Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

פרוטוקול להעברת MicroRNA לתוך למבוגרים הנגזרות מח עצם Hematopoietic תאי גזע כדי לאפשר הנדסה תא בשילוב עם מיקוד מגנטי

Published: June 18, 2018 doi: 10.3791/57474
Automatic Translation
*1,2, *1,2, *1, 1,2, 1,2
1Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Department of Cardiac Surgery, Rostock University Medical Center, 2Department Life, Light and Matter of the Interdisciplinary Faculty, Rostock University
* These authors contributed equally

Summary

פרוטוקול זה ממחיש הליך בטוחים ויעילים כדי לשנות CD133+ hematopoietic תאי גזע. הציג נגיפי, מגנטי polyplex-הגישה המבוססת על עשוי לספק בסיס אופטימיזציה של תאי גזע טיפולית אפקטים כמו גם לגבי ניטור המוצר תא מנוהל באמצעות תהודה מגנטית.

Abstract

בעוד CD133+ תאי גזע hematopoietic (SCs) הוכחו מספקים פוטנציאל גבוה בתחום של רפואה רגנרטיבית, שיעורי ההחזקה נמוך שלהן לאחר ההזרקה לתוך רקמות פצוע, כמו גם שיעורי התמותה נצפתה תא מסיבית להוביל מאוד אפקטים טיפולית מוגבלת. כדי להתגבר על מגבלות אלה, אנחנו ביקשו להקים עבור הנדסה תא מתאים לפני הממשל שלהם פרוטוקול מבוסס נגיפי. השינוי של האדם CD133+ לבטא SCs באמצעות microRNA (מיר) טעון מגנטית polyplexes היה מיועד ביחס ספיגת יעילות, בטיחות, כמו גם פוטנציאל מיקוד של התאים. להסתמך על הפרוטוקול שלנו, נוכל להשיג מיר גבוהה שיעור ספיגת של 80-90% בזמן CD133+ מאפייני תא גזע נותרים ללא כל שינוי. יתר על כן, תאים ששונה אלה מציעות את האפשרות של פילוח מגנטי. נתאר כאן הליך בטוח ויעיל מאוד עבור השינוי של CD133+ SCs. אנו מצפים בגישה זו כדי לספק טכנולוגיה סטנדרטית למיטוב של תאי גזע הטיפולית תופעות לניטור של המוצר תא מנוהל באמצעות תהודה מגנטית (MRI).

Introduction

CD133+ SCs מייצגים הטרוגנית גזע ו קדמון תא אוכלוסיה עם מבטיח פוטנציאל עבור רפואה רגנרטיבית. שלהם בידול hematopoietic, אנדותל, myogenic פוטנציאליים1,2,3 מאפשר את CD133+ תאים, למשל, לתרום כורוידאלית תהליכים באמצעות בידול לתוך לאחרונה יוצרים כלי והפעלה של pro-אנגיוגנזה איתות על-ידי paracrine מנגנונים4,5,6,7.

למרות הפוטנציאל שלהם גבוהה הפגינו יותר מ 30 ניסויים קליניים מאושרים (ClinicalTrails.gov), התוצאה הטיפולית שלהם הוא עדיין תחת הדיון במחלוקת4. אכן, יישום קליני של SCs היא הקשו על ידי שמירה נמוך באיבר של עניין תא הראשונית מסיבית מוות5,8,9. נוספים הנדסה של CD133+ השתלת מוקדמת SCs יכול לעזור להתגבר על האתגרים הללו.

תנאי הכרחי אחד עבור טיפול יעיל תא יהיה צמצום מסיבית הראשונית של המוות של תאים כדי לשפר את engraftment של התאים הרלוונטיים טיפולית10. מחקרים נוכחיים הפגינו אובדן תא העצום של 90-99% באיברים מאוד perfused כמו מוח ולב, במהלך ה 1-2 הראשון, ללא תלות בסוג התאים המושתלים או יישום לנתב11,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21. SC תיוג באמצעות חלקיקים מגנטיים (MNPs) מאפשר אסטרטגיית לא פולשנית חדשניות לתאי היעד לאתר של עניין22,23,24,25,26 בו זמנית מאפשרת תא ניטור באמצעות MRI27 ו חלקיקים מגנטיים הדמיה (MPI). ה היעילה ויוו מחקרים החלה תא magnetized מיקוד שמירה תא בשימוש לאחר המינהל המקומית העדפה תא הדרכה לאחר הזרקה תוך ורידי23,24,28 . לכן, הקבוצה שלנו עיצב מערכת המורכבת חלקיקי תחמוצת ברזל פאראמגנטי29. בטכניקה זו, CD133+ SCs ואת תאי אנדותל יפתור (HUVECs) יכול ביעילות ניתן לפלח, כפי שמגלה במבחנה ניסיונות30,31.

. עוד משוכה SC טיפולים הוא הסביבה דלקתיות עוינת של רקמות שנפגעו לאחר ההשתלה, אשר תורמת מות התא הראשוני32. מספר מחקרים מיזוג מראש, היישום של מירס הרלוונטיים טיפולית היה נבדק33; זה בהצלחה הוכח כי מירס אנטי-מוות לעכב אפופטוזיס במבחנה ולשפר את התא engraftment ויוו33. אלו מולקולות קטנות, מורכב 20 – 25 נוקלאוטידים, לשחק תפקיד מכריע כמו מאפננים posttranscriptional של RNAs שליח (mRNAs), ובכך להשפיע על גורל והתנהגות תאי גזע34. יתר על כן, המבוא אקסוגני של מירס להימנע השילוב יציב רצויה לתוך הגנום המארח34.

ניסיונות הנוכחי עבור מבוא יעילה של חומצות גרעין (NAs) לתוך ראשי SCs מתבססים בעיקר על וירוסים רקומביננטי8,35. למרות יעילות גבוהה תרביות תאים, וירוס רקומביננטי מניפולציה מציג מכשול גדול עבור תרגום ספסל-כדי-המיטה, למשל, ביטוי גנים בלתי נשלט, פתוגניות, immunogenicity ו- insertional מוטגנזה מכוונת35 ,36. לכן, נגיפי מערכות אספקה כגון בונה מבוסס פולימר הם קריטיים כדי לפתח. בין אלה, polyethylenimine (פיי) מייצג כלי רכב משלוח חוקי המציע הטבות עבור מירס כגון NA עיבוי להגן מפני השפלה, ספיגת הסלולר, אלבומו תאיים endosomal להימלט37,38. יתר על כן, מתחמי מיר-פיי הפגינו של הביו גבוהה בניסויים קליניים39. לכן, מערכת המסירה שלנו מורכב biotinylated קנים 25 kDa פיי מאוגדים מצופים streptavidin ליבה MNP30,31,40.

כתב יד זה, אנו מציגים פרוטוקול מקיף המתאר (i) הבידוד ידנית של CD133+ SC של תרומת מח עצם אנושית (מוניטור) עם אפיון מפורט של המוצר SC ו (ii) על אסטרטגיה יעילה ועדינה תקנים של דיסקות נגיפי מבוסס פולימר מערכת משלוח עבור הנדסה גנטית של CD133+ SCs באמצעות מירס. CD133+ SCs מבודדים, דיסקות מועשר מן האדם aspirates מוניטור בחזה ובצלעות באמצעות משטח נוגדן מבוססי מגנטי הופעל תא מיון (מקינטוש) מערכת. לאחר מכן, את הכדאיות תא, כמו גם את הטוהר תא מנותחים באמצעות cytometry זרימה. לאחר מכן, מתחמי מיר/פיי/MNP מוכנים, CD133+ SCs הם transfected. 18 h לאחר תרביות תאים, את יעילות ספיגת וההשפעה של תרביות תאים ב- SC סמן ביטוי ותא הכדאיות מנותחים. יתר על כן, הערכה של ההתפלגות תאיים של תרביות תאים מורכבים תרכובות מתבצעת באמצעות תיוג מארבעה צבעים, תאורה מובנית מיקרוסקופ (SIM).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

מוניטור האנושי בחזה ובצלעות לבידוד תא הושג מתורמים מושכלת, אשר נתן הסכמה בכתב שלהם כדי להשתמש בדגימות שלהם למחקר על פי הצהרת הלסינקי. הוועדה האתית של האוניברסיטה של רוסטוק אישרה המחקר הציג (רג א מס 2010 23, ממושך בשנת 2015).

1. תא הכנה

הערה: השתמש הפארין נתרן (250 IU/mL מוניטור) כדי למנוע קרישת דם לבדיקה מוניטור.

  1. CD133+ SC בידוד
    1. אופן ההכנה של פתרונות נדרש
      1. להכין תמיסת מלח פוספט buffered (PBS) / חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA) מלאי פתרון (2 מ מ) על ידי ערבוב 996 מיליליטר PBS 1 x 4 מ של EDTA (0.5 M). נמרצות לערבב את הפתרון, filtrate באמצעות מסנן 0.45 מיקרומטר. לאחסן בטמפרטורת החדר (RT).
      2. הכן את המאגר מקינטוש על ידי ערבוב 995 מ של 2 מ מ PBS/EDTA עם 5 g של אלבומין שור (BSA). נמרצות לערבב את הפתרון, filtrate באמצעות מסנן 0.45 מיקרומטר. חנות ב 4 º C.
      3. הכן collagenase B פתרון מניות (40 מ"ג/מ"ל) על ידי דילול 500 מ ג של collagenase B (מתוך Clostridium histolyticum) במ"ל ל- PBS. לערבב את הפתרון נמרצות, להפוך את aliquots של 350 µL ו לאחסן ב-20 ° C.
      4. הכנת deoxyribonuclease (DNAse) אני מדמין פתרון (10 mg/mL) על ידי דילול 100 מ ג DNase אני (מן הלבלב שור) ב- 10 מ"ל ל- PBS. לערבב את הפתרון נמרצות, להפוך את aliquots של 350 µL ו לאחסן ב-20 ° C.
    2. עיכול אנזימטי של מוניטור אנושי
      1. לחמם המדיום לימפוציטים אנושיים כדי RT, להפשיר אנזימים (1 aliquot כל collagenase B ו DNAse לכל 20 מ"ל מוניטור).
      2. לאסוף את מוניטור מזרקים לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל ומערבבים בעדינות. להתעלם כל קרישים קיימים.
        הערה: להעביר µL 200 של מוניטור מדולל לתוך צינור 1.5 mL לניתוח cytometric זרימה עוקבות. לאחסן ב 4 ° C עד השימוש.
      3. להעביר 10 מ"ל מוניטור לתוך צינור חרוטי 50 מ ל, להוסיף 6 מ של EDTA/PBS (2 מ מ), 20 מ של לימפוציטים אנושיים בינוני 175 µL של Collagenase B (40 מ"ג/מ"ל), 175 µL של DNAse אני (10 mg/mL). בעדינות לערבב את הפתרון, תקופת דגירה של 30 דקות ב- RT-מטרף. חזור על המדגם מוניטור הנותרים.
    3. צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות
      1. פריים צינור צנטריפוגה הדרגתי של צפיפות 50 מ על-ידי החלת 15 מ"ל של לימפוציטים אנושיים הפרדת בינוני לתוך צינור 50 מ. צנטריפוגה ב 1,000 x g ל 30 s.
      2. בזהירות שכבה 35 מ של מוניטור מדולל על גבי צפיפות צנטריפוגה הדרגתיות צינור מסנן ואת צנטריפוגה ב 445 x g למשך 35 דקות ב- RT.
        הערה: צנטריפוגה שהגדרות האצת נמוך (3) אין בלם (1).
      3. הסר בזהירות את הצינור מן לצנטריפוגה מבלי לרעוד. בזהירות להתעלם ~ 20 מ"ל מן הפתרון ברור העליון מבלי לגעת השכבה מעונן ישירות מעל המסנן.
      4. בזהירות להעביר את השכבה מעונן (אשר נמצא על המסנן ומכיל תאי תאי (MNCs)) לתוך צינור חרוטי 50 מ ל, להתמלא PBS/EDTA לאמצעי הסופי של 50 מ.
        הערה: לשלב כל MNCs של אחד מוניטור החולה מדגם צינור חדש אחד.
      5. לספור את MNCs על ידי העברת 10 µL של התליה תא 50 מ לתוך צינור 1.5 מ. להוסיף 10 µL של 3% חומצה אצטית עם מתילן כחול. בעדינות לערבב, החל 10 µL לתא ספירה. לחשב את מספר MNCs.
      6. צנטריפוגה ההשעיה MNC ב x 300 גרם במשך 10 דקות לבטל את תגובת שיקוע.
        הערה: במהלך צנטריפוגה, לקרר לצנטריפוגה מ RT עד 4 ° C.
    4. מבחר מגנטי של CD133+ SCs באמצעות חלקיקים של לתוספי ברזל פאראמגנטי מקושרים-נוגדן CD133 אנושי
      הערה: במהלך שלב זה, עבודה על קרח. לאחסן פתרונות עד השימוש ב 4 º C. לאחסן MACS מגנט קבוע ההפרדה עמודות, לסנן ההפרדה טרום ב 4 º C.
      1. בחר את גודל העמודה. עבור < 1.2 x 108 MNCs, השימוש MS עמודות, ועבור > 1.2 x 108 MNCs, להשתמש בעמודות LS (ראה טבלה של חומרים).
      2. להכנה של הבחירה מגנטי עבור מספר הטלפון הכולל8 עונה 1 פרק 10, בזהירות resuspend MNCs µL 300 MACS מאגר (4 ° C). להוסיף 100 µL ה-FcR חסימה ריאגנט (4 ° C) ו חלקיקי לתוספי ברזל פאראמגנטי מקושרים-נוגדן CD133 µL 100 (4 ° C).
      3. בעדינות לערבב התליה תא, תקופת דגירה של 30 דקות ב 4 º C. מנערים בעדינות התליה תא בתקופת דגירה (2 – 3 x).
      4. הוספת 2 מ של מקינטוש מאגר (4 ° C) לפי סה כ8 עונה 1 פרק 10 ש-mncs. בעדינות לערבב את ההשעיה תא צנטריפוגה ב x 300 גר' 10 דקות ב 4 º C.
      5. להגדיר את מחזיק מגנט MACS וצרף מגנט קבוע של מקינטוש. התקן את העמודה MACS, החילו את המסנן הכנה להפרדות צבע עליון.
      6. Equilibrate את הראשונה MACS MS/LS העמודות והסינון הכנה להפרדות צבע עם 0.5 mL (MS) או 3 מ ל (LS) של מקינטוש מאגר (4 ° C).
        הערה: לא תתיר את העמודות MACS להתייבש לאחר equilibration.
      7. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend בגדר שהושג ב 500 µL מאגר מקינטוש (4 ° C) לכל עונה 1 פרק 108 בתא סכום כמות. החל התליה תא לתוך המסנן הכנה להפרדות צבע.
      8. לשטוף את מקינטוש עמודה והפרדה קדם מסנן באמצעות שלוש פעמים, עבור כל כביסה, 0.5 mL (MS) או 3 מ"ל (LS) של מקינטוש מאגר (4 ° C).
        הערה: במהלך הכביסה-הצעד השלישי, התקן עמודה MACS השניה מגנט קבוע מקינטוש, equilibrate העמודה השניה MACS MS/LS עם 0.5 mL (MS) או 3 מ"ל (LS) מקינטוש מאגר (4 ° C).
      9. למחוק את המסנן הכנה להפרדות צבע.
      10. Elute השבר תאים ישירות על העמודה השניה מקינטוש: הוסף 1 מ"ל (MS) או 5 מ"ל (LS) מקינטוש מאגר (4 ° C) אל העמודה הראשונה MACS, הסר את העמודה MACS מגנט קבוע מקינטוש. מיד להעביר את העמודה הראשונה MACS מעל העמודה השניה MACS ודחף התליה תא באמצעות המדור MACS באמצעות הבוכנה שסופקו.
      11. לשטוף את העמודה MACS שלוש פעמים, שימוש עבור כל כביסה 0.5 mL (MS) או 3 מ"ל (LS) מקינטוש מאגר (4 ° C).
      12. Elute השבר תאים מן העמודה על-ידי הוספת 1 מ"ל (MS) או 5 מ"ל (LS) מקינטוש מאגר (4 ° C) אל העמודה השניה MACS הסרת העמודה MACS מגנט קבוע מקינטוש. מיד להעביר את העמודה השניה MACS מעל צינור 1.5 mL (MS) או צינור חרוטי 15מל (LS) ודחף התליה תא באמצעות המדור MACS באמצעות הבוכנה שסופקו.
      13. צנטריפוגה ב x 300 גר' 10 דקות ב 4 º C. בזהירות למחוק את תגובת שיקוע, resuspend בגדר שהושג ב 100 µL מאגר מקינטוש (4 ° C).
      14. לספור את CD133+ תאים: העברת 6 µL של התליה תא לתוך צינור 1.5 מ ל. הוסף µL 6 trypan blue פתרון (0.4%). בעדינות לערבב, החל 10 µL לתא ספירה. לחשב את מספר CD133+ תאים.
      15. לאחסן את CD133+ תאים על הקרח עד זריעה.
  2. אפיון מבודד טרי CD133+ SCs
    הערה: העבודה הבאה צריכה להתבצע בחדר מוגן מפני אור בהיר (העמום תאורה בלבד). לשמור על צינורות, מאגרים, נוגדנים על קרח אלא אם צוין אחרת.
    1. הכנת ה-SCs לניתוח cytometric זרימה
      1. להשתמש בשתי הדגימות כל (µL 10) של מוניטור aliquots דוגמא אחת של טרי מבודד CD133+ SCs (מינימום, עונה 1 פרק 104 תאים) לצורך ניתוח. העבר את התאים לתוך צינור 1.5 מ. הוסף 10 µL של ה-FcR חסימת ריאגנט ' למלא את מאגר מקינטוש (4 ° C) באמצעי אחסון של 33 µL.
      2. הוסף את הנוגדנים הבאים על הצד הפנימי של בהתאמה צינור (ראה טבלה 1): אנטי-CD34-fluorescein isothiocyanate (FITC) (שיבוט: AC136), אנטי-CD133/2-phycoerythrin (PE) (שיבוט: 293C 3), isotype לשלוט בעכבר IgG 2b-PE, anti-CD45-allophycocyanin (APC)-H7 (שיבוט: 2 ד 1), ו- 7-aminoactinomycin (מ). לאחר כל נוגדנים נוספו, לסחוט את הצד נוגדנים של הצינור. בעדינות לערבב את הפתרון (נפח סופי 50 µL), תקופת דגירה של מינימום 10-4 מעלות צלזיוס.
      3. להוסיף 1 מ"ל של מאגר פירוק של תאי הדם האדומים (RBC) x 1 בעדינות לערבב את המתלים, דגירה על קרח דק 10 צנטריפוגה ההשעיה ב x 300 גר' 10 דקות ב 4 º C.
      4. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend בגדר שהושג ב- PBS µL 100 (4 ° C). לאחסן בקירור עד ניתוח תזרים cytometric.
    2. זרימה ניתוח cytometric של CD133+ SCs
      1. כדי לבחון את הכדאיות תא והטוהר של CD133+ SC, להשתמש מותאם הבינלאומי החברה של Hematotherapy שתל הנדסה (ISHAGE) לזרום cytometry המגביל אסטרטגיה41 (ראה תיאור נציג באיור1). השתמש בסדר הבא:
        שלב 1: בחירת מאוכלוסיית תאים (איור 1 א')
        שלב 2: מבחר CD45+ תאים (איור 1B)
        שלב 3: מבחר של קיימא CD45+ תאים (איור 1C)
        שלב 4: מבחר של קיימא CD45+/CD34+ תאים (איור 1D)
        שלב 5: מבחר של קיימא CD45+/CD34+/CD133+ תאים (איור 1E)
        הפעל זרימת cytometer (ראה טבלה של חומרים) על פי הוראות היצרן.
      2. לחשב את הכדאיות תא וטוהר באמצעות המשוואות הבאות:

Equation 1   משוואה 1

Equation 2   משוואה 2

  1. תא תרבות של טרי המבודד CD133+ SCs
    1. Aliquot 100 x ציטוקין האנושי רקומביננטי תוספת 100 µL aliquots ולאחסן ב-20 ° C. הפשרה אחד 100 x aliquot לפני ההכנה בינוני.
    2. להכין את CD133+ SC תרבות בינונית, ללא סרום hematopoietic תא הרחבה בינונית עם תוספת ציטוקין האנושי רקומביננטי (x 1 הסופי) ו- 1% פניצילין/סטרפטומיצין.
    3. זרע 5 x 104 מבודד טרי CD133+ SCs עבור תרביות תאים לתוך צלחת 24-ובכן 500 µL תרבות בינונית. דגירה התאים ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 ו- 20% O2.
      הערה: זרע 5 x 104 טריים מבודד CD133+ SCs כפקד לניתוח cytometric זרימה.

2. הכנת קומפלקסים תרביות תאים

הערה: במהלך שלב זה, שמור את ribonuclease מרחב היצירה במלואה (RNAse)-חינם באמצעות פתרון טיהור RNAse ולהשתמש רק ללא RNAse מתכלים חומר.

  1. הכנת מיר
    הערה: העבודה הבאה צריכה להתבצע בחדר מוגן מפני אור בהיר (העמום תאורה בלבד).
    הערה: עבור הדגימה מיר: שימוש Cyanine 3 צבע הנקרא קודמן מיר ו miR קודמן ללא תווית.
    1. כדי להכין את הפתרון מניות מיר (50 מיקרומטר), לדלל את הסכום הרצוי של מיר באמצעי האחסון המתאים של מים נטולי נוקלאז (למשל, שתדללו nmol 5 של מיר במים µL 100). בעדינות לערבב הפתרון, aliquot את המניה מיר (5 µL), ולאחסן מתחת-20 ° C.
  2. הכנה של פיי
    1. הכינו את פיי בעקבות פרוטוקולים סטנדרטיים, הערה פיי ריכוז מניות31,42 .
  3. הכנת MNP
    1. להכין את MNPs בעקבות פרוטוקולים סטנדרטיים ורשום MNP ריכוז מניות31,42.
  4. הכנת קומפלקסים מיר/פיי
    1. להכין תמיסת גלוקוז 5% על ידי דילול D-(+)-גלוקוז במים נטולי נוקלאז. בעדינות לערבב הפתרון, aliquot את המניה (1.5 מ ל), ולאחסן ב 4 º C.
      הערה: העבודה הבאה צריכה להתבצע בחדר מוגן מפני אור בהיר (העמום תאורה בלבד).
    2. השתמש מיר pmol 20 לכל טוב של בן 24-ובכן צלחת30. לדלל מיר ב- 5% גלוקוז לפתרון ריכוז סופי של מיר pmol 0.25/µL....
    3. לחשב כמות פיי נדרש בהתבסס על כמות מיר (20 pmol, שלב 2.3.1) חנקן אופטימלית (של פיי) כדי פוספט (של מיר) יחס (N/P) מבוסס על ריכוז מניות פיי (שלב 2.2.1; כאן, שימש יחס של 7.5)30. לדלל את פיי ב כמות שווה של 5% גלוקוז פתרון המבוסס על המשוואה:
      Equation 3
      אשר סידור מחדש כדי
      Equation 4    משוואה 3
      איפה נפח פיי µL, [פיי] ב מ מ, N/P (אופטימיזציה עבור פרוטוקול זה) הוא 0.75. 0.12 מהווה גורם המרה ספיציפית מיר.
    4. הוסף את פיי מדולל מראש לתוך מיר מראש מדולל ו vortex ב-30 s.
    5. דגירה של מיר/פיי מורכבים למשך 30 דקות ב- RT.
  5. הכנת מתחמי מיר/פיי/MNP
    הערה: העבודה הבאה צריכה להתבצע בחדר מוגן מפני אור בהיר (העמום תאורה בלבד).
    1. בזמן המקננת מתחמי מיר/פיי, להכין את MNPs sonicating את MNPs עבור 20 דקות ב- 35 קילו-הרץ באמבט מים sonicating-RT כדי להבטיח החלקיקים ההשעיה, לא צבירה.
    2. לחשב את מספר MNPs הנדרשים (ברזל 3 µg/mL) מבוסס על הפתרון מניות MNP (שלב 2.3.1).
    3. הוסף MNPs sonicated לתוך מיר/פיי מתחמי ו vortex על Incubate ס' 30 את מתחמי מיר/פיי/MNP למשך 30 דקות ב- RT.
  6. הכנת מתחמי תקנים עבור תיוג מארבעה צבעים באמצעות SIM
    הערה: השתמש מיר קודמן ללא תווית.
    1. תווית של מיר עם Cyanine 5 צבע באמצעות תיוג מיר Cyanine 5 צבע קיט (ראה טבלה של חומרים) ההוראות של היצרן. למדוד את הריכוז מיר הסופי באמצעות ספקטרופוטומטרים המפורטים של (ראה טבלה של חומרים) בהתאם להגדרה מראש המסופקים על ידי היצרן (חומצת גרעין, RNA-40). Aliquot שמיר (5 µL) ואת החנות ב-80 מעלות צלזיוס מוגן מפני אור.
    2. תווית של פיי עם צבע פלורסצנטיות ירוק בהיר באמצעות תיוג החלבון המתאים קיט (ראה טבלה של חומרים) ההוראות של היצרן. הגדר את הריכוז פיי הסופי באמצעות וזמינותו Ninhydrin (שלב 2.2.1). Aliquot פיי (בכרך מחושב על בסיס משוואה 3) ולאחסן ב 4 ° C מוגן מפני אור.
    3. תווית של MNPs עם צבע rhodamine מצומדת כדי ביוטין באמצעות יחס של 1:1,000 w/w, לצבוע כדי MNP. לערבב את צבען rhodamine ואת MNPs במקביל הכנת היווצרות מורכבות מיר/פיי, דגירה הפתרון למשך 30 דקות בחושך. ישירות השתמש בתווית MNPs.

3. תרביות תאים של CD133+ SCs

הערה: במהלך שלב זה, שמור את ribonuclease מרחב היצירה במלואה (RNAse)-חינם באמצעות פתרון טיהור RNAse ולהשתמש רק ללא RNAse מתכלים חומר
הערה: העבודה הבאה צריכה להתבצע בחדר מוגן מפני אור בהיר (העמום תאורה בלבד).

  1. להוסיף המתחם miRNA/פיי/MNP מוכן dropwise ישירות לתוך הבאר המתאים המכיל את CD133 טרי מבודד+ SCs במדיום תרבות.
  2. מערבבים בעדינות במוזיקת את הצלחת אחורה וקדימה. דגירה את התאים עבור 18 h ב- 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2 ו- 20% O2.

4. ניתוח של מיר תרביות תאים

  1. בחינת יעילות ספיגת מיר, את cytotoxicity של מתחמי תרביות תאים
    הערה: עבור הדגימה מיר: להשתמש Cyanine 3 צבען מתויג קודמן מיר CD133 שאינם transfected והערכת ספיגת+ SCs על השערים שליטה cytometry זרימה.
    הערה: העבודה הבאה צריכה להתבצע בחדר מוגן מפני אור בהיר (העמום תאורה בלבד).
    הערה: לשמור את צינורות, מאגרים, נוגדנים על קרח אלא אם צוין אחרת.
    1. הכן הפתרון מניות paraformaldehyde (PFA, 4%) על ידי דילול 4 g מחברים ב- 100 מ ל PBS וחימום הפתרון 80 מעלות צלזיוס. נמרצות לערבב את הפתרון, התאם את ערך ה-pH 7.3. Aliquot מחברים במניה (1.5 מ"ל) ולאחסן ב-20 ° C.
    2. 18 h לאחר תרביות תאים, לאסוף כל טוב ב- mL 1.5 נפרדים צינור. לשטוף טוב פעם אחת עם µL 500 ל- PBS ולהעביר ההשעייה תא הצינור אותו.
    3. צנטריפוגה-300 גרם x 10 דקות ב 4 º C. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend בגדר שהושג ב 100 µL מאגר MACS 4 ° C.
    4. להוסיף 0.5 µL של צבע תגובתית אמין כדי להבחין בין תאים מתים וחיים, בעדינות לערבב את המתלים, תקופת דגירה של מינימום 10-4 מעלות צלזיוס. להוסיף 1 מ"ל PBS (4 ° C) ו צנטריפוגה ב x 300 גר' 10 דקות ב 4 º C.
    5. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend בגדר שהושג ב- 100 µL PBS, להוסיף µL 33 מחברים (4%), לאחסן בקירור או ב 4 ° C עד ניתוח תזרים cytometric.
    6. לארגן את האסטרטגיה חסימה על פי תיאור נציג באיור2. להפעיל את הדוגמאות על cytometer הזרימה (ראה טבלה של חומרים) על פי הוראות היצרן.
  2. אפיון transfected מיר CD133+ SCs
    הערה: שימוש ללא תווית קודמן מיר, כמו גם שאינם transfected CD133+ SCs לשערים שליטה cytometry זרימה.
    1. לאסוף כל טוב בשפופרת mL 1.5 נפרד ואני צנטריפוגה ב x 300 גר' 10 דקות ב 4 º C.
    2. השתמש את האסטרטגיה חסימה כפי שמתואר בשלב 1.2.
  3. בחינת התפלגות תאיים של מתחמי תרביות תאים על-ידי ה-SIM
    1. להכין את מתחמי, transfect את התאים כפי שמתואר בסעיף 2, סעיף 3.
    2. 18 h לאחר תרביות תאים, לאסוף כל טוב ב- mL 1.5 נפרדים צינור. לשטוף טוב פעם אחת עם µL 500 ל- PBS ולהעביר לשטוף את תוך צינור בהתאמה של הבאר. צנטריפוגה ב x 300 גר' 10 דקות ב 4 º C.
    3. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend בגדר שהושג ב 1 מ"ל של 2% נסיוב שור עוברית (FBS) ב- PBS בעדינות לערבב את המתלים, צנטריפוגה ב x 300 גר' 10 דקות ב 4 º C.
    4. למחוק את תגובת שיקוע, resuspend בגדר שהושג ב 100 µL ל- PBS, והוסף 33 µL מחברים (4%) במשך 20 דקות.
    5. להעביר את המתלים תא לתוך צלחת 24-תרבות חדשה המכילה coverslips זכוכית סטריליים דקה, צנטריפוגה ב x 300 גר' 10 דקות ב 4 º C.
    6. למחוק את תגובת שיקוע והוסף µL 500 ל- PBS. בעדינות לנער את הצלחת וזורקים PBS.
    7. מקם את coverslips מוכן בשקופיות מיקרוסקופיים באמצעות הרכבה מימית בינוני כדי לשמר פלורסצנטיות, לייבש אותם ב RT במשך לפחות שעה.
    8. לרכוש תמונות באמצעות מטרה טבילה 100 X שמן. הגדרות ה-SIM: 405, 488, 561, קווי לייזר nm 633 עירור ו- z-במחסן עם עומק 16 סיביות בזוויות 3, 3 שלבים, עם ממוצע של 4, רשתות בכל שורה לייזר: מיקרומטר 23 – 405, מיקרומטר 34 – 488, 42 מיקרומטר – 561 מיקרומטר 51-633.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

פרוטוקול הציג מתאר ידנית בידוד והעשרה מגנטי של האדם הנגזרות מוניטור CD133+ SCs עם וירוס עוקבות תא עצמאית הנדסה אסטרטגיה, כטכנולוגיה פולשני מניפולציה במבחנה תא, ויוו כלי ניטור.

טכנולוגיה זו שלושה שלבים בידוד היתרי כניסה פרידה של MNCs ויטביע בחזה ובצלעות מתעכל מראש באמצעות צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות. לאחר מכן, CD133+ תא שבר יכול להיות דיסקות מועשר בטכנולוגיה המתאימה בידוד. הדבר מאפשר העשרה של CD133+ SCs עם הכדאיות, טוהר גבוה מ- 80%, אשר יכול להיקבע על ידי cytometry זרימה (איור 1). להלן: רק SC מוצרים אשר תואמות לדרישות שימשו לניסויים נוספים.

שיטת תרביות תאים המתוארים כאן מאפשרת הקדמה יעילים של מיר אלה טריים מבודד CD133 האנושי+ SCs עם ספיגה כ- 80% של קיימא תאים (איור 2)30. בנוסף, ישנם ללא תופעות ציטוטוקסיות משמעותי ניכר 18 h לאחר תרביות תאים לעומת שליטה תאים (איור 2)30. יתר על כן, מספקת משלוח והפצה הרגיל של תרביות תאים מורכבים תרכובות (miR, פיי, MNPs) יכול להיות שנצפו בתוך הציטופלסמה של תאים באמצעות SIM (איור 3).

Figure 1
איור 1: נציג בוליאני gating אסטרטגיה עבור CD133+ SC אפיון. (A-E) תיאור של אסטרטגיה 5-שלב בחירת הערכה קפדנית של הכדאיות תא והטוהר של מבודדים CD133+ SC וכן CD133 (F) isotype שליטה באמצעות המדגם מוניטור ללא טיפול הולם. (א) למעט פסולת מאוכלוסיה שלמה תא בחלקה נקודה קדימה לצד פיזור (FSC/האס), ואחריו רצופים מבחר (B) CD45+ תא אוכלוסייה, CD45 קיימא (C)+ תא אוכלוסייה, (ד) קיימא CD45 חיובי זוגי+/CD34+ תא אוכלוסייה, ו (E) בת קיימא טריפל חיובי CD45+/CD34+/CD133+ תא האוכלוסייה. כתום: CD45+/CD34+/CD133+ תאים מודגשות בתוך כל שלב הבחירה. מקרא: APC-Cy7: anti-CD45, FITC: אנטי-CD34, FSC: ערוץ פיזור קדימה, PE: anti-CD133, האס: לצד פיזור ערוץ, 7-מ: 7-aminoactinomycin. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: נציג gating אסטרטגיה עבור הערכת יעילות ספיגת מיר ו- cytotoxicity של תרביות תאים מורכבים. אסטרטגיות חסימה של (A, B) transfected CD133+ SCs באותה מידה כמו (C, D) ללא-transfected CD133+ SCs עבור הניתוחים של (A, C) Cyanine3 צבען מתויג (יעילות ספיגת קודמן-miRNA אדום: Cy3 קיימא+ תאים) ו- (B, D) ציטוטוקסיות השפעות ההליך תרביות תאים מסומן על ידי צבע תגובתית אמין להבחין בין תאים מתים וחיים (כחול: תאים מתים). מקרא: האס: ערוץ צדדי פיזור, תאים בלבד: ללא transfected CD133+ SCs, miRNA/פיי/MNP: CD133+ SCs transfected עם התווית על-ידי Cy3 מיר אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: תאיים ויזואליזציה של תרביות תאים מורכבים. CD133+ SCs היו transfected עם תלת-צבעי שכותרתו מיר/פיי/MNP מורכבים (מיר: pmol 20, פיי: N/P יחס 7.5, MNP: 3 µg/mL). ויזואליזציה נציג בוצעה 18 h לאחר תרביות תאים באמצעות מיקרוסקופ תאורה מובנית. מיר סומן עם Cyanine5 צבע (אדום), פיי עם פלורסצנטיות ירוק בהיר צבע (ירוק) MNPs עם צבע rhodamine מצומדת כדי ביוטין (צהוב) ו הגרעין היה counterstained עם דאפי (כחול). סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

מדגם ה-FCR חסימה ריאגנט [µL] מאגר מקינטוש [µL] נוגדנים [µL] סה כ [µL]
מספר הדגימה תאים [µL] Isotype CD133-PE CD133-PE CD34-FITC CD45-APC-Cy7 להוסיף
1 מוניטור 10 10 12.5 5 - 5 2.5 5 50
2 מוניטור 10 10 12.5 - 5 5 2.5 5 50
3 CD133+ (1 x 104) 10 12.5 - 5 5 2.5 5 50

טבלה 1: פריסת Pipetting פלואורסנציה CD133 + SCs-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בשנים האחרונות, CD133+ SCs הופיעו כאוכלוסייה תא מבטיח עבור טיפולים מבוססי-SC כפי שמעידים מספר שלב אני II, III בניסויים קליניים43,44,45,46, 47 , 48 , 49 , 50 , 51 , 52 , 53 , 54. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט עבור מתוקננת ידנית טיהור וזרימה cytometric האפיון של תאים אלה מן האדם מוניטור בחזה ובצלעות. ההליך המתואר בידוד מבוסס במקינטוש מייצג אסטרטגיה עדין, מהיר ויעיל כדי להשיג טהור מאוד בר -קיימא hematopoietic SC שבר. תאימות טובה בשילוב עם השפלה מהירה של שיתוף מוזרק MACS. גרגרי משמש לצורך מיון תא הוכח בעבר על ידי55,שלנו קבוצה56.

הליך בידוד פותחה באמצעות מוניטור בחזה ובצלעות האנושי כחומר מקור, לכן, הפרוטוקול כעת מאפשר טיהור של hematopoietic SCs מיועד לשימוש במחקר הלא-קליני. אם CD133+ SCs מבודדים של רקמות אחרות (למשל, מוניטור המתקבל האגן) מספר שלבים של הפרוטוקול כגון צנטריפוגה לעיכול, צפיפות רקמת אנזימטי עשויים לדרוש התאקלמות. עבור יישום קליני תא, הקבוצה שלנו נקבע הליך ייצור באתר GMP-למתאים באמצעות מערכת אוטומטית על מנת לספק את הדרישות הנוספות מטעם קליני צריך57.

הנדסה של SCs לפני היישום שלהם היא אסטרטגיה הרומן כדי להתגבר על מכשולים מסוימים בטיפול SC, כולל שימור תא נמוך של מוות של תאים מסיבית. בפרוטוקול הנוכחי כוללת הוראות לייצור של מערכת תקנים ויראלי ללא רב תכליתיים המבוססת על פיי מסועף מאוגדים MNPs ויישום יעיל שלה לתוך CD133+ SCs30. היישום של מערכת זו מאפשרת שינוי גנטי תא, התא מבוקרת דיסקות הדרכה ומעקב תא לא פולשנית באמצעות MRI או MPI30,31,40,42,58 , 59 , 60.

חשוב, התנאים המתוארים תרביות תאים מוטבו עבור שינוי גנטי ארעית של CD133+ SCs BM-derived30. בעבודות קודמות, מערכת תקנים זו גם יושם בהצלחה עבור משלוח של פלסמיד ה-DNA ומיר כדי40,6031,סוגי תאים. הניסויים הראו כי יעילות תרביות תאים, כמו גם cytotoxicity הם התאים תלויי-סוג. לכן, קומפוזיציות אופטימלית של NAs פיי, MNPs צריכה להיות מוגדרת עבור כל סוג התא.

בשל יעילות גבוהה שלה, פיי הוא אחד פולימרים הנפוץ ביותר עבור נגיפי תא גנטי הנדסה61. אולם,61,יישום קליני62 של פיי הוא מאוד מוגבל עד כה בגלל61,שלה רעילות כללי63. מעניין, הקבוצה שלנו לאחרונה הראה כי MNPs להפחית רעילות פיי נכללת31,מערכת תקנים60. במקביל, רעילות אפשרי של חלקיקי תחמוצת ברזל מבוסס הנגרמת על ידי הייצור של מינים חמצן תגובתי (ROS) הוא תלוי במינון, מספר סוגים של חלקיקים פאראמגנטי יאושרו עבור MRI64,65 . עם זאת, יש לשלם תשומת לב הרעילות של מערכת במבחנה , בתוך vivo.

בסך הכל, הפרוטוקול הוא מורכב למדי, הכולל שלבים קריטיים רבים שצריך להתייחס בזהירות רבה. למטרה זו, יש סימנו נקודות אלה בסעיף פרוטוקול עם הערות. בפרט, אנו רוצים לציין את חשיבות לחלוטין RNAse סביבה ללא והימנעות מכל חשיפה קלה בעת טיפול את צבעי פלורסנט יישומית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים ללא ניגוד אינטרסים.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי משרד החינוך הפדרלי, גרמניה מחקר (FKZ 0312138A, FKZ 316159), את מדינת מקלנבורג-פורפומרן עם הקרנות המבניות של האיחוד האירופי (ESF/IVWM-B34-0030/10 ו- ESF/IVBM-B35-0010/12), את DFG (DA1296/2-1), קרן לב גרמני (F/01/12), את BMBF (VIP + 00240), קרן לח. בנוסף, F.H. ל בערב נתמכים על ידי FORUN תוכנית של רוסטוק המרכז הרפואי האוניברסיטאי ע"ש (889001).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
7-AAD BD Biosciences 559925
Acetic Acid with Methylene Blue Stemcell Technologies 7060 3%
anti-CD133/2-PE (clone: 293C3) Miltenyi Biotec GmbH 130-090-853
anti-CD34-FITC (clone: AC136) Miltenyi Biotec GmbH 130-081-001
anti-CD45-APC-H7 (clone: 2D1) BD Biosciences 560178
rhodamine dye; Atto 565 dye conjugated to biotin ATTO-TEC GmbH AD 565-71
BD FACS LSRII flow cytometer BD Biosciences
BD FACSDiva Software 6.1.2 BD Biosciences
BSA Sigma-Aldrich GmbH A7906
CD133 antibody-linked superparamagnetic iron dextran particles; CD133 MicroBead Kit Miltenyi Biotec GmbH 130-097-049
collagenase B Roche Diagnostics GmbH 11088831001
counting chamber Paul Marienfeld GmbH & Co. KG
Cyanine 3 dye labelled precursor miR; Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control #1 Ambion AM17120
Cyanine 5 dye miR labelling kit; Cy5 dye Label IT miRNA Labeling Kit Mirus Bio MIR 9650
DNAse I Roche Diagnostics GmbH 10104159001 (100 U/mL)
ELYRA PS.1 LSM 780 confocal microscope Carl Zeiss Jena GmbH
FcR Blocking Reagent, human Miltenyi Biotec GmbH 130-059-901
bright green protein labeling kit; Oregon Green 488 Protein Labeling Kit Thermo Fisher Scientific O10241
aqueous mounting medium; Fluoroshield Sigma-Aldrich GmbH F6182
density gradient centrifugation tube; Leukosep Centrifuge Tube Greiner Bio-One 89048-932
MACS magnet holder; MACS MultiStand Miltenyi Biotec GmbH 130-042-303
MACS pre-separation filter Miltenyi Biotec GmbH 130-041-407 30 µm
MACS separation column (MS / LS) Miltenyi Biotec GmbH 130-042-201 / 130-042-401
MACS permanent magnet; MACS Separator Miltenyi Biotec GmbH 130-042-302
Millex-HV PVDF Filter Merck SLHV013SL 0.45 μm
mouse IgG 2b-PE Miltenyi Biotec GmbH 130-092-215
amine reactive dye; Near-IR LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit Thermo Fisher Scientific L10119
human lymphocyte separating medium; Pancoll Pan Biotech GmbH P04-60500 density: 1.077 g/mL
PBS Pan Biotech GmbH P04-53500 without Ca and Mg
PEI Sigma-Aldrich GmbH 408727 branched; 25 kDa
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 100 U/mL, 100 μg/mL
PFA Merck Schuchardt OHG 1040051000
unlabelled precursor miR; Pre-miR miRNA Precursor Negative Control #1 Ambion AM17110
RBC lysis buffer eBioscience 00-4333-57
RNAse decontamination solution; RNaseZap Thermo Fisher Scientific AM9780
human lymphocyte medium; Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium Pan Biotech GmbH P04-16500
recombinant human cytokine supplement; StemSpan CC100 Stemcell Technologies 2690
serum-free haematopoietic cell expansion medium; StemSpan H3000 Stemcell Technologies 9800
Streptavidin MagneSphere Paramagnetic Particles Promega Corporation Z5481
Trypan Blue solution Sigma-Aldrich GmbH T8154 0.4 %
UltraPure EDTA Thermo Fisher Scientific 15575020 0.5 M; pH 8.0
ZEN2011 software Carl Zeiss Jena GmbH
NanoDrop 1000 Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific
Sonorex RK 100 SH sonicating water bath Bandelin electronic Ultrasonic nominal output: 80 W; Ultrasonic frequency: 35 kHz

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Meregalli, M., Farini, A., Belicchi, M., Torrente, Y. CD133(+) cells isolated from various sources and their role in future clinical perspectives. Expert opinion on biological therapy. 10 (11), 1521-1528 (2010).
  2. Lee, S., Yoon, Y. -S. Revisiting cardiovascular regeneration with bone marrow-derived angiogenic and vasculogenic cells. British journal of pharmacology. 169 (2), 290-303 (2013).
  3. Beksac, M., Preffer, F. Is it time to revisit our current hematopoietic progenitor cell quantification methods in the clinic? Bone marrow transplantation. 47 (11), 1391-1396 (2012).
  4. Bongiovanni, D., et al. The CD133+ cell as advanced medicinal product for myocardial and limb ischemia. Stem cells and development. 23 (20), 2403-2421 (2014).
  5. Wang, X., et al. The Clinical Status of Stem Cell Therapy for Ischemic Cardiomyopathy. Stem cells international. 2015, 135023 (2015).
  6. Ma, N., et al. Intramyocardial delivery of human CD133+ cells in a SCID mouse cryoinjury model: Bone marrow vs. cord blood-derived cells. Cardiovascular research. 71 (1), 158-169 (2006).
  7. Rafii, S., Lyden, D. Therapeutic stem and progenitor cell transplantation for organ vascularization and regeneration. Nature medicine. 9 (6), 702-712 (2003).
  8. Wang, D., Gao, G. State-of-the-art human gene therapy: part I. Gene delivery technologies. Discovery medicine. 18 (97), 67-77 (2014).
  9. Sart, S., Ma, T., Li, Y. Preconditioning stem cells for in vivo delivery. BioResearch open access. 3 (4), 137-149 (2014).
  10. Liu, J., et al. Early stem cell engraftment predicts late cardiac functional recovery: preclinical insights from molecular imaging. Circulation. Cardiovascular imaging. 5 (4), 481-490 (2012).
  11. Lang, C., et al. In vivo comparison of the acute retention of stem cell derivatives and fibroblasts after intramyocardial transplantation in the mouse model. European journal of nuclear medicine and molecular imaging. 41 (12), 2325-2336 (2014).
  12. Goussetis, E., et al. Intracoronary infusion of CD133+ and CD133-CD34+ selected autologous bone marrow progenitor cells in patients with chronic ischemic cardiomyopathy: cell isolation, adherence to the infarcted area, and body distribution. Stem cells. 24 (10), Dayton, Ohio. 2279-2283 (2006).
  13. Caveliers, V., et al. In vivo visualization of 111In labeled CD133+ peripheral blood stem cells after intracoronary administration in patients with chronic ischemic heart disease. Q J Nucl Med Mol Imaging. 51 (1), 61-66 (2007).
  14. Terrovitis, J. V., Smith, R. R., Marbán, E. Assessment and optimization of cell engraftment after transplantation into the heart. Circulation research. 106 (3), 479-494 (2010).
  15. Rosado-de-Castro, P. H., et al. Biodistribution of bone marrow mononuclear cells after intra-arterial or intravenous transplantation in subacute stroke patients. Regenerative medicine. 8 (2), 145-155 (2013).
  16. Kang, W. J., Kang, H. -J., Kim, H. -S., Chung, J. -K., Lee, M. C., Lee, D. S. Tissue distribution of 18F-FDG-labeled peripheral hematopoietic stem cells after intracoronary administration in patients with myocardial infarction. Journal of nuclear medicine official publication, Society of Nuclear Medicine. 47 (8), 1295-1301 (2006).
  17. Blocklet, D., et al. Myocardial homing of nonmobilized peripheral-blood CD34+ cells after intracoronary injection. Stem cells. 24 (2), Dayton, Ohio. 333-336 (2006).
  18. Penicka, M., et al. One-day kinetics of myocardial engraftment after intracoronary injection of bone marrow mononuclear cells in patients with acute and chronic myocardial infarction. Heart (British Cardiac Society). 93 (7), 837-841 (2007).
  19. Schächinger, V., et al. Pilot trial on determinants of progenitor cell recruitment to the infarcted human myocardium. Circulation. 118 (14), 1425-1432 (2008).
  20. Dedobbeleer, C., et al. Myocardial homing and coronary endothelial function after autologous blood CD34+ progenitor cells intracoronary injection in the chronic phase of myocardial infarction. Journal of cardiovascular pharmacology. 53 (6), 480-485 (2009).
  21. Musialek, P., et al. Randomized transcoronary delivery of CD34(+) cells with perfusion versus stop-flow method in patients with recent myocardial infarction: Early cardiac retention of (m)Tc-labeled cells activity. Journal of nuclear cardiology official publication of the American Society of Nuclear Cardiology. 18 (1), 104-116 (2011).
  22. Kyrtatos, P. G., et al. Magnetic tagging increases delivery of circulating progenitors in vascular injury. JACC. Cardiovascular interventions. 2 (8), 794-802 (2009).
  23. Vandergriff, A. C., et al. Magnetic targeting of cardiosphere-derived stem cells with ferumoxytol nanoparticles for treating rats with myocardial infarction. Biomaterials. 35 (30), 8528-8539 (2014).
  24. Huang, Z., et al. Magnetic targeting enhances retrograde cell retention in a rat model of myocardial infarction. Stem cell research & therapy. 4 (6), 149 (2013).
  25. Yanai, A., et al. Focused magnetic stem cell targeting to the retina using superparamagnetic iron oxide nanoparticles. Cell transplantation. 21 (6), 1137-1148 (2012).
  26. Arbab, A. S., Jordan, E. K., Wilson, L. B., Yocum, G. T., Lewis, B. K., Frank, J. A. In vivo trafficking and targeted delivery of magnetically labeled stem cells. Human gene therapy. 15 (4), 351-360 (2004).
  27. Cores, J., Caranasos, T. G., Cheng, K. Magnetically Targeted Stem Cell Delivery for Regenerative Medicine. Journal of functional biomaterials. 6 (3), 526-546 (2015).
  28. Cheng, K., et al. Magnetic enhancement of cell retention, engraftment, and functional benefit after intracoronary delivery of cardiac-derived stem cells in a rat model of ischemia/reperfusion. Cell transplant. 21 (6), 1121-1135 (2012).
  29. Li, W., et al. Enhanced thoracic gene delivery by magnetic nanobead-mediated vector. The journal of gene medicine. 10 (8), 897-909 (2008).
  30. Müller, P., et al. Magnet-Bead Based MicroRNA Delivery System to Modify CD133+ Stem Cells. Stem cells international. 2016, 7152761 (2016).
  31. Voronina, N., et al. Non-viral magnetic engineering of endothelial cells with microRNA and plasmid-DNA-An optimized targeting approach. Nanomedicine nanotechnology, biology, and medicine. , (2016).
  32. Noort, W. A., et al. Mesenchymal stromal cells to treat cardiovascular disease: strategies to improve survival and therapeutic results. Panminerva Med. 52 (1), 27-40 (2010).
  33. Jakob, P., Landmesser, U. Role of microRNAs in stem/progenitor cells and cardiovascular repair. Cardiovascular Research. 93 (4), 614-622 (2012).
  34. Sen, C. K. MicroRNAs as new maestro conducting the expanding symphony orchestra of regenerative and reparative medicine. Physiological genomics. 43 (10), 517-520 (2011).
  35. Papapetrou, E. P., Zoumbos, N. C., Athanassiadou, A. Genetic modification of hematopoietic stem cells with nonviral systems: past progress and future prospects. Gene therapy. 12, Suppl 1. S118-S130 (2005).
  36. Chira, S., et al. Progresses towards safe and efficient gene therapy vectors. Oncotarget. 6 (31), 30675-30703 (2015).
  37. Hobel, S., Aigner, A. Polyethylenimines for siRNA and miRNA delivery in vivo. Wiley interdisciplinary reviews. Nanomedicine and nanobiotechnology. 5 (5), 484-501 (2013).
  38. Villate-Beitia, I., Puras, G., Zarate, J., Agirre, M., Ojeda, E., Pedraz, J. L. First Insights into Non-invasive Administration Routes for Non-viral Gene Therapy. Gene Therapy - Principles and Challenges. Hashad, D. , (2015).
  39. Cubillos-Ruiz, J. R., Sempere, L. F., Conejo-Garcia, J. R. Good things come in small packages: Therapeutic anti-tumor immunity induced by microRNA nanoparticles. Oncoimmunology. 1 (6), 968-970 (2012).
  40. Schade, A., et al. Magnetic nanoparticle based nonviral microRNA delivery into freshly isolated CD105(+) hMSCs. Stem Cells Int. 2014, 197154 (2014).
  41. Sutherland, D. R., Anderson, L., Keeney, M., Nayar, R., Chin-Yee, I. The ISHAGE guidelines for CD34+ cell determination by flow cytometry. International society of hematotherapy and graft engineering. Journal of hematotherapy. 5 (3), 213-226 (1996).
  42. Voronina, N., et al. Preparation and in vitro characterization of magnetized mir-modified endothelial cells. Journal of visualized experiments. (123), (2017).
  43. Stamm, C., et al. Intramyocardial delivery of CD133+ bone marrow cells and coronary artery bypass grafting for chronic ischemic heart disease:Safety and efficacy studies. The journal of thoracic and cardiovascular surgery. 133 (3), 717-725 (2007).
  44. King, A., et al. REpeated AutoLogous Infusions of STem cells In Cirrhosis (REALISTIC): A multicentre, phase II, open-label, randomised controlled trial of repeated autologous infusions of granulocyte colony-stimulating factor (GCSF) mobilised CD133+ bone marrow stem cells in patients with cirrhosis. A study protocol for a randomised controlled trial. BMJ open. 5 (3), e007700 (2015).
  45. Martinez, H. R., et al. Stem cell transplantation in amyotrophic lateral sclerosis patients: methodological approach, safety, and feasibility. Cell transplantation. 21 (9), 1899-1907 (2012).
  46. Jimenez-Quevedo, P., et al. Selected CD133(+) progenitor cells to promote angiogenesis in patients with refractory angina: final results of the PROGENITOR randomized trial. Circulation research. 115 (11), 950-960 (2014).
  47. Raval, A. N., et al. Bilateral administration of autologous CD133+ cells in ambulatory patients with refractory critical limb ischemia: lessons learned from a pilot randomized, double-blind, placebo-controlled trial. Cytotherapy. 16 (12), 1720-1732 (2014).
  48. Andreone, P., et al. Reinfusion of highly purified CD133+ bone marrow-derived stem/progenitor cells in patients with end-stage liver disease: A phase I clinical trial. Digestive and liver disease. 47 (12), 1059-1066 (2015).
  49. Arici, V., et al. Autologous immuno magnetically selected CD133+ stem cells in the treatment of no-option critical limb ischemia: clinical and contrast enhanced ultrasound assessed results in eight patients. Journal of translational medicine. 13, 342 (2015).
  50. Zali, A., et al. Intrathecal injection of CD133-positive enriched bone marrow progenitor cells in children with cerebral palsy: feasibility and safety. Cytotherapy. 17 (2), 232-241 (2015).
  51. Al-Zoubi, A., et al. Transplantation of purified autologous leukapheresis-derived CD34+ and CD133+ stem cells for patients with chronic spinal cord injuries: long-term evaluation of safety and efficacy. Cell transplantation. 23, Suppl 1. S25-S34 (2014).
  52. Isidori, A., et al. Positive selection and transplantation of autologous highly purified CD133(+) stem cells in resistant/relapsed chronic lymphocytic leukemia patients results in rapid hematopoietic reconstitution without an adequate leukemic cell purging. Biology of blood and marrow transplantation. 13 (10), 1224-1232 (2007).
  53. Nasseri, B. A., et al. Autologous CD133+ bone marrow cells and bypass grafting for regeneration of ischaemic myocardium: the Cardio133 trial. European heart journal. 35 (19), 1263-1274 (2014).
  54. Steinhoff, G., et al. Cardiac Function Improvement and Bone Marrow Response -: Outcome Analysis of the Randomized PERFECT Phase III Clinical Trial of Intramyocardial CD133(+) Application After Myocardial Infarction. EBioMedicine. 22, 208-224 (2017).
  55. Muller, P., et al. Intramyocardial fate and effect of iron nanoparticles co-injected with MACS(R) purified stem cell products. Biomaterials. 135, 74-84 (2017).
  56. Müller, P., Gaebel, R., Lemcke, H., Steinhoff, G., David, R. Data on the fate of MACS® MicroBeads intramyocardially co-injected with stem cell products. Data in brief. 13, 569-574 (2017).
  57. Skorska, A., et al. GMP-conformant on-site manufacturing of a CD133+ stem cell product for cardiovascular regeneration. Stem cell research & therapy. 8 (1), 33 (2017).
  58. Delyagina, E., Li, W., Ma, N., Steinhoff, G. Magnetic targeting strategies in gene delivery. Nanomedicine (Lond). 6 (9), 1593-1604 (2011).
  59. Schade, A., et al. Innovative strategy for microRNA delivery in human mesenchymal stem cells via magnetic nanoparticles. International journal of molecular sciences. 14 (6), 10710-10726 (2013).
  60. Delyagina, E., et al. Improved transfection in human mesenchymal stem cells: Effective intracellular release of pDNA by magnetic polyplexes. Nanomedicine. 9 (7), London, England. 999-1017 (2014).
  61. Yin, H., Kanasty, R. L., Eltoukhy, A. A., Vegas, A. J., Dorkin, J. R., Anderson, D. G. Non-viral vectors for gene-based therapy. Nature reviews. Genetics. 15 (8), 541-555 (2014).
  62. Chen, J., Guo, Z., Tian, H., Chen, X. Production and clinical development of nanoparticles for gene delivery. Molecular therapy. Methods & clinical development. 3, 16023 (2016).
  63. Juliano, R. L. The delivery of therapeutic oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 44 (14), 6518-6548 (2016).
  64. Soenen, S. J., Rivera-Gil, P., Montenegro, J. -M., Parak, W. J., de Smedt, S. C., Braeckmans, K. Cellular toxicity of inorganic nanoparticles: Common aspects and guidelines for improved nanotoxicity evaluation. Nano today. 6 (5), 446-465 (2011).
  65. Estelrich, J., Sánchez-Martín, M. J., Busquets, M. A. Nanoparticles in magnetic resonance imaging: From simple to dual contrast agents. International journal of nanomedicine. 10, 1727-1741 (2015).

Tags

בביו-הנדסה גיליון 136 תאי גזע CD133 ההנדסה הגנטית תרביות תאים נגיפי microRNA מיקוד מגנטי חלקיקים מגנטיים polyethylenimine
פרוטוקול להעברת MicroRNA לתוך למבוגרים הנגזרות מח עצם Hematopoietic תאי גזע כדי לאפשר הנדסה תא בשילוב עם מיקוד מגנטי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hausburg, F., Müller, P.,… More

Hausburg, F., Müller, P., Voronina, N., Steinhoff, G., David, R. Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting. J. Vis. Exp. (136), e57474, doi:10.3791/57474 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter