Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Protokoll for MicroRNA overføring til voksen Ben margtransplantasjon-avledet blodkreft stamceller aktivere cellen Engineering kombinert med magnetiske målretting

Published: June 18, 2018 doi: 10.3791/57474
Automatic Translation
*1,2, *1,2, *1, 1,2, 1,2
1Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Department of Cardiac Surgery, Rostock University Medical Center, 2Department Life, Light and Matter of the Interdisciplinary Faculty, Rostock University
* These authors contributed equally

Summary

Denne protokollen illustrerer en sikker og effektiv fremgangsmåte for å endre CD133+ blodkreft stamceller. Presentert ikke-viral, magnetiske polyplex-basert tilnærming kan gi grunnlag for optimalisering av terapeutiske stamcelleforskningen effekter så vel som for overvåking administrert celle produktet via magnetisk resonans imaging.

Abstract

Mens CD133+ blodkreft stamceller (SCs) har vist seg for å gi høyt potensial innen regenerativ medisin, deres lav oppbevaring priser etter injeksjon i skadet vev som observerte massiv celle dødelighet føre til svært begrenset terapeutisk effekt. For å overvinne disse begrensningene, forsøkte vi å etablere en ikke-viral basert protokoll egnet cellen engineering før sin administrasjon. Endring av menneskelig CD133+ uttrykke SCs benytter microRNA (miR) lastet magnetiske polyplexes ble behandlet med hensyn til opptak effektivitet og sikkerhet, samt målretting potensialet i cellene. Stole på våre protokoll, kan vi oppnå høy miR opptak priser for 80 – 90%, mens CD133+ stamcelleforskningen egenskaper forbli upåvirket. Videre tilbyr disse endrede cellene muligheten for magnetisk målretting. Vi beskriver her en trygg og svært effektiv fremgangsmåte for endring av CD133+ SCs. Vi forventer denne tilnærmingen å gi en standardteknologi for optimalisering av terapeutiske stamcelleforskningen effekter og overvåking av administrert celle produktet via magnetisk resonans imaging (MRI).

Introduction

CD133+ SCs representerer en heterogen stammen og stamfar celle befolkning med lovende potensial for regenerativ medisin. Deres blodkreft endothelial og myogenic differensiering potensielle1,2,3 gjør CD133+ celler, f.ekså bidra til neovascularization prosesser gjennom differensiering i nylig dannet fartøy og aktivering av pro-angiogenic signalering av paracrine mekanismer4,5,6,7.

Til tross for sitt høye potensial i mer enn 30 godkjente kliniske studier (ClinicalTrails.gov), er terapeutiske utfallet fremdeles under kontroversiell diskusjon4. Faktisk er en klinisk anvendelse av SCs hindret av lav oppbevaring i organ for interesse og massiv første celle død5,8,9. Ekstra prosjektering av CD133+ SCs før transplantasjon kunne hjelpe overvinne disse utfordringene.

En forutsetning for en effektiv cellen terapi ville være reduksjon av massiv første celledød å forbedre engraftment av terapeutiske relevante celler10. Aktuelle studier vist en enorm celle tap av 90-99% i svært perfused organer som hjernen og hjertet under den første 1-2 h, uavhengig av hvilken transplantert cellen eller programmet ruten11,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21. SC merking bruker magnetisk nanopartikler (MNPs) gjør en nyskapende ikke-invasiv strategi til målcellene til området av interesse22,23,24,25,26 og samtidig gir cellen overvåking MRI27 og magnetiske partikler imaging (MPI). Den mest effektive i vivo studier bruk magnetisert celle målretting brukte celle oppbevaring etter lokal administrasjon fremfor celle veiledning etter intravenøs injeksjon23,24,28 . Derfor laget vårt en levering system som består av superparamagnetiske jernoksid nanopartikler29. Med denne teknikken, CD133+ SCs og menneskelige umbilical blodåre endotelceller (HUVECs) kan effektivt rettes, som demonstrert av i vitro forsøk30,31.

En annen hurdle SC terapi er fiendtlig inflammatorisk miljøet av berørte vev etter transplantasjon, som bidrar til den første celle død32. I tillegg til flere pre condition studier var anvendelse av terapeutiske relevante miRs testet33; Det har vært vellykket demonstrert at anti-apoptotisk miRs hemmer apoptose i vitro og forbedre celle engraftment i vivo33. Disse små molekyler, består av 20-25 nukleotider, spiller en avgjørende rolle som posttranscriptional modulatorer av messenger RNAs (mRNAs), og dermed påvirke stamcelleforskningen skjebne og atferd34. Videre eksogene innføring av miRs unngå uønskede stabil integrering i vert genomet34.

Nåværende forsøk for effektiv introduksjon om nukleinsyrer (NAs) i primære SCs er hovedsakelig basert på rekombinant virus8,35. Til tross for høy transfection effektiviteten presenterer rekombinant virus manipulasjon en stor utfordring for en benken til sengen oversettelse, f.eks, ukontrollerbare genuttrykk, virusets, immunogenisitet og insertional mutagenese35 ,36. Derfor er ikke-viral leveringssystemer som polymer-baserte konstruksjoner avgjørende for å utvikle. Blant dem, polyethylenimine (PEI) representerer en gyldig levering kjøretøy tilbyr fordeler for miRs NA kondens å beskytte fra fornedrelse, mobilnettet opptak, og intracellulær utgivelse gjennom endosomal rømme37,38. Videre demonstrert miR-PEI komplekser en høy biocompatibility i kliniske studier39. Derfor levering systemet består av en biotinylated forgrenet 25 kDa PEI bundet til en streptavidin-belagt MNP kjerner30,31,40.

I dette manuskriptet presenterer vi en omfattende protokoll som beskriver (i) manuell isolering av CD133+ SC fra human benmarg (BM) donasjon med en detaljert karakterisering av SC produktet og (ii) en effektiv og skånsom transfection strategi for en magnetisk ikke-viral polymer-baserte leveringssystem for genteknologi av CD133+ SCs benytter miRs. CD133+ SCs er isolert og magnetisk beriket fra menneskelige sternal BM aspirates bruker en overflate antistoff-baserte magnetiske-aktivert celle sortering (Mac) system. Etterpå er celle levedyktigheten samt celle renhet analysert ved hjelp av flowcytometri. Deretter miR/PEI/MNP komplekser er forberedt og CD133+ SCs er transfekterte. 18 h etter hva, opptak effektiviteten og virkningen av transfection på SC markør uttrykk og celle levedyktighet analyseres. Videre utføres evaluering av intracellulær fordelingen av transfection komplekse forbindelser med firefargers merking og strukturert belysning mikroskopi (SIM).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Sternal menneskelige BM for cellen aisolering er Hentet fra informert givere, som ga sitt skriftlige samtykke å bruke sine eksempler for forskning etter erklæring av Helsinki. Den etiske komiteen av universitetet i Rostock har godkjent presentert studien (reg. nr A 2010 23, langvarig i 2015).

1. celle forberedelse

Merk: Bruk heparin natrium (250 IU/mL BM) å hindre koagulering for BM eksamen.

  1. CD133+ SC isolasjon
    1. Utarbeidelse av nødvendige løsninger
      1. Forberede fosfat bufret saltvann (PBS) / ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) lagerløsning (2 mM) ved å blande 996 mL 1 x PBS med 4 mL av EDTA (0,5 M). Kraftig bland løsningen og Filtrer bruke filtere 0,45 µm. Lagre ved romtemperatur (RT).
      2. Klargjør Mac bufferen ved å blande 995 mL av 2 mM PBS/EDTA med 5 g av bovin serum albumin (BSA). Kraftig bland løsningen og Filtrer bruke filtere 0,45 µm. Butikken på 4 ° C.
      3. Klargjør collagenase B lagerløsning (40 mg/mL) ved å fortynne 500 mg av collagenase B (fra Clostridium histolyticum) i 12.5 mL PBS. Kraftig blande løsningen gjøre dele 350 µL og lagre på 20 ° C.
      4. Forberede deoxyribonuclease (DNAse) jeg lager løsning (10 mg/mL) fortynne 100 mg av DNase I (fra storfe bukspyttkjertelen) i 10 mL PBS. Kraftig blande løsningen gjøre dele 350 µL og lagre på 20 ° C.
    2. Enzymatisk fordøyelsen av menneskelig BM
      1. Forvarm menneskelige lymfocytt mediet til RT og tine enzymer (1 aliquot hver collagenase B og DNAse per 20 mL BM).
      2. Samle BM fra sprøyter i en 50 mL konisk rør og bland forsiktig. Forkaste alle eksisterende clots.
        Merk: Overføre 200 µL av ufortynnet BM i en 1,5 mL tube for påfølgende flyt cytometric analyse. Lagre på 4 ° C før bruk.
      3. Overfør 10 mL BM i en ny 50 mL konisk tube, legge 6 mL av PBS/EDTA (2 mM), 20 mL av menneskelig lymfocytt medium, 175 µL Collagenase b (40 mg/mL) og 175 µL DNAse jeg (10 mg/mL). Forsiktig bland løsningen og ruge i 30 min på RT på en shaker. Gjenta for gjenværende BM prøven.
    3. Tetthet gradert sentrifugering
      1. Prime en 50 mL tetthet gradert sentrifugeringsrøret ved å bruke 15 mL av menneskelig lymfocytt skille medium i en 50 mL tube. Sentrifuger 1000 x g for 30 s.
      2. Nøye lag 35 mL utvannet BM på toppen av tetthet gradert sentrifugering tube filter og sentrifuge 445 x g for 35 min på RT.
        Merk: Lav akselerasjon (3) sentrifuger er og ikke brems (1).
      3. Nøye fjerne røret fra sentrifuge uten risting. Forsiktig kaste ~ 20 mL fra øvre klar løsning uten å berøre skyet laget oppå filteret.
      4. Nøye overføre skyet laget (som er rett oppå filteret og inneholder de mononukleære cellene (MNCs)) til en ny 50 mL konisk tube og fylle opp med PBS/EDTA til et endelig antall 50 mL.
        Merk: Kombinere alle MNCs fra ett BM pasienten utvalg i en ny tube.
      5. Telle MNCs overføring 10 µL av 50 mL celle suspensjon til en 1,5 mL tube. Legge til 10 µL av 3% eddiksyre med methylene blåfarge. Forsiktig bland og bruke 10 µL inn en teller kammeret. Beregne antall MNCs.
      6. Sentrifuge MNC suspensjon på 300 x g for 10 min. forkaste nedbryting.
        Merk: Under sentrifugering, avkjølt sentrifuge fra RT til 4 ° C.
    4. Magnetisk utvalg av CD133+ SCs benytter menneskelige CD133 antistoff knyttet superparamagnetiske jern dekstran partikler
      Merk: I dette trinnet, fungere på is. Lager løsninger til bruk på 4 ° C. Lagre Mac permanent magnet, separasjon kolonner og pre separasjon filteret på 4 ° C.
      1. Velg kolonnestørrelsen. For < 1.2 x 108 MNCs, bruk MS kolonner, og for > 1.2 x 108 MNCs, bruke LS kolonner (se Tabell for materiale).
      2. For å forberede magnetiske utvalg for 1 x 108 totalt celle nummer, nøye resuspend MNCs 300 µL Mac buffer (4 ° C). Legg 100 µL FcR blokkerer reagens (4 ° C) og 100 µL CD133 antistoff knyttet superparamagnetiske jern dekstran partikler (4 ° C).
      3. Forsiktig bland celle suspensjon og ruge i 30 min på 4 ° C. Forsiktig risting celle suspensjon under inkubasjonen (2-3 x).
      4. Legg til 2 mL Mac buffer (4 ° C) per 1 x 108 totalt MNCs. Bland forsiktig celle fjæring og sentrifuge på 300 x g for 10 min på 4 ° C.
      5. Konfigurere Mac magnet holderen og fest Mac permanent magnet. Installer kolonnen Mac og bruke pre separasjon filteret på toppen.
      6. Equilibrate første Mac MS/LS kolonne og pre separasjon filter med 0,5 mL (MS) eller 3 mL (LS) MACS buffer (4 ° C).
        Merk: Aldri tillate kolonnene Mac tørke ut etter balanse.
      7. Forkast nedbryting og resuspend fått pellet i 500 µL Mac bufferen (4 ° C) per 1 x 108 totalt-cellen beløpet. Bruke celle suspensjon i pre separasjon-filteret.
      8. Vask Mac kolonne og pre separasjon filteret tre ganger, for hver vask, 0,5 mL (MS) eller 3 mL (LS) MACS buffer (4 ° C).
        Merk: Under det tredje vask-trinnet, installere en andre Mac-kolonnen i Mac permanent magnet og equilibrate andre Mac MS/LS kolonne med 0,5 mL (MS) eller 3 mL (LS) MACS buffer (4 ° C).
      9. Kast før separasjon filteret.
      10. Elute celle brøken direkte på den andre Mac-kolonnen: legge 1 mL (MS) eller 5 mL (LS) MACS buffer (4 ° C) på den første Mac-kolonnen og fjerne kolonnen Macintosh-maskiner fra Mac permanent magnet. Umiddelbart overføre den første Mac kolonnen ovenfor den andre Mac-kolonnen, og trykk celle suspensjon gjennom Mac kolonnen med medfølgende stempelet.
      11. Vask kolonnen Mac tre ganger, bruker for hver vask 0,5 mL (MS) eller 3 mL (LS) MACS buffer (4 ° C).
      12. Elute celle brøken kolonnen ved å legge til 1 mL (MS) eller 5 mL (LS) MACS buffer (4 ° C) på den andre Mac-kolonnen og fjerne kolonnen Mac fra Mac permanent magnet. Umiddelbart overføre den andre Mac-kolonnen ovenfor en 1,5 mL tube (MS) eller 15 mL konisk tube (LS) og presse celle suspensjon gjennom Mac kolonnen med medfølgende stempelet.
      13. Sentrifuger 300 x g i 10 min på 4 ° C. Forsiktig kaste nedbryting og resuspend fått pellet i 100 µL Mac bufferen (4 ° C).
      14. Telle CD133+ celler: overføring 6 µL av cellen suspensjon i en 1,5 mL tube. Legge til 6 µL trypan blå løsning (0,4%). Forsiktig bland og bruke 10 µL inn en teller kammeret. Beregne antall CD133+ celler.
      15. Lagre CD133+ celler på is inntil seeding.
  2. Karakteristikk av fersk isolert CD133+ SCs
    Merk: Følgende arbeid skal utføres i et rom som er beskyttet mot lys (svakt lys). Holde rør, buffere og antistoffer på is ikke annet er angitt.
    1. Utarbeidelse av SCs for flyt cytometric analyse
      1. Bruk to prøvene (hver 10 µL) av BM dele og et utvalg av fersk isolert CD133+ SCs (minimum, 1 x 104 celler) for analyse. Overføre cellene til en 1,5 mL tube. Legg til 10 µL av FcR blokkerer reagens og fylle opp med Mac-buffer (4 ° C) et volum på 33 µL.
      2. Legg til følgende antistoffer på innsiden av de respektive tube (se tabell 1): anti-CD34-fluorescein isothiocyanate (FITC) (klone: AC136), anti-CD133/2-phycoerythrin (PE) (klone: 293C 3), isotype kontrollere musen IgG 2b-PE, anti-CD45-allophycocyanin () APC)-H7 (klone: 2D 1), og 7-aminoactinomycin (AAD). Etter at alle antistoffer er lagt, riste ned antistoffer siden av røret. Forsiktig bland løsningen (siste bindet 50 µL) og ruge i 10 min på 4 ° C.
      3. Legge 1 mL 1 x røde blodlegemer (RBC) lyseringsbuffer, forsiktig blanding suspensjon og ruge på is 10 min. sentrifuge suspensjon på 300 x g for 10 min på 4 ° C.
      4. Forkast nedbryting og resuspend fått pellet i 100 µL PBS (4 ° C). Lagre på is inntil flyt cytometric analyse.
    2. Flow cytometric analyse av CD133+ SCs
      1. Undersøke celle levedyktighet og renhet av CD133+ SC, bruke en tilpasset internasjonale samfunnet av Hematotherapy og pode Engineering (ISHAGE) flyt cytometri gating strategi41 (se representant beskrivelsen i figur 1). Bruk følgende rekkefølge:
        Trinn 1: utvalg av celle befolkningen (figur 1A)
        Trinn 2: utvalg av CD45+ celler (figur 1B)
        Trinn 3: utvalg av levedyktig CD45+ celler (figur 1 c)
        Trinn 4: utvalg av levedyktig CD45+/CD34+ celler (figur 1 d)
        Trinn 5: utvalg av levedyktig CD45+/CD34+/CD133+ celler (figur 1E)
        Kjøre flyt cytometer (se Tabell for materiale) i henhold til produsentens instruksjoner.
      2. Beregne celle levedyktighet og renhet ved hjelp av følgende formler:

Equation 1   Formel 1

Equation 2   Ligning 2

  1. Celle kultur av fersk isolert CD133+ SCs
    1. Aliquot 100 x rekombinant menneskelige cytokin supplement i 100 µL dele og lagre på 20 ° C. Tøvær en 100 x aliquot før middels utarbeidelse.
    2. Forberede CD133+ SC kultur medium, serum-free blodkreft celle ekspansjon medium med rekombinant menneskelige cytokin supplement (siste 1 x) og 1% penicillin/streptomycin.
    3. Frø 5 x 104 fersk isolert CD133+ SCs for hva i en 24-vel plate med 500 µL kultur medium. Inkuber cellene på 37 ° C, 5% CO2 og 20% O2.
      Merk: Frø 5 x 104 fersk isolert CD133+ SCs som en kontroll for flyt cytometric analyse.

2. forberedelse av Transfection komplekser

Merk: I dette trinnet, holde hele arbeidet plass ribonuclease (RNAse)-gratis bruker RNAse dekontaminering løsning og bruke bare RNAse-fritt materiale som forbrukes.

  1. Utarbeidelse av miR
    Merk: Følgende arbeid skal utføres i et rom som er beskyttet mot lys (svakt lys).
    Merk: For miR-prøven: Bruk Cyanine 3 fargestoff merket forløper miR og umerkede forløper miR.
    1. For å forberede miR lager løsningen (50 µM), kan du fortynne den ønskede mengden av miR i riktige mengden nuclease-fritt vann (f.eksfortynne 5 nmol av miR i 100 µL vann). Forsiktig blande løsningen, aliquot miR lager (5 µL), og lagre under 20 ° C.
  2. Utarbeidelse av PEI
    1. Forberede PEI følgende standardprotokoller og Merk PEI lager konsentrasjon31,42 .
  3. Utarbeidelse av MNP
    1. Forberede MNPs etter standardprotokoller og Merk MNP lager konsentrasjon31,42.
  4. Utarbeidelse av miR/PEI komplekser
    1. Klargjør 5% glukose løsning ved å fortynne D-(+)-glukose i nuclease-fritt vann. Forsiktig blande løsningen, aliquot lager (1,5 mL), og lagre på 4 ° C.
      Merk: Følgende arbeid skal utføres i et rom som er beskyttet mot lys (svakt lys).
    2. Bruke 20 pmol miR per godt av en 24-vel plate30. Fortynne miR i 5% glukose løsningen på en siste konsentrasjon av 0,25 pmol miR/µL.
    3. Beregne mengden PEI kreves basert på miR mengde (20 pmol, trinn 2.3.1) og optimal nitrogen (av PEI) til fosfat (av miR) (N/P) forhold basert på PEI lager konsentrasjonen (trinn 2.2.1; her forholdet 7.5 ble brukt)30. Fortynne PEI i en lik mengde 5% glukose løsning basert på formelen:
      Equation 3
      som ordner å
      Equation 4    Formel 3
      hvor PEI er i µL og [PEI] er i mM N/P (optimalisert for denne protokollen) er 0,75. 0,12 er en konverteringsfaktor som er spesifikke for miR.
    4. Legg den pre utvannet PEI i pre utvannet miR og vortex for 30 s.
    5. Inkuber miR/PEI komplisert for 30 min på RT.
  5. Utarbeidelse av miR/PEI/MNP komplekser
    Merk: Følgende arbeid skal utføres i et rom som er beskyttet mot lys (svakt lys).
    1. Mens rugende forberede miR/PEI komplekser, MNPs av sonicating MNPs etter 20 min på 35 kHz i sonicating vannbad på RT å sikre partikler i suspensjon og ikke samles.
    2. Beregne antall nødvendige MNPs (3 µg jern/mL) basert på MNP lager løsningen (trinn 2.3.1).
    3. Legge til de sonicated MNPs i miR/PEI komplekser og vortex for 30 s. Incubate miR/PEI/MNP komplekser i 30 min på RT.
  6. Utarbeidelse av transfection komplekser for firefargers merking med SIM
    Merk: Bruk umerkede forløper miR.
    1. Etiketten miR med Cyanine 5 fargestoff benytter en Cyanine 5 fargestoff miR merking kit (se Tabell for materiale) følg produsentens instruksjoner. Måle siste miR konsentrasjonen bruker det oppførte spektrofotometeret (se Tabell for materiale) i henhold til før innstillingen fra produsenten (nucleic acid, RNA-40). Aliquot miR (5 µL) og butikk på-80 ° C beskyttet mot lyset.
    2. Merke PEI med en lys grønn fluorescens fargestoff med en passende protein merking kit (se Tabell for materiale) følg produsentens instruksjoner. Definere siste PEI konsentrasjonen med Ninhydrin analysen (trinn 2.2.1). Aliquot PEI (beregnet basert på formel 3i volumet) og lagre på 4 ° C beskyttet mot lyset.
    3. Merk MNPs med rhodamine fargestoff konjugert til biotin bruker forholdet 1:1,000 w/w, fargestoff til MNP. Bland rhodamine fargestoffet og MNPs samtidig med utarbeidelse av miR/PEI komplekse dannelse og ruge løsningen for 30 min i mørket. Direkte bruk merket MNPs.

3. hva av CD133+ SCs

Merk: I dette trinnet, holde hele arbeidet plass ribonuclease (RNAse)-gratis bruker RNAse dekontaminering løsning og bruke bare RNAse-fri forbrukes materiale
Merk: Følgende arbeid skal utføres i et rom som er beskyttet mot lys (svakt lys).

  1. Legg forberedt miRNA/PEI/MNP komplekset dropwise direkte inn i passende brønnen som inneholder den ferske isolert CD133+ SCs kultur medium.
  2. Bland forsiktig av rocking platen frem og tilbake. Inkuber celler for 18 h på 37 ° C, 5% CO2 og 20% O2.

4. analyse av miR Transfection

  1. Undersøkelse av miR opptak effektiviteten og cytotoksisitet av transfection komplekser
    Merk: For miR-prøven: Bruk Cyanine 3 fargestoff merket forløper miR for opptak evaluering og ikke-transfekterte CD133+ SCs på flyt cytometri kontroll portene.
    Merk: Følgende arbeid skal utføres i et rom som er beskyttet mot lys (svakt lys).
    Merk: Holde rør, buffere, og antistoffer på is ikke annet er angitt.
    1. Forberede paraformaldehyde lager løsningen (PFA, 4%) ved å fortynne 4 g PFA i 100 mL PBS og oppvarming løsningen på 80 ° C. Kraftig bland løsningen og justere pH verdien til 7.3. Aliquot PFA lager (1,5 mL) og lagre på 20 ° C.
    2. 18 h etter transfection, samle hver brønn i en separat 1,5 mL tube. Vask godt når med 500 µL av PBS og overføre denne cellen suspensjon til samme rør.
    3. Sentrifuger 300 x g i 10 min på 4 ° C. Forkast nedbryting og resuspend fått pellet i 100 µL 4 ° C Mac bufferen.
    4. Legge til 0,5 µL av et Amin reaktive dye skille mellom levende og døde celler, forsiktig blanding suspensjon og ruge i 10 min på 4 ° C. Legge 1 mL PBS (4 ° C) og sentrifuger på 300 x g i 10 min på 4 ° C.
    5. Forkaste nedbryting, resuspend fått pellet i 100 µL PBS, legge til 33 µL PFA (4%) og lagre på isen eller i 4 ° C til flyt cytometric analyse.
    6. Ordne gating strategien etter representant beskrivelsen i figur 2. Kjøre prøver på flyt cytometer (se Tabell for materiale) i henhold til produsentens instruksjoner.
  2. Karakteristikk av miR-transfekterte CD133+ SCs
    Merk: Brukt umerkede forløper miR samt ikke-transfekterte CD133+ SCs for flyt cytometri kontroll portene.
    1. Samle hver bra i en separat 1,5 mL tube og sentrifuge på 300 x g i 10 min på 4 ° C.
    2. Bruk gating strategien som beskrevet i trinn 1.2.
  3. Undersøkelse av intracellulær fordelingen av transfection komplekser av SIM
    1. Forberede komplekser og transfect cellene som beskrevet i del 2 og del 3.
    2. 18 h etter transfection, samle hver brønn i en separat 1,5 mL tube. Vask godt når med 500 µL av PBS og overføre vask i brønnens respektive rør. Sentrifuger 300 x g i 10 min på 4 ° C.
    3. Forkaste nedbryting resuspend fått pellet i 1 mL av 2% fosterets bovin serum (FBS) i PBS, forsiktig blanding suspensjon og sentrifuge på 300 x g i 10 min på 4 ° C.
    4. Forkaste nedbryting, resuspend fått pellet i 100 µL av PBS og legge 33 µL PFA (4%) for 20 min.
    5. Overføre celle suspensjon i en ny 24-kultur plate inneholder sterilt glass coverslips og sentrifuge på 300 x g for 10 min på 4 ° C.
    6. Forkaste nedbryting og legge 500 µL av PBS. Forsiktig riste platen og kast PBS.
    7. Plass den forberedt coverslips på mikroskopisk lysbildene ved hjelp av vandig montering medium å bevare fluorescens og tørk dem på RT minst 1t.
    8. Hente bilder ved hjelp av en 100 X nedsenking oljeobjektiv. SIM innstillinger: 405, 488, 561 og 633 nm laser linjer for eksitasjon og z-stabler med en 16-bits dybde på 3 vinkler, 3 etapper, med gjennomsnittlig 4, rutenett per laser linje: 23 µm-405 34 µm-488, 42 µm-561, 51 µm-633.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Presentert protokollen beskriver en manuell isolasjon og magnetiske anriking av menneskelig BM-avledet CD133+ SCs med en påfølgende virus uavhengig celle engineering strategi, som en ikke-invasiv teknologi i vitro celle manipulasjon og i vivo avlytting verktøyet.

Denne tre-trinns aisolering teknologien tillater en separasjon av MNCs fra det pre-oversikten sternal BM gjennom tetthet gradert sentrifugering. Etterpå, en CD133+ celle brøkdel kan bli magnetisk beriket bruker riktig isolasjon teknologi. Dette tillater en berikelse av CD133+ SCs levedyktighet og renhet høyere enn 80%, noe som kan avgjøres av flowcytometri (figur 1). Heretter, ble bare SC produkter som oppfyller kravene brukt for videre studier.

Hva metoden beskrevet her gjør det en effektive innføring av miR i disse ferske isolert menneskelig CD133+ SCs med et opptak av omtrent 80% av levedyktig celler (figur 2)30. I tillegg finnes det ingen signifikante cytotoksiske effekter tydelig 18t etter transfection sammenlignet kontroll celler (figur 2)30. Videre kan en tilstrekkelig levering og vanlig fordeling av transfection komplekse forbindelser (miR, PEI og MNPs) observeres i cytoplasma av celler med SIM (Figur 3).

Figure 1
Figur 1: Representant boolsk gating strategi for CD133+ SC karakterisering. (A-E) Skildring av en 5-trinns utvalg strategi for en streng vurdering av cellen levedyktighet og renhet av isolerte CD133+ SC og (F) CD133 isotype kontroll med passende ubehandlet BM prøven. (A) unntatt rusk fra intakt celle befolkningen i et forover/side (FSC/SSC) dot spredningsdiagram, etterfulgt av påfølgende utvalg av (B) CD45+ celle befolkningen, (C) levedyktig CD45+ celle befolkningen, (D) levedyktig dobbel positiv CD45+/CD34+ celle befolkningen, og (E) levedyktig trippel positiv CD45+/CD34+/CD133+ celle befolkningen. Orange: CD45+/CD34+/CD133+ celler uthevet i hvert utvalg trinn. Forklaring: APC-Cy7: anti-CD45, FITC: anti-CD34, FSC: fremover Scatter kanal, PE: anti-CD133, SSC: Side Scatter kanal, 7-AAD: 7-aminoactinomycin. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: representant gating strategi for evaluering av miR opptak effektivitet og cytotoksisitet av transfection komplekse. Gating strategier (A, B) transfekterte CD133+ SCs også som (C, D) ikke-transfekterte CD133+ SCs for analyser av (A, C) Cyanine3 fargestoff merket forløper-miRNA opptak effektivitet ( rød: levedyktig Cy3+ celler) og (B, D) cytotoksiske effekter av hva prosedyren preget av et Amin reaktive dye skille mellom levende og døde celler (blå: døde celler). Forklaring: SSC: Side Scatter kanal, celler bare: ikke-transfekterte CD133+ SCs, miRNA/PEI/MNP: CD133+ SCs transfekterte med Cy3-merket miR Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: intracellulær visualisering av hva komplekse. CD133+ SCs ble transfekterte med tre farger merket miR/PEI/MNP komplekse (miR: 20 pmol, PEI: N/P forholdet 7.5, MNP: 3 µg/mL). Representant visualisering ble utført 18t etter hva bruker strukturert belysning mikroskopi. MiR var merket med Cyanine5 farge (rød), PEI med en lys grønn fluorescens farge (grønn), MNPs med rhodamine fargestoff konjugert til biotin (gul) og kjernen var counterstained med DAPI (blå). Skala bar = 5 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

eksempel FCR blokkerer reagens [µL] Mac buffer [µL] antistoffer [µL] Totalt [µL]
nummer prøven celler [µL] CD133-PE isotype CD133-PE CD34-FITC CD45-APC-Cy7 LEGG TIL
1 BM 10 10 12.5 5 - 5 2.5 5 50
2 BM 10 10 12.5 - 5 5 2.5 5 50
3 CD133+ (1 x 104) 10 12.5 - 5 5 2.5 5 50

Tabell 1: pipettering oppsett for karakterisering av CD133 + SCs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De siste årene, CD133+ SCs har dukket opp som en lovende celle befolkningen for SC-basert behandling som dokumentert av flere fase I, II og III kliniske studier43,44,45,46, 47 , 48 , 49 , 50 , 51 , 52 , 53 , 54. Her presenterer vi en detaljert protokoll for standardisert manuell rensing og flyt cytometric karakterisering av disse cellene fra menneskelige sternal BM. Prosedyren beskrevet Mac-baserte isolasjon representerer en lett, rask og effektiv strategi for å få en svært ren og levedyktig blodkreft SC brøkdel. God kompatibilitet kombinert med rask nedbrytning av co injisert Mac MicroBeads brukes til celle sortering har vist tidligere ved vår gruppe55,56.

Denne isolasjon prosedyren ble utviklet ved hjelp av menneskelig sternal BM som kildemateriale, og derfor protokollen for tiden gjør rensing av blodkreft SCs beregnet for bruk i ikke-klinisk forskning. Hvis CD133+ SCs er isolert fra andre vev (f.eks BM fra iliaca bølgetopp) flere trinn av protokollen som enzymatisk vev fordøyelsen og tetthet sentrifugering krever tilpasning. For klinisk celle program, vår gruppe videre etablerte en GMP konform stedets produksjon prosedyre ved hjelp av et automatisk system for å ytterligere krav på vegne av kliniske trenger57.

Utvikling av SCs før deres er en ny strategi å overkomme enkelte i SC terapi, inkludert lav celle oppbevaring og massiv celledød. Gjeldende protokollen består av instruksjoner for produksjon av et virus-fri multifunksjonelle transfection system basert på forgrenet PEI bundet til MNPs og effektiv introduksjonen til CD133+ SCs30. Anvendelse av dette systemet muliggjør genetisk celle endring, magnetisk kontrollert celle veiledning og ikke-invasiv celle sporing via MRI eller MPI30,31,40,42,58 , 59 , 60.

Viktigere, beskrevet hva forholdene er optimalisert for forbigående genmodifisering av CD133+ BM-avledet SCs30. I tidligere verker har hva systemet vært også anvendt for levering av plasmider DNA og miR til andre cellen typer31,40,60. Disse eksperimenter har vist at hva effektivitet samt cytotoksisitet er cellen Typeavhengige. Derfor må optimal komposisjonene til NAs, PEI og MNPs defineres for hver celle.

På grunn av sin høye effektivitet er PEI en av de mest brukte polymerer for ikke-viral genetiske celle engineering61. Klinisk anvendelse61,62 PEI er imidlertid svært begrenset til dags dato på grunn av sin generelle toksisitet61,63. Interessant, vist vår gruppe nylig at MNPs redusere PEI toksisitet da hva systemet31,60. Samtidig, mulige toksisitet av jernoksid basert nanopartikler skyldes produksjon av reaktive oksygen arter (ROS) er doseavhengig og flere typer superparamagnetiske nanopartikler er godkjent for Mr64,65 . Men må oppmerksomhet betales til toksisitet av systemet i vitro og i vivo.

Samlet er protokollen ganske komplisert, som inneholder mange viktige skritt som må håndteres svært forsiktig. For dette formålet, har vi fremhevet disse punktene i delen protokollen med notater. Spesielt ønsker vi å påpeke viktigheten av et helt RNAse-fritt miljø og unngå alle lyseksponering ved håndtering av anvendt fluorescerende fargestoffer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklære noen interessekonflikt.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av Federal Utdannings og forskning Tyskland (FKZ 0312138A og FKZ 316159), til delstaten Mecklenburg-Vorpommern med EU Structural Funds (ESF/IVWM-B34-0030/10 og ESF/IVBM-B35-0010/12) og DFG (DA1296/2-1), den Tyske Heart Foundation (F/01/12), BMBF (VIP + 00240) og fuktig Foundation. I tillegg støtter F.H. og PM av FORUN programmet i Rostock University Medical Centre (889001).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
7-AAD BD Biosciences 559925
Acetic Acid with Methylene Blue Stemcell Technologies 7060 3%
anti-CD133/2-PE (clone: 293C3) Miltenyi Biotec GmbH 130-090-853
anti-CD34-FITC (clone: AC136) Miltenyi Biotec GmbH 130-081-001
anti-CD45-APC-H7 (clone: 2D1) BD Biosciences 560178
rhodamine dye; Atto 565 dye conjugated to biotin ATTO-TEC GmbH AD 565-71
BD FACS LSRII flow cytometer BD Biosciences
BD FACSDiva Software 6.1.2 BD Biosciences
BSA Sigma-Aldrich GmbH A7906
CD133 antibody-linked superparamagnetic iron dextran particles; CD133 MicroBead Kit Miltenyi Biotec GmbH 130-097-049
collagenase B Roche Diagnostics GmbH 11088831001
counting chamber Paul Marienfeld GmbH & Co. KG
Cyanine 3 dye labelled precursor miR; Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control #1 Ambion AM17120
Cyanine 5 dye miR labelling kit; Cy5 dye Label IT miRNA Labeling Kit Mirus Bio MIR 9650
DNAse I Roche Diagnostics GmbH 10104159001 (100 U/mL)
ELYRA PS.1 LSM 780 confocal microscope Carl Zeiss Jena GmbH
FcR Blocking Reagent, human Miltenyi Biotec GmbH 130-059-901
bright green protein labeling kit; Oregon Green 488 Protein Labeling Kit Thermo Fisher Scientific O10241
aqueous mounting medium; Fluoroshield Sigma-Aldrich GmbH F6182
density gradient centrifugation tube; Leukosep Centrifuge Tube Greiner Bio-One 89048-932
MACS magnet holder; MACS MultiStand Miltenyi Biotec GmbH 130-042-303
MACS pre-separation filter Miltenyi Biotec GmbH 130-041-407 30 µm
MACS separation column (MS / LS) Miltenyi Biotec GmbH 130-042-201 / 130-042-401
MACS permanent magnet; MACS Separator Miltenyi Biotec GmbH 130-042-302
Millex-HV PVDF Filter Merck SLHV013SL 0.45 μm
mouse IgG 2b-PE Miltenyi Biotec GmbH 130-092-215
amine reactive dye; Near-IR LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit Thermo Fisher Scientific L10119
human lymphocyte separating medium; Pancoll Pan Biotech GmbH P04-60500 density: 1.077 g/mL
PBS Pan Biotech GmbH P04-53500 without Ca and Mg
PEI Sigma-Aldrich GmbH 408727 branched; 25 kDa
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 100 U/mL, 100 μg/mL
PFA Merck Schuchardt OHG 1040051000
unlabelled precursor miR; Pre-miR miRNA Precursor Negative Control #1 Ambion AM17110
RBC lysis buffer eBioscience 00-4333-57
RNAse decontamination solution; RNaseZap Thermo Fisher Scientific AM9780
human lymphocyte medium; Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium Pan Biotech GmbH P04-16500
recombinant human cytokine supplement; StemSpan CC100 Stemcell Technologies 2690
serum-free haematopoietic cell expansion medium; StemSpan H3000 Stemcell Technologies 9800
Streptavidin MagneSphere Paramagnetic Particles Promega Corporation Z5481
Trypan Blue solution Sigma-Aldrich GmbH T8154 0.4 %
UltraPure EDTA Thermo Fisher Scientific 15575020 0.5 M; pH 8.0
ZEN2011 software Carl Zeiss Jena GmbH
NanoDrop 1000 Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific
Sonorex RK 100 SH sonicating water bath Bandelin electronic Ultrasonic nominal output: 80 W; Ultrasonic frequency: 35 kHz

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Meregalli, M., Farini, A., Belicchi, M., Torrente, Y. CD133(+) cells isolated from various sources and their role in future clinical perspectives. Expert opinion on biological therapy. 10 (11), 1521-1528 (2010).
  2. Lee, S., Yoon, Y. -S. Revisiting cardiovascular regeneration with bone marrow-derived angiogenic and vasculogenic cells. British journal of pharmacology. 169 (2), 290-303 (2013).
  3. Beksac, M., Preffer, F. Is it time to revisit our current hematopoietic progenitor cell quantification methods in the clinic? Bone marrow transplantation. 47 (11), 1391-1396 (2012).
  4. Bongiovanni, D., et al. The CD133+ cell as advanced medicinal product for myocardial and limb ischemia. Stem cells and development. 23 (20), 2403-2421 (2014).
  5. Wang, X., et al. The Clinical Status of Stem Cell Therapy for Ischemic Cardiomyopathy. Stem cells international. 2015, 135023 (2015).
  6. Ma, N., et al. Intramyocardial delivery of human CD133+ cells in a SCID mouse cryoinjury model: Bone marrow vs. cord blood-derived cells. Cardiovascular research. 71 (1), 158-169 (2006).
  7. Rafii, S., Lyden, D. Therapeutic stem and progenitor cell transplantation for organ vascularization and regeneration. Nature medicine. 9 (6), 702-712 (2003).
  8. Wang, D., Gao, G. State-of-the-art human gene therapy: part I. Gene delivery technologies. Discovery medicine. 18 (97), 67-77 (2014).
  9. Sart, S., Ma, T., Li, Y. Preconditioning stem cells for in vivo delivery. BioResearch open access. 3 (4), 137-149 (2014).
  10. Liu, J., et al. Early stem cell engraftment predicts late cardiac functional recovery: preclinical insights from molecular imaging. Circulation. Cardiovascular imaging. 5 (4), 481-490 (2012).
  11. Lang, C., et al. In vivo comparison of the acute retention of stem cell derivatives and fibroblasts after intramyocardial transplantation in the mouse model. European journal of nuclear medicine and molecular imaging. 41 (12), 2325-2336 (2014).
  12. Goussetis, E., et al. Intracoronary infusion of CD133+ and CD133-CD34+ selected autologous bone marrow progenitor cells in patients with chronic ischemic cardiomyopathy: cell isolation, adherence to the infarcted area, and body distribution. Stem cells. 24 (10), Dayton, Ohio. 2279-2283 (2006).
  13. Caveliers, V., et al. In vivo visualization of 111In labeled CD133+ peripheral blood stem cells after intracoronary administration in patients with chronic ischemic heart disease. Q J Nucl Med Mol Imaging. 51 (1), 61-66 (2007).
  14. Terrovitis, J. V., Smith, R. R., Marbán, E. Assessment and optimization of cell engraftment after transplantation into the heart. Circulation research. 106 (3), 479-494 (2010).
  15. Rosado-de-Castro, P. H., et al. Biodistribution of bone marrow mononuclear cells after intra-arterial or intravenous transplantation in subacute stroke patients. Regenerative medicine. 8 (2), 145-155 (2013).
  16. Kang, W. J., Kang, H. -J., Kim, H. -S., Chung, J. -K., Lee, M. C., Lee, D. S. Tissue distribution of 18F-FDG-labeled peripheral hematopoietic stem cells after intracoronary administration in patients with myocardial infarction. Journal of nuclear medicine official publication, Society of Nuclear Medicine. 47 (8), 1295-1301 (2006).
  17. Blocklet, D., et al. Myocardial homing of nonmobilized peripheral-blood CD34+ cells after intracoronary injection. Stem cells. 24 (2), Dayton, Ohio. 333-336 (2006).
  18. Penicka, M., et al. One-day kinetics of myocardial engraftment after intracoronary injection of bone marrow mononuclear cells in patients with acute and chronic myocardial infarction. Heart (British Cardiac Society). 93 (7), 837-841 (2007).
  19. Schächinger, V., et al. Pilot trial on determinants of progenitor cell recruitment to the infarcted human myocardium. Circulation. 118 (14), 1425-1432 (2008).
  20. Dedobbeleer, C., et al. Myocardial homing and coronary endothelial function after autologous blood CD34+ progenitor cells intracoronary injection in the chronic phase of myocardial infarction. Journal of cardiovascular pharmacology. 53 (6), 480-485 (2009).
  21. Musialek, P., et al. Randomized transcoronary delivery of CD34(+) cells with perfusion versus stop-flow method in patients with recent myocardial infarction: Early cardiac retention of (m)Tc-labeled cells activity. Journal of nuclear cardiology official publication of the American Society of Nuclear Cardiology. 18 (1), 104-116 (2011).
  22. Kyrtatos, P. G., et al. Magnetic tagging increases delivery of circulating progenitors in vascular injury. JACC. Cardiovascular interventions. 2 (8), 794-802 (2009).
  23. Vandergriff, A. C., et al. Magnetic targeting of cardiosphere-derived stem cells with ferumoxytol nanoparticles for treating rats with myocardial infarction. Biomaterials. 35 (30), 8528-8539 (2014).
  24. Huang, Z., et al. Magnetic targeting enhances retrograde cell retention in a rat model of myocardial infarction. Stem cell research & therapy. 4 (6), 149 (2013).
  25. Yanai, A., et al. Focused magnetic stem cell targeting to the retina using superparamagnetic iron oxide nanoparticles. Cell transplantation. 21 (6), 1137-1148 (2012).
  26. Arbab, A. S., Jordan, E. K., Wilson, L. B., Yocum, G. T., Lewis, B. K., Frank, J. A. In vivo trafficking and targeted delivery of magnetically labeled stem cells. Human gene therapy. 15 (4), 351-360 (2004).
  27. Cores, J., Caranasos, T. G., Cheng, K. Magnetically Targeted Stem Cell Delivery for Regenerative Medicine. Journal of functional biomaterials. 6 (3), 526-546 (2015).
  28. Cheng, K., et al. Magnetic enhancement of cell retention, engraftment, and functional benefit after intracoronary delivery of cardiac-derived stem cells in a rat model of ischemia/reperfusion. Cell transplant. 21 (6), 1121-1135 (2012).
  29. Li, W., et al. Enhanced thoracic gene delivery by magnetic nanobead-mediated vector. The journal of gene medicine. 10 (8), 897-909 (2008).
  30. Müller, P., et al. Magnet-Bead Based MicroRNA Delivery System to Modify CD133+ Stem Cells. Stem cells international. 2016, 7152761 (2016).
  31. Voronina, N., et al. Non-viral magnetic engineering of endothelial cells with microRNA and plasmid-DNA-An optimized targeting approach. Nanomedicine nanotechnology, biology, and medicine. , (2016).
  32. Noort, W. A., et al. Mesenchymal stromal cells to treat cardiovascular disease: strategies to improve survival and therapeutic results. Panminerva Med. 52 (1), 27-40 (2010).
  33. Jakob, P., Landmesser, U. Role of microRNAs in stem/progenitor cells and cardiovascular repair. Cardiovascular Research. 93 (4), 614-622 (2012).
  34. Sen, C. K. MicroRNAs as new maestro conducting the expanding symphony orchestra of regenerative and reparative medicine. Physiological genomics. 43 (10), 517-520 (2011).
  35. Papapetrou, E. P., Zoumbos, N. C., Athanassiadou, A. Genetic modification of hematopoietic stem cells with nonviral systems: past progress and future prospects. Gene therapy. 12, Suppl 1. S118-S130 (2005).
  36. Chira, S., et al. Progresses towards safe and efficient gene therapy vectors. Oncotarget. 6 (31), 30675-30703 (2015).
  37. Hobel, S., Aigner, A. Polyethylenimines for siRNA and miRNA delivery in vivo. Wiley interdisciplinary reviews. Nanomedicine and nanobiotechnology. 5 (5), 484-501 (2013).
  38. Villate-Beitia, I., Puras, G., Zarate, J., Agirre, M., Ojeda, E., Pedraz, J. L. First Insights into Non-invasive Administration Routes for Non-viral Gene Therapy. Gene Therapy - Principles and Challenges. Hashad, D. , (2015).
  39. Cubillos-Ruiz, J. R., Sempere, L. F., Conejo-Garcia, J. R. Good things come in small packages: Therapeutic anti-tumor immunity induced by microRNA nanoparticles. Oncoimmunology. 1 (6), 968-970 (2012).
  40. Schade, A., et al. Magnetic nanoparticle based nonviral microRNA delivery into freshly isolated CD105(+) hMSCs. Stem Cells Int. 2014, 197154 (2014).
  41. Sutherland, D. R., Anderson, L., Keeney, M., Nayar, R., Chin-Yee, I. The ISHAGE guidelines for CD34+ cell determination by flow cytometry. International society of hematotherapy and graft engineering. Journal of hematotherapy. 5 (3), 213-226 (1996).
  42. Voronina, N., et al. Preparation and in vitro characterization of magnetized mir-modified endothelial cells. Journal of visualized experiments. (123), (2017).
  43. Stamm, C., et al. Intramyocardial delivery of CD133+ bone marrow cells and coronary artery bypass grafting for chronic ischemic heart disease:Safety and efficacy studies. The journal of thoracic and cardiovascular surgery. 133 (3), 717-725 (2007).
  44. King, A., et al. REpeated AutoLogous Infusions of STem cells In Cirrhosis (REALISTIC): A multicentre, phase II, open-label, randomised controlled trial of repeated autologous infusions of granulocyte colony-stimulating factor (GCSF) mobilised CD133+ bone marrow stem cells in patients with cirrhosis. A study protocol for a randomised controlled trial. BMJ open. 5 (3), e007700 (2015).
  45. Martinez, H. R., et al. Stem cell transplantation in amyotrophic lateral sclerosis patients: methodological approach, safety, and feasibility. Cell transplantation. 21 (9), 1899-1907 (2012).
  46. Jimenez-Quevedo, P., et al. Selected CD133(+) progenitor cells to promote angiogenesis in patients with refractory angina: final results of the PROGENITOR randomized trial. Circulation research. 115 (11), 950-960 (2014).
  47. Raval, A. N., et al. Bilateral administration of autologous CD133+ cells in ambulatory patients with refractory critical limb ischemia: lessons learned from a pilot randomized, double-blind, placebo-controlled trial. Cytotherapy. 16 (12), 1720-1732 (2014).
  48. Andreone, P., et al. Reinfusion of highly purified CD133+ bone marrow-derived stem/progenitor cells in patients with end-stage liver disease: A phase I clinical trial. Digestive and liver disease. 47 (12), 1059-1066 (2015).
  49. Arici, V., et al. Autologous immuno magnetically selected CD133+ stem cells in the treatment of no-option critical limb ischemia: clinical and contrast enhanced ultrasound assessed results in eight patients. Journal of translational medicine. 13, 342 (2015).
  50. Zali, A., et al. Intrathecal injection of CD133-positive enriched bone marrow progenitor cells in children with cerebral palsy: feasibility and safety. Cytotherapy. 17 (2), 232-241 (2015).
  51. Al-Zoubi, A., et al. Transplantation of purified autologous leukapheresis-derived CD34+ and CD133+ stem cells for patients with chronic spinal cord injuries: long-term evaluation of safety and efficacy. Cell transplantation. 23, Suppl 1. S25-S34 (2014).
  52. Isidori, A., et al. Positive selection and transplantation of autologous highly purified CD133(+) stem cells in resistant/relapsed chronic lymphocytic leukemia patients results in rapid hematopoietic reconstitution without an adequate leukemic cell purging. Biology of blood and marrow transplantation. 13 (10), 1224-1232 (2007).
  53. Nasseri, B. A., et al. Autologous CD133+ bone marrow cells and bypass grafting for regeneration of ischaemic myocardium: the Cardio133 trial. European heart journal. 35 (19), 1263-1274 (2014).
  54. Steinhoff, G., et al. Cardiac Function Improvement and Bone Marrow Response -: Outcome Analysis of the Randomized PERFECT Phase III Clinical Trial of Intramyocardial CD133(+) Application After Myocardial Infarction. EBioMedicine. 22, 208-224 (2017).
  55. Muller, P., et al. Intramyocardial fate and effect of iron nanoparticles co-injected with MACS(R) purified stem cell products. Biomaterials. 135, 74-84 (2017).
  56. Müller, P., Gaebel, R., Lemcke, H., Steinhoff, G., David, R. Data on the fate of MACS® MicroBeads intramyocardially co-injected with stem cell products. Data in brief. 13, 569-574 (2017).
  57. Skorska, A., et al. GMP-conformant on-site manufacturing of a CD133+ stem cell product for cardiovascular regeneration. Stem cell research & therapy. 8 (1), 33 (2017).
  58. Delyagina, E., Li, W., Ma, N., Steinhoff, G. Magnetic targeting strategies in gene delivery. Nanomedicine (Lond). 6 (9), 1593-1604 (2011).
  59. Schade, A., et al. Innovative strategy for microRNA delivery in human mesenchymal stem cells via magnetic nanoparticles. International journal of molecular sciences. 14 (6), 10710-10726 (2013).
  60. Delyagina, E., et al. Improved transfection in human mesenchymal stem cells: Effective intracellular release of pDNA by magnetic polyplexes. Nanomedicine. 9 (7), London, England. 999-1017 (2014).
  61. Yin, H., Kanasty, R. L., Eltoukhy, A. A., Vegas, A. J., Dorkin, J. R., Anderson, D. G. Non-viral vectors for gene-based therapy. Nature reviews. Genetics. 15 (8), 541-555 (2014).
  62. Chen, J., Guo, Z., Tian, H., Chen, X. Production and clinical development of nanoparticles for gene delivery. Molecular therapy. Methods & clinical development. 3, 16023 (2016).
  63. Juliano, R. L. The delivery of therapeutic oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 44 (14), 6518-6548 (2016).
  64. Soenen, S. J., Rivera-Gil, P., Montenegro, J. -M., Parak, W. J., de Smedt, S. C., Braeckmans, K. Cellular toxicity of inorganic nanoparticles: Common aspects and guidelines for improved nanotoxicity evaluation. Nano today. 6 (5), 446-465 (2011).
  65. Estelrich, J., Sánchez-Martín, M. J., Busquets, M. A. Nanoparticles in magnetic resonance imaging: From simple to dual contrast agents. International journal of nanomedicine. 10, 1727-1741 (2015).

Tags

Bioteknologi problemet 136 Stamcelle CD133 genetisk modifisering ikke-viral transfection microRNA magnetiske målretting magnetiske nanopartikler polyethylenimine
Protokoll for MicroRNA overføring til voksen Ben margtransplantasjon-avledet blodkreft stamceller aktivere cellen Engineering kombinert med magnetiske målretting
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hausburg, F., Müller, P.,… More

Hausburg, F., Müller, P., Voronina, N., Steinhoff, G., David, R. Protocol for MicroRNA Transfer into Adult Bone Marrow-derived Hematopoietic Stem Cells to Enable Cell Engineering Combined with Magnetic Targeting. J. Vis. Exp. (136), e57474, doi:10.3791/57474 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter