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Biochemistry

भाजित-BioID-Proteomic उनके देशी सेलुलर वातावरण में संदर्भ विशिष्ट प्रोटीन परिसरों का विश्लेषण

Published: April 20, 2018 doi: 10.3791/57479
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Cluster of excellence CellNetworks, Heidelberg University, 2Heidelberg University Biochemistry Center (BZH)

Summary

हम विभाजन-BioID, एक प्रोटीन टुकड़े-पूरक परख निकटता लेबलिंग तकनीक BioID के आधार पर के लिए एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं । दो दिया प्रोटीन की बातचीत पर सक्रिय, यह अपने देशी सेलुलर वातावरण में संदर्भ निर्भर प्रोटीन परिसरों के प्रोटियोमिक् विश्लेषण की अनुमति देता है । विधि सरल, लागत प्रभावी है और केवल मानक प्रयोगशाला उपकरणों की आवश्यकता है ।

Abstract

प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन (पीपीआई) की पहचान के लिए मौजूदा संबध शुद्धिकरण (AP) दृष्टिकोणों को पूरक करने के लिए, एंजाइमों का परिचय दिया गया है जो जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन की निकटता पर निर्भर लेबलिंग की अनुमति देते हैं । एक ऐसा एंजाइम, बिरा * (BioID दृष्टिकोण में प्रयुक्त), लगभग 10 एनएम की एक सीमा के भीतर प्रोटीन की biotinylation मध्यस्थता । इसलिए, जब ब्याज की एक प्रोटीन से जुड़े और कोशिकाओं में व्यक्त की, यह अपने पैतृक वातावरण में समीपस्थ प्रोटीन के लेबल की अनुमति देता है । एपी के विरोध के रूप में है कि इकट्ठे प्रोटीन परिसरों की शुद्धि पर निर्भर करता है, BioID का पता लगाता है प्रोटीन है कि कोशिकाओं के भीतर चिह्नित किया गया है कोई फर्क नहीं पड़ता कि वे अभी भी ब्याज के प्रोटीन के साथ बातचीत कर रहे है जब वे अलग कर रहे हैं । यह समीपस्थ प्रोटीन biotinylates के बाद से, एक इसके अलावा बहुत कुशलता से उन्हें अलग करने के लिए बायोटिन के लिए streptavidin के असाधारण संबंध पर कैपिटल कर सकते हैं । जबकि BioID क्षणिक या कमजोर बातचीत की पहचान के लिए एपी से बेहतर प्रदर्शन, दोनों एपी और BioID-मास स्पेक्ट्रोमेट्री दृष्टिकोण हर संभव बातचीत एक दिया प्रोटीन हो सकता है की एक सिंहावलोकन प्रदान करते हैं । हालांकि, वे प्रत्येक पहचान पीपीआई के संदर्भ में जानकारी प्रदान नहीं करते हैं । दरअसल, ज्यादातर प्रोटीन आमतौर पर कई परिसरों का हिस्सा हैं, अलग परिपक्वता कदम या विभिंन कार्यात्मक इकाइयों के लिए इसी । दोनों तरीकों की इस आम सीमा का पता है, हम एक प्रोटीन-टुकड़े पूरक परख बिरा * एंजाइम के आधार पर इंजीनियर है । इस परख में, बिरा के दो निष्क्रिय टुकड़े * एक सक्रिय एंजाइम में फिर से इकट्ठा कर सकते है जब दो बातचीत प्रोटीन जो वे जुड़े हुए है द्वारा करीब निकटता में लाया । जिसके परिणामस्वरूप विभाजन-BioID परख इस प्रकार प्रोटीन का लेबल है कि चारों ओर बातचीत प्रोटीन की एक जोड़ी इकट्ठा अनुमति देता है । बशर्ते इन दोनों केवल एक दिए गए संदर्भ में बातचीत, विभाजन-BioID तो उनके देशी सेलुलर वातावरण में विशिष्ट संदर्भ पर निर्भर कार्यात्मक इकाइयों के विश्लेषण की अनुमति देता है । यहाँ, हम परीक्षण करने के लिए एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं और एक जोड़ी प्रोटीन बातचीत करने के लिए विभाजन BioID लागू.

Introduction

के रूप में सबसे सेलुलर कार्यों प्रोटीन है कि गतिशील macromolecular परिसरों को इकट्ठा द्वारा प्रदर्शन कर रहे हैं, प्रोटीन की पहचान-प्रोटीन बातचीत (पीपीआई) जैव चिकित्सा अनुसंधान में एक प्रमुख प्रयास है । दरअसल, पीपीआई अक्सर रोग में विनियमित रहे है और चिकित्सकीय के लिए संभावित लक्ष्यों का प्रतिनिधित्व1। पीपीआई की पहचान के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया विधि समानता शुद्धि (एपी) दृष्टिकोण है, जिसमें सेल lysis, ब्याज की एक प्रोटीन विशेष रूप से एक मैट्रिक्स पर शुद्ध है और संबंधित प्रोटीन बाद में जन स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा की पहचान की है (MS) । जबकि एपी एमएस एक शक्तिशाली दृष्टिकोण है, यह आमतौर पर खराब घुलनशील प्रोटीन परिसरों, बहुत क्षणिक बातचीत या पीपीआई कि एक बरकरार सेलुलर संरचना की आवश्यकता पर अच्छी तरह से प्रदर्शन नहीं करता है । इसके अलावा, डेटा की व्याख्या पीपीआई नेटवर्क के गतिशील स्वभाव से जटिल हो सकती है, क्योंकि एक भी प्रोटीन अक्सर कई विशिष्ट प्रोटीन कॉम्प्लेक्स का हिस्सा होता है ।

निकटता-लेबलिंग तकनीक जैसे BioID2 या APEX23,4 हाल ही में एपी एमएस दृष्टिकोण की सीमाओं में से कुछ को संबोधित करने के लिए विकसित किए गए । BioID में, एंजाइम बिरा * (जंगली प्रकार ई. कोलाई एंजाइम के एक G115R संस्करण के लिए इसी) labile biotinyl के गठन catalyzes-amp (जैव amp) कि प्राथमिक अमीन के साथ प्रतिक्रिया कर सकते हैं. के रूप में जंगली प्रकार एंजाइम का विरोध किया, कि अपने सक्रिय केंद्र में जैव amp बरकरार रखती है, बिरा * अपने पड़ोसी वातावरण के लिए इसके प्रसार की अनुमति जैव amp विज्ञप्ति. इसलिए, जब ब्याज की एक प्रोटीन से जुड़े हुए और कोशिकाओं में व्यक्त की है, समीपस्थ प्रोटीन 10 एनएम के एक अनुमानित सीमा के भीतर biotinylated जा सकता है5। इन चिह्नित समीपस्थ प्रोटीन तो streptavidin pulldown द्वारा पृथक कर रहे है और एमएस द्वारा की पहचान की । एपी-एमएस के विरोध के रूप में, BioID एक फ्यूजन प्रोटीन की अभिव्यक्ति की आवश्यकता है । यह इस प्रकार केवल जिसका समारोह टैगिंग से बाधा नहीं है प्रोटीन के लिए लागू किया जा सकता है । इसके अलावा, लेबलिंग की गति धीमी है, आमतौर पर 6-24 ज2,6, कम रहते थे चुनौतीपूर्ण प्रोटीन का पता लगाने । फिर भी, एपी की तुलना में, एमएस, BioID-ms कई प्रमुख लाभ प्रदान करता है: पहले, अपनी अपनी देशी सेलुलर पर्यावरण में बातचीत कब्जा; दूसरा, लेबल प्रोटीन के बजाय इकट्ठे परिसरों कोशिका lysis के बाद अलग कर रहे हैं; तीसरा, streptavidin pulldowns denaturing बफ़र्स और कठोर धोने की स्थिति का उपयोग कर अनुमति देते हैं । इसलिए, विधि क्षणिक या कमजोर बातचीत का पता लगाने के लिए अधिक संवेदनशील है7 या बातचीत है कि एक विशिष्ट और सेलुलर संरचना को अलग करने के लिए कठिन पर होते है8।

हालांकि, सबसे प्रोटीन आम तौर पर बड़े परिसरों का हिस्सा है कि सेलुलर cues या समारोह की जरूरत है कि प्रदर्शन करने के लिए के अनुसार remodel कर सकते हैं । इसलिए, एक एकल प्रोटीन आम तौर पर कई परिसरों का हिस्सा है, विशिष्ट कार्यात्मक इकाइयों के लिए इसी, अलग शामिल है और/ दोनों दृष्टिकोण सभी संघों एक दिया प्रोटीन हो सकता है की एक सिंहावलोकन दे, लेकिन वे व्यक्तिगत पीपीआई के संदर्भ को संबोधित करने में विफल । बाद के संकल्प को बढ़ाने के लिए, हम एक प्रोटीन-टुकड़े पूरक परख (पीसीए) डिजाइन किया है जिसमें बिरा * (NBirA *, कि उत्प्रेरक डोमेन शामिल है, और CBirA * कि पुनः के रूप में देखा जा सकता है के दो निष्क्रिय टुकड़े-सक्रियकरण डोमेन) एक सक्रिय एंजाइम में फिर से इकट्ठा जब दो बातचीत प्रोटीन9से करीब निकटता में लाया । जिसके परिणामस्वरूप विभाजन-BioID परख प्रोटीन पर निकटता-निर्भर biotinylation है कि एक जोड़ी के आसपास इकट्ठा प्रोटीन पर केंद्रित है और इस तरह संदर्भ निर्भर प्रोटीन विधानसभाओं की पहचान की अनुमति देता है । हम हाल ही में दो अलग प्रोटीन miRNA में शामिल परिसरों-मध्यस्थता जीन-मुंह बंद करनेमार्ग9 को हल करके विभाजित-BioID के बकाया संकल्प शक्ति का प्रदर्शन किया ।

कुल मिलाकर, एक एकल और सरल परख, विभाजन BioID की खोज और विशेष रूप से पीपीआई निर्दिष्ट करने के लिए परिभाषित कार्यात्मक इकाइयों जिसमें एक दिया प्रोटीन शामिल है की अनुमति देता है, एक अतिरिक्त इसी प्रोटीन परिसर के प्रोटीन बातचीत में जाना जाता है प्रदान की ।

Protocol

नोट: विधि का ओवरव्यू चित्र 1पर दिखाया गया है ।

1. क्लोनिंग रणनीति की योजना

  1. परीक्षण करने के लिए दो putatively बातचीत प्रोटीन का चयन करें ।
    नोट: दो प्रोटीन के प्रत्येक एक विभाजन BioID टुकड़ा से जुड़े हो जाएगा: या तो NBirA * या CBirA * । एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में, CBirA * फ्यूजन प्रोटीन NBirA * ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (NBirA *-GFP) से जुड़े के साथ परीक्षण किया जाएगा । एक अतिरिक्त नियंत्रण के रूप में, NBirA * फ्यूजन अकेले परीक्षण किया जा सकता है, cognate CBirA * फ्यूजन या एक CBirA * एक असंबंधित प्रोटीन से जुड़े हुए के साथ संयोजन में बिना । यह एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में CBirA *-GFP का उपयोग करने के लिए उचित नहीं है के रूप में यह लगातार प्रमुख पृष्ठभूमि जब किसी भी NBirA * फ्यूजन प्रोटीन9करने के लिए संयुक्त करने के लिए नेतृत्व दिखाया गया था । इस अवलोकन के कारण CBirA *-GFP की अभिव्यक्ति का स्तर हो सकता है, बहुत अधिक किसी भी अन्य CBirA * फ्यूजन प्रोटीन हम अब तक इस्तेमाल किया है, कि NBirA के साथ महत्वपूर्ण reसंबद्धता के लिए नेतृत्व कर सकते हैं * टुकड़ा.
  2. एक बार दो प्रोटीन का चयन कर रहे हैं, कि क्या दोनों पहले से ही सफलतापूर्वक कार्यात्मक अध्ययन में टैग किया गया है खोजने के लिए साहित्य की जांच (उदाहरण के लिए एक GFP-टैग संलयन प्रोटीन के रूप में) ।
    1. यदि ऐसे अध्ययन मौजूद हैं, तो टैग की स्थिति को नोट करें (एन-या सी-टर्मिनस पर) और विभाजित-BioID अंशों के साथ रुचि के प्रोटीनों को टैग करने के लिए उसी अभिविन्यास का उपयोग करते हैं.
    2. यदि ऐसा कोई अध्ययन मौजूद है, योजना दोनों प्रोटीन के लिए कोडिंग का निर्माण करता है एन और सी में टैग-टर्मिनस और एक परख योजना के लिए फ्यूजन प्रोटीन की कार्यक्षमता का परीक्षण (उदाहरण के लिए, एक सेल लाइन में एक बचाव प्रयोग WT प्रोटीन के लिए समाप्त) ।
      नोट: जब दो फ्यूजन प्रोटीन बाँधना plasmids का उपयोग करते हुए चित्रा 2 में वर्णित है कि लंबे समय लचीला लिंक सांकेतिक शब्दों में बदलना, फ्यूजन प्रोटीन के उंमुखीकरण (बिरा * टुकड़े ऊपर या ब्याज के नीचे की बहाव से जुड़े) आम तौर पर कोई फर्क नहीं पड़ता . वास्तव में FRB और FKBP का प्रयोग मॉडल प्रोटीन के रूप में, यह दिखाया गया है कि सभी चार संभव पुनरावृत्तियों (n पर दोनों टुकड़े-टर्मिनी, दोनों सी पर-टर्मिनी, एन में एक-टर्मिनस और अंय सी-टर्मिनस, और इसके विपरीत) उपज तुलनीय biotinylation9।
  3. डिजाइन प्राइमरों भाजित-BioID plasmids में क्लोनिंग के लिए ब्याज की दो प्रोटीन के ORFs बढ़ाना । ध्यान दें कि अनुवाद फ्रेम बिरा * टुकड़े के रूप में ही कर रहे हैं । यदि चित्रा 2में वर्णित plasmids का उपयोग कर, प्रतिबंध एंजाइमों PmeI और PacI के निर्माण के लिए CBirA * संलयन का उपयोग करें, और एंजाइमों ClaI और MluI * संलयन NBirA के लिए ।
    नोट: plasmids चित्रा 2 में चित्रित किया एक द्वि-दिशात्मक tet-उत्तरदायी तत्व F3/FRT पुनर्संयोजन साइटों द्वारा पार्श्व ले । यह एक ही प्लाज्मिड से दोनों संलयन प्रोटीन के लगभग एक ही स्तर पर विनियमित सह अभिव्यक्ति की अनुमति देता है10, और संभावना को तेजी से संयोजन द्वारा स्थिर सेल लाइनों का निर्माण-मध्यस्थता कैसेट एक्सचेंज (RMCE) । इन plasmids में, NBirA * में एक myc टैग है जबकि CBirA * में एक फ्लैग टैग है । ORFs पाठ्यक्रम का भी गठन प्रमोटरों के साथ व्यक्तिगत plasmids पर क्लोन किया जा सकता है ।
    महत्वपूर्ण चरण: जब परीक्षण दो प्रोटीन बातचीत, यह NBirA की तुलना करने के लिए सिफारिश की है * 1 CBirA के साथ संयुक्त प्रोटीन से जुड़े * 2 प्रोटीन से जुड़े हुए, और NBirA * प्रोटीन से जुड़े 2 CBirA के साथ संयुक्त * 1 प्रोटीन से जुड़े हुए । वास्तव में, यह अक्सर देखा है कि एक चलना दूसरे से बेहतर काम करता है ।

2. विभक्ति में रुचि के जीन के ORFs की क्लोनिंग-BioID प्लाज्मिड

नोट: इस उदाहरण में, N-टर्मिनस पर टैग किया जा सकता दो प्रोटीन माना जाता है । चार शर्तों का परीक्षण किया जाएगा और गैर-transfected कक्षों (तालिका 1) की तुलना की जाएगी ।

  1. उपयुक्त प्राइमरों के साथ परीक्षण किए जाने वाले दो प्रोटीनों के ORFs को बढ़ाना पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) का उपयोग करना. डिजाइन प्राइमर कि NBirA * फ्यूजन प्रोटीन के लिए ClaI और MluI प्रतिबंध साइटों को लागू करने, और PmeI * फ्यूजन प्रोटीन के लिए PacI और CBirA साइटों ।
    नोट: पीसीआर किसी भी व्यावसायिक, अधिमानी ठीक करना, डीएनए पोलीमरेज़ के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है । पुस्तिका से मानक प्रोटोकॉल का पालन करें और यह प्राइमरों के पिघलने के तापमान और ओआरएफ की लंबाई के लिए अनुकूलित करने के लिए निर्माता के दिशा निर्देशों के अनुसार परिलक्षित हो ।
  2. उपक्लोन पहले ओआरएफ
    1. दोनों प्लाज्मिड (के बारे में 2 μg) और पीसीआर-प्रवर्धित ORF1 डाइजेस्ट ClaI और MluI के साथ (NBirA * से जुड़े होने के लिए) । प्रत्येक एंजाइम के 1 μL का उपयोग कर पाचन प्रतिक्रियाओं का प्रदर्शन, ३७ डिग्री सेल्सियस पर 1 ज के लिए एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में 20 μL की कुल मात्रा में डीएनए और प्रतिक्रिया बफर की उचित मात्रा के साथ मिश्रित ।
    2. एक 1% agarose पर दोनों पाचन नमूने भागो-ताे डीएनए जेल । एक्साइज बैंड्स इसी से पच प्लाज्मिड और ORF1 को क्लीन स्केलपेल के साथ और १.५ एमएल ट्यूबों को ट्रांसफर कर दिया ।
    3. दोनों एक मानक डीएनए निष्कर्षण किट का उपयोग कर बैंड शुद्ध ।
    4. Ligate पचता प्लाज्मिड और ORF1 मानक रिएजेंट का उपयोग कर ।
      1. यदि बंधाव किट का उपयोग कर सामग्री की तालिकामें संकेत दिया, ligate १०० डीएनए के एनजी ४.५ μL की कुल मात्रा में तीन से पांच बार दाढ़ अतिरिक्त डालने पर प्लाज्मिड से युक्त । 2x टी-4 ligase बफर और बंधाव किट से टी-4 डीएनए ligase के ०.५ μL के 5 μL जोड़ें । कमरे के तापमान (आरटी) में 10 मिनट के लिए एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब में बंधाव प्रतिक्रिया करते हैं ।
    5. मानक डीएच-5 α ई. कोलाई सक्षम कोशिकाओं में परिणत (Inoue की विधि 11 के अनुसार तैयार) ।
      1. मिश्रण 3 बर्फ पर १.५ मिलीलीटर ट्यूब में सक्षम कोशिकाओं के ५० μL के साथ बंधाव प्रतिक्रिया के μL और 30 मिनट के लिए मशीन । 30-45 s के लिए ४२ ° c करने के लिए सेट एक गर्मी ब्लॉक करने के लिए कोशिकाओं को हस्तांतरण और फिर 2 मिनट के लिए बर्फ पर वापस मशीन । जोड़ें २५० पूर्व के μL-गरम (३७ डिग्री सेल्सियस) lysogeny शोरबा (LB) मध्यम और प्लेट १०० μL पर कोशिकाओं की एक पूर्व गर्म (३७ डिग्री सेल्सियस) एम्पीसिलीन युक्त पौंड-आगर प्लेट । ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात भर कोशिकाओं की मशीन ।
    6. अगले दिन पर, चार से छह कालोनियों उठाओ और उंहें ३७ ° c, १८० rpm पर गर्मी, पौंड मध्यम के 3 मिलीलीटर में रात भर १०० μg ⋅ मिलि-1 एम्पीसिलीन एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में ।
    7. एक मानक डीएनए MiniPrep किट का उपयोग कर उठाया कालोनियों से plasmids को अलग ।
    8. कैसेट 2 रिवर्स प्राइमर (तालिका 2) का उपयोग करके plasmids की शुद्धता को सत्यापित करें ।
  3. एक बार एक प्लाज्मिड युक्त पहले ओआरएफ की पहचान की गई है, उपक्लोन है कि प्लाज्मिड में दूसरा ओआरएफ कदम २.२ के रूप में एक ही कदम निंनलिखित लेकिन PmeI और PacI एंजाइमों का उपयोग कर ।
  4. परिणामस्वरूप plasmids कैसेट 1 रिवर्स प्राइमर (2 तालिका) का उपयोग कर अनुक्रम ।

3. फ्यूजन प्रोटीन का परीक्षण

नोट: निम्नलिखित निर्देश दोहरी inducible अभिव्यक्ति plasmids के लिए कर रहे हैं (चित्रा 2) और हेला-11ht कोशिकाओं, एक उपक्लोनी हेला-CCL2 सेल लाइन, छुरा रिवर्स टेट्रासाइक्लिन नियंत्रित प्रतिलेखन उत्प्रेरक rtTA-M2 व्यक्त और एक युक्त RMCE के लिए लोकस12. इन कोशिकाओं के लिए विकास के माध्यम Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) 10% टेट्रासाइक्लिन मुक्त भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) युक्त है । जब एक और कोशिका प्रकार, सटीक बोने की स्थिति और विकास माध्यम का उपयोग करने के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता होगी ।

  1. क्षणिक अभिकर्मक
    1. 1 x 105 कोशिकाओं के एक एकाग्रता पर बीज कोशिकाओं में एक छह अच्छी तरह से थाली अभिकर्मक से पहले दिन और ३७ ° c, 5% एक सेल संस्कृति मशीन में2 सह पर रात भर की कोशिकाओं के प्रति 2 मिलीलीटर में ।
    2. अभिकर्मक के दिन, प्रत्येक कुआं के माध्यम को निकालें और ताजा माध्यम के 2 मिलीलीटर के साथ प्रतिस्थापित करें ।
    3. तालिका 1के अनुसार चार अभिकर्मक प्रतिक्रियाओं को तैयार करें । प्रत्येक अच्छी तरह से transfect करने के लिए, एक १.५ मिलीलीटर बाँझ ट्यूब में प्लाज्मिड डीएनए के 3 µ g करने के लिए polyethylenimine के 6 µ जी जोड़ें और सीरम के बिना µ माध्यम के साथ ५०० DMEM एल को भरें ।
    4. प्रत्येक अच्छी तरह से छोड़ने के लिए बुद्धिमान जोड़ने से पहले कमरे के तापमान पर न्यूनतम 5 मिनट के लिए प्रत्येक अभिकर्मक मिश्रण की मशीन । ३७ ° c, 5% CO2पर रात भर कोशिकाओं गर्मी ।
  2. प्रेरण और निकटता-लेबलिंग
    1. अभिकर्मक के बाद दिन, मध्यम निकालें और ५० µ m पर बायोटिन के साथ पूरक के साथ की जगह को उत्तेजित करने के लिए biotinylation और doxycycline पर २०० एनजी ⋅ एमएल−1 फ्यूजन प्रोटीन की अभिव्यक्ति प्रेरित करने के लिए । ३७ ° c, 5% CO2पर कम से 20 h के लिए कक्षों को मशीन करें ।
      1. बायोटिन की एक शेयर समाधान बनाने के लिए, ५० mg ⋅ एमएल-1 ( ca. २०० मिमी के अनुरूप) में बायोटिन भंग 2 M अमोनियम हीड्राकसीड. एक बार यह पूरी तरह से भंग हो गया है, यह ५०० mm Hepes, पीएच ७.४ में ५० mm के लिए पतला है, तो पीएच को एचसीएल के साथ ७.४ करने के लिए समायोजित करें. Aliquot और परिणामी 1, 000x स्टॉक समाधान पर-20 ° c संग्रहीत करें । 10 मिलीग्राम ⋅ मिलीलीटर में doxycycline भंग-1 में ७०% इथेनॉल और दुकान में एक पेंच टोपी microtube में-20 ° c अंधेरे में.
  3. सेल lysate तयारी
    1. ठंड (4 डिग्री सेल्सियस) फॉस्फेट-बफर खारा (पंजाब) के 1 मिलीलीटर के साथ एक बार कोशिकाओं को धो लें ।
    2. प्रत्येक अच्छी तरह से, lysis बफर (५० mm Tris पीएच ७.४, १५० मिमी NaCl, 2 मिमी EDTA, ०.५% NP-४०, ०.५ मिमी डीटीटी और चिढ़ाना अवरोधकों) के १०० µ एल जोड़ें ।
    3. फसल एक सेल स्क्रेपर और १.५ मिलीलीटर ट्यूबों के लिए स्थानांतरण के साथ कोशिकाओं ।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए १४,००० x g पर नमूनों को सेल मलबे को हटाने के लिए केंद्रापसारक ।
    5. ताजा ट्यूबों और बर्फ पर जगह के लिए supernatants स्थानांतरण ।
    6. एक ब्रैडफोर्ड परख के साथ प्रोटीन मात्रा निर्धारित करें ।
  4. एसडीएस-polyacrylamide gel ट्रो (PAGE) और वेस्टर्न सोख्ता
    1. एक एसडीएस-polyacrylamide जेल तैयार करें ।
    2. प्रत्येक द्वाा lysate के लिए, एसडीएस-लोडिंग बफ़र के 30 µ l के कुल में 30 µ g (न् यूनतम 15 µ g) प्रोटीन का एक पृष्ठ नमूना तैयार करें । फिर प्रत्येक नमूने की बराबर मात्रा लोड (20 µ एल/एसडीएस-polyacrylamide जेल पर) और ट्रो के लिए आगे बढ़ना ।
    3. ट्रो के बाद, किसी भी मानक प्रोटोकॉल का उपयोग कर एक कम प्रतिदीप्ति PVDF दाग झिल्ली को fractionated प्रोटीन स्थानांतरण ।
      नोट: प्रोटीन biotinylation का विश्लेषण करने के लिए, एक तेजी से स्थानांतरण अर्द्ध शुष्क पश्चिमी सोख्ता डिवाइस के "उच्च मेगावाट" कार्यक्रम के साथ एक 10 मिनट के हस्तांतरण के समय आमतौर पर अच्छी तरह से काम करता है ।
    4. स्थानांतरण के बाद, 30 मिनट के लिए आर टी में 5% शुष्क दूध में झिल्ली ब्लॉक ।
    5. 30-आर सी के लिए झिल्ली गर्मी फ्लोरोसेंट streptavidin संयुग्मी के साथ आरटी में 1 पतला: 2% BSA और ०.१% के बीच-20% से युक्त पंजाब में 15000 ।
    6. धो झिल्ली तीन बार, 10 मिनट के लिए प्रत्येक ०.१% के बीच-20 युक्त, पंजाबियों के साथ, और फिर एक बार पंजाबियों के साथ और अधिक ।
    7. एक प्रतिदीप्ति स्कैनर इमेजिंग प्रणाली पर झिल्ली स्कैन ।
      नोट: एक ठेठ पश्चिमी दाग चित्रा 3पर दिखाया गया है । इसके बाद के संस्करण की प्रक्रिया का वर्णन एक फ्लोरोसेंट आधारित का पता लगाने लेकिन एक luminescence आधारित एचआरपी का उपयोग कर खोज-युग्मित streptavidin समान रूप से अच्छी तरह से काम

4. विभाजन-प्रोटियोमिक् अध्ययन के लिए BioID

महत्वपूर्ण नोट: अंतिम मास spectrometric विश्लेषण के लिए, सभी निम्न चरणों केरातिन-मुक्त स्थितियों में किया जा करने के लिए कर रहे हैं, सभी सामग्री और रिएजेंट केरातिन के रूप में संभव के रूप में मुक्त होना चाहिए.

  1. क्षणिक अभिकर्मक
    1. अभिकर्मक से पहले दिन, बीज तीन थाली प्रति 10 मिलीलीटर में 8 x 105 कोशिकाओं के एक एकाग्रता में प्रत्येक शर्त के लिए ४ १० सेमी प्लेटें, और ३७ ° c, 5% एक सेल संस्कृति मशीन में सह 2 पर रात की कोशिकाओं मशीन ।
    2. अगले दिन, प्रत्येक अभिकर्मक हालत के लिए एक मास्टर अभिकर्मक मिश्रण तैयार: शर्त प्रति तीन प्लेटों के लिए, polyethylenimine के ३६ µ जी, और µ डीएनए के 18 प्लाज्मिड जी ९०० µ एल सीरम मुक्त DMEM में भंग । आरटी में कम से कम 5 मिनट के लिए प्रत्येक मास्टर मिश्रण की मशीन ।
    3. इस बीच, ताजा माध्यम के साथ प्रत्येक डिश के माध्यम की जगह है, और फिर अभिकर्मक मिश्रण के ३०० µ एल जोड़ने के लिए प्रत्येक थाली को बुद्धिमान ड्रॉप ।
    4. ३७ ° c, 5% CO2पर रात भर कोशिकाओं गर्मी ।
  2. प्रेरण और निकटता-लेबलिंग
    1. अभिकर्मक के बाद दिन में 15 सेमी डिश के लिए कोशिकाओं को हस्तांतरण । प्रत्येक डिश के लिए, मध्यम निकालें, पंजाब के 7 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धोने, एक trypsin की १.५ मिलीलीटर-EDTA समाधान और आरटी पर 5 मिनट के लिए मशीन जोड़ें । कोशिकाओं को पुनः निलंबित और वृद्धि मध्यम के 20 मिलीलीटर से भरा एक 15 सेमी डिश के लिए सेल सस्पेंशन के लिए कक्ष निलंबन के लिए ३.५ मिलीलीटर जोड़ें ५० µ मीटर पर बायोटिन के साथ पूरक के लिए २०० एनजी ⋅ एमएल− 1 (अंतिम सांद्रता) में फ्यूजन प्रोटीन की अभिव्यक्ति प्रेरित करने के लिए biotinylation और doxycycline को उत्तेजित ।
    2. ३७ ° c, 5% CO2पर कम से 20 h के लिए कक्षों को मशीन करें ।
  3. कटाई और कोशिकाओं के भंडारण
    1. पंजाबियों के साथ दो बार कोशिकाओं को धो लें, फिर प्रत्येक थाली में पंजाब के १.५ मिलीलीटर जोड़ें और एक स्क्रेपर के साथ कोशिकाओं फसल ।
    2. काटा कोशिकाओं को एक शर्त के लिए इसी एक 15 मिलीलीटर ट्यूब हस्तांतरण और १,२०० x g, 5 मिनट, 4 ° c पर केंद्रापसारक द्वारा उंहें फसल ।
    3. supernatants निकालें और स्नैप तरल नाइट्रोजन में छर्रों फ्रीज, तो ८० डिग्री सेल्सियस पर आगे प्रसंस्करण तक की दुकान ।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, कोशिकाओं को भी trypsinization द्वारा अलग किया जा सकता है, विकास के माध्यम में काटा, एक 15 मिलीलीटर ट्यूब को हस्तांतरित और ठंड से पहले पंजाबियों के साथ तीन बार धोया ।
  4. सेल lysates की तैयारी
    1. lysis बफर के 1 मिलीलीटर में सेल छर्रों reसस्पेंड (५० mM Tris पीएच ७.४, ५०० मिमी NaCl, ०.४% एसडीएस, 5 मिमी EDTA, 1 मिमी डीटीटी, 1x पूरा छेड़ने वाला अवरोध करनेवाला) आर टी पर 10 कोशिकाओं-20 बार (पांच से दस स्ट्रोक) एक 25 ग्राम सुई के माध्यम से गुजारें ।
    2. नमूनों को sonification डिवाइस से Sonicate ।
      नोट: sonification डिवाइस के साथ सामग्री की तालिकामें संकेत दिया, निम्न प्रोग्राम उपयोग किया जा सकता: उच्च तीव्रता पर चार चक्र, एक ठंड में चक्र प्रति 30 एस (4 डिग्री सेल्सियस) पानी स्नान. किसी भी अन्य sonification डिवाइस उपयुक्त है, लेकिन मापदंडों तदनुसार समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है.
    3. ट्राइटन X-१०० बरामद sonicated lysate के लिए 2% की एक अंतिम एकाग्रता तक पहुंचने के लिए जोड़ें (आमतौर पर, जोड़ें १०० μL के 20% ट्राइटन X-१०० करने के लिए ९०० μL sonicated सेल lysate), और फिर २.३ मिलीलीटर की ५० मिमी Tris, पीएच = ७.४ प्रति 1 मिलीलीटर lysate के लिए NaCl एकाग्रता को समायोजित करने के लिए १५० मिमी से पहले बी streptavidin-युग्मित मोतियों को डिंग ।
      महत्वपूर्ण नोट: उच्च नमक सांद्रता अक्सर मोती के लिए बहुत कम कुशल बाध्यकारी में परिणाम है ।
    4. १.५ मिलीलीटर ट्यूबों (ca. १.१ मिलीलीटर में तीन ट्यूबों) में समायोजित lysates वितरित और उंहें १६,००० x g, 10 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस पर केंद्रापसारक ।
    5. supernatants (ca. ३.२ एमएल) को 15 मिलीलीटर ट्यूब पर स्थानांतरित करें, और 50 – 100 μL को इनपुट सामग्री के रूप में रखें ।
    6. एक ब्रैडफोर्ड परख के साथ प्रत्येक नमूने की एकाग्रता को मापने और streptavidin pulldown के लिए 3 से ३.५ मिलीग्राम प्रोटीन सामग्री के बराबर का उपयोग करें ।
  5. Streptavidin pulldown
    नोट: pulldown कार्यविधि का ओवरव्यू आरेख 4पर दिखाया गया है । यह लगभग मूल रॉक्स और सहयोगियों द्वारा प्रकाशित प्रोटोकॉल के समान है2। पहली बार pulldown प्रदर्शन किया है, के माध्यम से प्रवाह के नमूने और धो 1 – 4 पश्चिमी दाग विश्लेषण के लिए अलग रखा जा सकता है प्रक्रिया को सुनिश्चित करने के लिए ठीक से काम किया (चित्रा 5) ।
    1. प्रत्येक शर्त के लिए, स्थानांतरण २०० μL के streptavidin-युग्मित चुंबकीय मोती निलंबन के लिए एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब । एक चुंबकीय रैक पर ट्यूबों प्लेस, मोती ट्यूबों के पक्ष के लिए छड़ी (सीए. 1 मिनट) और भंडारण बफर हटाने के लिए रुको ।
    2. धीरे से equilibration बफर के 1 मिलीलीटर (५० mm Tris पीएच 7-4, १५० mm NaCl, ०.०५% ट्राइटन एक्स-१००, और 1 मिमी डीटीटी) के साथ मिश्रण से मोतियों को धो लें ।
    3. ट्यूबों के आवश्यक संख्या में बराबर राशि में equilibrated मोती प्रेषण (आमतौर पर जब 3 के साथ शुरू-3.5 मिलीग्राम प्रोटीन सामग्री, प्रत्येक हालत से lysates चार १.५ मिलीलीटर ट्यूबों में भेज सकते हैं) और चुंबकीय रैक पर वापस जगह है ।
    4. equilibration बफर निकालें और चरण 4.4.7 से इसी सेल lysates की बराबर मात्रा के साथ मोतियों का प्रत्येक सेट reसस्पेंड । एक घूर्णन पहिया पर 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर मशीन ।
    5. अगले दिन पर, एक चुंबकीय रैक पर १.५ मिलीलीटर ट्यूबों जगह है, मोती ट्यूबों के पक्ष में छड़ी और एक 15 मिलीलीटर के माध्यम से प्रवाह के रूप में लेबल ट्यूब के लिए supernatants हस्तांतरण जब तक रुको ।
      नोट: अब से, सभी कदम कमरे के तापमान पर प्रदर्शन कर रहे है जब तक अंयथा संकेत दिया ।
    6. धो 1 (2% पानी में एसडीएस) बफर के २०० μL के साथ एक ट्यूब में मोती reसस्पेंड, और १.५ मिलीलीटर ट्यूबों में एक शर्त के अनुरूप reसस्पैंड मोतियों के प्रत्येक सेट गठबंधन ।
    7. धो दो बार एक रोटेशन पहिया पर 8 मिनट के लिए मोतियों की 1 मिलीलीटर के साथ धो 1 बफर ।
    8. एक रोटेशन पहिया पर 8 मिनट धोने बफर 2 के 1 मिलीलीटर (५० mm HEPES पीएच ७.४, 1 मिमी EDTA, ५०० mm NaCl, 1% ट्राइटन एक्स-१००, और ०.१% एनए-deoxycholate) के साथ के लिए दो बार मोती धो लो ।
    9. एक रोटेशन पहिया पर 8 मिनट के लिए दो बार मोतियों की धुलाई बफर 3 (10 मिमी Tris पीएच 8, २५० मिमी LiCl, 1 मिमी EDTA, ०.५% NP-४०, और ०.५% Na-deoxycholate) के 1 मिलीलीटर के साथ धो लें ।
    10. एक रोटेशन पहिया पर 8 मिनट धोने बफर 4 (५० mm Tris पीएच ७.४, ५० mm NaCl, ०.१% NP-४०) के 1 मिलीलीटर के साथ के लिए दो बार मोतियों धो लो ।
    11. यह सुनिश्चित करने के लिए कि अंतिम वॉश चरण के बाद वॉश बफ़र पूरी तरह से निकाल दिया गया है, अधिकांश supernatant को निकाल दें, और फिर नमूनों को नीचे स्पिन करें । उंहें चुंबकीय रैक पर वापस रखो, मोती ट्यूबों के पक्ष के लिए छड़ी और फिर शेष बफर हटाने के लिए रुको ।
    12. 30 μL का रेफरेंस बफर (10 एमएम Tris pH ७.४, 2% एसडीएस, 5% β-mercaptoethanol, और 2 mm बायोटिन) के मोतियों को जोड़ें । 15 मिनट के लिए ९८ ° c पर मशीन, तो तुरंत एक चुंबकीय रैक पर मोतियों को हटा दें ।
    13. eluted नमूना एक ताजा ट्यूब के लिए स्थानांतरण और आगे प्रसंस्करण तक-20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर.
  6. एसडीएस-पेज और वेस्टर्न सोख्ता
    नोट: मास स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण से पहले, यह एसडीएस द्वारा biotinylation और pulldown की सफलता का आकलन करने के लिए सिफारिश की है-पृष्ठ और पश्चिमी दाग. यदि कोई biotinylation पैटर्न एक विचार हो सकता है कि या तो dox या बायोटिन मध्यम करने के लिए नहीं जोड़ा गया था या कि दो स्टॉक समाधान में से एक समझौता किया है ।
    1. प्रत्येक इनपुट नमूने के लिए, 28 μL के कुल में 3x एसडीएस-लोडिंग बफ़र की उपयुक्त मात्रा के साथ प्रोटीन का नमूना बराबर मात्रा में मिलाकर एक पृष्ठ नमूना तैयार करें । २.५ µ एल के 3x एसडीएस के साथ प्रत्येक रेफरेंस सैंपल के 5 µ l को मिक्स करके पेज के नमूने तैयार करें-बफ़र लोड कर रहा है ।
    2. नमूनों को लोड करें (25 µ l/अच्छी तरह से आदानों के लिए, 7 µ एक एसडीएस-polyacrylamide जेल पर) रेफरेंस नमूनों के लिए l/ धारा ३.४ में बताए अनुसार ट्रो और वेस्टर्न सोख्ता के लिए आगे बढ़ें ।
    3. यदि पहली बार के लिए pulldown प्रदर्शन, pulldown के प्रत्येक चरण के लिए पृष्ठ नमूने तैयार (इनपुट, के माध्यम से प्रवाह, धो 1 – 4, रेफरेंस) प्रत्येक नमूने के 20 µ एल मिश्रण द्वारा (इनपुट, के माध्यम से प्रवाह, धो 1 – 4) 3x एसडीएस के 10 µ एल के साथ-लोड हो रहा बफर या 5 µ एल (रेफरेंस) के साथ २.५ µ एल की 3x S DS-लोड हो रहा है बफ़र और चरण 4.6.4 (चित्र 5) पर के रूप में आगे बढ़ें ।
  7. एसडीएस-एमएस विश्लेषण के लिए पृष्ठ
    नोट: संभावित केरातिन संदूषण, कास्टिक जैल और वाणिज्यिक नमूना लोडिंग बफ़र को कम करने के लिए उपयोग किया जा सकता है ।
    1. प्रत्येक रेफरेंस सैंपल के १८.७५ μL के लिए 4x नमूना बफर के ६.२५ μL जोड़ें और जब तक वे जेल में 2 – 3 सेमी माइग्रेट करें तब तक 4 – 20% कच्चा एसडीएस-जेल पर नमूने चलाएं ।
    2. एक 15 सेमी पेट्री डिश में कोलाइडयन Coomassie शानदार नीले G250 धुंधला13 के साथ जेल दाग ।
    3. एक साफ स्केलपेल का प्रयोग करें प्रत्येक नमूने के लिए पूरी गलियों एक्साइज, streptavidin बैंड को छोड़कर (ca. 17 पर चल रहे केडीए, चित्रा 6), और १.५ मिलीलीटर ट्यूबों के लिए एक्साइज बैंड स्थानांतरण ।
    4. इन नमूनों को आगे के विश्लेषण के लिए एक प्रोटियोमिक् सुविधा के लिए भेजें ।
      नोट: ठेठ एमएस परिणाम संदर्भ 9 में देखा जा सकता है (चित्रा 3 और चित्रा 7, और अनुपूरक तालिकाओं). पूरे डेटासेट गौरव भंडार (एक् सेस नंबर PXD005005) पर उपलब् ध है ।

Representative Results

इस विधि कैसे काम करता है वर्णन करने के लिए, खुले पढ़ने के फ्रेम (ORFs) प्रोटीन Ago2, TNRC6C और Dicer (सभी miRNA में शामिल-मध्यस्थता जीन मुंह बंद करने मार्ग) विभाजन-BioID plasmids में क्लोन किया गया था । Ago2 में TNRC6C के साथ बातचीत करने के लिए जाना जाता है एक miRNA प्रेरित मुंह बंद करने परिसर (miRISC) कि अनुवाद दमन और लक्ष्य mRNAs के क्षय कोउत्तेजित14. miRISC इकट्ठा करने से पहले, Ago2 Dicer के साथ बातचीत, एंजाइम कि परिपक्व miRNAs उत्पादन, एक जटिल में यह एक miRNA15के साथ भरी हुई मिल सकती है के भीतर. इसलिए स्प्लिट-BioID को Ago2/Dicer पेयर या Ago2/TNRC6C पेयर के लिए लागू किया गया था । परीक्षण प्रोटीन के प्रत्येक जोड़ी के लिए, Ago2 या तो NBirA * या CBirA से जुड़े हुए थे * हमारे विभाजन का उपयोग कर-BioID plasmids (चित्रा 2), और Dicer और TNRC6C इसी cognate बिरा * टुकड़ा करने के लिए । इसके अलावा, प्रत्येक प्रोटीन CBirA * से जुड़े और एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में एक NBirA *-GFP संलयन के साथ जोड़ा गया था । परीक्षण प्रोटीन की प्रत्येक जोड़ी के लिए चार पुनरावृत्तियों का परीक्षण करने में यह परिणाम (तालिका 1) ।

परीक्षण करने के लिए कि क्या विभाजन-BioID परीक्षण प्रोटीन की जोड़ी की बातचीत पर सक्रिय है, हम चित्र 1पर चित्रित योजना का पालन किया । plasmids एक tet-प्रणाली संगत हेला सेल लाइन में क्षणिक transfected थे । फ्यूजन प्रोटीन की अभिव्यक्ति doxycycline (dox) के साथ प्रेरित किया गया था और biotinylation वृद्धि मध्यम करने के लिए अतिरिक्त बायोटिन जोड़कर उत्तेजित किया गया था. dox और बायोटिन के साथ एक 20 एच मशीन समय के बाद, कोशिकाओं लीजड ड और streptavidin प्रोटीन का पता लगाने के लिए संयुग्मित biotinylated का उपयोग पश्चिमी सोख्ता द्वारा विश्लेषण किया गया । स्तनधारी कोशिकाओं में, दो प्रमुख बैंड आम तौर पर untransfected नमूना (चित्रा 3, तारे) में संयुग्मित streptavidin द्वारा पता चला रहे है और endogenously biotinylated प्रोटीन (सबसे शायद mitochondrial carboxylases) के अनुरूप हैं । इन दो बैंड सभी नमूनों में मौजूद है और आसानी से आंतरिक लोड हो रहा है नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, इस प्रकार, एक गृह व्यवस्था प्रोटीन का पता लगाने के बराबर प्रोटीन मात्रा की लोडिंग नियंत्रित करने के लिए अनावश्यक है । एक BioID के लिए ठेठ/विभाजन-BioID प्रयोग, अतिरिक्त प्रमुख बैंड है कि मनाया जा सकता है कि आत्म biotinylated मिला फ्यूजन प्रोटीन हैं । यहां तक कि अगर कोई अंय biotinylated प्रोटीन देखा है, इस स्तर पर फ्यूजन प्रोटीन के biotinylation का पता लगाने के पहले से ही संकेत मिलता है कि दो परीक्षण प्रोटीन कोशिकाओं में बातचीत की । चित्रा 3पर चित्रित प्रयोग में, यह स्पष्ट है कि एक NBirA *-Ago2 फ्यूजन प्रोटीन TNRC6C या Dicer करने के लिए CBirA * संलयन के साथ युग्मित विपरीत संयोजन जिसमें CBirA *-Ago2 करने के लिए जोड़ा जाता है से अधिक कुशल है अन्य दो के * संलयन प्रोटीन (चित्रा 3, ऊपरी पैनल, गलियों के 2-3 से 6-7 लेन की तीव्रता की तुलना करें) । इसके अलावा, सक्रियकरण CBirA * फ्यूजन के रूप में कोई भी विशिष्ट था NBirA *-GFP नियंत्रण प्रशंसनीय के स्तर को फ्यूजन प्रोटीन (चित्रा 3, लेन की तुलना 1, 4-5 लेन 8 कि untransfected कोशिकाओं से मेल खाती है) । हमारे plasmids में से, NBirA * एक myc टैग है और CBirA * एक झंडा टैग (चित्रा 2) है, प्रत्येक संलयन प्रोटीन की अभिव्यक्ति के स्तर पर इन दो टैग के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ विश्लेषण किया जा सकता है (चित्रा 3, नीचे पैनल) ।

जब बातचीत प्रेरित biotinylation मनाया जाता है, प्रयोग को बढ़ाया जा सकता है, और biotinylated प्रोटीन streptavidin पर अलग-युग्मित मोतियों के रूप में प्रोटोकॉल के पैरा 4 में संकेत के रूप में (चित्रा 4) । जब अलगाव पहली बार प्रदर्शन, शुद्धि के सभी कदम पश्चिमी सोख्ता (चित्रा 5) द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है । आमतौर पर, मोतियों को बाध्यकारी लगभग मात्रात्मक होना चाहिए और लगभग कोई रिसाव के माध्यम से धोया में मनाया जाना चाहिए । पहले मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए नमूनों की प्रोसेसिंग, हम एक पश्चिमी दाग प्रेरित-biotinylation के रूप में काम किया सुनिश्चित करने की सिफारिश की और है कि फ्यूजन प्रोटीन व्यक्त किया गया । फ्यूजन प्रोटीन की अभिव्यक्ति की कमी या तो गरीब अभिकर्मक दक्षता या दोषपूर्ण dox प्रेरण के कारण है । यदि फ्यूजन प्रोटीन व्यक्त किया लेकिन कोई biotinylation है, जांच अगर अतिरिक्त बायोटिन (५० माइक्रोन) वास्तव में माध्यम से जोड़ा गया था और कहा कि स्टॉक बायोटिन अभी भी सक्रिय है । जब eluted सामग्री एक Coomassie-सना हुआ प्रोटीन जेल (चित्रा 6) पर विश्लेषण किया जाता है, आमतौर पर, सबसे मजबूत बैंड के बारे में 17 केडीए में चलाता है और monomeric streptavidin से मेल खाती है मनाया जाएगा । बैंड अंतर्जात biotinylated प्रोटीन और फ्यूजन प्रोटीन के अनुरूप भी मनाया जा सकता है । हम आमतौर पर streptavidin बैंड के ऊपर नमूना लेन के क्षेत्र में अच्छी तरह से लोड हो रहा है (चित्रा 6) के लिए उत्पाद । एक्साइज बैंड को १.५ एमएल ट्यूब में संग्रहित कर जन स्पेक्ट्रोमेट्री की सुविधा के लिए भेजा जा सकता है । वैकल्पिक रूप से, बंधे प्रोटीन भी trypsin-streptavidin युग्मित मोतियों और पचा पेप्टाइड्स eluted स्तंभ फार्म पर पचा जा सकता है । हम नियमित रूप से MaxQuant सॉफ्टवेयर16 का उपयोग करें (ज्यादातर डिफ़ॉल्ट मापदंडों का उपयोग कर और एक संभव पोस्ट-शोधों संशोधन के रूप में lysine biotinylation जोड़ने, अधिक जानकारी के लिए और ठेठ एमएस परिणामों के लिए संदर्भ 9 देखें) एमएस रॉ डेटा का विश्लेषण और पर्सेउस सुइट17 बाद के सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए, दोनों मुफ्त सॉफ्टवेयर हैं । नमूने आमतौर पर तीन जैविक प्रतिकृति में चला रहे हैं । लेबल मुक्त ठहराव का उपयोग करना, विशेष रूप से समृद्ध प्रोटीन नियंत्रण की स्थिति पर पहचाना जा सकता है । endogenously biotinylated प्रोटीन के लिए और प्रोटीन है कि गैर विशेष रूप से बिरा * एंजाइम द्वारा लेबल के लिए फ़िल्टर करने के लिए, हम केवल प्रोटीन है कि काफी छह असंबंधित प्रोटीन के साथ उत्पंन छह डेटासेट से हिट से अधिक समृद्ध कर रहे है पर विचार करें । इसके अलावा, हम केवल हिट है कि एक विभाजन-BioID डेटासेट जिसमें NBirA * फ्यूजन प्रोटीन NBirA *-GFP द्वारा प्रतिस्थापित किया गया है पर समृद्ध कर रहे हैं पर विचार करें । अंय डेटा विश्लेषण रणनीतियों विशेष रूप से सेल संस्कृति (SILAC) में एमिनो एसिड के साथ मात्रात्मक प्रोटियोमिक् के लिए लेबलिंग स्थिर आइसोटोप का उपयोग कर प्रस्तावित किया गया है18. इसके अलावा, विभिन्न रणनीतियों biotinylated पेप्टाइड्स के प्रत्यक्ष अलगाव18बायोटिन के लिए कमजोर अपनत्व के साथ एक streptavidin संस्करण का उपयोग करने के लिए वर्णित किया गया है, विशेष रेफरेंस कार्बनिक सॉल्वैंट्स19 या बायोटिन-विशिष्ट का उपयोग कर शर्तों एंटीबॉडी20,21. जबकि जरूरी नहीं कि अधिक प्रोटीन की खोज के लिए अग्रणी, biotinylation साइटों की पहचान हिट की विशिष्टता के रूप में और अधिक विश्वास जोड़ने के लिए और उपयोगी है जब एक बातचीत की टोपोलॉजी को संबोधित ।

Figure 1
चित्र 1: विभाजन-BioID कार्यविधि का ओवरव्यू. प्रोटीन 1 जटिल A के भाग के रूप में प्रोटीन 2 के साथ इंटरैक्ट करता है, या जटिल B के भाग के रूप में प्रोटीन 3 के साथ । विशेष रूप से जटिल एक की संरचना की जांच करने के लिए, विभाजन BioID 1 और 2 प्रोटीन के लिए लागू किया जा सकता है । जन स्पेक्ट्रोमीटर की तस्वीर एक क्रिएटिव कॉमंस रोपण के अंतर्गत है-साझा एक जैसे ३.० unported लाइसेंस और ThermoScientificOrbitrapElite. JPG की फ़ाइल नाम के साथ https://commons.wikimedia.org से डाउनलोड किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: विभाजन की अभिव्यक्ति कैसेट्स-BioID plasmids. हम NBirA * और CBirA * फ्यूजन प्रोटीन के सभी संयोजनों के परीक्षण की अनुमति देने के लिए चार plasmids प्रदान करते हैं । plasmids और पूरा नक्शे संकेत संख्या के तहत addgene.org पर उपलब्ध हैं । plasmids में एक tet-प्रतिक्रियाशील तत्व (7x tetO) होता है और आवश्यकता ऐसी सेल लाइन में इस्तेमाल की जाती है जो tet एक्सप्रेशन सिस्टम के साथ संगत हो । यह भी ध्यान दें कि सभी plasmids में FKBP और FRB के ORFs से जुड़े हुए है NBirA * और CBirA * टुकड़े क्रमशः । इन दो प्रोटीन rapamycin की उपस्थिति में ही बातचीत और इसलिए plasmids जल्दी से इस रसायन की उपस्थिति या अनुपस्थिति में प्रणाली का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है9। इंगित प्रतिबंध साइटें अनंय हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: एक विभाजन BioID प्रयोग के लिए ठेठ पश्चिमी दाग । ऊपरी पैनल: फ्लोरोसेंट लेबल streptavidin के साथ biotinylated प्रोटीन का पता लगाने । लोअर पैनल: विरोधी Myc और विरोधी झंडा एंटीबॉडी के साथ फ्यूजन प्रोटीन का पता लगाने । प्रोटीन के दो जोड़े परीक्षण किया गया: Ago2/TNRC6C और Ago2/Dicer । गलियों में 2 & 3, Ago2 CBirA * टुकड़ा के लिए संलग्न किया गया था । गलियों में 6 और 7, Ago2 NBirA * टुकड़ा के लिए संलग्न किया गया था । कोई महत्वपूर्ण संकेत जब तीन प्रोटीन के किसी भी NBirA *-GFP (लेन 1, 4-5) के साथ संयुक्त थे मनाया गया था । तारे endogenously biotinylated प्रोटीन है कि आंतरिक लोड हो रहा है नियंत्रण के रूप में सेवा कर सकते है इसी बैंड से संकेत मिलता है । यह आंकड़ा Schopp एट अल के फिगर 5B से अनुकूलित है । 9 के तहत एक क्रिएटिव कॉमंस रोपण ४.० अंतर्राष्ट्रीय लाइसेंस । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4: streptavidin pulldown कार्यविधि का ओवरव्यू. बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए biotinylated प्रोटीन के अलगाव के लिए प्रमुख कदम चित्रित कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: एक streptavidin pulldown प्रयोग के लिए ठेठ पश्चिमी दाग । प्रत्येक संकेत नमूने के बराबर मात्रा एक एसडीएस-polyacrylamide जेल पर लोड किए गए थे । वेस्टर्न सोख्ता के बाद, biotinylated प्रोटीन एचआरपी-युग्मित streptavidin के साथ पाया गया । बैंड NBirA *-TNRC6C और CBirA *-Ago2 के लिए इसी संकेत कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6: ठेठ Coomassie-बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए प्रोटीन जेल दाग । streptavidin-युग्मित मोतियों से eluted नमूना एक कच्चा प्रोटीन जेल पर लोड और नमूना 2-3 सेमी माइग्रेट तक चला गया था । लगभग 17 केडीए में देखा गया प्रमुख बैंड streptavidin है । उस बैंड के ऊपर सीधे क्षेत्र को एक्साइज और जन स्पेक्ट्रोमेट्री की सुविधा के लिए भेजा गया है । बैंड NBirA *-TNRC6C और CBirA *-Ago2 के लिए इसी संकेत कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

अभिकर्मक नमुना हालत परीक्षण
1 NBirA *-protein1/CBirA *-protein2
2 CBirA *-protein1/NBirA *-protein2
3 NBirA *-GFP/CBirA *-protein1
4 NBirA *-GFP/CBirA *-protein2
5 कोई अभिकर्मक

तालिका 1: सामांयतया परीक्षण स्थितियां जब विभाजित-BioID दो प्रोटीन के लिए लागू कर रहा है ।

sequencing प्राइमर अनुक्रम
कैसेट 1 रिवर्स प्राइमर (CBirA * फ्यूजन) TATACTTTCTAGAGAATAGGAAC
कैसेट 2 रिवर्स प्राइमर (NBirA * फ्यूजन) GTGGTTTGTCCAAACTCATC

तालिका 2: विभाजन के लिए sequencing प्राइमरों-BioID plasmids ।

Discussion

उल्लिखित प्रक्रिया का वर्णन कैसे विभाजन में ब्याज की जीन क्लोन करने के लिए-BioID plasmids, कैसे संपर्क के लिए परीक्षण के लिए प्रेरित biotinylation और कैसे biotinylated प्रोटीन को अलग करने के लिए जन स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण के लिए । हम यहां एक क्षणिक अभिकर्मक के आधार पर प्रक्रिया का वर्णन । जबकि फ्यूजन प्रोटीन की अभिव्यक्ति मध्यम करने के लिए जोड़ा dox की राशि से देखते किया जा सकता है, परिवर्तनीय अभिकर्मक कुछ कोशिकाओं है कि मोटे तौर पर फ्यूजन प्रोटीन जब अंतर्जात की तुलना में व्यक्त के साथ गैर समरूप प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए नेतृत्व कर सकते हैं समकक्षों. यह इसी interactomes की विकृतियों और पीपीआई के लिए नेतृत्व कर सकते है कि ईमानदारी से बातचीत है कि अंतर्जात प्रोटीन शामिल प्रतिबिंबित नहीं करते । यह आमतौर पर स्थिर सेल लाइनों का निर्माण एक बार विभाजन-BioID क्षणिक प्रणाली के साथ स्थापित किया गया है सलाह दी जाती है । plasmids Flp-मध्यस्थता पुनर्संयोजन प्रणाली के साथ संगत कर रहे हैं और एक ही tet उत्तरदायी तत्व के विनियमन के तहत ब्याज की दोनों जीन जगह. यदि आवश्यक हो, और जब संगत स्तनधारी कोशिकाओं के साथ प्रयोग किया जाता है, वे स्थिर inducible सेल लाइनों के आसान निर्माण की अनुमति देते हैं । उदाहरण के लिए, हम हेला-EM2-11 लाइन है कि rtTA टेट्रासाइक्लिन-प्रतिलेखन उत्प्रेरक और एक अद्वितीय लक्षित जीनोमिक लोकस है जो टेट्रासाइक्लिन से मध्यस्थता जीन अभिव्यक्ति कसकर12विनियमित किया जा सकता है व्यक्त का उपयोग करें । इस कक्ष पंक्ति और Flp-मध्यस्थ पुनर्संयोजन का उपयोग करते हुए, transgene की केवल एक प्रति वाली स्थिर कक्ष रेखाओं को दो-तीन सप्ताह के भीतर प्राप्त किया जा सकता है । वैकल्पिक रूप से, एक भी वर्तमान जीनोम संपादन तकनीक का उपयोग करने के लिए ब्याज की जीन के मूल जीनोमिक loci में बिरा * टुकड़े शुरू कर सकता है ।

के रूप में किसी भी परख कि एक प्रोटीन टैगिंग पर निर्भर करता है, एक पर विचार अगर जिसके परिणामस्वरूप फ्यूजन प्रोटीन कार्यात्मक है की जरूरत है । उपलब्ध डेटा जिसमें ब्याज के प्रोटीन (इमेजिंग अध्ययन के लिए GFP के साथ उदाहरण के लिए) टैग किए गए थे और कार्यात्मक परीक्षण के लिए तय अगर बिरा * टुकड़े ऊपर या बहाव के नीचे क्लोन किया जाना चाहिए उपयोगी है ब्याज की जीन । यदि कोई ऐसा डेटा उपलब्ध हैं, एक परीक्षण करना चाहिए N-टर्मिनली या सी-टर्मिनली एक कार्यात्मक परख में प्रोटीन टैग । उदाहरण के लिए, फ्यूजन प्रोटीन की गतिविधि एक सेल लाइन जिसमें अंतर्जात प्रोटीन खटखटाया गया है और जंगली प्रकार की स्थिति की तुलना में परीक्षण किया जा सकता है । यदि ब्याज की प्रोटीन दोनों एन और सी-टर्मिनल टैग बर्दाश्त, दोनों का परीक्षण किया जाना चाहिए । दरअसल, BioID प्रयोगों में, फ्यूजन प्रोटीन के उंमुखीकरण22लेबलिंग की दक्षता को प्रभावित कर सकते हैं । इसके अलावा, हमने देखा है कि जब प्रोटीन की एक जोड़ी के लिए विभाजन-BioID लागू करने, दो प्रोटीन के जो या तो NBirA * या CBirA * टुकड़ा संलग्न है भी9लेबलिंग की क्षमता को प्रभावित करते हैं । विभाजन में-BioID plasmids, 16 एमिनो एसिड लंबे glycine/serine अमीर बिरा के लिए ब्याज की प्रोटीन युग्मन लिंकर्स * टुकड़े एक और पीसीए23 से लिया और हम अब तक परीक्षण किया है सभी प्रोटीन बातचीत के लिए हमारे लिए काम किया गया । हालांकि, एक विचार करना चाहिए कि कुछ प्रोटीन जोड़े छोटे या लंबे समय के साथ बेहतर काम हो सकता है । अंतिम ध्यान दें, एक और परख Bollen समूह द्वारा वर्णित किया गया था24। इस परख में, बिरा * हमारी तुलना में एक और साइट (E140/Q141) पर विभाजित है (E256/G257) । हम दोनों विभाजन BioID जायके का परीक्षण किया है साथ-साथ और पाया है कि E256/G257, इस प्रोटोकॉल में वर्णित है, मजबूत पुनः सक्रियण की ओर जाता है जब दो के लिए युग्मित प्रोटीन9।

इस विधि की एक सामांय खामी लेबलिंग की धीमी गति है । आमतौर पर, बायोटिन के साथ 6 से 24 ज मशीन समय प्रशंसनीय biotinylation6प्राप्त करने के लिए आवश्यक है, precluding प्रोटीन परिसरों के गतिशील पुनर्मॉडलिंग के अध्ययन के लिए इस तकनीक का उपयोग करें । हालांकि इस परख आंशिक रूप से इस चेतावनी के रूप में यह केवल जब दो प्रोटीन बातचीत सक्रिय है, बहुत गतिशील प्रक्रियाओं के लिए प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए इसके उपयोग बाधा लेबलिंग की धीमी गति या कम-प्रोटीन रहते विश्लेषण का पता है । इंजीनियर peroxidase APEX2 1 मिनट के भीतर समीपस्थ प्रोटीन के कुशल लेबलिंग को बढ़ावा देने के लिए जाना जाता है3. एक APEX2 पर आधारित पीसीए इस प्रकार BioID की धीमी लेबलिंग गति की सीमाओं को संबोधित कर सकते है परख व्युत्पंन । एक सबूत के सिद्धांत का अध्ययन इस तरह के एक विभाजन APEX2 परख25वर्णित है । हालांकि, हालांकि एक homodimerizing प्रोटीन सफलतापूर्वक biotinylated था, चाहे परख भी लेबल और प्रोटीन है कि बातचीत प्रोटीन की एक जोड़ी के आसपास इकट्ठा की पहचान के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है का प्रदर्शन किया जाएगा । बहुत हाल ही में, विकास का निर्देश TurboID और miniTurbo, बिरा के दो वेरिएंट * बढ़ाया गतिविधि है कि बहुत कम लेबलिंग समय खिड़कियों, 10 मिनट के लिए नीचे26की अनुमति के साथ बनाने के लिए इस्तेमाल किया गया था । इन नए वेरिएंट के लिए विभाजन BioID अनुकूलन आगे आवेदनों की एक व्यापक क्षेत्र के लिए इस तकनीक के उपयोग का विस्तार होगा ।

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम जर्मन अनुसंधान परिषद (DFG) द्वारा जर्मन उत्कृष्टता पहल (CellNetworks DFG-EXC ८१) और सहयोगी अनुसंधान केंद्र SFB638 द्वारा आंशिक वित्तपोषण के माध्यम से वित्त पोषित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid (glacial) VWR 20104.298 To make TAE buffer
Agarose Sigma A9539 Take TAE-agarose gels for DNA analysis and extraction
Ammonia solution 25% NH3 Bernd Kraft 6012 To dissolve biotin
Ampicillin Sigma A9518 To select transformed bacteria
Bioruptor plus sonification device Diagenode B01020001 Other sonification devices are also ok
Biotin Sigma B4639 To be added to the growth medium to stimulate efficient biotinylation
Bovine serum albumin fraction V Carl Roth 8076 Used in Western blot buffers and a protein standard in Bradford assays
Bradford Ultra reagent Expedeon BFU05L Any other method/kit for protein determination is fine, this particular reagent is more tolerant to detergent than other Bradford reagents
Cell scrappers TPP 99002 Any other model is also fine
ClaI New England Biolabs R0197 Restriction enzyme for cloning into the split-BioID plasmids (NBirA* fusion)
DMEM medium Sigma D6046 If using another cell line, use the corresponding optimal growth medium
DNA miniprep kit Sigma PLN350 Any other kit is also fine
Doxycycline Applichem A2951 Dox is light sensitive
DTT Applichem A2948 Make 1M stock solution, store at -20 °C and always use fresh
DyLight 680-conjugated streptavidin Thermo scientific 21848 to use with a LiCor Western blot scanning device
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Invitrogen 65002 The C1 beads are not BSA coated which is preferable for downstream MS applications (no leakthrough of BSA in the final elution)
EDTA Applichem A5097 Make a 500 mM stock, adjust pH to 8 while dissolving the EDTA powder
Ethanol Sigma 32205 Make a 70% stock solution in which Doxycycline can be dissolved at 10 mg.mL-1
Fastgene Gel/PCR DNA Extraction Kit Nippon Genetics FG-91302 Any other kit is also fine
HCl 37% Merck 1.00317.1000 To adjust pH of biotin stock solution
HEPES Carl Roth 6763 Make a 500 mM stock solution, adjust the pH to 7.4
Immobilon-FL PVDF membrane, 0.45 µm Millipore IPFL00010 This membrane shows minimal autofluorescence when used with a LiCor Western blot scanning device
LiCl Grüssing GmbH 12083 Make a 5M stock solution
Odyssey CLx imaging system LI-COR N/A To scan Western blot membrane decorated with fluorophore-labeled antibody
Linear polyethylenimine (PEI) Polysciences 23966-2 Any other transfection reagent is also fine
Milk powder Carl Roth T145 To block Western blot membranes
MluI-HF New England Biolabs R3198 Restriction enzyme for cloning into the split-BioID plasmids (NBirA* fusion)
Na-deoxycholate Sigma 30970 Make a 10% (w/v) stock solution
NaCl Sigma 31434 Make a 5M stock solution
NP-40 (Nonidet P40 substitute) Sigma 74385 Make a 20% (v/v) stock solution
PacI New England Biolabs R0547 Restriction enzyme for cloning into the split-BioID plasmids (CBirA* fusion)
Phosphate buffer saline (PBS) Sigma 806552 To wash cells before scrapping
PmeI New England Biolabs R0560 Restriction enzyme for cloning into the split-BioID plasmids (CBirA* fusion)
Protease inhibitor cocktail Roche 4693132001 Added to the lysis buffer to prevent protein degradation
pSF3-Flag-CBir-FRB_Myc-NBir-FKBP Addgene 90003 Split-BioID plasmid, mediates the co-expression of NBirA*-FKBP and CBirA*-FRB, FKBP and FRB can be replaced by two other ORFs
pSF3-Flag-CBir-FRB_FKBP-Myc-Nbir Addgene 90004 Split-BioID plasmid, mediates the co-expression of FKBP-NBirA* and CBirA*-FRB, FKBP and FRB can be replaced by two other ORFs
pSF3-Flag-FRB-Cbir_Myc-NBir-FKBP Addgene 90008 Split-BioID plasmid, mediates the co-expression of NBirA*-FKBP and FRB-CBirA*, FKBP and FRB can be replaced by two other ORFs
pSF3-Flag-FRB-Cbir_FKBP-Myc-Nbir Addgene 90009 Split-BioID plasmid, mediates the co-expression of FKBP-NBirA* and FRB-CBirA*, FKBP and FRB can be replaced by two other ORFs
Q5 High-Fidelity PCR kit New England Biolabs E0555S To amplify the ORF coding for the proteins to be tested. Any other thermostable DNA polymerase is fine.
Quick ligation kit New England Biolabs M2200S To ligate DNA fragments into the split-BioID plasmids, any other DNA ligation system is fine.
RunBlue 4-20% SDS precast gels Expedeon BCG42012 To use when running samples for MS analysis
RunBlue LDS Sample Buffer Expedeon NXB31010 Running buffer for the RunBlue precast gels
SDS Sigma 5030 Comes as a 20% stock solution
tet-free serum Biowest S181T we use tet-free serum to minimize basal expression of the fusion proteins
Trans-Blot Turbo Transfer system Bio-Rad 1704150 High speed Western blotting transfer system, any other transfer system is also fine
Tris Carl Roth 4855 Make 1M stock solutions with adequate pH (7.4 and 8)
Triton X-100 Applichem A4975 Make a 20% (v/v) stock solution
Tween-20 Carl Roth 9127 Used in Western blot buffers, Tween 20 leads to high background fluorescence and should be omitted in the blocking and last wash step

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References

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Schopp, I. M., Béthune, J. Split-BioID — Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment. J. Vis. Exp. (134), e57479, doi:10.3791/57479 (2018).

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