs de zijkant van de antilichamen van de buis. Zachtjes Meng de oplossing (eindvolume 50 µL) en incubeer gedurende 10 min bij 4 ° C.
      3. Voeg 1 mL 1 x rode bloedcellen (RBC) lysis-buffermengsel, voorzichtig mengen van de opschorting en incubeer op ijs 10 min. Centrifuge de schorsing bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
      4. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet verkregen in 100 µL PBS (4 ° C). Bewaren in de ijskast tot flow cytometrische analyse.
    2. Stromen van de cytometrische analyse van CD133+ SCs
      1. De levensvatbaarheid van de cellen en de zuiverheid van CD133 te onderzoeken+ SC, gebruik maken van een aangepast internationale maatschappij van Hematotherapy en Graft Engineering (ISHAGE) stroom cytometry gating strategie41 (Zie de representatieve afbeelding in Figuur 1). Gebruik de volgende volgorde:
        Stap 1: selectie celpopulatie (figuur 1A)
        Stap 2: selectie van CD45+ cellen (figuur 1B)
        Stap 3: selectie van levensvatbare CD45+ cellen (Figuur 1 c)
        Stap 4: selectie van levensvatbare CD45+/CD34+ cellen (Figuur 1 d)
        Stap 5: selectie van levensvatbare CD45+/CD34+/CD133+ cellen (figuur 1E)
        Stroom cytometer worden uitgevoerd (Zie Tabel van materialen) volgens instructies van de fabrikant.
      2. Bereken de levensvatbaarheid van de cellen en zuiverheid met behulp van de volgende vergelijkingen:

Equation 1   Vergelijking 1

Equation 2   Vergelijking 2

  1. Cel cultuur van vers geïsoleerde CD133+ SCs
    1. Aliquot 100 x recombinante menselijke cytokine aanvulling in 100 µL aliquots en opgeslagen bij-20 ° C. Dooi een 100 x aliquot voordat de middellange voorbereiding.
    2. Voorbereiden van de CD133+ SC kweekmedium, serumvrij hematopoietische cel expansie medium aangevuld met recombinante menselijke cytokine supplement (laatste 1 x) en 1% penicilline/streptomycine.
    3. Zaad 5 x 10,4 vers geïsoleerd CD133+ SCs voor Transfectie in een 24-well plaat met 500 µL cultuurmedium. Incubeer de cellen bij 37 ° C, 5% CO2 en 20% O2.
      Opmerking: Zaad 5 x 10,4 vers geïsoleerd CD133+ SCs als een besturingselement voor flow cytometrische analyse.

2. voorbereiding van de transfectie complexen

Opmerking: Tijdens deze stap, houd de ganse werk ruimte ribonuclease (RNAse)-gratis gebruik van RNAse decontaminatie-oplossing en gebruik alleen RNAse-vrij verbruikbare materiaal.

  1. Voorbereiding van miR
    Opmerking: De volgende werkzaamheden moet worden uitgevoerd in een kamer die beschermd tegen fel licht (dim verlichting alleen).
    Opmerking: voor de miR-specimen: gebruik Cyanine 3 kleurstof label voorloper miR en labelloze voorloper miR.
    1. Verdun ter voorbereiding van de miR-stockoplossing (50 µM), de gewenste hoeveelheid miR in de juiste hoeveelheid water nuclease-gratis (b.v., verdunde 5 nmol van miR in 100 µL water). Zachtjes Meng de oplossing, aliquoot de miR voorraad (5 µL) en op te slaan onder de-20 ° C.
  2. Voorbereiding van PEI
    1. Bereiden de PEI na standaardprotocollen en Opmerking de PEI voorraad concentratie31,42 .
  3. Voorbereiding voor MNP
    1. De MNPs na standaardprotocollen voor te bereiden en noteer het MNP voorraad concentratie31,42.
  4. Voorbereiding van miR/PEI complexen
    1. 5% glucose oplossing bereid door verdunning van D-(+)-glucose in nuclease-gratis water. Zachtjes Meng de oplossing, aliquoot de voorraad (1,5 mL) en bewaren bij 4 ° C.
      Opmerking: De volgende werkzaamheden moet worden uitgevoerd in een kamer die beschermd tegen fel licht (dim verlichting alleen).
    2. Gebruik 20 pmol miR per putje van een 24-well plaat30. Verdun miR in de 5% glucose oplossing voor een eindconcentratie van 0,25 pmol miR/µL.
    3. Bereken de hoeveelheid PEI vereist op basis van het bedrag van de miR (20 pmol, stap 2.3.1) en de optimale stikstof (van PEI) fosfaat (van miR) (N/P) verhouding op basis van de voorraad concentratie van PEI (stap 2.2.1; hier, een verhouding van 7.5 werd gebruikt)30. Verdun de PEI in een gelijke hoeveelheid van 5% glucose oplossing op basis van de vergelijking:
      Equation 3
      die herschikt om te
      Equation 4    Vergelijking 3
      waar PEI volume µL en [PEI] is in mM en N/P (geoptimaliseerd voor dit protocol) is 0,75. 0.12 is een conversiefactor die specifiek zijn voor de miR.
    4. Voeg de vooraf verdunde PEI in de vooraf verdunde miR en vortex voor 30 s.
    5. Incubeer de miR/PEI complex voor 30 min op RT.
  5. Voorbereiding van de miR/PEI/MNP complexen
    Opmerking: De volgende werkzaamheden moet worden uitgevoerd in een kamer die beschermd tegen fel licht (dim verlichting alleen).
    1. Tijdens het broeden bereiden de miR/PEI complexen, de MNPs door sonicating de MNPs gedurende 20 minuten bij 35 kHz in het sonicating waterbad op RT om ervoor te zorgen de deeltjes in suspensie en niet aggregeren.
    2. Bereken het aantal vereiste MNPs (ijzer 3 µg/mL) op basis van de stockoplossing MNP (stap 2.3.1).
    3. Voeg de sonicated MNPs in de miR/PEI complexen en vortex voor 30 s. Incubate de miR/PEI/MNP complexen voor 30 min op RT.
  6. Voorbereiding van de transfectie complexen voor vierkleuren labelen met behulp van SIM
    Opmerking: Gebruik de voorloper van de labelloze miR.
    1. Label de miR met Cyanine 5 kleurstof met behulp van een Cyanine 5 kleurstof miR labeling kit (Zie Tabel van materialen) volgens de instructies van de fabrikant. De concentratie van de uiteindelijke miR met behulp van de beursgenoteerde spectrofotometer meten (Zie Tabel van materialen) in overeenstemming met de instelling vooraf geleverd door de fabrikant (nucleic zuur, RNA-40). Aliquot die de miR (5 µL) en de winkel bij-80 ° C beschermd tegen licht.
    2. Label de PEI met een helder groene fluorescentie kleurstof met behulp van een geschikte eiwit labeling kit (Zie Tabel van materialen) volgens de instructies van de fabrikant. Definieer de eindconcentratie van PEI met behulp van de ninhydrine assay (stap 2.2.1). Aliquot de PEI (berekend op basis van vergelijking 3in het volume) en bewaren bij 4 ° C beschermd tegen licht.
    3. Label de MNPs met rhodamine kleurstof geconjugeerd met biotine met behulp van een ratio van 1:1,000 w/w, kleurstof naar MNP. Meng de rhodamine kleurstof en MNPs gelijktijdig met de voorbereiding van de miR/PEI complexvorming en de oplossing gedurende 30 min. in het donker uit te broeden. Direct gebruik maken van gelabelde MNPs.

3. de transfectie van CD133+ SCs

Opmerking: Tijdens deze stap, houd de ganse werk ruimte ribonuclease (RNAse)-gratis gebruik van RNAse decontaminatie-oplossing en gebruik alleen RNAse-vrije verbruikbare kunststof
Opmerking: De volgende werkzaamheden moet worden uitgevoerd in een kamer die beschermd tegen fel licht (dim verlichting alleen).

  1. Voeg het bereid miRNA/PEI/MNP complex ontkleuring direct in de juiste goed met de vers geïsoleerde CD133+ SCs kweekmedium.
  2. Meng voorzichtig door de plaat heen en weer schommelen. Incubeer de cellen gedurende 18 uur bij 37 ° C, 5% CO2 en 20% O2.

4. analyse van de miR transfectie

  1. Onderzoek van de doeltreffendheid van de opname miR en de cytotoxiciteit van transfectie complexen
    Opmerking: voor de miR-specimen: gebruik Cyanine 3 kleurstof label voorloper miR voor de evaluatie van de opname en de niet-transfected CD133+ SCs voor de stroom cytometry controle poorten.
    Opmerking: De volgende werkzaamheden moet worden uitgevoerd in een kamer die beschermd tegen fel licht (dim verlichting alleen).
    Opmerking: Houd de buizen, buffers en antilichamen op ijs, tenzij anders vermeld.
    1. De stockoplossing paraformaldehyde (PFA, 4%) bereid door verdunnen van 4 g PFA in 100 mL PBS en verwarming van de oplossing tot 80 ° C. Krachtig de oplossing mengen en de pH-waarde tot 7.3. Aliquot de PFA voorraad (1,5 mL) en opgeslagen bij-20 ° C.
    2. 18 h na transfectie, verzamelen elk putje in een aparte 1,5 mL tube. Was nou eenmaal met 500 µL van PBS en deze celsuspensie overbrengen in de dezelfde buis.
    3. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet verkregen in 100 µL van 4 ° C MACS buffer.
    4. Voeg 0,5 µL van een kleurstof amine reactieve onderscheid maken tussen levende en dode cellen, Zacht mengen van de opschorting en incubeer gedurende 10 min bij 4 ° C. Voeg 1 mL PBS (4 ° C) en centrifuge bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
    5. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet verkregen in 100 µL PBS, voeg 33 µL PFA (4%) opslaan op ijs of bij 4 ° C tot flow cytometrische analyse.
    6. Schik de gating strategie volgens de representatieve afbeelding in Figuur 2. De monsters worden uitgevoerd op de stroom cytometer (Zie Tabel van materialen) volgens instructies van de fabrikant.
  2. Karakterisering van de miR-transfected CD133+ SCs
    Opmerking: Gebruikt labelloze voorloper miR, alsmede niet-transfected CD133+ SCs voor stroom cytometry controle poorten.
    1. Verzamel elk in een aparte 1,5 mL-buis goed samen en centrifugeer bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
    2. Gebruik de gating strategie zoals beschreven in stap 1,2.
  3. Onderzoek van de intracellulaire verdeling van transfectie complexen door SIM
    1. Voorbereiden van de complexen en transfect van de cellen, zoals beschreven in sectie 2 en deel 3.
    2. 18 h na de transfectie, verzamelen elk putje in een aparte 1,5 mL tube. Was nou eenmaal met 500 µL van PBS en breng het wassen in de respectieve buis van de put. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
    3. Verwijder het supernatant en resuspendeer de verkregen pellet in 1 mL 2% foetale runderserum (FBS) in PBS, Zacht mengen van de schorsing, samen en centrifugeer bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
    4. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet verkregen in 100 µL van PBS Voeg 33 µL PFA (4%) voor 20 min.
    5. Spoel de celsuspensie in een nieuwe 24-cultuur-plaat met steriele glazen coverslips en centrifuge op 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C.
    6. Verwijder het supernatant en voeg 500 µL van PBS. Voorzichtig schudden van de plaat en negeren van PBS.
    7. Plaats de voorbereide coverslips op de microscopische dia's met behulp van waterige montage medium te bewaren van fluorescentie en droog ze op RT gedurende ten minste 1 uur.
    8. Verwerven van beelden met behulp van een 100 X olie onderdompeling doelstelling. SIM-instellingen: 405, 488, 561 en 633 nm laserlijnen voor excitatie en z-stacks met een 16-bit diepte 3 hoeken, 3 fasen, met gemiddeld 4, rasters per laser lijn: 23 µm-405, 34 µm-488, 42 µm-561, 51 µm-633.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Het gepresenteerde protocol beschrijft een handmatige isolatie en magnetische verrijking van menselijke BM afkomstige CD133+ SCs met een latere virus onafhankelijke cel engineering strategie, als een niet-invasieve technologie voor in vitro cel manipulatie en in vivo controlehulpmiddel.

Deze technologie van de isolatie van drie-stap staat een scheiding van multinationals van de vooraf verteerd sternale BM via dichtheid kleurovergang centrifugeren. Daarna een CD133+ cel breuk kan magnetisch worden verrijkt met behulp van de technologie van de juiste isolatie. Hierdoor is een verrijking van CD133+ SCs met een levensvatbaarheid en zuiverheid hoger dan 80%, wat kan worden vastgesteld door stroom cytometry (Figuur 1). Hierna werden alleen SC producten die voldoen aan de vereisten gebruikt voor verdere experimenten.

De hier beschreven methode van de transfectie kan een zeer effectieve invoering van miR in dit vers geïsoleerde menselijke CD133+ SCs met een opname van ongeveer 80% van levensvatbare cellen (Figuur 2)30. Bovendien, zijn er geen significante cytotoxische effecten duidelijk 18 h na transfectie t.o.v. controle (Figuur 2)30 cellen. Bovendien kunnen een voldoende levering en gebruikelijke verdeling van de transfectie complexe verbindingen (miR, PEI en MNPs) worden waargenomen in het cytoplasma van de cellen met behulp van SIM (Figuur 3).

Figure 1
Figuur 1: Vertegenwoordiger Boolean gating strategie voor CD133+ SC karakterisering. (A-E) Afbeelding van een selectie van de 5-stap-strategie voor een strenge beoordeling van de levensvatbaarheid van de cellen en zuiverheid van geïsoleerde CD133+ SC evenals (F) CD133 isotype controle met behulp van het juiste onbehandelde BM monster. (A) met uitzondering van puin van intact celpopulatie in een voorwaarts/zijde (FSC/SSC) stip scatterplot, gevolgd door opeenvolgende selectie van (B) CD45+ cel bevolking, (C) levensvatbaar CD45+ cel bevolking, (D) levensvatbare dubbele positieve CD45+/CD34+ -celpopulatie en (E) levensvatbare triple positieve CD45+/CD34+/CD133+ cel bevolking. Oranje: CD45+/CD34+/CD133+ cellen gemarkeerd binnen elke selectie stap. Opschrift: APC-Cy7: anti-CD45, FITC: anti-CD34, FSC: Forward Scatter kanaal, PE: anti-CD133, SSC: kant Scatter kanaal, 7-AAD: 7-aminoactinomycin. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: vertegenwoordiger strategie voor de beoordeling van miR opname efficiëntie en cytotoxiciteit van de transfectie complexe gating. Gating strategieën (A, B) transfected CD133+ SCs zo goed als (C, D) niet-transfected CD133+ SCs voor de analyses van (A, C) Cyanine3 kleurstof label voorloper-miRNA opname efficiëntie () rood: levensvatbare Cy3+ cellen) en (B, D) cytotoxische effecten van de transfectie procedure gekenmerkt door een amine reactieve kleurstof onderscheid maken tussen levende en dode cellen (blauwe: dode cellen). Opschrift: SSC: kant Scatter kanaal, cellen alleen: niet-transfected CD133+ SCs miRNA/PEI/MNP: CD133+ SCs transfected met Cy3-geëtiketteerden miR Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: intracellulair visualisatie van de transfectie complexe. CD133+ SCs transfected waren met drie kleuren label miR/PEI/MNP complexe (miR: 20 pmol, PEI: N/P ratio 7.5, MNP: 3 µg/mL). Representatieve visualisatie werd 18 h na transfectie met behulp van gestructureerde verlichting microscopie uitgevoerd. De miR was gelabeld met Cyanine5 kleurstof (rood), met een helder groene fluorescentie kleurstof (groen), PEI MNPs met rhodamine kleurstof geconjugeerd met biotine (geel) en de kern werd counterstained met de DAPI (blauw). Schaal bar = 5 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

monster FCR blokkerende reagens [µL] MACS buffer [µL] antilichamen [µL] totaal [µL]
nummer specimen cellen [µL] CD133-PE isotype CD133-PE CD34-FITC CD45-APC-Cy7 TOEVOEGEN
1 BM 10 10 12,5 5 - 5 2.5 5 50
2 BM 10 10 12,5 - 5 5 2.5 5 50
3 CD133+ (1 x 10-4) 10 12,5 - 5 5 2.5 5 50

Tabel 1: Pipetting lay-out voor de karakterisering van CD133 + SCs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In de afgelopen jaren, CD133+ SCs opgedoken als een veelbelovende celpopulatie voor SC gebaseerde therapieën zoals blijkt uit verschillende fase I, II en III klinische proeven43,44,45,46, 47 , 48 , 49 , 50 , 51 , 52 , 53 , 54. hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor de gestandaardiseerde handmatige reiniging en stroom cytometrische karakterisatie van deze cellen van menselijke sternale BM. De procedure beschreven op basis van MACS isolatie vertegenwoordigt een zachte, snelle en efficiënte strategie voor een zeer zuiver en levensvatbare hematopoietische SC-Fractie. De goede compatibiliteit, gecombineerd met de snelle afbraak van mede ingespoten MACS MicroBeads gebruikt voor het sorteren van de cel is eerder aangetoond in onze groep55,,56.

Deze isolatie-procedure werd ontwikkeld met behulp van menselijke sternale BM als grondstof, en daarom kunnen via het protocol momenteel zuivering van hematopoietische SCs bestemd voor gebruik in niet-klinisch onderzoek. Als CD133+ SCs zijn geïsoleerd van andere weefsels (bijvoorbeeld BM verkregen iliac crest) verschillende stappen van het protocol zoals enzymatische weefsel spijsvertering en dichtheid centrifugeren mogelijk aanpassing. Voor klinische cel toepassing, heeft onze fractie verder een GMP-voldoet on-site productie procedure vastgesteld met behulp van de een automatisch systeem om te voldoen aan de aanvullende eisen namens klinische moet57.

Engineering van SCs voorafgaand aan hun toepassing is een nieuwe strategie om bepaalde blokkeringen in SC therapie, met inbegrip van lage cel retentie en massale celdood. Het huidige protocol bevat instructies voor de productie van een virale-vrije multifunctionele transfectie systeem gebaseerd op vertakte PEI gebonden aan MNPs en de efficiënte invoering ervan in de CD133+ SCs30. Toepassing van dit systeem maakt de cel van de genetische modificatie, magnetisch gecontroleerde cel begeleiding en niet-invasieve cel traceren via MRI of MPI30,31,40,42,58 , 59 , 60.

Nog belangrijker is, de voorwaarden beschreven transfectie zijn geoptimaliseerd voor voorbijgaande genetische modificatie van CD133+ BM afkomstige SCs30. In eerdere werken, is dit systeem van transfectie ook met succes toegepast voor de levering van plasmide DNA en miR op andere cel typen31,40,60. Deze experimenten hebben aangetoond dat transfectie efficiëntie alsmede cytotoxiciteit cel type-afhankelijke. De optimale composities van NAs, PEI en MNPs moeten worden gedefinieerd voor elk celtype.

Dankzij zijn hoog rendement is PEI een van de meest gebruikte polymeren voor niet-virale genetische cel engineering61. Echter is de klinische toepassing61,62 van PEI zeer beperkt is tot nu toe vanwege haar algemene toxiciteit61,63. Interessant is dat onze fractie onlangs aangetoond dat MNPs PEI toxiciteit wanneer opgenomen in de transfectie systeem31,60verminderen. Op hetzelfde moment, de mogelijke toxiciteit van ijzeroxide gebaseerd nanodeeltjes veroorzaakt door de productie van reactieve zuurstof soorten (ROS) is dosisafhankelijk en verschillende soorten superparamagnetische nanodeeltjes worden goedgekeurd voor MRI64,65 . Echter moet er aandacht worden besteed aan de toxiciteit van het systeem in vitro en in vivo.

Het protocol is over het algemeen vrij complex, met vele kritische stappen die moeten zeer zorgvuldig worden aangepakt. Voor dit doel, hebben wij gewezen op deze punten in de sectie protocol met notities. Wij willen met name wijzen op het belang van een volledig RNAse-vrije omgeving en het vermijden van eventuele blootstelling aan licht, bij de behandeling van de toegepaste fluorescente kleurstoffen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren geen belangenconflict.

Acknowledgments

Dit werk werd gesteund door het federale ministerie van onderwijs en onderzoek Duitsland (FKZ 0312138A en FKZ 316159), de staat Mecklenburg-Voorpommeren met EU-structuurfondsen (ESF/IVWM-B34-0030/10 en ESF/IVBM-B35-0010/12) en de DFG (DA1296/2-1), de Duitse Hartstichting (F/01/12), de goedgekeurd (VIP + 00240) en de VOCHTIGE Foundation. Bovendien, worden F.H. en P.M. ondersteund door het FORUN programma van Rostock Universiteit medisch centrum (889001).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
7-AAD BD Biosciences 559925
Acetic Acid with Methylene Blue Stemcell Technologies 7060 3%
anti-CD133/2-PE (clone: 293C3) Miltenyi Biotec GmbH 130-090-853
anti-CD34-FITC (clone: AC136) Miltenyi Biotec GmbH 130-081-001
anti-CD45-APC-H7 (clone: 2D1) BD Biosciences 560178
rhodamine dye; Atto 565 dye conjugated to biotin ATTO-TEC GmbH AD 565-71
BD FACS LSRII flow cytometer BD Biosciences
BD FACSDiva Software 6.1.2 BD Biosciences
BSA Sigma-Aldrich GmbH A7906
CD133 antibody-linked superparamagnetic iron dextran particles; CD133 MicroBead Kit Miltenyi Biotec GmbH 130-097-049
collagenase B Roche Diagnostics GmbH 11088831001
counting chamber Paul Marienfeld GmbH & Co. KG
Cyanine 3 dye labelled precursor miR; Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control #1 Ambion AM17120
Cyanine 5 dye miR labelling kit; Cy5 dye Label IT miRNA Labeling Kit Mirus Bio MIR 9650
DNAse I Roche Diagnostics GmbH 10104159001 (100 U/mL)
ELYRA PS.1 LSM 780 confocal microscope Carl Zeiss Jena GmbH
FcR Blocking Reagent, human Miltenyi Biotec GmbH 130-059-901
bright green protein labeling kit; Oregon Green 488 Protein Labeling Kit Thermo Fisher Scientific O10241
aqueous mounting medium; Fluoroshield Sigma-Aldrich GmbH F6182
density gradient centrifugation tube; Leukosep Centrifuge Tube Greiner Bio-One 89048-932
MACS magnet holder; MACS MultiStand Miltenyi Biotec GmbH 130-042-303
MACS pre-separation filter Miltenyi Biotec GmbH 130-041-407 30 µm
MACS separation column (MS / LS) Miltenyi Biotec GmbH 130-042-201 / 130-042-401
MACS permanent magnet; MACS Separator Miltenyi Biotec GmbH 130-042-302
Millex-HV PVDF Filter Merck SLHV013SL 0.45 μm
mouse IgG 2b-PE Miltenyi Biotec GmbH 130-092-215
amine reactive dye; Near-IR LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit Thermo Fisher Scientific L10119
human lymphocyte separating medium; Pancoll Pan Biotech GmbH P04-60500 density: 1.077 g/mL
PBS Pan Biotech GmbH P04-53500 without Ca and Mg
PEI Sigma-Aldrich GmbH 408727 branched; 25 kDa
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 100 U/mL, 100 μg/mL
PFA Merck Schuchardt OHG 1040051000
unlabelled precursor miR; Pre-miR miRNA Precursor Negative Control #1 Ambion AM17110
RBC lysis buffer eBioscience 00-4333-57
RNAse decontamination solution; RNaseZap Thermo Fisher Scientific AM9780
human lymphocyte medium; Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium Pan Biotech GmbH P04-16500
recombinant human cytokine supplement; StemSpan CC100 Stemcell Technologies 2690
serum-free haematopoietic cell expansion medium; StemSpan H3000 Stemcell Technologies 9800
Streptavidin MagneSphere Paramagnetic Particles Promega Corporation Z5481
Trypan Blue solution Sigma-Aldrich GmbH T8154 0.4 %
UltraPure EDTA Thermo Fisher Scientific 15575020 0.5 M; pH 8.0
ZEN2011 software Carl Zeiss Jena GmbH
NanoDrop 1000 Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific
Sonorex RK 100 SH sonicating water bath Bandelin electronic Ultrasonic nominal output: 80 W; Ultrasonic frequency: 35 kHz

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Meregalli, M., Farini, A., Belicchi, M., Torrente, Y. CD133(+) cells isolated from various sources and their role in future clinical perspectives. Expert opinion on biological therapy. 10 (11), 1521-1528 (2010).
  2. Lee, S., Yoon, Y. -S. Revisiting cardiovascular regeneration with bone marrow-derived angiogenic and vasculogenic cells. British journal of pharmacology. 169 (2), 290-303 (2013).
  3. Beksac, M., Preffer, F. Is it time to revisit our current hematopoietic progenitor cell quantification methods in the clinic? Bone marrow transplantation. 47 (11), 1391-1396 (2012).
  4. Bongiovanni, D., et al. The CD133+ cell as advanced medicinal product for myocardial and limb ischemia. Stem cells and development. 23 (20), 2403-2421 (2014).
  5. Wang, X., et al. The Clinical Status of Stem Cell Therapy for Ischemic Cardiomyopathy. Stem cells international. 2015, 135023 (2015).
  6. Ma, N., et al. Intramyocardial delivery of human CD133+ cells in a SCID mouse cryoinjury model: Bone marrow vs. cord blood-derived cells. Cardiovascular research. 71 (1), 158-169 (2006).
  7. Rafii, S., Lyden, D. Therapeutic stem and progenitor cell transplantation for organ vascularization and regeneration. Nature medicine. 9 (6), 702-712 (2003).
  8. Wang, D., Gao, G. State-of-the-art human gene therapy: part I. Gene delivery technologies. Discovery medicine. 18 (97), 67-77 (2014).
  9. Sart, S., Ma, T., Li, Y. Preconditioning stem cells for in vivo delivery. BioResearch open access. 3 (4), 137-149 (2014).
  10. Liu, J., et al. Early stem cell engraftment predicts late cardiac functional recovery: preclinical insights from molecular imaging. Circulation. Cardiovascular imaging. 5 (4), 481-490 (2012).
  11. Lang, C., et al. In vivo comparison of the acute retention of stem cell derivatives and fibroblasts after intramyocardial transplantation in the mouse model. European journal of nuclear medicine and molecular imaging. 41 (12), 2325-2336 (2014).
  12. Goussetis, E., et al. Intracoronary infusion of CD133+ and CD133-CD34+ selected autologous bone marrow progenitor cells in patients with chronic ischemic cardiomyopathy: cell isolation, adherence to the infarcted area, and body distribution. Stem cells. 24 (10), Dayton, Ohio. 2279-2283 (2006).
  13. Caveliers, V., et al. In vivo visualization of 111In labeled CD133+ peripheral blood stem cells after intracoronary administration in patients with chronic ischemic heart disease. Q J Nucl Med Mol Imaging. 51 (1), 61-66 (2007).
  14. Terrovitis, J. V., Smith, R. R., Marbán, E. Assessment and optimization of cell engraftment after transplantation into the heart. Circulation research. 106 (3), 479-494 (2010).
  15. Rosado-de-Castro, P. H., et al. Biodistribution of bone marrow mononuclear cells after intra-arterial or intravenous transplantation in subacute stroke patients. Regenerative medicine. 8 (2), 145-155 (2013).
  16. Kang, W. J., Kang, H. -J., Kim, H. -S., Chung, J. -K., Lee, M. C., Lee, D. S. Tissue distribution of 18F-FDG-labeled peripheral hematopoietic stem cells after intracoronary administration in patients with myocardial infarction. Journal of nuclear medicine official publication, Society of Nuclear Medicine. 47 (8), 1295-1301 (2006).
  17. Blocklet, D., et al. Myocardial homing of nonmobilized peripheral-blood CD34+ cells after intracoronary injection. Stem cells. 24 (2), Dayton, Ohio. 333-336 (2006).
  18. Penicka, M., et al. One-day kinetics of myocardial engraftment after intracoronary injection of bone marrow mononuclear cells in patients with acute and chronic myocardial infarction. Heart (British Cardiac Society). 93 (7), 837-841 (2007).
  19. Schächinger, V., et al. Pilot trial on determinants of progenitor cell recruitment to the infarcted human myocardium. Circulation. 118 (14), 1425-1432 (2008).
  20. Dedobbeleer, C., et al. Myocardial homing and coronary endothelial function after autologous blood CD34+ progenitor cells intracoronary injection in the chronic phase of myocardial infarction. Journal of cardiovascular pharmacology. 53 (6), 480-485 (2009).
  21. Musialek, P., et al. Randomized transcoronary delivery of CD34(+) cells with perfusion versus stop-flow method in patients with recent myocardial infarction: Early cardiac retention of (m)Tc-labeled cells activity. Journal of nuclear cardiology official publication of the American Society of Nuclear Cardiology. 18 (1), 104-116 (2011).
  22. Kyrtatos, P. G., et al. Magnetic tagging increases delivery of circulating progenitors in vascular injury. JACC. Cardiovascular interventions. 2 (8), 794-802 (2009).
  23. Vandergriff, A. C., et al. Magnetic targeting of cardiosphere-derived stem cells with ferumoxytol nanoparticles for treating rats with myocardial infarction. Biomaterials. 35 (30), 8528-8539 (2014).
  24. Huang, Z., et al. Magnetic targeting enhances retrograde cell retention in a rat model of myocardial infarction. Stem cell research & therapy. 4 (6), 149 (2013).
  25. Yanai, A., et al. Focused magnetic stem cell targeting to the retina using superparamagnetic iron oxide nanoparticles. Cell transplantation. 21 (6), 1137-1148 (2012).
  26. Arbab, A. S., Jordan, E. K., Wilson, L. B., Yocum, G. T., Lewis, B. K., Frank, J. A. In vivo trafficking and targeted delivery of magnetically labeled stem cells. Human gene therapy. 15 (4), 351-360 (2004).
  27. Cores, J., Caranasos, T. G., Cheng, K. Magnetically Targeted Stem Cell Delivery for Regenerative Medicine. Journal of functional biomaterials. 6 (3), 526-546 (2015).
  28. Cheng, K., et al. Magnetic enhancement of cell retention, engraftment, and functional benefit after intracoronary delivery of cardiac-derived stem cells in a rat model of ischemia/reperfusion. Cell transplant. 21 (6), 1121-1135 (2012).
  29. Li, W., et al. Enhanced thoracic gene delivery by magnetic nanobead-mediated vector. The journal of gene medicine. 10 (8), 897-909 (2008).
  30. Müller, P., et al. Magnet-Bead Based MicroRNA Delivery System to Modify CD133+ Stem Cells. Stem cells international. 2016, 7152761 (2016).
  31. Voronina, N., et al. Non-viral magnetic engineering of endothelial cells with microRNA and plasmid-DNA-An optimized targeting approach. Nanomedicine nanotechnology, biology, and medicine. , (2016).
  32. Noort, W. A., et al. Mesenchymal stromal cells to treat cardiovascular disease: strategies to improve survival and therapeutic results. Panminerva Med. 52 (1), 27-40 (2010).
  33. Jakob, P., Landmesser, U. Role of microRNAs in stem/progenitor cells and cardiovascular repair. Cardiovascular Research. 93 (4), 614-622 (2012).
  34. Sen, C. K. MicroRNAs as new maestro conducting the expanding symphony orchestra of regenerative and reparative medicine. Physiological genomics. 43 (10), 517-520 (2011).
  35. Papapetrou, E. P., Zoumbos, N. C., Athanassiadou, A. Genetic modification of hematopoietic stem cells with nonviral systems: past progress and future prospects. Gene therapy. 12, Suppl 1. S118-S130 (2005).
  36. Chira, S., et al. Progresses towards safe and efficient gene therapy vectors. Oncotarget. 6 (31), 30675-30703 (2015).
  37. Hobel, S., Aigner, A. Polyethylenimines for siRNA and miRNA delivery in vivo. Wiley interdisciplinary reviews. Nanomedicine and nanobiotechnology. 5 (5), 484-501 (2013).
  38. Villate-Beitia, I., Puras, G., Zarate, J., Agirre, M., Ojeda, E., Pedraz, J. L. First Insights into Non-invasive Administration Routes for Non-viral Gene Therapy. Gene Therapy - Principles and Challenges. Hashad, D. , (2015).
  39. Cubillos-Ruiz, J. R., Sempere, L. F., Conejo-Garcia, J. R. Good things come in small packages: Therapeutic anti-tumor immunity induced by microRNA nanoparticles. Oncoimmunology. 1 (6), 968-970 (2012).
  40. Schade, A., et al. Magnetic nanoparticle based nonviral microRNA delivery into freshly isolated CD105(+) hMSCs. Stem Cells Int. 2014, 197154 (2014).
  41. Sutherland, D. R., Anderson, L., Keeney, M., Nayar, R., Chin-Yee, I. The ISHAGE guidelines for CD34+ cell determination by flow cytometry. International society of hematotherapy and graft engineering. Journal of hematotherapy. 5 (3), 213-226 (1996).
  42. Voronina, N., et al. Preparation and in vitro characterization of magnetized mir-modified endothelial cells. Journal of visualized experiments. (123), (2017).
  43. Stamm, C., et al. Intramyocardial delivery of CD133+ bone marrow cells and coronary artery bypass grafting for chronic ischemic heart disease:Safety and efficacy studies. The journal of thoracic and cardiovascular surgery. 133 (3), 717-725 (2007).
  44. King, A., et al. REpeated AutoLogous Infusions of STem cells In Cirrhosis (REALISTIC): A multicentre, phase II, open-label, randomised controlled trial of repeated autologous infusions of granulocyte colony-stimulating factor (GCSF) mobilised CD133+ bone marrow stem cells in patients with cirrhosis. A study protocol for a randomised controlled trial. BMJ open. 5 (3), e007700 (2015).
  45. Martinez, H. R., et al. Stem cell transplantation in amyotrophic lateral sclerosis patients: methodological approach, safety, and feasibility. Cell transplantation. 21 (9), 1899-1907 (2012).
  46. Jimenez-Quevedo, P., et al. Selected CD133(+) progenitor cells to promote angiogenesis in patients with refractory angina: final results of the PROGENITOR randomized trial. Circulation research. 115 (11), 950-960 (2014).
  47. Raval, A. N., et al. Bilateral administration of autologous CD133+ cells in ambulatory patients with refractory critical limb ischemia: lessons learned from a pilot randomized, double-blind, placebo-controlled trial. Cytotherapy. 16 (12), 1720-1732 (2014).
  48. Andreone, P., et al. Reinfusion of highly purified CD133+ bone marrow-derived stem/progenitor cells in patients with end-stage liver disease: A phase I clinical trial. Digestive and liver disease. 47 (12), 1059-1066 (2015).
  49. Arici, V., et al. Autologous immuno magnetically selected CD133+ stem cells in the treatment of no-option critical limb ischemia: clinical and contrast enhanced ultrasound assessed results in eight patients. Journal of translational medicine. 13, 342 (2015).
  50. Zali, A., et al. Intrathecal injection of CD133-positive enriched bone marrow progenitor cells in children with cerebral palsy: feasibility and safety. Cytotherapy. 17 (2), 232-241 (2015).
  51. Al-Zoubi, A., et al. Transplantation of purified autologous leukapheresis-derived CD34+ and CD133+ stem cells for patients with chronic spinal cord injuries: long-term evaluation of safety and efficacy. Cell transplantation. 23, Suppl 1. S25-S34 (2014).
  52. Isidori, A., et al. Positive selection and transplantation of autologous highly purified CD133(+) stem cells in resistant/relapsed chronic lymphocytic leukemia patients results in rapid hematopoietic reconstitution without an adequate leukemic cell purging. Biology of blood and marrow transplantation. 13 (10), 1224-1232 (2007).
  53. Nasseri, B. A., et al. Autologous CD133+ bone marrow cells and bypass grafting for regeneration of ischaemic myocardium: the Cardio133 trial. European heart journal. 35 (19), 1263-1274 (2014).
  54. Steinhoff, G., et al. Cardiac Function Improvement and Bone Marrow Response -: Outcome Analysis of the Randomized PERFECT Phase III Clinical Trial of Intramyocardial CD133(+) Application After Myocardial Infarction. EBioMedicine. 22, 208-224 (2017).
  55. Muller, P., et al. Intramyocardial fate and effect of iron nanoparticles co-injected with MACS(R) purified stem cell products. Biomaterials. 135, 74-84 (2017).
  56. Müller, P., Gaebel, R., Lemcke, H., Steinhoff, G., David, R. Data on the fate of MACS® MicroBeads intramyocardially co-injected with stem cell products. Data in brief. 13, 569-574 (2017).
  57. Skorska, A., et al. GMP-conformant on-site manufacturing of a CD133+ stem cell product for cardiovascular regeneration. Stem cell research & therapy. 8 (1), 33 (2017).
  58. Delyagina, E., Li, W., Ma, N., Steinhoff, G. Magnetic targeting strategies in gene delivery. Nanomedicine (Lond). 6 (9), 1593-1604 (2011).
  59. Schade, A., et al. Innovative strategy for microRNA delivery in human mesenchymal stem cells via magnetic nanoparticles. International journal of molecular sciences. 14 (6), 10710-10726 (2013).
  60. Delyagina, E., et al. Improved transfection in human mesenchymal stem cells: Effective intracellular release of pDNA by magnetic polyplexes. Nanomedicine. 9 (7), London, England. 999-1017 (2014).
  61. Yin, H., Kanasty, R. L., Eltoukhy, A. A., Vegas, A. J., Dorkin, J. R., Anderson, D. G. Non-viral vectors for gene-based therapy. Nature reviews. Genetics. 15 (8), 541-555 (2014).
  62. Chen, J., Guo, Z., Tian, H., Chen, X. Production and clinical development of nanoparticles for gene delivery. Molecular therapy. Methods & clinical development. 3, 16023 (2016).
  63. Juliano, R. L. The delivery of therapeutic oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 44 (14), 6518-6548 (2016).
  64. Soenen, S. J., Rivera-Gil, P., Montenegro, J. -M., Parak, W. J., de Smedt, S. C., Braeckmans, K. Cellular toxicity of inorganic nanoparticles: Common aspects and guidelines for improved nanotoxicity evaluation. Nano today. 6 (5), 446-465 (2011).
  65. Estelrich, J., Sánchez-Martín, M. J., Busquets, M. A. Nanoparticles in magnetic resonance imaging: From simple to dual contrast agents. International journal of nanomedicine. 10, 1727-1741 (2015).

Tags

Bioengineering kwestie 136 stamcel CD133 genetische modificatie niet-virale transfectie microRNA magnetische targeting magnetische nanodeeltjes polyethylenimine
Protocol voor MicroRNA overdracht naar volwassen beenmerg-afgeleide hematopoietische stamcellen om cel Engineering gecombineerd met magnetische Targeting
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hausburg, F., Müller, P.,… More

Hausburg, F., Müller, P., Voronina, N., Steinhoff, G., David, R. Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting. J. Vis. Exp. (136), e57474, doi:10.3791/57474 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter