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Bioengineering

Protocolo para transferência de MicroRNA na medula óssea-derivado hematopoiéticas células-tronco adultas para habilitar celular engenharia combinada com alvo magnético

Published: June 18, 2018 doi: 10.3791/57474
Automatic Translation
*1,2, *1,2, *1, 1,2, 1,2
1Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Department of Cardiac Surgery, Rostock University Medical Center, 2Department Life, Light and Matter of the Interdisciplinary Faculty, Rostock University
* These authors contributed equally

Summary

Este protocolo ilustra um procedimento seguro e eficiente para modificar CD133+ células-tronco hematopoiéticas. A apresentado não-virais, magnética polyplex abordagem pode fornecer uma base para a otimização dos efeitos terapêuticos células-tronco, bem como acompanhamento do produto celular administrado via ressonância magnética.

Abstract

Enquanto CD133+ células-tronco hematopoiéticas (SCs) tem sido comprovadas para fornecer alto potencial no campo da medicina regenerativa, suas taxas de retenção baixa após a injeção em tecidos feridos, bem como as taxas de mortalidade observadas células maciça levam a muito restrito de efeitos terapêuticos. Para superar essas limitações, nós procurou estabelecer um protocolo baseado em não-viral para engenharia celular adequada antes da sua administração. A modificação de CD133 humana+ expressar SCs usando os polyplexes magnético microRNA (miR) carregado foi abordada em relação a eficiência de absorção e de segurança, bem como o alvo potencial das células. Confiando em nosso protocolo, podemos conseguir taxas de absorção alta miR de 80-90%, enquanto o CD133+ Propriedades de células-tronco permanecem inalteradas. Além disso, essas células modificadas oferecem a opção de segmentação magnético. Descrevemos aqui um procedimento seguro e altamente eficiente para a modificação de CD133+ SCs. Esperamos que esta abordagem para fornecer uma tecnologia padrão para otimização dos efeitos terapêuticos de células estaminais e para acompanhamento do produto celular administrado através de ressonância magnética (MRI).

Introduction

CD133+ SCs representam uma população de célula de tronco e progenitoras heterogénea com promissor potencial para a medicina regenerativa. Sua diferenciação hematopoiéticas, endoteliais e miogênico potencial1,2,3 permite o CD133+ células, por exemplo, contribuir para processos de neovascularização através da modulação em recém formando vasos e ativação de pro-angiogênico sinalização parácrina mecanismos4,5,6,7.

Apesar de seu alto potencial demonstrado em ensaios clínicos aprovados mais de 30 (ClinicalTrails.gov), seu resultado terapêutico é ainda sob polêmica discussão4. Na verdade, uma aplicação clínica de SCs é dificultada pela baixa retenção no órgão de interesse e enorme pilha inicial morte5,8,9. Produção adicional de CD133+ transplante prévio de SCs ajudasse a superar esses desafios.

Um pré-requisito para uma terapia celular eficiente seria a redução da morte maciça de pilha inicial para melhorar a enxertia de células relevantes terapêutico10. Estudos atuais demonstraram uma perda imensa pilha de 90 – 99% em órgãos altamente perfundidos, como o cérebro e o coração durante as primeiras horas de 1 – 2, independente do tipo de células transplantadas ou aplicativo rota11,12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21. SC rotulagem usando nanopartículas magnéticas (MNPs) permite uma estratégia inovadora de não-invasivo para células-alvo para o site de interesse22,23,24,25,26 e simultaneamente permite que a célula de monitoramento usando MRI27 e partícula magnética (MPI) de imagem. O mais eficiente na vivo estudos aplicando magnetizada célula alvo de retenção célula usada após a administração local, em detrimento da orientação celular após injeção intravenosa23,24,28 . Portanto, o nosso grupo projetado um sistema de entrega consiste de nanopartículas de óxido de ferro superparamagnético29. Com esta técnica, CD133+ SCs e células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) com eficiência poderiam ser alvo, como demonstrado em vitro tentativas de30,31.

Um outro obstáculo para terapias de SC é o ambiente hostil e inflamatório do tecido afetado após o transplante, o que contribui para a morte de pilha inicial32. Além de vários estudos de pré-condicionamento, a aplicação de terapêuticas miRs relevantes foi testado33; foi com sucesso demonstrado que anti-apoptotic miRs inibem a apoptose em vitro e realçam a enxertia de celular na vivo33. Estas pequenas moléculas, compostas por 20-25 nucleotides, desempenham um papel crucial como moduladores posttranscriptional de RNA mensageiro (mRNAs) e, portanto, afetam células estaminais destino e comportamento34. Além disso, a introdução exógena de miRs evitar a integração estável indesejada para o anfitrião do genoma34.

Atuais tentativas para introdução eficiente de ácidos nucleicos (NAs) em SCs primárias baseiam-se principalmente a vírus recombinante8,35. Apesar da eficiência elevada do transfection, manipulação de vírus recombinante apresenta um grande obstáculo para uma tradução de banco-de-cabeceira, por exemplo, expressão gênica incontrolável, patogenicidade, imunogenicidade e mutagênese insercional35 ,36. Portanto, sistemas de entrega não-virais como construções baseadas em polímero são fundamentais para desenvolver. Entre esses, o polyethylenimine (PEI) representa um veículo de entrega válido, oferecendo benefícios para miRs como condensação de ND para proteger da degradação, absorção celular, e liberação intracelular através de CDDP escapar37,38. Além disso, complexos de miR-PEI demonstraram uma alta biocompatibilidade em ensaios clínicos39. Portanto, nosso sistema de entrega consiste de um biotinilado ramificada 25 kDa PEI acoplado a um streptavidin-revestido MNP-núcleo30,31,40.

Neste manuscrito, apresentamos um protocolo abrangente descrevendo (i) o isolamento manual de CD133+ SC de doação de medula óssea humana (BM) com uma caracterização detalhada do produto SC e (ii) uma estratégia de transfeccao eficiente e suave de um sistema baseado em polímero magneticamente não-virais entrega por engenharia genética de CD133+ SCs usando miRs. CD133+ SCs são isoladas e magneticamente enriquecido de humanos aspirados BM esternais, usando uma superfície baseado em anticorpos magnético-ativado da pilha classificação sistema (MACS). Depois disso, a viabilidade celular, bem como a pureza de célula é analisada usando citometria de fluxo. Posteriormente, miR/PEI/MNP complexos são preparados e CD133+ SCs são transfectadas. 18 h após a transfeccao, a eficiência de absorção e o impacto do transfection na viabilidade de expressão e célula de marcador de SC são analisados. Além disso, avaliação da distribuição dos compostos complexos transfeccao intracelular é executada usando rotulagem quatro cores e iluminação estruturada microscopia (SIM).

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Protocol

Esternal BM humana para isolamento de célula foi obtido de doadores informados, que deu o seu consentimento por escrito para usar suas amostras para pesquisa de acordo com a declaração de Helsinque. O Comité de ética da Universidade de Rostock aprovou o estudo apresentado (reg. n. º A 23 2010, prolongada em 2015).

1. preparação da pilha

Nota: Use heparina de sódio (250 UI/mL BM) para impedir a coagulação para exame de BM.

  1. CD133+ SC isolamento
    1. Preparação das soluções necessárias
      1. Preparar o soro de tampão fosfato (PBS) / ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) estoque solução (2mm) misturando 996 mL de 1X PBS com 4 mL de EDTA (0,5 M). Vigorosamente, misturar a solução e filtrar usando um filtro de 0,45 µm. Armazenar em temperatura ambiente (RT).
      2. Prepare o buffer de MACS misturando 995 mL de PBS/EDTA de 2 mM com 5 g de albumina de soro bovino (BSA). Vigorosamente, misturar a solução e filtrar usando um filtro de 0,45 µm. Loja a 4 ° C.
      3. Prepare solução colagenase B (40mg/mL), diluir 500 mg de colagenase B (do Clostridium histolyticum) em 12,5 mL de PBS. Misturar a solução vigorosamente, alíquotas de 350 µ l de fazer e armazenar a-20 ° C.
      4. Preparar a desoxirribonuclease (DNAse) armazeno (10 mg/mL) de solução diluindo-se 100 mg de DNase I (a partir de pâncreas bovino) em 10 mL de PBS. Misturar a solução vigorosamente, alíquotas de 350 µ l de fazer e armazenar a-20 ° C.
    2. Digestão enzimática de BM humana
      1. Pré-aquecer o meio de linfócitos humanos para RT e descongelar enzimas (1 alíquota cada de colagenase B e DNAse por 20 mL BM).
      2. Coletar o BM de seringas em um tubo cónico de 50 mL e misture delicadamente. Descarte qualquer coágulos existentes.
        Nota: Transferi 200 µ l de BM não diluído em um tubo de 1,5 mL para análise de subsequentes fluxo cytometric. Armazenar a 4 ° C até o uso.
      3. Transferir 10 mL BM para um novo tubo cónico de 50 mL, adicionar 6 mL de PBS/EDTA (2 mM), 20 mL de meio de linfócitos humanos, 175 µ l de colagenase B (40mg/mL) e 175 µ l de DNAse eu (10mg/mL). Delicadamente, misturar a solução e incube por 30 min em RT em uma coqueteleira. Repita para a amostra restante do BM.
    3. Centrifugação de gradiente de densidade
      1. Primeiro um tubo de centrifugação gradiente de densidade de 50 mL, aplicando-se 15 mL de linfócitos humanos, separando médio em um tubo de 50 mL. Centrifugar a 1.000 x g por 30 s.
      2. Cuidadosamente, camada 35 mL de diluídos BM em cima do filtro de tubo de centrifugação gradiente de densidade e centrifugar 445 x g por 35 min em RT
        Nota: As configurações de centrífuga são baixa aceleração (3) e sem freio (1).
      3. Retire cuidadosamente o tubo de centrífuga sem tremer. Cuidadosamente descarte ~ 20 mL da solução clara superior sem tocar a nublado camada diretamente sobre o filtro.
      4. Cuidadosamente, transferir a camada turva (que está diretamente em cima do filtro e contém as células mononucleares (MNCs)) para um novo tubo cónico de 50 mL e encher com PBS/EDTA até um volume final de 50 mL.
        Nota: Combine todas as multinacionais de uma amostra do paciente BM em um novo tubo.
      5. Conte as MNCs pela transferência de 10 µ l de suspensão de células de 50 mL para um tubo de 1,5 mL. Adicione 10 µ l de ácido acético a 3% com azul de metileno. Delicadamente, misture e aplique 10 µ l em uma câmara de contagem. Calcule o número de multinacionais.
      6. Centrifugar a suspensão de MNC x g durante 10 min. descartar o sobrenadante.
        Nota: Durante a centrifugação, arrefecer o centrifugador de RT para 4 ° C.
    4. Seleção magnética de CD133+ SCs humana CD133 partículas de dextran de ferro superparamagnético vinculados ao anticorpo
      Nota: Durante esta etapa, trabalha no gelo. Soluções de armazenamento até o uso em 4 ° C. Armazenar os MACS ímã permanente, colunas de separação e filtro de pré-separação a 4 ° C.
      1. Escolha o tamanho da coluna. Para < 1.2 x 108 MNCs, usar colunas de MS e para > 1.2 x 108 MNCs, usar colunas LS (veja a Tabela de materiais).
      2. Para preparar de seleção magnética para 1 x 108 celular total, cuidadosamente Resuspenda as multinacionais no buffer de MACS 300 µ l (4 ° C). Adicione 100 µ l reagente bloqueio de FcR (4 ° C) e 100 µ l CD133 vinculados ao anticorpo superparamagnético ferro dextrano partículas (4 ° C).
      3. Delicadamente misture a suspensão de eritrócitos e incube por 30 min a 4 ° C. Agite a suspensão de eritrócitos durante a incubação (2 – 3. x).
      4. Adicionar 2 mL de tampão de MACS (4 ° C) por 10 x 18 total que MNCs. Misture suavemente a suspensão de células e centrifugar x g por 10 min a 4 ° C.
      5. Configurar o titular do ímã de MACS e anexar o ímã permanente de MACS. Instalar a coluna de MACS e aplicar o filtro de pré-separação em cima.
      6. Equilibrar a primeira coluna de MACS MS/LS e filtro de pré-separação com 0,5 mL (MS) ou 3 mL (LS) de buffer de MACS (4 ° C).
        Nota: Nunca permita que as colunas de MACS secar depois de equilibração.
      7. Desprezar o sobrenadante e ressuspender o obtidos em 500 µ l de tampão de MACS (4 ° C) por 1 x 108 montante de célula total. Aplica a suspensão de células para o filtro de pré-separação.
      8. Lavar o filtro de coluna e pré-separação de MACS usando três vezes, para cada lavagem, 0,5 mL (MS) ou 3 mL (LS) de MACS buffer (4 ° C).
        Nota: Durante a terceira etapa de lavagem, instalar uma segunda coluna de MACS para o ímã permanente de MACS e equilibrar a segunda coluna de MACS MS/LS com 0,5 mL (MS) ou 3 mL (LS) MACS buffer (4 ° C).
      9. Descarte o filtro de pré-separação.
      10. Eluir a fração de célula diretamente sobre a segunda coluna de MACS: adicionar 1 mL (MS) ou 5 mL (LS) MACS buffer (4 ° C) para a primeira coluna de MACS e remover a coluna de MACS do ímã permanente de MACS. Imediatamente transferir a primeira coluna de MACS acima da segunda coluna de MACS e empurre a suspensão de eritrócitos através da coluna de MACS usando o êmbolo fornecido.
      11. Lavar a coluna de MACS três vezes, usando para cada lavagem 0,5 mL (MS) ou 3 mL (LS) MACS de buffer (4 ° C).
      12. Eluir a fração de célula da coluna, adicionando 1 mL (MS) ou 5 mL (LS) MACS buffer (4 ° C) para a segunda coluna de MACS e retirar o ímã permanente de MACS a coluna de MACS. Imediatamente transferir a segunda coluna de MACS acima de um tubo de 1,5 mL (MS) ou tubo cônico de 15 mL (LS) e empurre a suspensão de eritrócitos através da coluna de MACS usando o êmbolo fornecido.
      13. Centrifugação a 300 x g durante 10 minutos a 4 ° C. Cuidadosamente, desprezar o sobrenadante e ressuspender o obtidos em 100 µ l de tampão de MACS (4 ° C).
      14. Contar o CD133+ células: transferência 6 µ l de suspensão de células para um tubo de 1,5 mL. Adicione a solução de azul de trypan 6 µ l (0,4%). Delicadamente, misture e aplique 10 µ l em uma câmara de contagem. Calcular o número de CD133+ células.
      15. Armazenar o CD133+ células no gelo até a semeadura.
  2. Caracterização de isolados recentemente CD133+ SCs
    Nota: O seguinte trabalho deve ser efectuado num quarto protegido da luz brilhante (fraca iluminação apenas). Manter os tubos, buffers e anticorpos no gelo, salvo indicação em contrário.
    1. Preparação das SCs para análise de fluxo cytometric
      1. Use duas amostras (cada 10 µ l) de alíquotas BM e uma amostra de recém isolado CD133+ SCs (mínimo, 1 x 104 células) para análise. Transferi as células para um tubo de 1,5 mL. Adicionar 10 µ l de FcR bloqueando o reagente e encher com buffer de MACS (4 ° C) para um volume de 33 µ l.
      2. Adicionar os seguintes anticorpos para o lado interno das respectivas do tubo (ver tabela 1): isotiocianato de anti-CD34-fluoresceína (FITC) (clone: AC136), anti-CD133/2-ficoeritrina (PE) (clone: 293 3), isotipo controle do mouse IgG 2b-PE, anti-CD45-allophycocyanin (APC)-H7 (clone: 2D 1) e 7-aminoactinomycin (AAD). Depois que todos os anticorpos foram adicionados, chacoalhar o lado de anticorpos do tubo. Delicadamente, misturar a solução (volume final de 50 μL) e incubar durante 10 minutos a 4 ° C.
      3. Adicionar 1 mL de tampão de lise de glóbulos vermelhos (RBC) x 1, delicadamente misturar a suspensão e incubar no gelo 10 min. centrifugar a suspensão de 300 x g durante 10 minutos a 4 ° C.
      4. Desprezar o sobrenadante e ressuspender o obtidos em 100 µ l PBS (4 ° C). Armazenar no gelo até a análise de fluxo cytometric.
    2. Fluxo cytometric análise de CD133+ SCs
      1. Para examinar a viabilidade celular e pureza de CD133+ SC, usar um adaptado da sociedade internacional de Hematotherapy e de estratégia associada de enxerto engenharia (ISHAGE) fluxo cytometry41 (veja a descrição representativa na Figura 1). Use a seguinte ordem:
        Passo 1: seleção da população celular (figura 1A)
        Passo 2: seleção de CD45+ células (figura 1B)
        Etapa 3: seleção de CD45 viável+ células (Figura 1)
        Passo 4: seleção de CD45 viável+/CD34+ células (Figura 1)
        Passo 5: seleção de CD45 viável+/CD34+/CD133+ células (Figura 1E)
        Executar o citômetro de fluxo (ver Tabela de materiais) de acordo com as instruções do fabricante.
      2. Calcule a viabilidade celular e pureza utilizando as seguintes equações:

Equation 1   Equação 1

Equation 2   Equação 2

  1. Cultura de CD133 recentemente isolados de células+ SCs
    1. Alíquota 100x citocina humana recombinante complementar em 100 alíquotas µ l e armazenar a-20 ° C. Descongelar uma alíquota de 100 x antes da preparação média.
    2. Preparar o CD133+ SC cultura médio, suplementado com suplemento de citocina humana recombinante (final 1 x) e 1% penicilina/estreptomicina expansão células hematopoiéticas isento de soro.
    3. Semente de 5 x 104 recentemente isolado CD133+ SCs para transfeccao em uma placa com meio de cultura 500 µ l de 24. Incube as celulas em 37 ° C, 5% de CO2 e de 20% O2.
      Nota: Semente 5 x 104 recentemente isolado CD133+ SCs como um controle para análise de fluxo cytometric.

2. preparação de transfeccao complexos

Nota: Durante este passo, manter a ribonuclease de espaço de trabalho inteiro (RNAse)-livre usando solução de descontaminação de RNAse e usar apenas material consumível RNAse-livre.

  1. Preparação de miR
    Nota: O seguinte trabalho deve ser efectuado num quarto protegido da luz brilhante (fraca iluminação apenas).
    Nota: para a miR-amostra: uso da cianina 3 tingir etiquetados miR precursor e miR precursor sem rótulo.
    1. Para preparar a solução-mãe de miR (50 µM), dilua a quantidade desejada de miR no volume adequado de água livre de nuclease (por exemplo, diluir 5 nmol de miR em 100 água µ l). Delicadamente misturar a solução, alíquota o estoque de miR (5 µ l) e armazenar abaixo de-20 ° C.
  2. Preparação do PEI
    1. Prepare o PEI seguindo protocolos padrão e nota o PEI concentração estoque31,42 .
  3. Preparação de MNP
    1. Preparar os MNPs seguindo protocolos padrão e observe a concentração das ações de MNP31,42.
  4. Preparação de complexos da miR/PEI
    1. Preparar a solução de glicose 5% diluindo D-(+)-glicose em água livre de nuclease. Delicadamente misturar a solução, alíquota o estoque (1,5 mL) e armazenar a 4 ° C.
      Nota: O seguinte trabalho deve ser efectuado num quarto protegido da luz brilhante (fraca iluminação apenas).
    2. Use 20 pmol miR por alvéolo de uma placa 2430. Dilua a miR em solução de glicose a 5% para uma concentração final de 0,25 pmol miR / µ l.
    3. Calcular a quantidade de PEI necessário baseado na quantidade de miR (20 pmol, passo 2.3.1) e ideal azoto (PEI) de fosfato (de miR) ratio (N/P) com base na concentração das ações PEI (passo 2.2.1; aqui, utilizou-se uma proporção de 7,5)30. Dilua o PEI em uma quantidade igual de solução de glicose 5% com base na equação:
      Equation 3
      que reorganiza a
      Equation 4    Equação 3
      onde o volume de PEI está em µ l e [PEI] está em mM e N/P (otimizado para este protocolo) é de 0,75. 0.12 é um fator de conversão específico à miR.
    4. Adicionar o PEI pré-diluídos nas miR pré-diluídos e vórtice por 30 s.
    5. Incubar o miR/PEI complexo durante 30 min à RT
  5. Preparação dos complexos miR/PEI/MNP
    Nota: O seguinte trabalho deve ser efectuado num quarto protegido da luz brilhante (fraca iluminação apenas).
    1. Ao mesmo tempo incubando os complexos de miR/PEI, prepare os MNPs sonicating os MNPs por 20 min a 35 kHz o banho de água sonicating a RT para garantir as partículas em suspensão e não agregando.
    2. Calcule o número de MNPs exigidos (ferro de 3 µ g/mL) com base na solução-mãe MNP (passo 2.3.1).
    3. Adicionar os MNPs lisados nas complexos miR/PEI e vórtice por 30 s. Incubar os complexos de miR/PEI/MNP por 30 min em RT
  6. Preparação dos complexos para transfeccao rotulagem quatro cores usando SIM
    Nota: Use miR precursor sem rótulo.
    1. Rotular a miR com cianina 5 tintura usando uma tintura de cianina 5 miR rotulagem kit (veja a Tabela de materiais) seguindo as instruções do fabricante. Medir a concentração de miR final utilizando o espectrofotômetro listado (ver Tabela de materiais) de acordo com a pre-configuração fornecida pelo fabricante (ácidos nucleicos, RNA-40). Alíquota que do miR (5 µ l) e loja a-80 ° C, protegidos da luz.
    2. Rotular o PEI com um corante de fluorescência verde brilhante usando uma rotulagem adequada proteína kit (veja a Tabela de materiais) seguindo as instruções do fabricante. Defina a concentração final de PEI usando o ensaio de ninidrina (etapa 2.2.1). Alíquota do PEI (no volume calculado com base na equação 3) e armazenar a 4 ° C, protegido da luz.
    3. Rotular os MNPs com rodamina tintura conjugada com biotina usando uma relação de 1:1,000 w/w, tintura de MNP. Misture o corante rodamina e MNPs concomitantemente com a preparação da formação complexa miR/PEI e incube a solução por 30 min no escuro. Use diretamente MNPs rotuladas.

3. a transfeccao de CD133+ SCs

Nota: Durante este passo, manter a ribonuclease de espaço de trabalho inteiro (RNAse)-livre usando solução de descontaminação de RNAse e usar apenas material consumível RNAse-livre
Nota: O seguinte trabalho deve ser efectuado num quarto protegido da luz brilhante (fraca iluminação apenas).

  1. Adicionar o preparado miRNA/PEI/MNP complexo gota a gota diretamente no poço apropriado contendo o CD133 recém isoladas+ SCs em meio de cultura.
  2. Misture delicadamente agite-a placa e para trás. Incube as celulas por 18 h a 37 ° C, 5% de CO2 e de 20% O2.

4. análise da miR Transfection

  1. Análise da eficiência de absorção a miR e a citotoxicidade dos complexos de transfeccao
    Nota: para o miR-espécime: usar tintura de cianina 3 rotulada miR precursor para a avaliação da absorção e não transfectadas CD133+ SCs para os portões de controle de citometria de fluxo.
    Nota: O seguinte trabalho deve ser efectuado num quarto protegido da luz brilhante (fraca iluminação apenas).
    Nota: Manter os tubos, buffers e anticorpos no gelo, salvo indicação em contrário.
    1. Preparar a solução de paraformaldeído (PFA, 4%) diluindo 4G PFA em 100 mL de PBS e aquecimento da solução a 80 ° C. Vigorosamente, misturar a solução e ajustar o valor de pH de 7,3. Alíquota da PFA estoque (1,5 mL) e armazenar a-20 ° C.
    2. 18 h após a transfeccao, recolher cada poço em um separado 1,5 mL do tubo. Lave bem uma vez com 500 µ l de PBS e transferir esta suspensão de células para o mesmo tubo.
    3. Centrifugação a 300 x g durante 10 minutos a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante e ressuspender o obtidos em 100 µ l de tampão de MACS de 4 ° C.
    4. Adicionar 0,5 µ l de um corante reativo de amina para distinguir entre células vivas e mortas, delicadamente misturar a suspensão e incubar durante 10 minutos a 4 ° C. Adicionar 1 mL PBS (4 ° C) e centrifugar a 300 x g durante 10 minutos a 4 ° C.
    5. Desprezar o sobrenadante, resuspenda o pellet Obtido em 100 µ l PBS, adicionar 33 µ l PFA (4%) e armazenar no gelo ou a 4 ° C até análise de fluxo cytometric.
    6. Organize a estratégia associada de acordo com a representação representante na Figura 2. Executar os exemplos sobre o citômetro de fluxo (ver Tabela de materiais) de acordo com as instruções do fabricante.
  2. Caracterização do CD133 miR-transfectadas+ SCs
    Nota: Usado miR precursor sem rótulo, bem como não-transfectadas CD133+ SCs para portões de controle de citometria de fluxo.
    1. Recolher cada um bem em um tubo separado 1,5 mL e centrifugar a 300 x g durante 10 minutos a 4 ° C.
    2. Use a estratégia associada conforme descrito na etapa 1.2.
  3. Exame da distribuição intracelular de complexos de transfeccao pelo SIM
    1. Preparar os complexos e transfect as células conforme descrito na seção 2 e na secção 3.
    2. 18 h após o transfeccao, recolher cada poço em um separado 1,5 mL do tubo. Lave bem uma vez com 500 µ l de PBS e transferir a lavagem no respectivo tubo do poço. Centrifugação a 300 x g durante 10 minutos a 4 ° C.
    3. Desprezar o sobrenadante e ressuspender o precipitado obtido em 1 mL de 2% de soro fetal bovino (FBS) em PBS, delicadamente misturar a suspensão e centrifugar a 300 x g durante 10 minutos a 4 ° C.
    4. Desprezar o sobrenadante e ressuspender o obtidos em 100 µ l de PBS adicionar 33 µ l PFA (4%) por 20 min.
    5. Transferir a suspensão de células em uma nova placa de 24-cultura contendo as lamelas de vidro estéril e centrifugar x g por 10 min a 4 ° C.
    6. Desprezar o sobrenadante e adicionar 500 µ l de PBS. Homogeneizar a placa e descartar a PBS.
    7. Coloque as preparado lamelas microscópicos slides usando o meio de montagem aquoso para preservar a fluorescência e secá-los no RT pelo menos 1 h.
    8. Adquira imagens usando um objectivo de imersão de óleo X 100. Configurações de SIM: 405, 488, 561 e 633 nm laser linhas para excitação e z-pilhas com uma profundidade de 16 bits em 3 ângulos, 3 fases, com uma média de 4, grades por linha de laser: 23 µm – 405, 34 µm – 488, 42 µm-561, 51 µm-633.

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Representative Results

O protocolo apresentado descreve um isolamento manual e magnético enriquecimento do humano BM-derivado CD133+ SCs com uma célula independente de vírus subsequentes engenharia estratégia, como uma tecnologia não-invasiva para manipulação de células em vitro e em vivo ferramenta de monitoramento.

Esta tecnologia de isolamento de três etapas permite uma separação de multinacionais de BM esternal pré-digerida através de centrifugação gradiente de densidade. Depois, um CD133+ fração de cela pode ser enriquecida magneticamente utilizando a tecnologia de isolamento adequadas. Isto permite um enriquecimento de CD133+ SCs com viabilidade e pureza superior a 80%, o que pode ser determinada por citometria de fluxo (Figura 1). A seguir, apenas produtos de SC que correspondem aos requisitos foram usados para novas experiências.

O método de transfeccao descrito aqui permite uma introdução altamente eficaz de miR nestes recém isolado humana CD133+ SCs com uma absorção de aproximadamente 80% de viáveis células (Figura 2)30. Além disso, existem sem significativos efeitos citotóxicos evidente 18 h depois de células de transfeccao comparado ao controle (Figura 2)30. Além disso, uma entrega suficiente e distribuição usual dos compostos complexos transfeccao (miR, PEI e MNPs) podem ser observados no citoplasma de células usando o SIM (Figura 3).

Figure 1
Figura 1: Representante Boolean gating estratégia para CD133+ SC caracterização. (A-E) Representação de uma estratégia de seleção de 5 passos para uma avaliação rigorosa da viabilidade celular e pureza do isolado CD133+ SC bem como CD133 (F) do isotipo controle usando o exemplo de BM sem tratamento adequado. (A) excluindo os restos da população celular intacta em uma frente/lateral (FSC/SSC) ponto de dispersão, seguido por sucessiva seleção de CD45 (B)+ população, viável CD45 (C) de células+ população, (D) de células CD45 positivo duplo viável+/CD34+ população da pilha e (E) viável triplo CD45 positivas+/CD34+/CD133+ população da pilha. Laranja: CD45+/CD34+/CD133+ células destacadas dentro de cada etapa de seleção. Legenda: APC-Cy7: anti-CD45, FITC: anti-CD34, FSC: Forward Scatter canal, PE: anti-CD133, SSC: canaleta de dispersão lateral, AAD-7: 7-aminoactinomycin. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: representante de retenção de estratégia para a avaliação da eficiência de absorção de miR e citotoxicidade do complexo do transfection. Associada a estratégias de (A, B) transfectadas CD133+ SCs, bem como (C, D) não-transfectadas CD133+ SCs para a análise da (A, C) Cyanine3 corante rotulado precursor-miRNA (de eficiência de absorção vermelho: Cy3 viável+ células) e (B, D) efeitos citotóxicos do processo do transfection marcado por um corante reativo de amina para distinguir entre células vivas e mortas (azul: células mortas). Legenda: SSC: canaleta lateral de dispersão, as células só: não-transfectadas CD133+ SCs, miRNA/PEI/MNP: CD133+ SCs transfected com miR Cy3-rotulado clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: visualização intracelular do complexo do transfection. CD133+ SCs foram transfectadas com três cores rotulado miR/PEI/MNP complexo (miR: 20 pmol, PEI: relação N/P 7.5, MNP: 3 µ g/mL). Visualização representante foi realizada 18 h após a transfeccao usando microscopia de iluminação estruturada. A miR foi rotulado com Cyanine5 corante (vermelho), PEI com um corante de fluorescência verde brilhante (verde) e MNPs com corante rodamina conjugada com biotina (amarela), e o núcleo foi counterstained com DAPI (azul). Barra de escala = 5 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

amostra Reagente FCR bloqueio µ [l] Buffer de MACS µ [l] anticorpos µ [l] total µ [l]
número espécime células µ [l] Isotype CD133-PE CD133-PE CD34-FITC CD45-APC-Cy7 ADICIONAR
1 BM 10 10 12.5 5 - 5 2.5 5 50
2 BM 10 10 12.5 - 5 5 2.5 5 50
3 CD133+ (1 x 104) 10 12.5 - 5 5 2.5 5 50

Tabela 1: layout de pipetagem para caracterização de CD133 + SCs.

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Discussion

Nos últimos anos, CD133+ SCs surgiram como uma população celular promissor para terapias baseadas em SC, como evidenciado por vários fase I, II e III ensaios clínicos43,44,,45,46, 47 , 48 , 49 , 50 , 51 , 52 , 53 , 54. aqui, apresentamos um protocolo detalhado para o padronizado manual purificação e fluxo cytometric caracterização dessas células de humano BM esternal. O procedimento descrito de MACS isolamento representa uma estratégia suave, rápida e eficiente para obter uma fração de SC hematopoiética altamente pura e viável. A boa compatibilidade, combinada com a rápida degradação de co injetado MicroBeads de MACS usados para classificação de célula foi demonstrada anteriormente pelo nosso grupo55,56.

Este procedimento de isolamento foi desenvolvido usando BM esternal humana como matéria-prima, e portanto, o protocolo atualmente permite a purificação de SCs hematopoiéticas para uso em pesquisa pré-clínica. Se CD133+ SCs são isolados de outros tecidos (por exemplo, BM, obtido a partir da crista ilíaca) várias etapas do protocolo como centrifugação de digestão e densidade do tecido enzimática podem exigir adaptação. Para aplicação clínica da célula, nosso grupo estabeleceu mais um processo de fabrico no local de GMP-conformant usando o precisa de um sistema automático para satisfazer exigências adicionais em nome clínico57.

Engenharia de SCs, antes da sua aplicação é uma estratégia nova para superar certos obstáculos na terapia de SC, incluindo retenção baixa celular e morte celular maciça. O protocolo atual inclui instruções para a produção de um sistema de transfeccao viral livre multifunctional baseado no PEI ramificada vinculado a MNPs e sua introdução eficiente no CD133+ SCs30. A aplicação deste sistema permite a modificação genética da célula, célula controlado magneticamente orientação e rastreamento de pilha não-invasiva através de ressonância magnética ou MPI30,31,40,42,58 , 59 , 60.

Importante, as condições de transfeccao descritos foram otimizadas para modificação genética transiente de CD133+ BM-derivado SCs30. Em trabalhos anteriores, este sistema de transfeccao também com sucesso aplicou-se para a entrega do plasmídeo e miR para outra célula tipos31,40,60. Estas experiências têm demonstrado que a eficiência de transfeccao, bem como a citotoxicidade é dependentes do tipo de célula. Portanto, as ideais composições NAs, PEI e MNPs precisam ser definida para cada tipo de célula.

Devido a sua alta eficiência, o PEI é um dos polímeros mais usados para não-virais célula genética61de engenharia. No entanto, a aplicação clínica61,62 do PEI é muito limitado até à data por causa de sua toxicidade geral61,63. Curiosamente, o nosso grupo demonstrado recentemente que MNPs reduzem a toxicidade de PEI, quando incluído no sistema do transfection31,60. Ao mesmo tempo, a possível toxicidade de nanopartículas de óxido de ferro com base causadas pela produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) é dose-dependente e vários tipos de nanopartículas superparamagnético são aprovados para MRI64,65 . No entanto, deve-se prestar atenção à toxicidade do sistema em vitro e in vivo.

Em geral, o protocolo é bastante complexo, contendo muitos passos críticos que precisam ser tratados com muito cuidado. Para este efeito, realçamos a estes pontos na seção de protocolo com notas. Em especial, gostaríamos de salientar a importância de um ambiente completamente livre de RNAse e evitando qualquer exposição à luz, ao manipular as tinturas fluorescentes aplicadas.

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Disclosures

Os autores declaram não haverá conflito de interesses.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado pelo Ministério Federal da educação e pesquisa Alemanha (FKZ 0312138A e FKZ 316159), o estado Mecklemburgo-Pomerânia Ocidental com fundos estruturais (FSE/IVWM-B34-0030/10 e FSE/IVBM-B35-0010/12) e a DFG (DA1296/2-1), o Fundação coração alemão (F/01/12), o BMBF (VIP + 00240) e a Fundação úmida. Além disso, F.H. e P.M. são suportados pelo Forum programa de Rostock University centro médico (889001).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
7-AAD BD Biosciences 559925
Acetic Acid with Methylene Blue Stemcell Technologies 7060 3%
anti-CD133/2-PE (clone: 293C3) Miltenyi Biotec GmbH 130-090-853
anti-CD34-FITC (clone: AC136) Miltenyi Biotec GmbH 130-081-001
anti-CD45-APC-H7 (clone: 2D1) BD Biosciences 560178
rhodamine dye; Atto 565 dye conjugated to biotin ATTO-TEC GmbH AD 565-71
BD FACS LSRII flow cytometer BD Biosciences
BD FACSDiva Software 6.1.2 BD Biosciences
BSA Sigma-Aldrich GmbH A7906
CD133 antibody-linked superparamagnetic iron dextran particles; CD133 MicroBead Kit Miltenyi Biotec GmbH 130-097-049
collagenase B Roche Diagnostics GmbH 11088831001
counting chamber Paul Marienfeld GmbH & Co. KG
Cyanine 3 dye labelled precursor miR; Cy3 Dye-Labeled Pre-miR Negative Control #1 Ambion AM17120
Cyanine 5 dye miR labelling kit; Cy5 dye Label IT miRNA Labeling Kit Mirus Bio MIR 9650
DNAse I Roche Diagnostics GmbH 10104159001 (100 U/mL)
ELYRA PS.1 LSM 780 confocal microscope Carl Zeiss Jena GmbH
FcR Blocking Reagent, human Miltenyi Biotec GmbH 130-059-901
bright green protein labeling kit; Oregon Green 488 Protein Labeling Kit Thermo Fisher Scientific O10241
aqueous mounting medium; Fluoroshield Sigma-Aldrich GmbH F6182
density gradient centrifugation tube; Leukosep Centrifuge Tube Greiner Bio-One 89048-932
MACS magnet holder; MACS MultiStand Miltenyi Biotec GmbH 130-042-303
MACS pre-separation filter Miltenyi Biotec GmbH 130-041-407 30 µm
MACS separation column (MS / LS) Miltenyi Biotec GmbH 130-042-201 / 130-042-401
MACS permanent magnet; MACS Separator Miltenyi Biotec GmbH 130-042-302
Millex-HV PVDF Filter Merck SLHV013SL 0.45 μm
mouse IgG 2b-PE Miltenyi Biotec GmbH 130-092-215
amine reactive dye; Near-IR LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain Kit Thermo Fisher Scientific L10119
human lymphocyte separating medium; Pancoll Pan Biotech GmbH P04-60500 density: 1.077 g/mL
PBS Pan Biotech GmbH P04-53500 without Ca and Mg
PEI Sigma-Aldrich GmbH 408727 branched; 25 kDa
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 100 U/mL, 100 μg/mL
PFA Merck Schuchardt OHG 1040051000
unlabelled precursor miR; Pre-miR miRNA Precursor Negative Control #1 Ambion AM17110
RBC lysis buffer eBioscience 00-4333-57
RNAse decontamination solution; RNaseZap Thermo Fisher Scientific AM9780
human lymphocyte medium; Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium Pan Biotech GmbH P04-16500
recombinant human cytokine supplement; StemSpan CC100 Stemcell Technologies 2690
serum-free haematopoietic cell expansion medium; StemSpan H3000 Stemcell Technologies 9800
Streptavidin MagneSphere Paramagnetic Particles Promega Corporation Z5481
Trypan Blue solution Sigma-Aldrich GmbH T8154 0.4 %
UltraPure EDTA Thermo Fisher Scientific 15575020 0.5 M; pH 8.0
ZEN2011 software Carl Zeiss Jena GmbH
NanoDrop 1000 Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific
Sonorex RK 100 SH sonicating water bath Bandelin electronic Ultrasonic nominal output: 80 W; Ultrasonic frequency: 35 kHz

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