Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Split-BioID — Proteoom analyse van Context-specifieke eiwitcomplexen in hun inheemse cellulaire omgeving

Published: April 20, 2018 doi: 10.3791/57479
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Cluster of excellence CellNetworks, Heidelberg University, 2Heidelberg University Biochemistry Center (BZH)

Summary

Wij bieden een stapsgewijze protocol voor split-BioID, een eiwit fragmenten-complementatie test gebaseerd op de nabijheid-labeling techniek BioID. Geactiveerd op de interactie tussen twee bepaalde eiwitten, hierdoor de proteomics analyse van context-afhankelijke eiwitcomplexen in hun inheemse cellulaire omgeving. De methode is eenvoudig, kosteneffectief en vereist alleen gebruikelijke laboratoriumbenodigdheden.

Abstract

Ter aanvulling van de bestaande affiniteit zuivering (AP) benaderingen voor de identificatie van eiwit-eiwitinteractie (PPI), enzymen zijn ingevoerd waarmee de nabijheid-afhankelijke labeling van proteïnen in levende cellen. Één dergelijke enzym, BirA * (gebruikt in de BioID aanpak), bemiddelt de biotinylation van eiwitten binnen een bereik van ongeveer 10 nm. Vandaar, wanneer aan een proteïne van belang gesmolten en in cellen uitgedrukt, laat het de etikettering van proximale eiwitten in hun eigen omgeving. In tegenstelling tot AP die afhankelijk van de zuivering van geassembleerde eiwitcomplexen is, detecteert BioID eiwitten die binnen cellen maakt niet uit of ze nog steeds zijn interactie met de proteïne van belang wanneer zij geïsoleerd zijn gemarkeerd. Omdat het biotinylates proximale eiwitten, een kan bovendien profiteren van de uitzonderlijke affiniteit van daar voor Biotine zeer efficiënt isoleren hen. Terwijl BioID beter dan AP voor het identificeren van voorbijgaande aard of zwakke interacties presteert, bieden beide AP - en BioID-mass spectrometry benaderingen een overzicht van alle mogelijke interacties die een bepaald proteïne kan hebben. Zij doen echter geen informatie verschaffen over de context van elke geïdentificeerde PPI. Inderdaad, de meeste eiwitten zijn meestal onderdeel van verschillende complexen, overeenkomt met verschillende rijping stappen of verschillende functionele eenheden. Om aan deze gemeenschappelijke beperking van beide methoden, hebben we een eiwit-fragmenten complementatie analyse op basis van het BirA-enzym ontworpen. In deze test, kunnen twee inactief fragmenten van BirA * Monteer in een actieve enzym toen bracht in de nabijheid van twee interacterende eiwitten waarnaar zij zijn gesmolten. De resulterende split-BioID bepaling kan dus de etikettering van eiwitten dat rond een paar interacterende eiwitten verzamelen. Mits deze twee alleen in een bepaalde context werken, laat split-BioID dan de analyse van specifieke context-afhankelijke functionele eenheden in hun inheemse cellulaire omgeving. Hier bieden we een stapsgewijze protocol om te testen en de toepassing van de split-BioID op een paar interacterende eiwitten.

Introduction

Zoals meest cellulaire functies worden uitgevoerd door eiwitten die dynamisch macromoleculaire complexen monteren, is de identificatie van eiwit-eiwitinteractie (PPI) een grote inspanning in biomedisch onderzoek. Inderdaad, PPI zijn vaak gedereguleerd in ziekte en doelwit voor therapeutiek1vertegenwoordigen. De meest gebruikte methode voor de identificatie van PPI de affiniteit zuivering (AP) aanpak waarin is, naar aanleiding van de lysis van de cel, een proteïne van belang specifiek op een matrix wordt gezuiverd en geassocieerde eiwitten worden vervolgens geïdentificeerd door massaspectrometrie (MS). Terwijl AP-MS een krachtige aanpak is, doet het meestal niet goed presteren op slecht oplosbare eiwitcomplexen, zeer voorbijgaande interacties of PPI die vergen een intacte subcellular structuur. Bovendien is dat de interpretatie van de gegevens kan worden bemoeilijkt door de dynamische aard van PPI netwerken, zoals een één eiwit vaak onderdeel van verscheidene verschillende eiwitcomplexen is.

Nabijheid-labeling technieken zoals BioID2 of APEX23,4 werden onlangs ontwikkeld om ingaan op enkele van de beperkingen van de AP-MS benaderingen. In BioID katalyseert het enzym BirA * (overeenkomend met een G115R variant van het wild type E. coli enzym) de vorming van onstabiele biotinyl-AMP (bio-AMP) die met primaire amines reageren kan. In tegenstelling tot het wild type enzym, dat bio-AMP in zijn actief Centrum behoudt, releases BirA * bio-AMP waardoor de verspreiding aan de naburige milieu. Vandaar, als gesmolten aan een proteïne van belang, maar uitgedrukt in cellen, proximale eiwitten kunnen biotinyleerd binnen een geschat bereik van 10 nm5. Deze gemarkeerd proximale eiwitten zijn vervolgens door daar pulldown geïsoleerd en geïdentificeerd door MS. In tegenstelling tot AP-MS vereist BioID de uitdrukking van een fusieproteïne. Het kan dus alleen worden toegepast op eiwitten waarvan de functie niet wordt belemmerd door tagging. Bovendien, de snelheid van labeling is traag, meestal 6-24 h2,6, waardoor de detectie van kortstondige eiwitten uitdagend. Toch, in vergelijking met de AP-MS, BioID-MS biedt verschillende voordelen: ten eerste, de vangt de interacties in hun inheemse cellulaire omgeving; tweede, gelabelde proteïnen in plaats van geassembleerde complexen zijn geïsoleerd na de lysis van de cel; Ten derde, daar pulldowns toestaan met behulp van denatureren buffers en harde wassen voorwaarden. Vandaar, de methode is meer gevoelig voor het detecteren van voorbijgaande aard of zwakke interacties7 of interacties die op een specifieke plaatsvinden en moeilijk te isoleren subcellular structuur8.

De meeste eiwitten zijn echter meestal deel uit van grotere complexen die remodelleren kan volgens cellulaire signalen of naar de functie die moet worden uitgevoerd. Vandaar, een één eiwit is meestal onderdeel van verschillende complexen, overeenkomt met de verschillende functionele eenheden, waarbij verschillende en/of overlappende PPI. Beide benaderingen geven een overzicht van alle verenigingen die een bepaald eiwit wellicht, maar verzuimen om aan te pakken van de context van afzonderlijke PPI. Het vergroten van de resolutie van de laatste, hebben wij een eiwit-fragmenten complementatie analyse (PCA) ontworpen in welke twee inactief fragmenten van BirA * (NBirA *, dat de katalytische domein bevat, en CBirA * die kan worden gezien als het domein van de Re-activering) kan Monteer in een actieve enzym toen bracht in de nabijheid van twee interactie eiwitten9. De resulterende split-BioID bepaling is de nabijheid-afhankelijke biotinylation gericht op eiwitten die verzamelen rond een paar interacterende eiwitten en dus maakt de identificatie van de context afhankelijke eiwitten assemblages. We toonden onlangs de uitstekende resolutie kracht van split-BioID wordt omgezet in twee afzonderlijke eiwitcomplexen die betrokken zijn bij de miRNA-gemedieerde gen-zwijgen traject9.

Over het geheel genomen in een enkele en eenvoudige assay kunt split-BioID ontdekken en PPI specifiek toe te wijzen aan gedefinieerde functionele eenheden waarin een bepaald proteïne is betrokken, voor zover dat een extra interactie eiwit van het complex bijbehorende eiwit is bekend.

Protocol

Opmerking: Een overzicht van de methode wordt weergegeven in Figuur 1.

1. planning van de strategie van klonen

  1. Selecteer twee vermeende interacterende eiwitten te beproeven.
    Opmerking: Elk van de twee eiwitten zal worden gesmolten naar een fragment van de split-BioID: NBirA * of CBirA *. Als een negatieve controle, zal de CBirA * fusion eiwitten worden getest met NBirA * gesmolten aan de groen fluorescente proteïne (NBirA *-GFP). Als een extra controle, kunnen de NBirA *-fusies alleen, zonder cognaat CBirA * fusion of in combinatie met een CBirA * gesmolten aan een ongerelateerde proteïne worden getest. Het is raadzaam niet te gebruiken CBirA *-GFP als een negatieve controle als het werd aangetoond dat het consequent leiden tot grote achtergrond wanneer samengevoegd tot een NBirA * fusion eiwit9. De oorzaak van deze observatie mogelijk het niveau van de expressie van de CBirA *-GFP, veel hoger dan elke andere CBirA * fusion eiwitten hebben we tot nu toe gebruikt die tot aanzienlijke hier met het NBirA-fragment leiden kunnen.
  2. Als twee eiwitten zijn geselecteerd, controleert u de literatuur te vinden of beide zijn reeds met succes gelabeld in functionele studies (bijvoorbeeld als een GFP-gelabeld fusieproteïne).
    1. Als dergelijke studies bestaat, noteert u de positie van de tag (op de N - of C-terminus) en dezelfde afdrukstand gebruiken om tag van de proteïnen van belang met de split-BioID fragmenten.
    2. Als geen dergelijke studie bestaat, plan constructies coderen voor beide eiwitten op de N - en C-terminus gelabeld en plan een test om te testen van de functionaliteit van de fusie-eiwitten (bijvoorbeeld een experiment van de redding in een cellijn uitgeput voor de WT-proteïne).
      Opmerking: Wanneer twee fusion eiwitten met behulp van de plasmiden beschreven in Figuur 2 die lange flexibele linkers coderen in paren rangschikken, de oriëntatie van de fusie-eiwitten (BirA * fragmenten gesmolten stroomopwaarts of stroomafwaarts van de proteïnen van belang) in het algemeen maakt niet uit . Inderdaad met behulp van FRB en FKBP als model eiwitten, werd aangetoond dat alle vier mogelijke iteraties (beide fragmenten op de N-termini, zowel op de C-termini, één voor één de N-terminus en anderzijds de C-terminus, en vice versa) opbrengst van vergelijkbare biotinylation9.
  3. Inleidingen aan het versterken van de ORFs van de twee eiwitten van belang voor het klonen in de split-BioID-plasmiden ontwerpen. Aandacht dat de vertaling frames hetzelfde als de BirA-fragmenten zijn. Als met de plasmiden beschreven in Figuur 2, gebruikt u de restrictie-enzymen PmeI en PacI voor de bouw van de CBirA-fusie en de enzymen ClaI en MluI voor de NBirA-fusie.
    Opmerking: De plasmiden afgebeeld in Figuur 2 voeren een bi-directionele tet-responsief element geflankeerd door F3/FRT recombinatie sites. Hierdoor is de gereglementeerde co expressie op ongeveer hetzelfde niveau van beide fusie-eiwitten uit de dezelfde plasmide10, en de mogelijkheid om snel het bouwen van stabiele cellijnen door recombinatie-gemedieerde cassette exchange (RMCE). In deze plasmiden heeft NBirA * een myc tag terwijl CBirA * een vlag-tag. De ORFs kunnen natuurlijk ook worden gekloond op individuele plasmiden met constitutieve initiatiefnemers.
    Kritieke stap: Bij het testen van twee interacterende eiwitten, wordt u geadviseerd te vergelijken NBirA * gesmolten aan proteïne 1 gecombineerd met CBirA * gesmolten aan proteïne 2 en NBirA * gesmolten aan proteïne 2 gecombineerd met CBirA * gesmolten aan proteïne 1. Inderdaad, is er vaak opgemerkt dat één iteratie beter dan de andere werkt.

2. het klonen van de ORFs van de genen van belang in het plasmide Split-BioID

Opmerking: In dit voorbeeld worden twee proteïnen die kunnen worden gecodeerd in de N-terminus beschouwd. Vier voorwaarden zal worden getest en vergeleken met niet-transfected cellen (tabel 1).

  1. Polymerase-kettingreactie (PCR) gebruiken om te vergroten de ORFs van de twee eiwitten te beproeven met de juiste inleidingen. Inleidingen die invoering van de ClaI en MluI beperking sites voor de NBirA * fusie-eiwitten, en de PacI en PmeI voor de CBirA * fusion eiwitten te ontwerpen.
    Opmerking: De PCR kan worden uitgevoerd met enig commercieel, bij voorkeur proeflezen, polymerase van DNA. Volg het standaardprotocol van het handboek en aan te passen aan de smelttemperatuur van de inleidingen en de lengte van de ORF kan worden versterkt, volgens de richtlijnen van de fabrikant.
  2. De eerste ORF subclone
    1. Het verteren van zowel de plasmide (ongeveer 2 μg) en de PCR-versterkte ORF1 (te worden gesmolten tot NBirA *) met ClaI en MluI. Uitvoeren van spijsvertering reacties met behulp van 1 μL van elk enzym, gemengd met het juiste volume van DNA en reactie buffer in een totaal volume van 20 μL in een tube 1,5 mL gedurende 1 uur bij 37 ° C.
    2. Beide voorbeelden van spijsvertering uitvoeren op een 1% agarose-TAE DNA-gel. Accijnzen de bands verteerd plasmide en ORF1 correspondeert met een schone scalpel en transfer naar 1,5 mL tubes.
    3. Beide bands met een standaard kit voor de extractie van DNA te zuiveren.
    4. Afbinden verteerd plasmide en ORF1 gebruikmaken van standaard reagentia.
      1. Wanneer met behulp van de afbinding kit in Tabel van materialen aangegeven, afbinden 100 ng DNA bevatten drie tot vijf keer molaire overmaat invoegen over plasmide in een totaal volume van 4.5 μL. Voeg 5 μL van 2 x T4 ligase buffer en 0,5 μL van T4 DNA ligase uit de afbinding kit. De afbinding reactie in een tube 1,5 mL gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT) uitvoeren.
    5. Transformeren in standaard DH-5α E. coli bevoegde cellen (bereid volgens Inoue de methode11).
      1. Mix 3 μL van de afbinding reactie met 50 μl van bevoegde cellen in een 1,5 mL tube op ijs en incubeer gedurende 30 min. overdracht de cellen aan een hitte ingesteld op 42 ° C gedurende 30-45 s blokkeren en vervolgens uit te broeden terug op het ijs voor 2 min. 250 toevoegen μL van voorverwarmde (37 ° C) lysogenie Bouillon (LB) medium en plaat 100 μl van de cellen in een voorverwarmde (37 ° C) ampicilline-bevattende LB-agarplaat. Incubeer de cellen 's nachts bij 37 ° C.
    6. Op de volgende dag, ophalen vier tot zes kolonies en hen Incubeer bij 37 ° C, 180 rpm, overnachting in 3 mL LB opslagmedium met 100 μg⋅mL-1 ampicilline in een tube van 15 mL.
    7. Isoleren van de plasmiden uit de geplukte kolonies met behulp van een standaard DNA MiniPrep kit.
    8. De juistheid van de plasmiden door Sanger sequencing met behulp van de Cassette 2 omgekeerde primer (tabel 2).
  3. Zodra een plasmide die met de eerste ORF is geconstateerd, subclone het tweede ORF in dat plasmide volgen de zelfde stappen zoals stap 2.2 maar met behulp van de PmeI en PacI enzymen.
  4. Het volgnummer van de resulterende plasmiden met behulp van de Cassette 1 omgekeerde primer (tabel 2).

3. het testen van de fusie-eiwitten

Opmerking: De volgende instructies gelden voor de dubbele afleidbare expressie plasmiden (Figuur 2) en HeLa-11ht cellen, een subclonal HeLa-CCL2-cellijn, stabiel uiten de omgekeerde transcriptie van het tetracycline-gecontroleerde activator rtTA-M2 en met een Locus voor RMCE12. Het groeimedium voor deze cellen is de Dulbecco bewerkt Eagle Medium (DMEM) met 10% tetracycline-vrije foetale runderserum (FBS). Wanneer u een ander celtype, zal exacte seeding voorwaarden en groeimedium moeten worden aangepast.

  1. Voorbijgaande Transfectie
    1. Zaad-cellen bij een concentratie van 1 x 105 cellen in 2 mL per putje van de plaat van een zes-well eergisteren transfectie en Incubeer de cellen 's nachts bij 37 ° C, 5% CO2 in een cel cultuur incubator.
    2. Op de dag van de transfectie, verwijder het medium van elk putje en vervang met 2 mL verse voedingsbodem.
    3. De vier reacties van de transfectie volgens tabel 1voor te bereiden. Toevoegen voor elk putje te transfect, 6 µg polyethylenimine tot 3 µg plasmide DNA in een steriele buis 1,5 mL en vul tot 500 µL met DMEM medium zonder serum.
    4. Incubeer elke transfectie mix voor ten minste 5 minuten bij kamertemperatuur voordat u drop wise toevoegt aan elk putje. Incubeer de cellen 's nachts bij 37 ° C, 5% CO2.
  2. Inductie en nabijheid-labeling
    1. De dag na de transfectie, verwijder het medium en vervang met medium aangevuld met biotine op 50 µM ter stimulering van biotinylation en doxycycline bij 200 ng⋅mL−1 voor het opwekken van de expressie van de fusie-eiwitten. Incubeer de cellen gedurende ten minste 20 uur bij 37 ° C, 5% CO2.
      1. Om een stockoplossing van biotine, ontbinden Biotine op 50 mg⋅mL-1 (overeen met ca. 200 mM) in 2 M ammoniak hydroxide. Zodra het volledig is opgelost, Verdun het tot 50 mM 500 mM Hepes, pH 7.4, dan breng de pH op 7.4 met HCl. Aliquot en opslaan van de resulterende 1.000 x stockoplossing bij-20 ° C. Ontbinden doxycycline op 10 mg⋅mL-1 in 70% ethanol en winkel in een schroefdop microtube bij-20 ° C in het donker.
  3. Cel lysate voorbereiding
    1. Wassen van de cellen een keer met 1 mL koud (4 ° C)-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
    2. Voeg 100 µL van lysis buffer (50 mM Tris pH 7.4, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA 0.5% NP-40, 0.5 mM DTT en proteaseinhibitors) toe aan elk putje.
    3. Het oogsten van de cellen met een cel scrapper en transfer naar 1,5 mL tubes.
    4. Centrifugeer de monsters bij 14.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C tot cel puin te verwijderen.
    5. Het supernatant overbrengen in verse buizen en plaats op ijs.
    6. Bepalen eiwit bedragen met een analyse van Bradford.
  4. SDS-polyacrylamide gelelektroforese (pagina) en het westelijke bevlekken
    1. Voorbereiden van een SDS-polyacrylamide-gel.
    2. Voor elk gewist lysate, een voorbeeld van de pagina van 30 µg (minimum 15 µg) eiwit in een totaal van 30 µL van SDS-laden buffer voor te bereiden. Dan laden gelijke hoeveelheden van elk monster (20 µL per putje) op de SDS-polyacrylamide-gel en overgaan tot elektroforese.
    3. Na elektroforese, door de gefractioneerde eiwitten te overbrengen in een lage fluorescentie PVDF vlek membraan met behulp van een standaardprotocol.
      Opmerking: Voor het analyseren van eiwit-biotinylation, een transfertijd van 10 min met de "hoge MW"-programma van een snelle overdracht semi-droge westelijke bevlekken apparaat meestal goed werkt.
    4. Na de overdracht, blokkeren de membraan in 5% droge melk in PBS voor 30 min op RT.
    5. Incubeer de membraan voor 30-60 min op RT met fluorescerende streptavidine geconjugeerde verdunde 1:15,000 in PBS met 2% BSA en 0,1% Tween-20.
    6. Spoel het membraan driemaal, elk voor 10 min, met PBS met 0,1% Tween-20, en klik vervolgens eenmaal meer met PBS.
    7. Scan het membraan op een fluorescentie scanner imaging systeem.
      Opmerking: een typische westelijke vlek is op Figuur 3weergegeven. De bovenstaande procedure beschrijft een TL gebaseerde detectie maar een luminescentie gebaseerde detectie met behulp van HRP-coupled daar werkt even goed.

4. Split-BioID voor Proteomics Studies

Kritische noot: Voor massaspectrometrische uiteindelijk al de volgende stappen moeten worden uitgevoerd in de keratine-vrij voorwaarden, alle materiaal en reagentia moeten als keratine-vrij mogelijk.

  1. Voorbijgaande Transfectie
    1. De dag voor transfectie, zaad van drie tot vier 10 cm platen voor elke voorwaarde in een concentratie tussen 8 x 105 cellen in 10 mL per plaat, en Incubeer de cellen 's nachts bij 37 ° C, 5% CO2 in een cel cultuur incubator.
    2. Op de volgende dag, bereiden een master transfectie mix voor elke voorwaarde transfectie: voor drie platen per voorwaarde, 36 µg voor polyethylenimine, en 18 µg plasmide DNA ontbonden in 900 µL serumvrij DMEM. Incubeer elke master mix voor minstens 5 min op RT.
    3. In de tussentijd, het vervangen van het medium voor elk gerecht met verse medium, en voegt u 300 µL van de transfectie mengsels drop verstandig om elke plaat.
    4. Incubeer de cellen 's nachts bij 37 ° C, 5% CO2.
  2. Inductie en nabijheid-labeling
    1. De dag na de transfectie, transfer de cellen tot 15 cm schotels. Voor elk gerecht, verwijderen van het medium, wassen van de cellen met 7 mL PBS, voeg 1,5 mL van een trypsine-EDTA-oplossing en incubeer gedurende 5 min op RT. Voeg 3,5 mL van groeimedium resuspendeer de cellen en het overbrengen van de celsuspensie naar een 15 cm schotel gevuld met 20 mL groeimedium aangevuld met biotine op 50 µM ter stimulering van biotinylation en doxycycline op 200 ng⋅mL−1 (eindconcentraties) voor het opwekken van de expressie van de fusie-eiwitten.
    2. Incubeer de cellen gedurende ten minste 20 uur bij 37 ° C, 5% CO2.
  3. Oogsten en opslaan van de cellen
    1. Wassen van de cellen tweemaal met PBS, dan Voeg 1,5 mL PBS toe aan elke plaat en oogsten van de cellen met een scrapper.
    2. Overdracht van de geoogste cellen dat overeenkomt met een voorwaarde voor een tube van 15 mL en oogst ze door centrifugeren op 1200 x g, 5 min, 4 ° C.
    3. Verwijder het supernatant en module bevriezen de pellets in vloeibare stikstof, dan winkel bij 80 ° C totdat zij worden verwerkt.
      Opmerking: Als alternatief, cellen kunnen ook worden losgekoppeld door trypsinebehandeling, geoogst in groeimedium, overgebracht naar een tube van 15 mL en drie keer met PBS gewassen vóór het invriezen.
  4. Voorbereiding van cel lysates
    1. De cel pellets in 1 mL lysisbuffermengsel (50 mM Tris pH 7.4, 500 mM NaCl, 0,4% SDS, 5 mM EDTA, 1 mM DTT, 1 x volledige proteaseinhibitor) bij RT. Pass resuspendeer de cellen 10-20 keer (vijf tot tien strokes) door middel van een naald van 25 G.
    2. Bewerk ultrasone trillingen ten de monsters met een sonification-apparaat.
      Opmerking: Met het sonification apparaat aangegeven in Tabel van materialen, het volgende programma kan worden gebruikt: vier cycli bij hoge intensiteit, 30 s per cyclus in een koud (4 ° C) waterbad. Een ander sonification-apparaat is geschikt maar parameters zou moeten dienovereenkomstig worden aangepast.
    3. Voeg Triton X-100 naar de herstelde sonicated lysate te bereiken van een definitieve concentratie van 2% (meestal, voeg 100 μl van 20% sonicated Triton X-100 tot 900 μL cel lysate), en vervolgens 2,3 mL 50 mM Tris, pH = 7.4 per 1 mL lysate aanpassen van de concentratie van de NaCl tot 150 mM voor b INDENDE aan streptavidine-coupled kralen.
      Kritische noot: Hogere concentraties van zout resulteren vaak in veel minder efficiënt binding met de kralen.
    4. Verspreiden van de aangepaste lysates in 1,5 mL buisjes (ca. 1.1 mL in drie buizen) en centrifugeer ze bij 16.000 x g, 10 min, 4 ° C.
    5. Overdracht van het supernatant (ca. 3,2 mL) aan een tube 15 mL, en houd 50-100 μl als INPUT materiaal.
    6. Meten van de concentratie van elk monster met een analyse van Bradford en gebruik het equivalent van 3 tot en met 3.5 mg eiwitgehalte voor de daar pulldown.
  5. Daar pulldown
    Opmerking: Een overzicht van de pulldown procedure wordt weergegeven in Figuur 4. Het is vrijwel identiek aan het oorspronkelijke protocol gepubliceerd door Roux en collega's2. De eerste keer de pulldown wordt uitgevoerd, monsters van stroom door- en afwas 1 – 4 kunnen opzij worden gezet voor westelijke vlekkenanalyse om ervoor te zorgen de procedure naar behoren werkte (Figuur 5).
    1. Voor elke voorwaarde die, door 200 μL van daar-coupled magnetische kralen schorsing te overbrengen in een 1,5 mL-buis. Plaatsen van de buizen op een magnetische rek, wachten tot de kralen vasthouden aan de kant van de buizen (ca. 1 min) en verwijderen van de opslag-buffer.
    2. Het wassen van de kralen door zachtjes te vermengen met 1 mL van de evenwichtsinstelling buffer (50 mM Tris pH 7-4, 150 mM NaCl, 0,05% Triton X-100 en 1 mM DTT).
    3. Verzending van de equilibrated kralen in gelijke hoeveelheid in het benodigde aantal buizen (gewoonlijk wanneer te beginnen met 3-3,5 mg eiwit inhoud, dat de lysates van elke voorwaarde kan worden verzonden in twee tot vier 1,5 mL buizen) en plaats terug op het magnetische rek.
    4. Verwijder de evenwichtsinstelling buffer en resuspendeer elke set van parels met gelijke hoeveelheden van de corresponderende cel lysates uit stap 4.4.7. Na een nacht bebroeden bij 4 ° C op een roterend wiel.
    5. Op de volgende dag, de 1,5 mL buisjes plaatsen op een magnetische rek, wachten tot de kralen aan de kant van de buizen vasthouden en het supernatant overbrengen in een tube van 15 mL aangeduid als Flow door.
      Opmerking: voortaan alle stappen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur tenzij anders aangegeven.
    6. Resuspendeer de kralen in elke buis met 200 μL van was buffer 1 (2% SDS in water), en elke set van geresuspendeerde kralen overeenkomt met één voorwaarde in 1,5 mL buizen combineren.
    7. Wassen van de kralen tweemaal gedurende 8 minuten op een rotatie wiel met 1 mL was buffer 1.
    8. Wassen van de kralen tweemaal gedurende 8 minuten op een rotatie wiel met 1 mL 2-was buffer (50 mM HEPES pH 7.4, 1 mM EDTA, 500 mM NaCl, 1% Triton X-100 en 0,1% nb-deoxycholate).
    9. Wassen van de kralen tweemaal gedurende 8 minuten op een rotatie wiel met 1 mL was buffer 3 (10 mM Tris pH 8, 250 mM LiCl, 1 mM EDTA, 0,5% NP-40, en 0,5% NB-deoxycholate).
    10. Wassen van de kralen tweemaal gedurende 8 minuten op een rotatie wiel met 1 mL was buffer 4 (50 mM Tris pH 7.4, 50 mM NaCl, 0,1% NP-40).
    11. Om ervoor te zorgen dat de wash-buffer wordt volledig verwijderd nadat de laatste wassen stap, allermeest naar de bovendrijvende vloeistof verwijderen en draai vervolgens naar beneden van de monsters. Zet ze terug op het magnetische rek, wachten tot de kralen aan de kant van de buizen vasthouden en verwijder vervolgens de resterende buffer.
    12. Voeg 30 l elutie buffer (10 mM Tris pH 7.4, 2% SDS, 5% β-mercaptoethanol en 2 mM Biotine) op de parels. Incubeer bij 98 ° C gedurende 15 minuten, waarna de kralen op een magnetische rek onmiddellijk te verwijderen.
    13. Overdracht van het eluted monster een verse buis en opslag bij-20 ° C totdat zij worden verwerkt.
  6. SDS-pagina en het westelijke bevlekken
    Opmerking: Vóór de analyse van de Spectrometrie van de massa, het is aanbevolen om te beoordelen van het succes van de biotinylation en de pulldown door SDS-pagina en westelijke vlek. Indien geen biotinylation patroon wordt waargenomen men kan oordelen dat dox of Biotine is niet toegevoegd aan het medium of dat een van de twee voorraadoplossingen in het gedrang komt.
    1. Voor elke invoer monster, bereid u een voorbeeld van de pagina door het mengen van gelijke hoeveelheden eiwitSteekproef met het juiste volume voor 3 x SDS-laden buffer in totaal 28 μL. Bereid pagina monsters door het mengen van 5 µL van elk monster elutie met 2,5 µL van 3 x SDS-laden buffer.
    2. Laden van de monsters (25 µL per putje voor ingangen, 7 µL per putje voor elutie monsters) op een SDS-polyacrylamide-gel. Ga naar elektroforese en Western blotting zoals beschreven in sectie 3.4.
    3. Als de keuzelijst voor de eerste keer uitvoert, bereid pagina monsters voor elke stap van de pulldown (Input, stroom door, Wash 1 – 4: elutie) door het mengen van 20 µL van elk monster (Input, stroom door, Wash 1 – 4) met 10 µL van 3 x SDS-laden buffer of 5 µL (elutie) met 2,5 µL van 3 x S DS-laden buffer en ga op stap 4.6.4 (Figuur 5).
  7. SDS-pagina voor MS analyse
    Opmerking: Om te minimaliseren van potentiële keratine besmetting, geprefabriceerd gels en commerciële monster laden buffer kunnen worden gebruikt.
    1. 6,25 μL van 4 x monster buffer toevoegen aan 18,75 μL van elk monster elutie en draaien van de monsters op een 4-20% voorgegoten SDS-gel totdat ze 2 – 3 cm in de gel migreren.
    2. De gel met colloïdaal Coomassie briljant blauw G25013 in een petrischaal 15 cm kleuring vlekken.
    3. Gebruik een schone scalpel de hele rijstroken voor elk monster, met uitzondering van de streptavidine band (uitgevoerd op ca. 17 kDa, Figuur 6), accijnzen en het overbrengen van de verwijderde bands naar 1,5 mL tubes.
    4. Stuur deze monsters tot een proteomics facility voor verdere analyse.
      Opmerking: MS (normaal) resultaten kunnen worden gezien in de verwijzing 9 (Figuur 3 en Figuur 7, en aanvullende tabellen). De hele datasets zijn beschikbaar op de trots repository (toetreding nummer PXD005005).

Representative Results

Om te illustreren hoe deze methode werkt, de open lezing frames (ORFs) van de eiwitten Ago2, werden TNRC6C en Dicer (alle betrokkenen in de miRNA-gemedieerde gen silencing traject) gekloond in split-BioID plasmiden. Ago2 is bekend voor interactie met TNRC6C binnen een miRNA-geïnduceerde silencing complex (miRISC) dat vertaling onderdrukt en verval van doel mRNAs14stimuleren. Voorafgaand aan het monteren van de miRISC, de Ago2 interactie met Dicer, het enzym dat volwassen miRNAs, binnen een complex waarin het krijgen met een miRNA15 geladen kanproduceert. Vandaar was split-BioID toegepast op de Ago2/Dicer pair of het paar Ago2/TNRC6C. Voor elk paar van geteste eiwitten was Ago2 een gesmolten te NBirA * CBirA * met behulp van onze split-BioID plasmiden (Figuur 2) en Dicer en TNRC6C naar de overeenkomstige cognaat BirA * fragment. Bovendien, elke proteïne was gesmolten tot CBirA * en gecombineerd met een NBirA *-GFP kernfusie als een negatieve controle. Dit resulteert in het testen van vier iteraties voor elk paar van geteste eiwit (tabel 1).

Om te testen of split-BioID wordt geactiveerd op de interactie van het paar van geteste eiwitten, volgden we de regeling afgebeeld op Figuur 1. De plasmiden waren Transient transfected in een tet-systeem compatibel HeLa cellijn. De expressie van de fusie-eiwitten is verkregen met doxycycline (dox) en biotinylation werd gestimuleerd door de overtollige Biotine toe te voegen aan het groeimedium. Na een incubatietijd van 20u met dox en biotine, werden cellen lysed en geanalyseerd door het westelijke bevlekken met behulp van geconjugeerd streptavidine biotinyleerd eiwitten. In de cellen van zoogdieren, twee grote bands worden meestal gedetecteerd door het geconjugeerd streptavidine in het untransfected monster (Figuur 3, sterren) en corresponderen met endogeen biotinyleerd eiwitten (waarschijnlijk mitochondriale carboxylases). Deze twee bands in alle monsters aanwezig zijn en gemakkelijk kunnen worden gebruikt als interne laden besturingselementen, de detectie van een eiwit huishouding waarmee het laden van gelijke eiwit bedragen is dus overbodig. Typisch voor een BioID/split-BioID experiment, de extra grote bands die kunnen worden waargenomen zijn de fusie-eiwitten die kreeg van zelf-biotinyleerd. Zelfs als geen andere biotinyleerd eiwit wordt gezien, opsporen van biotinylation van de fusie-eiwitten in dit stadium al geeft aan dat de twee geteste eiwitten interactie in de cellen. In het experiment afgebeeld op Figuur 3, is het duidelijk dat het hebben van een NBirA *-Ago2 fusieproteïne gecombineerd met CBirA * fusies te TNRC6C of Dicer is efficiënter dan het tegenovergestelde combinaties in welke CBirA *-Ago2 is gekoppeld aan NBirA * fusies van de andere twee eiwitten (Figuur 3, bovenste paneel, vergelijk de intensiteiten van 2-3 rijstroken aan rijstroken 6-7). Bovendien was de activering specifieke als geen van de CBirA *-fusies de NBirA activeren kunnen *-GFP controle fusieproteïne tot aanzienlijke niveaus (Figuur 3, vergelijk rijstroken 1, 4-5 aan steeg 8 die overeenkomt met untransfected cellen). Omdat in onze plasmiden, NBirA * een myc tag en CBirA * een vlag label (Figuur 2 heeft), kunnen de expressie niveaus van elke fusieproteïne worden geanalyseerd met antilichamen tegen deze twee codes (Figuur 3, onderste paneel).

Als interactie-geïnduceerde biotinylation wordt waargenomen, het experiment kan worden opgeschaald en de biotinyleerd eiwitten geïsoleerd op daar-coupled kralen, zoals aangegeven in punt 4 van het protocol (Figuur 4). Als u de isolatie, de eerste keer uitvoert, kunnen alle stappen van de zuivering worden geanalyseerd door Westelijke Bevlekkende (Figuur 5). Typisch, binding met de kralen moet bijna kwantitatieve en vrijwel geen lek via moet worden nageleefd in de wast. Voorafgaande verwerking van de monsters voor massaspectrometrie, raden wij uitgevoerd een westelijke vlek zodat geïnduceerde-biotinylation werkte zoals verwacht en dat de fusie-eiwitten naar voren zijn gebracht. Het gebrek aan expressie van de fusie-eiwitten is hetzij als gevolg van slechte transfectie efficiëntie of defecte dox inductie. Als de fusie-eiwitten naar voren zijn gebracht, maar geen biotinylation is waargenomen, controleert u of overtollige Biotine (50 μM) eigenlijk aan het medium zijn toegevoegd en dat de voorraad Biotine nog steeds actief is. Wanneer het eluted materiaal wordt geanalyseerd op een Coomassie gebeitste eiwit gel (Figuur 6), meestal, de sterkste band moeten worden genomen ongeveer 17 kDa prestatiestatus en komt overeen met monomeer daar. Bands die overeenkomt met de endogene biotinyleerd eiwitten en de fusie-eiwitten kunnen ook worden waargenomen. We meestal accijnzen het gebied van de baan van de steekproef boven de band daar tot het laden goed (Figuur 6). De verwijderde band kan worden opgeslagen in een tube van 1,5 mL en verzonden naar een faciliteit van de Spectrometrie van de massa. U kunt ook kunnen afhankelijke eiwitten ook trypsine-verteerd op de streptavidine-coupled parels en de verteerd peptiden geëlueerd vormen de kolom. Regelmatig gebruiken we de MaxQuant software16 (met behulp van meestal standaardparameters en lysine biotinylation als een eventuele posttranslationele wijziging toe te voegen, zie referentie 9 voor meer details en typische MS resultaten) om de MS ruwe gegevens te analyseren en de Perseus suite17 voor de latere statistische analyse, beide zijn gratis software. Monsters worden meestal uitgevoerd in drie biologische replicatieonderzoeken. Met behulp van label-vrije kwantificering, kunnen speciaal verrijkt eiwitten over controlevoorwaarden worden geïdentificeerd. Als u wilt filteren voor endogeen biotinyleerd eiwitten en proteïnen die niet-specifiek worden aangeduid door het BirA-enzym, vinden wij alleen eiwitten die aanzienlijk over treffers van zes datasets gegenereerd met zes onafhankelijke eiwitten verrijkt zijn. Daarnaast overwegen wij alleen hits die zijn verrijkt over een dataset van de split-BioID waarin de NBirA * fusie-eiwitten zijn vervangen door NBirA *-GFP. Andere data analyse strategieën zijn voorgesteld met name met behulp van stabiele isotoop labelen met aminozuren in celkweek (SILAC) voor kwantitatieve proteomics18. Daarnaast zijn verschillende strategieën beschreven voor de directe isolatie van peptides van de biotinyleerd met behulp van een streptavidine-variant met verzwakte affiniteit met biotine18, speciale elution voorwaarden met behulp van organische oplosmiddelen19 of Biotine-specifieke antilichamen20,21. Hoewel niet noodzakelijkerwijs leidt tot de ontdekking van meer eiwitten, de identificatie van biotinylation sites toevoegen meer vertrouwen over de specificiteit van de hits en is handig wanneer het aanpakken van de topologie van een interactie.

Figure 1
Figuur 1: overzicht van de procedure van de split-BioID. Eiwitten 1 interageert met eiwit 2 als onderdeel van complexe A of met eiwit 3 als onderdeel van complexe B. Als u wilt specifiek sonde de samenstelling van complexe A, kan split-BioID worden toegepast op eiwitten 1 en 2. De foto van de massaspectrometer is onder een Creative Commons Attribution-Share Alike 3.0 Unported licentie en werd gedownload van https://commons.wikimedia.org met de naam van het bestand van ThermoScientificOrbitrapElite.JPG. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: expressie cassettes van de split-BioID-plasmiden. Wij bieden vier plasmiden zodat testen alle combinaties van NBirA * en CBirA * fusie-eiwitten. De plasmiden en volledige kaarten zijn verkrijgbaar bij addgene.org onder de aangegeven nummers. De plasmiden hebben een tet-responsief element (7 x tetO) en moeten worden gebruikt in een cellijn die compatibel is met het tet expressie systeem. Merk ook op dat in alle plasmiden de ORFs van FKBP en FRB worden gesmolten tot de NBirA * en CBirA * respectievelijk fragmenten. Deze twee eiwitten interactie alleen in aanwezigheid van rapamycin en vandaar de plasmiden kunnen worden gebruikt om het systeem snel te testen in de aanwezigheid of afwezigheid van deze chemische9. De aangegeven beperkingsplaatsen zijn uniek. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: typische westelijke vlek voor een experiment van de split-BioID. Bovenste deelvenster: detectie van biotinyleerd eiwitten met fluorescently geëtiketteerde daar. Lagere paneel: detectie van de fusie-eiwitten met anti-Myc en Dizzee RASCAL antilichamen. Twee paren van eiwitten zijn getest: Ago2/TNRC6C en Ago2/Dicer. In rijstroken 2 & 3, werd Ago2 toegevoegd aan het CBirA-fragment. In rijstroken 6 & 7, werd Ago2 toegevoegd aan het NBirA-fragment. Geen significante signaal werd waargenomen wanneer om het even welk van de drie eiwitten werden gecombineerd met NBirA *-GFP (banen 1, 4-5). De sterren geven de bands overeenkomt met endogeen biotinyleerd eiwitten die als interne laden besturingselementen dienen kunnen. Dit percentage is aangepast van figuur 5B van Schopp et al. 9 onder een Creative Commons Naamsvermelding 4.0 internationaal-licentie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: overzicht van de procedure daar pulldown. Belangrijke stappen voor de isolatie van proteïnen van de biotinyleerd voor spectrometrische analyse worden afgebeeld. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5: typische westelijke vlek voor een experiment daar pulldown. Gelijke hoeveelheden van elk aangegeven monster werden geladen op een SDS-polyacrylamide-gel. Na het westelijke bevlekken, waren biotinyleerd eiwitten met HRP-coupled daar ontdekt. Bands die overeenkomt met NBirA *-TNRC6C en CBirA-Ago2 worden aangegeven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 6
Figuur 6: typisch Coomassie gebeitste eiwit gel massaspectrometrie p.a.. Het eluted monster van daar-coupled kralen was geladen op een geprefabriceerd eiwit-gel en uitgevoerd totdat het monster migreren 2-3 cm. De grote band gezien op ongeveer 17 kDa is daar. Het gebied direct boven die band wordt weggesneden en verstuurd naar een faciliteit van de Spectrometrie van de massa. Bands die overeenkomt met NBirA *-TNRC6C en CBirA-Ago2 worden aangegeven. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Voorbeeld van de Transfectie Voorwaarde getest
1 NBirA *-protein1 / CBirA *-protein2
2 CBirA *-protein1 / NBirA *-protein2
3 NBirA *-GFP / CBirA *-protein1
4 NBirA *-GFP / CBirA *-protein2
5 geen transfectie

Tabel 1: Getest meestal voorwaarden bij de toepassing van de split-BioID aan twee eiwitten.

Sequencing primer volgorde
Cassette 1 omgekeerde primer (CBirA * fusie) TATACTTTCTAGAGAATAGGAAC
Cassette 2 omgekeerde primer (NBirA * fusie) GTGGTTTGTCCAAACTCATC

Tabel 2: Sequencing inleidingen voor de split-BioID-plasmiden.

Discussion

De geschetste procedure beschrijft hoe te klonen van genen van belang in de split-BioID plasmiden, hoe om te testen voor interactie-geïnduceerde biotinylation en hoe te isoleren biotinyleerd eiwitten voor spectrometrische analyse. Hier beschrijven we een procedure op basis van voorbijgaande transfectie. Terwijl de expressie van de fusie-eiwitten kan worden afgesteld door de hoeveelheid dox toegevoegd aan het medium kan voorbijgaande transfectie leiden tot niet-homogene eiwit expressie met sommige cellen die grove overexpress het fusie-eiwitten in vergelijking met de endogene tegenhangers. Dit kan leiden tot verstoring van de bijbehorende interactomes en tot PPI die weerspiegelen niet getrouw de interacties die betrekking hebben op de endogene eiwitten. Het is dus in het algemeen aan te raden om te bouwen van stabiele cellijnen Zodra split-BioID is opgezet met het voorbijgaande systeem. De plasmiden zijn compatibel met het Flp-gemedieerde recombinatie systeem en plaats beide genen van belang onder de regulering van hetzelfde tet-responsief element. Indien nodig, en bij gebruik met compatibele zoogdiercellen, maken ze het gemakkelijk van stabiele afleidbare cellijnen. We gebruiken bijvoorbeeld de HeLa-EM2-11 lijn die spreekt uit de tetracycline-geactiveerde transcriptie activator van rtTA en een unieke targetable genomic locus waaruit tetracycline-gemedieerde genexpressie strak gereguleerde12kan worden. Met behulp van deze cellijn en Flp-gemedieerde recombinatie, kunnen stabiele cellijnen die slechts één exemplaar van de transgenic bevatten worden verkregen binnen twee of drie weken. Anderzijds kan men ook huidige genoom bewerkingstechnieken gebruiken om het BirA fragmenten in de inheemse genomic loci van de genen van belang.

Zoals in elke bepaling die afhankelijk is van een eiwit tagging, moet men overwegen als de resulterende fusie-eiwitten functioneel zijn. Beschikbare gegevens in die de proteïnen van belang waren gelabeld (bijvoorbeeld met GFP voor imaging studies) en functioneel getest zijn nuttig om te beslissen als de BirA-fragmenten moeten worden gekloond stroomopwaarts of stroomafwaarts de genen van belang. Als geen dergelijke gegevens beschikbaar zijn, moet een N-terminaal testen of C-terminaal gelabeld eiwitten in een functionele test. Bijvoorbeeld, kan de activiteit van de fusie-eiwitten worden getest in een cellijn waarin de endogene proteïne is knock-out en vergeleken met de situatie van de wild-type. Als de proteïnen van belang beide N - en C-terminal codes tolereren, moeten beide worden getest. Inderdaad, in BioID experimenten, de oriëntatie van de fusieproteïne kan beïnvloeden de efficiëntie van het labelen van22. Bovendien, hebben wij geconstateerd dat wanneer toepassing van split-BioID op een paar van eiwitten, welke van de twee eiwitten wordt toegevoegd aan hetzij de NBirA * of CBirA * fragment ook invloed de efficiëntie van het labelen van9. In de split-BioID-plasmiden, de 16 aminozuur lange glycine/serine rijke linkers koppelen van de proteïnen van belang aan de BirA-fragmenten werden overgenomen uit een ander PSO23 en werkte voor ons voor alle interacterende eiwitten we hebben getest tot nu toe. Men moet echter overwegen dat sommige paren eiwit beter zou kunnen met kortere of langere linkers werken. Van de definitieve nota, werd een ander assay beschreven door de Bollen groep24. In deze test, is BirA * verdeeld op een andere site (E140/Q141) dan de onze (E256/G257). We hebben getest zowel split-BioID smaken side-by-side en vond dat E256/G257, beschreven in dit protocol, tot sterkere Re-activering leidt wanneer gekoppeld aan twee interacterende eiwitten9.

Een algemeen nadeel van deze methode is de lage snelheid van labeling. De incubatietijd van 6 tot en met 24 h met biotine is meestal nodig zijn om merkbare biotinylation6, zich verzet tegen het gebruik van deze techniek voor de studie van dynamische remodelleren van eiwitcomplexen. Terwijl deze test gedeeltelijk adressen dit voorbehoud zoals het alleen geactiveerd wordt wanneer twee eiwitten interactie, de langzame snelheid van labeling beletsel voor het gebruik ervan voor de studie van de reactie op de zeer dynamische processen of analyseren van kortstondige eiwitten. De gemanipuleerde peroxydase APEX2 is bekend dat de bevordering van efficiënte etikettering van proximale eiwitten binnen 1 min3. Een PSO op basis van APEX2 kan dus de beperkingen van de trage labeling van BioID afkomstige tests pakken. Een bewijs-van-principe studie beschreven die een split-APEX2 assay25. Hoewel een homodimerizing eiwit met succes biotinyleerd was, blijft of de test ook gebruikt kan worden voor het label en het identificeren van eiwitten die rond een paar interacterende eiwitten verzamelen echter om te worden aangetoond. Zeer onlangs, gerichte evolutie werd gebruikt om TurboID en miniTurbo, twee varianten van het BirA met verbeterde activiteit waarmee veel korter labeling tijd windows, tot 10 min26te maken. Split-BioID naar deze nieuwe varianten aan te passen zal een verdere uitbreiding van het gebruik van deze techniek tot een breder gebied van toepassingen.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd gefinancierd door de Duitse Onderzoeksraad (DFG) via het Duitse excellence-initiatief (CellNetworks DFG-EXC 81) en een gedeeltelijke financiering door het centrum voor onderzoek in samenwerkingsverband SFB638.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid (glacial) VWR 20104.298 To make TAE buffer
Agarose Sigma A9539 Take TAE-agarose gels for DNA analysis and extraction
Ammonia solution 25% NH3 Bernd Kraft 6012 To dissolve biotin
Ampicillin Sigma A9518 To select transformed bacteria
Bioruptor plus sonification device Diagenode B01020001 Other sonification devices are also ok
Biotin Sigma B4639 To be added to the growth medium to stimulate efficient biotinylation
Bovine serum albumin fraction V Carl Roth 8076 Used in Western blot buffers and a protein standard in Bradford assays
Bradford Ultra reagent Expedeon BFU05L Any other method/kit for protein determination is fine, this particular reagent is more tolerant to detergent than other Bradford reagents
Cell scrappers TPP 99002 Any other model is also fine
ClaI New England Biolabs R0197 Restriction enzyme for cloning into the split-BioID plasmids (NBirA* fusion)
DMEM medium Sigma D6046 If using another cell line, use the corresponding optimal growth medium
DNA miniprep kit Sigma PLN350 Any other kit is also fine
Doxycycline Applichem A2951 Dox is light sensitive
DTT Applichem A2948 Make 1M stock solution, store at -20 °C and always use fresh
DyLight 680-conjugated streptavidin Thermo scientific 21848 to use with a LiCor Western blot scanning device
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Invitrogen 65002 The C1 beads are not BSA coated which is preferable for downstream MS applications (no leakthrough of BSA in the final elution)
EDTA Applichem A5097 Make a 500 mM stock, adjust pH to 8 while dissolving the EDTA powder
Ethanol Sigma 32205 Make a 70% stock solution in which Doxycycline can be dissolved at 10 mg.mL-1
Fastgene Gel/PCR DNA Extraction Kit Nippon Genetics FG-91302 Any other kit is also fine
HCl 37% Merck 1.00317.1000 To adjust pH of biotin stock solution
HEPES Carl Roth 6763 Make a 500 mM stock solution, adjust the pH to 7.4
Immobilon-FL PVDF membrane, 0.45 µm Millipore IPFL00010 This membrane shows minimal autofluorescence when used with a LiCor Western blot scanning device
LiCl Grüssing GmbH 12083 Make a 5M stock solution
Odyssey CLx imaging system LI-COR N/A To scan Western blot membrane decorated with fluorophore-labeled antibody
Linear polyethylenimine (PEI) Polysciences 23966-2 Any other transfection reagent is also fine
Milk powder Carl Roth T145 To block Western blot membranes
MluI-HF New England Biolabs R3198 Restriction enzyme for cloning into the split-BioID plasmids (NBirA* fusion)
Na-deoxycholate Sigma 30970 Make a 10% (w/v) stock solution
NaCl Sigma 31434 Make a 5M stock solution
NP-40 (Nonidet P40 substitute) Sigma 74385 Make a 20% (v/v) stock solution
PacI New England Biolabs R0547 Restriction enzyme for cloning into the split-BioID plasmids (CBirA* fusion)
Phosphate buffer saline (PBS) Sigma 806552 To wash cells before scrapping
PmeI New England Biolabs R0560 Restriction enzyme for cloning into the split-BioID plasmids (CBirA* fusion)
Protease inhibitor cocktail Roche 4693132001 Added to the lysis buffer to prevent protein degradation
pSF3-Flag-CBir-FRB_Myc-NBir-FKBP Addgene 90003 Split-BioID plasmid, mediates the co-expression of NBirA*-FKBP and CBirA*-FRB, FKBP and FRB can be replaced by two other ORFs
pSF3-Flag-CBir-FRB_FKBP-Myc-Nbir Addgene 90004 Split-BioID plasmid, mediates the co-expression of FKBP-NBirA* and CBirA*-FRB, FKBP and FRB can be replaced by two other ORFs
pSF3-Flag-FRB-Cbir_Myc-NBir-FKBP Addgene 90008 Split-BioID plasmid, mediates the co-expression of NBirA*-FKBP and FRB-CBirA*, FKBP and FRB can be replaced by two other ORFs
pSF3-Flag-FRB-Cbir_FKBP-Myc-Nbir Addgene 90009 Split-BioID plasmid, mediates the co-expression of FKBP-NBirA* and FRB-CBirA*, FKBP and FRB can be replaced by two other ORFs
Q5 High-Fidelity PCR kit New England Biolabs E0555S To amplify the ORF coding for the proteins to be tested. Any other thermostable DNA polymerase is fine.
Quick ligation kit New England Biolabs M2200S To ligate DNA fragments into the split-BioID plasmids, any other DNA ligation system is fine.
RunBlue 4-20% SDS precast gels Expedeon BCG42012 To use when running samples for MS analysis
RunBlue LDS Sample Buffer Expedeon NXB31010 Running buffer for the RunBlue precast gels
SDS Sigma 5030 Comes as a 20% stock solution
tet-free serum Biowest S181T we use tet-free serum to minimize basal expression of the fusion proteins
Trans-Blot Turbo Transfer system Bio-Rad 1704150 High speed Western blotting transfer system, any other transfer system is also fine
Tris Carl Roth 4855 Make 1M stock solutions with adequate pH (7.4 and 8)
Triton X-100 Applichem A4975 Make a 20% (v/v) stock solution
Tween-20 Carl Roth 9127 Used in Western blot buffers, Tween 20 leads to high background fluorescence and should be omitted in the blocking and last wash step

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Scott, D. E., Bayly, A. R., Abell, C., Skidmore, J. Small molecules, big targets: drug discovery faces the protein-protein interaction challenge. Nat Rev Drug Discov. 15 (8), 533-550 (2016).
  2. Roux, K. J., Kim, D. I., Raida, M., Burke, B. A promiscuous biotin ligase fusion protein identifies proximal and interacting proteins in mammalian cells. J Cell Biol. 196 (6), 801-810 (2012).
  3. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nat Methods. 12 (1), 51-54 (2015).
  4. Rhee, H. W., et al. Proteomic mapping of mitochondria in living cells via spatially restricted enzymatic tagging. Science. 339 (6125), 1328-1331 (2013).
  5. Kim, D. I., et al. Probing nuclear pore complex architecture with proximity-dependent biotinylation. P Natl Acad Sci USA. 111 (24), E2453-E2461 (2014).
  6. Kim, D. I., et al. An improved smaller biotin ligase for BioID proximity labeling. Mol Biol Cell. 27 (8), 1188-1196 (2016).
  7. Lambert, J. P., Tucholska, M., Go, C., Knight, J. D., Gingras, A. C. Proximity biotinylation and affinity purification are complementary approaches for the interactome mapping of chromatin-associated protein complexes. J Proteomics. 118, 81-94 (2015).
  8. Morriswood, B., et al. Novel bilobe components in Trypanosoma brucei identified using proximity-dependent biotinylation. Eukaryot Cell. 12 (2), 356-367 (2013).
  9. Schopp, I. M., et al. Split-BioID a conditional proteomics approach to monitor the composition of spatiotemporally defined protein complexes. Nat Commun. 8, (2017).
  10. Béthune, J., Artus-Revel, C. G., Filipowicz, W. Kinetic analysis reveals successive steps leading to miRNA-mediated silencing in mammalian cells. EMBO Rep. 13 (8), 716-723 (2012).
  11. Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 96 (1), 23-28 (1990).
  12. Weidenfeld, I., et al. Inducible expression of coding and inhibitory RNAs from retargetable genomic loci. Nucleic Acids Res. 37 (7), e50 (2009).
  13. Dyballa, N., Metzger, S. Fast and sensitive colloidal coomassie G-250 staining for proteins in polyacrylamide gels. J Vis Exp. (30), (2009).
  14. Jonas, S., Izaurralde, E. Towards a molecular understanding of microRNA-mediated gene silencing. Nat Rev Genet. 16 (7), 421-433 (2015).
  15. MacRae, I. J., Ma, E., Zhou, M., Robinson, C. V., Doudna, J. A. In vitro reconstitution of the human RISC-loading complex. P Natl Acad Sci USA. 105 (2), 512-517 (2008).
  16. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nat Biotechnol. 26 (12), 1367-1372 (2008).
  17. Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nat Methods. 13 (9), 731-740 (2016).
  18. Opitz, N., et al. Capturing the Asc1p/Receptor for Activated C Kinase 1 (RACK1) Microenvironment at the Head Region of the 40S Ribosome with Quantitative BioID in Yeast. Mol Cell Proteomics. 16 (12), 2199-2218 (2017).
  19. Mackmull, M. T., et al. Landscape of nuclear transport receptor cargo specificity. Mol Syst Biol. 13 (12), 962 (2017).
  20. Kim, D. I., et al. BioSITe: A Method for Direct Detection and Quantitation of Site-Specific Biotinylation. J Proteome Res. , (2017).
  21. Udeshi, N. D., et al. Antibodies to biotin enable large-scale detection of biotinylation sites on proteins. Nat Methods. 14 (12), 1167-1170 (2017).
  22. Chapat, C., et al. Cap-binding protein 4EHP effects translation silencing by microRNAs. P Natl Acad Sci USA. 114 (21), 5425-5430 (2017).
  23. Luker, K. E., et al. Kinetics of regulated protein-protein interactions revealed with firefly luciferase complementation imaging in cells and living animals. P Natl Acad Sci USA. 101 (33), 12288-12293 (2004).
  24. De Munter, S., et al. Split-BioID: a proximity biotinylation assay for dimerization-dependent protein interactions. FEBS Lett. 591 (2), 415-424 (2017).
  25. Xue, M., et al. Optimizing the fragment complementation of APEX2 for detection of specific protein-protein interactions in live cells. Sci Rep. 7 (1), 12039 (2017).
  26. Branon, T. C., et al. Directed evolution of TurboID for efficient proximity labeling in living cells and organisms. bioRxiv. , (2017).

Tags

Biochemie kwestie 134 BioID proteomics Eiwittechnologie eiwit-fragmenten complementatie assay eiwit-eiwitinteractie nabijheid labeling
Split-BioID — Proteoom analyse van Context-specifieke eiwitcomplexen in hun inheemse cellulaire omgeving
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schopp, I. M., Béthune, J.… More

Schopp, I. M., Béthune, J. Split-BioID — Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment. J. Vis. Exp. (134), e57479, doi:10.3791/57479 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter