Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Split-BioID — Proteomiska analys av sammanhangsberoende proteinkomplex i deras infödda cellulära miljön

Published: April 20, 2018 doi: 10.3791/57479
Automatic Translation
1,2, 1,2
1Cluster of excellence CellNetworks, Heidelberg University, 2Heidelberg University Biochemistry Center (BZH)

Summary

Vi erbjuder en stegvis protokoll för split-BioID, en protein fragment-komplettering analysen bygger på närhet-märkning teknik BioID. Aktiverad på samspelet mellan två givna proteiner, tillåter det Proteomik analys av innehållsberoende proteinkomplex i deras infödda cellulära miljön. Metoden är enkel, kostnadseffektiv och kräver endast vanlig laboratorieutrustning.

Abstract

För att komplettera befintliga affinitet rening (AP) metoder för identifiering av protein-protein interaktioner (PPI), enzymer har införts som tillåter närhet-beroende märkning av proteiner i levande celler. Ett sådant enzym, BirA * (används metoden BioID), förmedlar biotinylation av proteiner inom ett område på cirka 10 nm. Därför, när smält till ett protein av intresse och uttryckt i celler, kan märkning av proximala proteiner i sin ursprungliga miljö. I motsats till AP som bygger på rening av monterade proteinkomplex, upptäcker BioID proteiner som har markerats i celler oavsett om de fortfarande interagerar med proteinet av intresse när de är isolerade. Eftersom det biotinylates proximala proteiner, en kan dessutom dra nytta av streptividin för biotin att mycket effektivt isolera dem enastående affinitet. Medan BioID presterar bättre än AP för identifierande övergående eller svaga interaktioner, ger båda AP - och BioID-mass spectrometry metoderna en översikt över alla möjliga interaktioner ett visst protein kan ha. De ger dock inte information på ramen för varje identifierad PPI. De flesta proteiner är faktiskt normalt en del av flera komplex, motsvarande tydlig mognad steg eller olika funktionella enheter. För att lösa denna gemensamma begränsning av båda metoderna, har vi konstruerat en protein-fragment komplettering analys baserat på enzymet BirA *. I denna analys, kan två inaktiva fragment av BirA * sätt ihop till ett aktivt enzym när förde i närheten av två samverkande proteiner som de smälts. Den resulterande split-BioID assay tillåter således märkning av proteiner som samlas kring ett par av samverkande proteiner. Förutsatt dessa två samverkar endast i ett visst sammanhang, gör split-BioID sedan analysen av specifika innehållsberoende funktionella enheter i deras infödda cellulära miljön. Här, ger vi en steg för steg-protokollet för att testa och tillämpa split-BioID till ett par av samverkande proteiner.

Introduction

Som mest cellulära funktioner utförs av proteiner som dynamiskt monterar makromolekylärt komplex, är identifiering av protein-protein interaktioner (PPI) en viktig strävan i biomedicinsk forskning. Faktiskt, PPI är ofta avregleras i sjukdom och representerar potentiella mål för therapeutics1. Mest använda metoden för identifiering av PPI är metoden affinitet rening (AP) som, efter cellys, ett protein av intresse renas specifikt på en matris och associerade proteiner identifieras senare av masspektrometri (MS). AP-MS är en kraftfull metod, utför det vanligtvis inte bra på dåligt lösligt proteinkomplex, mycket övergående interaktioner eller PPI som kräver en intakt subcellulär struktur. Tolkningen av data kan dessutom kompliceras av den dynamiska karaktären av PPI nätverk, som ett enda protein är ofta en del av flera olika proteinkomplex.

Närhet-märkning tekniker såsom BioID2 eller APEX23,4 utvecklades nyligen för att ta itu med några av begränsningarna av AP-MS metoder. I BioID katalyserar enzymet BirA * (motsvarande en G115R variant av enzymet vildtyp E. coli ) bildandet av labila biotinyl-AMP (bio-AMP) som kan reagera med primära aminer. I motsats till enzymet vildtyp, som behåller bio-AMP i dess aktivet centrerar, släpper BirA * bio-AMP så att dess spridning till dess närliggande miljö. Därför, när smält till ett protein av intresse och uttryckt i celler, proximala proteiner kan vara biotinylerade inom en beräknad räckvidd 10 nm5. Dessa markerade proximala proteiner sedan isoleras genom streptividin pulldown och identifieras av MS. I motsats till AP-MS kräver BioID ett uttryck för ett fusionsprotein. Det kan således endast tillämpas på proteiner vars funktion inte hämmas av taggning. Dessutom hastighet märkning är långsam, vanligen 6 – 24 h2,6, att göra detektion av kortlivade proteiner utmanande. Ändå, jämfört med AP-MS, BioID-MS erbjuder flera viktiga fördelar: första, dess fångar interaktioner i deras infödda cellulära miljön; andra, märkta proteiner i stället för monterade komplex isoleras efter cellys; tredje kan streptividin pulldowns använda denatureringen buffertar och hårda tvätt villkor. Metoden är därför mer känsliga att upptäcka övergående eller svaga interaktioner7 eller interaktioner som inträffar på en specifik och svårt att isolera subcellulär struktur8.

De flesta proteiner ingår dock vanligen i större komplex som kan renovera enligt cellulära signaler eller till funktionen som behöver utföras. Ett enda protein är därför vanligtvis en del av flera komplex, motsvarar olika funktionella enheter, som innebär tydliga eller överlappande PPI. Båda metoderna ger en översikt över alla föreningar ett visst protein kan ha, men de misslyckas med att ta itu med ramen för enskilda PPI. För att öka upplösningen på den senare, har vi utformat en protein-fragment komplettering assay (PCA) i vilken två inaktiva fragment av BirA * (NBirA *, som innehåller den katalytiska domänen, och CBirA * som kan ses som re-aktiveringen domän) kan återmontera till ett aktivt enzym när förde i närheten av två interagerar proteiner9. Resulterande split-BioID analysen fokuserar den närhet-beroende biotinylation på proteiner som samlas kring ett par av samverkande proteiner och därmed möjliggör identifiering av sammanhang beroende protein församlingar. Vi har nyligen visat enastående upplösning makt split-BioID genom att lösa två distinkta proteinkomplex inblandade i miRNA-medierad nedtystning väg9.

Sammantaget i en enda, enkel analys tillåter split-BioID att upptäcka och uttryckligen tilldela PPI till definierade funktionella enheter där ett visst protein är inblandade, förutsatt att en ytterligare samverkande protein av motsvarande protein komplex är känd.

Protocol

Obs: En översikt över metoden som visas på bild 1.

1. planering av kloning strategi

  1. Välj två förment samverkande proteiner som skall testas.
    Obs: Var och en av de två proteinerna kommer vara smält till en split-BioID fragment: antingen NBirA * eller CBirA *. Som en negativ kontroll, CBirA * fusionsproteinerna kommer att testas med NBirA * smält till grönt fluorescerande protein (NBirA *-GFP). Som en ytterligare kontroll provas de NBirA * fusioner ensam, utan besläktat CBirA * fusion eller i kombination med en CBirA * smält till en icke-närstående protein. Det är inte tillrådligt att använda CBirA *-GFP som en negativ kontroll som det visades att konsekvent leda till större bakgrund när de kombineras till någon NBirA * fusion protein9. Orsaken till denna observation kan vara uttryck nivån på CBirA *-GFP, mycket högre än alla andra CBirA * fusionsproteinerna har vi använt hittills, som kan leda till betydande reassociation med NBirA * fragmentet.
  2. När två proteiner väljs, kontrollera litteraturen för att hitta oavsett om båda har redan framgångsrikt taggats i funktionella studier (exempelvis som en GFP-märkta fusionsprotein).
    1. Om sådana studier finns, Observera placeringen av taggen (på N - eller C-terminus) och Använd samma riktning för att tagga proteinerna av intresse med split-BioID fragment.
    2. Om ingen sådan studie finns plan konstruktioner kodning för både proteiner taggade på N - och C-terminus och planerar ett test för att testa funktionaliteten hos fusionsproteinerna (exempelvis ett rescue experiment i en cellinje utarmat för WT protein).
      Obs: När du kopplar två fusionsproteinerna med hjälp av plasmider som beskrivs i figur 2 som kodar långa flexibla linkers, orienteringen av fusionsproteinerna (BirA * fragment smält uppströms eller nedströms av proteinerna av intresse) allmänt spelar ingen roll . Verkligen använder FRB och FKBP som modell proteiner, har visat att alla fyra möjliga iterationer (båda fragment på N-termini, både på C-termini, en vid N-terminalen och den andra C-terminus, och vice versa) ge jämförbara biotinylation9.
  3. Design grundfärger att förstärka ORFs av de två proteinerna av intresse för kloning i de split-BioID plasmidsna. Betala uppmärksamhet att översättning ramarna är samma som BirA * fragment. Om de plasmider som beskrivs i figur 2Använd restriktionsenzym PmeI och PacI för att konstruera CBirA * fusion och enzymerna ClaI och MluI för fusion NBirA *.
    Obs: De plasmider som avbildas i figur 2 bär en dubbelriktad tet-responsive element flankerad av F3/FRT rekombination platser. Detta tillåter det reglerade samtidig uttrycket ungefär på samma nivå av både fusionsproteinerna från samma plasmid10, och möjligheten att snabbt konstruera stabil cellinjer genom rekombination-medierad kassett exchange (RMCE). I dessa plasmider har NBirA * en myc-tag medan CBirA * har en flagga tagg. ORFs kan naturligtvis också klonas på enskilda plasmider med konstituerande initiativtagare.
    Kritiska steg: När du testar två samverkande proteiner, det rekommenderas att jämföra NBirA * smält till protein 1 kombinerat med CBirA * smält till protein 2 och NBirA * smält till protein 2 kombinerat med CBirA * smält till protein 1. Det är faktiskt ofta observerats att en iteration fungerar bättre än andra.

2. kloning ORFs av generna sevärdheter i Split-BioID plasmiden

Obs: I det här exemplet anses två proteiner som kan vara märkta vid N-terminalen. Fyra villkor kommer att testas och jämfört med icke-transfekterade celler (tabell 1).

  1. Använd polymeras-kedjereaktion (PCR) för att förstärka ORFs av de två proteinerna skall provas med de lämpliga grundfärger. Design primers som introducerar den ClaI och MluI begränsning platser för NBirA * fusionsproteinerna och den PacI och PmeI platser för fusionsproteinerna CBirA *.
    Obs: PCR kan utföras med kommersiell, företrädesvis korrekturläsning, DNA-polymeras. Följ standardprotokollet i handboken och anpassa det till smälttemperatur av primers och längden av ORFEN kan förstärkas enligt tillverkarens riktlinjer.
  2. Subclone första ORF
    1. Smälta både plasmid (ca 2 μg) och PCR-förstärkta ORF1 (för att vara smält till NBirA *) med ClaI och MluI. Utföra matsmältningen reaktioner med 1 μL av varje enzym, blandat med lämplig volym av DNA och reaktion buffert i en total volym på 20 μL i en 1,5 mL tub för 1 h vid 37 ° C.
    2. Kör både matsmältningen prover på en 1% agaros-TAE DNA gel. Punktskatt banden motsvarande smält plasmid och ORF1 med en ren skalpell och överföring till 1,5 mL rör.
    3. Rena båda banden med en standardsats för DNA-extraktion.
    4. Ligera smält plasmid och ORF1 använder standard reagenser.
      1. Om hjälp av ligering kit anges i Tabell för material, ligera 100 ng av DNA som innehåller tre till fem tiden molar överskott infoga över plasmid i en total volym på 4,5 μL. Lägga till 5 μL av 2 x T4 ligase buffert och 0,5 μL av T4 DNA-ligase från ligering kit. Utföra ligatur reaktionen i en 1,5 mL tub under 10 minuter vid rumstemperatur (RT).
    5. Omvandla till standard DH-5α E. coli behöriga celler (beredd enligt Inoues metod11).
      1. Blanda 3 μL av ligering reaktionen med 50 μl av behöriga celler i en 1,5 mL röret på is och inkubera i 30 min. Transfer celler till en värme blockera set till 42 ° C i 30-45 s och sedan Inkubera tillbaka på is för 2 min. Lägg 250 μL före värmde (37 ° C) lysogeny buljong (LB) medium och platta 100 μL av cellerna på en pre värmde (37 ° C) ampicillin-innehållande LB-agarplatta. Inkubera cellerna över natten vid 37 ° C.
    6. Nästa dag, plocka fyra till sex kolonier och inkubera dem vid 37 ° C, 180 rpm, övernattning i 3 mL LB medium innehållande 100 μg⋅mL-1 ampicillin i en 15 mL tub.
    7. Isolera plasmidsna från plockade kolonierna använder DNA MiniPrep standardsats.
    8. Kontrollera riktigheten av plasmidsna av Sanger sekvensering med kassett 2 reverse primer (tabell 2).
  3. När en plasmid som innehåller den första ORF har identifierats, subclone andra ORF i denna plasmid följa samma steg som steg 2.2 men använder PmeI och PacI enzymer.
  4. Sekvensera de resulterande plasmider som använder kassett 1 reverse primer (tabell 2).

3. provning av fusionsproteinerna

Obs: Följande instruktioner gäller för de dubbla inducerbara uttryck plasmidsna (figur 2) och HeLa-11ht celler, en subclonal HeLa-CCL2 cellinje, stabilt uttrycker den omvända tetracyklin-kontrollerade transkription aktivator rtTA-M2 och som innehåller en Locus för RMCE12. Odlingsmedium för dessa celler är Dulbeccos modifierade Eagle Medium (DMEM) innehållande 10% tetracyklin-fritt fetalt bovint serum (FBS). När du använder en annan celltyp, behöver exakta sådd villkoren och odlingsmedium anpassas.

  1. Övergående transfection
    1. Utsäde celler vid en koncentration på 1 x 105 celler i 2 mL per brunn sex-well platta dagen innan transfection och inkubera cellerna över natten vid 37 ° C, 5% CO2 i en cell kultur inkubator.
    2. På dagen för transfection, ta medlet av varje brunn och ersätta med 2 mL färsk medium.
    3. Förbereda de fyra transfection reaktionerna enligt tabell 1. För varje brunn till transfect, lägga till 6 µg polyethylenimine 3 µg av plasmid DNA i en 1,5 mL sterilt rör och fyll till 500 µL med DMEM medium utan serum.
    4. Inkubera varje transfection mix för minst 5 minuter i rumstemperatur innan du lägger till drop wise till varje brunn. Inkubera cellerna över natten vid 37 ° C, 5% CO2.
  2. Induktion och närhet-märkning
    1. Dagen efter transfection, ta bort mediet och ersätta med medium kompletteras med biotin vid 50 µM att stimulera biotinylation och doxycyklin 200 ng⋅mL−1 att inducera uttrycket av fusionsproteinerna. Inkubera cellerna för minst 20 h vid 37 ° C, 5% CO2.
      1. För att göra en stamlösning av biotin, upplösa biotin på 50 mg⋅mL-1 (motsvarar ca. 200 mM) i 2 M ammoniumhydroxid. När det är helt upplöst, späd det till 50 mM i 500 mM Hepes, pH 7,4, sedan justera pH till 7,4 med HCl. alikvot och lagra de resulterande 1000 x stamlösning vid-20 ° C. Lös upp doxycyklin 10 mg⋅mL-1 i 70% etanol och butik i ett skruvlock mikrorör vid-20 ° C i mörker.
  3. Cell lysate beredning
    1. Tvätta cellerna en gång med 1 mL kall (4 ° C) fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
    2. I varje brunn, tillsätt 100 µL lyseringsbuffert (50 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 0,5% NP-40, 0,5 mM DTT och proteashämmare).
    3. Skörda cellerna med en cell scrapper och överföring till 1,5 mL rör.
    4. Centrifugera proverna vid 14 000 x g i 10 minuter vid 4 ° C ta bort cellfragment.
    5. Överföra supernatanterna färska rör och placera på isen.
    6. Bestämma protein belopp med en Bradford-analysen.
  4. SDS-polyakrylamid gelelektrofores (sidan) och Western blotting
    1. Förbereda en SDS-polyakrylamidgel.
    2. För varje rensat lysate, förbereda ett sidan prov av 30 µg (minimum 15 µg) protein i sammanlagt 30 µL av SDS-lastning buffert. Sedan Ladda lika mängder varje prov (20 µL per brunn) på SDS-Polyakrylamidgelen och vidare till elektrofores.
    3. Efter elektrofores, överföra de fraktionerade proteinerna till en låg fluorescens PVDF blot membran enligt någon standardprotokoll.
      Obs: För att analysera protein biotinylation, en 10 min överföringstid med ”hög MW” program för en snabb överföring halvtorr Western blotting enheten oftast fungerar bra.
    4. Efter överföringen, blockera membranet i 5% torr mjölk i PBS för 30 min vid RT.
    5. Inkubera membranet för 30 – 60 min på RT med fluorescerande streptividin konjugat utspätt 1:15,000 i PBS som innehåller 2% BSA och 0,1% Tween-20.
    6. Tvätta membranet tre gånger, var och en för 10 min, med PBS som innehåller 0,1% Tween-20 och sedan en gång mer med PBS.
    7. Skanna membranet på ett fluorescens scanner imaging system.
      Obs: en typisk Western blot visas på figur 3. Ovanstående procedur beskriver en fluorescerande-baserad detektion men en luminescence-baserad detektion använder HRP-kopplade streptividin fungerar lika bra.

4. Split-BioID för proteomik studier

Kritisk anmärkning: För massa spektrometriska slutändan alla följande steg måste utföras i keratin-fria förhållanden, bör allt material och reagenser som keratin fria som möjligt.

  1. Övergående transfection
    1. Dagen innan transfection, utsäde tre till fyra 10 cm plattor för varje villkor vid en koncentration på 8 x 105 celler i 10 mL per platta och inkubera cellerna över natten vid 37 ° C, 5% CO2 i en cell kultur inkubator.
    2. Nästa dag, förbereda en master transfection blandning för varje transfection villkor: för tre plattor per skick, 36 µg av polyethylenimine och 18 µg av plasmid DNA upplöst i 900 µL serum-fri DMEM. Inkubera varje master mix för minst 5 min vid RT.
    3. Under tiden ersätta medlet av varje maträtt med färska medium, och sedan lägga 300 µL av transfection blandningar drop klokt att varje platta.
    4. Inkubera cellerna över natten vid 37 ° C, 5% CO2.
  2. Induktion och närhet-märkning
    1. Dagen efter transfection, överföra cellerna till 15 cm rätter. För varje maträtt, ta bort mediet, tvätta cellerna med 7 mL PBS, tillsätt 1,5 mL av en trypsin-EDTA-lösning och inkubera i 5 min på RT. Tillsätt 3,5 mL i odlingsmedium för att resuspendera cellerna och överföra cellsuspensionen till en 15 cm skål fylld med 20 mL odlingsmedium kompletteras med biotin vid 50 µM att stimulera biotinylation och doxycyklin 200 ng⋅mL−1 (slutliga koncentrationer) inducera uttrycket av fusionsproteinerna.
    2. Inkubera cellerna för minst 20 h vid 37 ° C, 5% CO2.
  3. Skörd och förvaring av cellerna
    1. Tvätta cellerna två gånger med PBS, sedan tillsätt 1,5 mL PBS till varje platta och skörda cellerna med en scrapper.
    2. Överföra de skördade celler som motsvarar ett villkor att en 15 mL tub och skörda dem genom centrifugering vid 1,200 x g, 5 min, 4 ° C.
    3. Ta bort supernatanterna och snapin frysa pellets i flytande kväve, då butiken vid 80 ° C tills vidare bearbetning.
      Obs: Alternativt celler kan också vara fristående vid trypsinization, skördas i odlingsmedium, överförs till en 15 mL tub och tvättat tre tid med PBS före frysning.
  4. Beredning av cell lysates
    1. Omsuspendera cell pellets i 1 mL lyseringsbuffert (50 mM Tris pH 7,4, 500 mM NaCl, 0,4% SDS, 5 mM EDTA, 1 mM DTT, 1 x komplett proteashämmare) vid RT. passera cellerna 10 – 20 gånger (fem till tio slag) genom en 25 G nål.
    2. Sonikera prover med en placera mätkolven enhet.
      Obs: Med placera mätkolven enheten anges i Tabell för material, följande program kan användas: fyra cykler vid hög intensitet, 30 s per cykel i en kall (4 ° C) vattenbad. Någon annan placera mätkolven enhet är lämplig men parametrar kan behöva justeras.
    3. Lägg till Triton x-100 till den återvunna sonicated lysate att nå en slutlig koncentration på 2% (vanligtvis, tillsätt 100 μL av 20% Triton x-100 till 900 μL sonicated cell lysate), och sedan 2,3 mL 50 mM Tris, pH = 7,4 per 1 mL lysat justera NaCl koncentrationen 150 mm före b INDANDE till streptividin-kopplade pärlor.
      Kritisk anmärkning: Högre salt koncentrationer resultera ofta i mycket mindre effektiv bindning till pärlorna.
    4. Distribuera den justerade lysates i 1,5 mL rör (ca. 1,1 mL i tre rör) och centrifugera dem vid 16 000 x g, 10 min, 4 ° C.
    5. Överföra supernatanterna (ca. 3,2 mL) till en 15 mL tub, och hålla 50 – 100 μL som INPUT material.
    6. Mätning av koncentrationen av varje prov med en analys som Bradford och använda motsvarande 3 till 3,5 mg proteininnehåll för streptividin rullgardinsmenyn.
  5. Streptividin pulldown
    Obs: En översikt över förfarandet pulldown visas på figur 4. Det är nästan identisk med den ursprungliga protokollet som publiceras av Roux och kollegor2. Första gången rullgardinsmenyn utförs, prover av flödet genom och tvätta 1 – 4 kan åsidosättas för Western blot-analys för att säkerställa att förfarandet fungerade ordentligt (figur 5).
    1. För varje villkor, överföra 200 μL streptividin-kopplade magnetiska pärlor suspension till en 1,5 mL tub. Placera rören på en magnetisk rack, vänta tills pärlorna sticka till sidan av rören (ca. 1 min) och ta bort lagring bufferten.
    2. Tvätta pärlorna genom att försiktigt blanda med 1 mL Jämviktstiden buffert (50 mM Tris pH 7 – 4, 150 mM NaCl, 0,05% Triton x-100 och 1 mM DTT).
    3. Avsändandet skakad pärlorna i lika mängd i nödvändigt antal tuber (vanligtvis när start med 3 – 3,5 mg protein innehåll, lysates från varje villkor kan sändas i två till fyra 1,5 mL rör) och placera tillbaka på det magnetiska racket.
    4. Ta bort Jämviktstiden bufferten och resuspendera varje uppsättning pärlor med lika mängder den motsvarande cell lysates från steg 4.4.7. Inkubera över natten vid 4 ° C på en roterande hjul.
    5. Nästa dag, placera 1,5 mL tuberna på en magnetisk rack, vänta tills pärlorna stick till sidan av rören och överföra supernatanterna till en 15 mL tub märkt som flödar genom.
      Obs: från nu på, alla steg utförs vid rumstemperatur om inget annat anges.
    6. Återsuspendera pärlor i varje rör med 200 μL tvättbuffert 1 (2% SDS i vatten) och kombinera varje uppsättning återsuspenderade pärlor som motsvarar ett villkor i 1,5 mL rör.
    7. Tvätta pärlorna två gånger i 8 min på en rotation rullar med 1 mL av tvättbuffert 1.
    8. Tvätta pärlorna två gånger i 8 min på en rotation rullar med 1 mL av tvättbuffert 2 (50 mM HEPES pH 7,4, 1 mM EDTA, 500 mM NaCl, 1% Triton X-100 och 0,1% Na-deoxicholat).
    9. Tvätta pärlorna två gånger i 8 min på en rotation rullar med 1 mL av tvättbuffert 3 (10 mM Tris pH 8, 250 mM LiCl, 1 mM EDTA, 0,5% NP-40, och 0,5% Na-deoxicholat).
    10. Tvätta pärlorna två gånger i 8 min på en rotation rullar med 1 mL av tvättbuffert 4 (50 mM Tris pH 7,4, 50 mM NaCl, 0,1% NP-40).
    11. Ta bort de flesta av supernatanten kontrollera tvättbuffert bort helt efter sist tvätta steg, och sedan snurra ner proverna. Lägg tillbaka dem på magnetiska racket, vänta tills pärlorna stick till sidan av rören och sedan ta bort återstående bufferten.
    12. Tillsätt 30 μL av eluering buffert (10 mM Tris pH 7,4, 2% SDS, 5% β-merkaptoetanol och 2 mM Biotin) till pärlorna. Inkubera vid 98 ° C under 15 minuter, sedan omedelbart bort pärlorna på en magnetisk rack.
    13. Överföra eluerade provet till en färsk tub och förvaras vid-20 ° C tills vidare bearbetning.
  6. SDS-PAGE och Western blotting
    Obs: Före masspektrometri analys, det rekommenderas att bedöma framgången av den biotinylation och pulldown av SDS-PAGE och Western blot. Om inget biotinylation mönster observeras man kan betrakta som antingen dox eller biotin lades inte till medium eller att en av de två stamlösningar äventyras.
    1. För varje ingående prov, förbereda ett sida-prov genom att blanda lika mängder protein prov med lämplig volym av 3 x SDS-lastning buffert i sammanlagt 28 μL. Förbereda sidan prover genom att blanda 5 µL av varje eluering prov med 2,5 µL 3 x SDS-lastning buffert.
    2. Ladda proverna (25 µL per brunn för insatsvaror, 7 µL per brunn för eluering prover) på en SDS-Polyakrylamidgelen. Fortsätt till elektrofores och Western blotting som beskrivs i avsnitt 3.4.
    3. Om rullgardinsmenyn för första gången, förbereda sidan prover för varje steg i rullgardinsmenyn (ingång, flödet genom, tvätta 1 – 4: eluering) genom att blanda 20 µL av varje prov (ingång, flödet genom, tvätta 1 – 4) med 10 µL 3 x SDS-lastning buffert eller 5 µL (eluering) med 2,5 µL 3 x S DS-lastning buffert och fortsätt som på steg 4.6.4 (figur 5).
  7. SDS-PAGE för MS analys
    Obs: För att minimera potentiella keratin kontaminering, förtillverkade geler och kommersiella prov lastning bufferten kan användas.
    1. Lägg till 6,25 μL av 4 x provet buffert till 18,75 μL av varje eluering prov och kör exemplen på en 4 – 20% förtillverkade SDS-gel tills de migrerar 2 – 3 cm in i gelen.
    2. Fläcken gelen med kolloidal Coomassie Brilliant Blue G250 färgning13 i en 15 cm petriskål.
    3. Använd en ren skalpell att punktskatt hela banorna för varje prov, exklusive streptividin bandet (körs på ca. 17 kDa, figur 6), och överföra exciderad banden 1,5 mL rör.
    4. Skicka proverna till en proteomik anläggning för vidare analys.
      Obs: Typisk MS resultaten kan ses i referens 9 (figur 3 och figur 7och kompletterande tabeller). De hela datamängderna finns på databasen stolthet (anslutningen nummer PXD005005).

Representative Results

För att illustrera hur denna metod fungerar, öppna läsning ramar (ORFs) av proteiner Ago2, var TNRC6C och Dicer (alla inblandade i den miRNA-medierad nedtystning väg) klonad i split-BioID plasmider. Ago2 är kända för att interagera med TNRC6C inom ett miRNA-inducerad ljuddämpningssystemet komplex (miRISC) som förtrycker översättning och stimulera förfalla av målet mRNA14. Före att montera miRISC, Ago2 interagera med Dicer, det enzym som producerar mogen MicroRNA, i ett komplex där den kan få laddad med en miRNA15. Split-BioID tillämpades därför antingen Ago2/Dicer paret eller Ago2/TNRC6C paret. För varje par av testade proteiner var Ago2 antingen smält NBirA * eller CBirA * använda vår split-BioID plasmider (figur 2) och Dicer och TNRC6C till den motsvarande cognate BirA * fragment. Dessutom varje protein var smält till CBirA * och ihopkopplad med en NBirA *-GFP fusion som en negativ kontroll. Detta resulterar i att testa fyra iterationer för varje par av testade protein (tabell 1).

För att testa om split-BioID aktiveras vid växelverkan av para av testade proteiner, följde vi den ordningen som avbildas på figur 1. Plasmidsna var övergående transfekterade i en tet-system kompatibelt HeLa cellinje. Uttrycket av fusionsproteinerna förmåddes med doxycyklin (dox) och biotinylation stimulerades genom att lägga till överskott biotin odlingsmedium. Efter en 20 h inkubationstiden med dox och biotin, celler var lyserat och analyseras av Western blotting med konjugerad streptividin att upptäcka biotinylerade proteiner. I däggdjursceller, två stora band upptäcks vanligen av den konjugerade streptividin i untransfected provet (figur 3, stjärnor) och motsvarar endogent biotinylerade proteiner (troligen mitokondriella carboxylases). Dessa två band är närvarande i alla prover och bekvämt kan användas som intern lastning kontroller, upptäckt av en städning protein att styra lastning av lika protein belopp är således överflödig. Typiskt för en BioID/split-BioID experiment, de extra stora band som kan observeras är fusionsproteinerna som fick self-biotinylerade. Även om inga andra biotinylerade protein ses, anger att upptäcka biotinylation av fusionsproteinerna i detta skede redan att de två testa proteinerna samverkade i cellerna. I experimentet avbildad på figur 3, det är klart att ha en NBirA *-Ago2 fusionsprotein parad med CBirA * fusioner till TNRC6C eller Dicer är effektivare än de motsatta kombinationerna i som CBirA *-Ago2 kopplas till NBirA * fusioner av de andra två proteiner (figur 3, övre panelen, jämför stödnivåerna körfält 2-3 till lanes 6-7). Aktiveringen var dessutom specifika som ingen av de CBirA * fusioner kunde aktivera den NBirA *-GFP kontroll fusionsprotein till märkbara nivåer (figur 3, jämför körfält 1, 4-5 till lane 8 som motsvarar untransfected celler). Eftersom i våra plasmider, NBirA * har en myc-tagg och CBirA * har en flagga tagg (figur 2), kan uttrycksnivåerna för varje fusionsprotein analyseras med antikroppar mot dessa två Taggar (figur 3, nedre panelen).

När interaktion-inducerad biotinylation observeras, experimentet kan skalas upp och de biotinylerade proteinerna isolerade på streptividin-kopplade pärlor som anges i punkt 4 i protokollet (figur 4). När du utför isolering första gången, kan alla steg i reningen analyseras med Western blotting (figur 5). Normalt bindande till pärlorna ska vara nästan kvantitativa och praktiskt taget inget läckage genom bör observeras i tvättarna. Före bearbetning proverna för masspektrometri, rekommenderar vi kör en Western blot för att säkerställa inducerad-biotinylation fungerade som förväntat och att fusionsproteinerna uttrycktes. Avsaknaden av uttryck av fusionsproteinerna är antingen på grund av dålig transfection effektivitet eller felaktiga dox induktion. Om fusionsproteinerna uttrycktes men ingen biotinylation observeras, kontrollera om överskott biotin (50 μM) faktiskt lades till medium och att de lager biotin är fortfarande aktiv. När eluerade materialet analyseras på en Coomassie-färgade protein gel (figur 6), vanligtvis, det starkaste bandet ska observeras körs på cirka 17 kDa och motsvarar monomer streptividin. Band som motsvarar de endogena biotinylerade proteinerna och fusionsproteinerna kan också observeras. Vi punktskatt vanligtvis området av provet lane ovan streptividin bandet upp till lastning väl (figur 6). Exciderad bandet kan lagras i ett 1,5 mL rör och skickas till en anläggning för masspektrometri. Alternativt, bundna proteiner kan också vara trypsin-rötas på streptividin-kopplade pärlor och smält peptiderna elueras bilda kolumnen. Vi använder rutinmässigt MaxQuant programvara16 (som mestadels standardparametrar och lägga till lysin biotinylation som ett möjligt posttranslationella modifieringen, se hänvisning 9 för mer detaljer och typiska MS resultat) att analysera MS rådata och Perseus suite17 för efterföljande statistisk analys, båda är fri programvara. Prover är vanligtvis kör i tre biologiska replikat. Använder etikett-fri kvantifiering, kan speciellt anrikade proteiner identifieras över villkor som kontroll. För att filtrera för endogent biotinylerade proteiner och proteiner som är icke-specifikt märkta av enzymet BirA *, anser vi bara proteiner som är avsevärt berikad över träffar från sex datamängder som genereras med sex orelaterade proteiner. Dessutom anser vi endast träffar som är berikad över en split-BioID datamängd som NBirA * fusionsproteinerna har ersatts av NBirA *-GFP. Andra strategier för analys av data har föreslagits särskilt med hjälp av stabila isotoper märkning med aminosyror i cellkultur (SILAC) för kvantitativ proteomik18. Dessutom har olika strategier beskrivits för direkta isolering av biotinylerade peptider med en streptividin variant med försvagade affinitet till biotin18, särskilda eluering förhållanden med hjälp av organiska lösningsmedel19 eller biotin-specifika antikroppar20,21. Samtidigt inte nödvändigtvis leder till upptäckten av flera proteiner, identifiering av biotinylation platser tillsätt mer förtroende när det gäller specificitet träffar och användbar när behandlar topologin för en interaktion.

Figure 1
Figur 1: översikt över förfarandet för split-BioID. Protein 1 samverkar med protein 2 som en del av komplexa A eller med protein 3 som en del av komplexa B. För att speciellt undersöka sammansättningen av komplexa A, kan split-BioID tillämpas på proteiner 1 och 2. Fotografiet av masspektrometer under en Creative Commons Attribution-Share Alike 3.0 Unported licens och hämtades från https://commons.wikimedia.org med filnamn som ThermoScientificOrbitrapElite.JPG. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: uttryck kassetter av split-BioID plasmidsna. Vi erbjuder fyra plasmider för att testa alla kombinationer av NBirA * och CBirA * fusionsproteinerna. De plasmider och kompletta kartor finns på addgene.org under indikerad numrerar. Plasmidsna ha tet-responsive element (7 x tetO) och behöver användas i en cellinje som är kompatibel med systemet tet uttryck. Observera också att i alla plasmider den ORFs av FKBP och FRB är smält till de NBirA * och CBirA * fragment respektive. Dessa två proteiner samverkar endast i närvaro av rapamycin och därmed plasmidsna kan användas för att snabbt testa systemet i närvaron eller frånvaron av detta kemiska9. De angivna begränsningen platserna är unika. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: typisk Western blot för en split-BioID experiment. Övre panelen: detektion av biotinylerade proteiner med fluorescently märkta streptividin. Nedre panelen: Påvisande av fusionsproteinerna med anti Myc och anti-Flag antikroppar. Två par av proteiner testades: Ago2/TNRC6C och Ago2/Dicer. I körfält 2 & 3, var Ago2 bifogas CBirA * fragmentet. Lanes 6 & 7, var Ago2 bifogas NBirA * fragmentet. Ingen betydande signal observerades när någon av de tre proteinerna kombinerades med NBirA *-GFP (körfält 1, 4-5). Stjärnorna visar de banden som motsvarar endogent biotinylerade proteiner som kan fungera som intern lastning kontroller. Denna siffra är anpassade från figur 5B i Schopp o.a. 9 under en Creative Commons Attribution 4.0 International licens. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: översikt över förfarandet för streptividin-pulldown. Stora steg för isolering av biotinylerade proteiner för masspektrometri analys skildras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: typisk Western blot för ett experiment med streptividin i pulldown. Lika volymer av varje indikerade prov lastades på en SDS-Polyakrylamidgelen. Efter Western blotting, biotinylerade proteiner påvisades med HRP-kopplade streptividin. Band som motsvarar NBirA *-TNRC6C och CBirA *-Ago2 indikeras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: typiska Coomassie-färgade protein gel för masspektrometri analys. De eluerade provet från streptividin-kopplade pärlor var lastat på en prefabricerad protein gel och kör tills provet migrera 2-3 cm. Det stora bandet sett på cirka 17 kDa är streptividin. Området direkt ovanför det bandet är censurerade och skickas till en anläggning för masspektrometri. Band som motsvarar NBirA *-TNRC6C och CBirA *-Ago2 indikeras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Transfection prov Villkoret testas
1 NBirA *-protein1 / CBirA *-protein2
2 CBirA *-protein1 / NBirA *-protein2
3 NBirA *-GFP / CBirA *-protein1
4 NBirA *-GFP / CBirA *-protein2
5 ingen transfection

Tabell 1: Testade normalt villkor när du tillämpar split-BioID på två proteiner.

Sekvensering primer sekvens
Kassett 1 reverse primer (CBirA * fusion) TATACTTTCTAGAGAATAGGAAC
Kassett 2 reverse primer (NBirA * fusion) GTGGTTTGTCCAAACTCATC

Tabell 2: Sekvensering primers för split-BioID plasmidsna.

Discussion

Konturerad beskrivs hur man klona gener av intresse i den split-BioID plasmider, hur man testar för interaktion-inducerad biotinylation och hur man isolera biotinylerade proteiner för masspektrometri analys. Här beskriver vi ett förfarande baserat på övergående transfection. Medan uttrycket av fusionsproteinerna kan stämmas av mängden dox tillsätts mediet, kan övergående transfection leda till icke-homogen proteinuttryck med vissa celler som grovt överuttrycka fusionsproteinerna jämfört med den endogena motsvarigheter. Detta kan leda till snedvridning av de motsvarande interactomes och PPI som inte återspeglar troget de interaktioner som involverar de endogena proteinerna. Det är således allmänt tillrådligt att bygga stabila cellinjer split-BioID har fastställts med övergående systemet. Plasmidsna är kompatibla med systemet Flp-medierad rekombination och placera båda gener av intresse under reglering av samma tet-responsive element. Om det behövs, och när den används med kompatibel däggdjursceller, tillåter de lätt skapandet av stabila inducerbara cellinjer. Exempelvis använder vi HeLa-EM2-11 raden som uttrycker den rtTA tetracyklin-aktiverad transkription aktivatorn och en unik targetable genomisk locus som tetracyklin-medierad genuttryck kan vara hårt reglerad12. Använda denna cellinje och Flp-medierad rekombination, kan stabil cellinjer som innehåller bara en kopia av transgenens erhållas inom två-tre veckor. Alternativt kan man också använda aktuella genomet redigering tekniker för att införa BirA * fragment i de infödda genomisk loci av generna av intresse.

Som i någon analysmetod som bygger på tagga ett protein, måste man överväga om de resulterande fusionsproteinerna är funktionella. Tillgängliga data som proteinerna av intresse (till exempel med GFP för imaging studier) var etiketten och funktionellt testade är användbara att avgöra om fragment BirA * ska vara klonade uppströms eller nedströms generna av intresse. Om inga sådana uppgifter finns tillgängliga, man bör testa N-terminalt eller C-obotligt taggade proteiner i en funktionell analys. Aktiviteten av fusionsproteinerna kan till exempel testas i en cellinje som det kroppsegna proteinet har knackade ut och jämfört med vildtyp situationen. Om proteinerna av intresse tål både N - och C-terminal taggar, bör båda testas. Faktiskt i BioID experiment, kan orienteringen av proteinet fusion påverka effektiviteten i märkning22. Dessutom har vi observerat att när tillämpa split-BioID till ett par av proteiner, vilket av de två proteinerna läggs till antingen den NBirA * eller CBirA * fragmenterar också påverkan av märkning9effektivitet. I split-BioID plasmidsna, den 16 aminosyror lång glycin/serin rika linkers koppling proteinerna av intresse till BirA * fragmenten togs från en annan PCA23 och arbetat för oss i alla samverkande proteiner har vi testat hittills. Man bör dock överväga att några protein par skulle fungera bättre med kortare eller längre linkers. Av sista anmärkning beskrevs en annan analys av den Bollen grupp24. I denna analys, är BirA * uppdelad på en annan plats (E140/Q141) än vår (E256/G257). Vi har testat både split-BioID smaker sida-vid-sida och fann att E256/G257, beskrivs i detta protokoll, leder till starkare re-aktiveringen när kopplat till två samverkande proteiner9.

En allmän nackdel med denna metod är långsam hastighet märkning. 6 till 24 h inkubationstiden med biotin är vanligtvis krävs för att erhålla märkbar biotinylation6, utgör hinder för användningen av denna teknik för att studera dynamiska omdaning av proteinkomplex. Medan denna analys adresser delvis denna varning eftersom det aktiveras endast när två proteiner interagerar, långsam hastighet märkning hinder för dess användning för att studera svar mycket dynamiska processer eller analysera kortlivade proteiner. Bakåtkompilerade peroxidaset APEX2 är kända för att främja effektiv märkning av proximala proteiner inom 1 min3. En PCA baserat på APEX2 kan således ta itu begränsningarna av långsam märkning hastighet av BioID-derived analyser. En proof-of-principle studie beskrivs sådan en split-APEX2 assay25. Även om ett homodimerizing protein var framgångsrikt biotinylerade, återstår huruvida analysen kan också användas för att märka och identifiera proteiner som samlas kring ett par av samverkande proteiner emellertid påvisas. Helt nyligen användes riktad evolution för att skapa TurboID och miniTurbo, två varianter av BirA * med ökad aktivitet som tillåter mycket kortare märkning tidsfönster, ner till 10 min26. Anpassa split-BioID till dessa nya varianter kommer att ytterligare utöka användningen av denna teknik till ett bredare fält av applikationer.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete finansierades av det tyska forskningrådet (DFG) genom tyska excellence-initiativet (CellNetworks DFG-EXC 81) och en delfinansiering av collaborative research centre SFB638.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid (glacial) VWR 20104.298 To make TAE buffer
Agarose Sigma A9539 Take TAE-agarose gels for DNA analysis and extraction
Ammonia solution 25% NH3 Bernd Kraft 6012 To dissolve biotin
Ampicillin Sigma A9518 To select transformed bacteria
Bioruptor plus sonification device Diagenode B01020001 Other sonification devices are also ok
Biotin Sigma B4639 To be added to the growth medium to stimulate efficient biotinylation
Bovine serum albumin fraction V Carl Roth 8076 Used in Western blot buffers and a protein standard in Bradford assays
Bradford Ultra reagent Expedeon BFU05L Any other method/kit for protein determination is fine, this particular reagent is more tolerant to detergent than other Bradford reagents
Cell scrappers TPP 99002 Any other model is also fine
ClaI New England Biolabs R0197 Restriction enzyme for cloning into the split-BioID plasmids (NBirA* fusion)
DMEM medium Sigma D6046 If using another cell line, use the corresponding optimal growth medium
DNA miniprep kit Sigma PLN350 Any other kit is also fine
Doxycycline Applichem A2951 Dox is light sensitive
DTT Applichem A2948 Make 1M stock solution, store at -20 °C and always use fresh
DyLight 680-conjugated streptavidin Thermo scientific 21848 to use with a LiCor Western blot scanning device
Dynabeads MyOne Streptavidin C1 Invitrogen 65002 The C1 beads are not BSA coated which is preferable for downstream MS applications (no leakthrough of BSA in the final elution)
EDTA Applichem A5097 Make a 500 mM stock, adjust pH to 8 while dissolving the EDTA powder
Ethanol Sigma 32205 Make a 70% stock solution in which Doxycycline can be dissolved at 10 mg.mL-1
Fastgene Gel/PCR DNA Extraction Kit Nippon Genetics FG-91302 Any other kit is also fine
HCl 37% Merck 1.00317.1000 To adjust pH of biotin stock solution
HEPES Carl Roth 6763 Make a 500 mM stock solution, adjust the pH to 7.4
Immobilon-FL PVDF membrane, 0.45 µm Millipore IPFL00010 This membrane shows minimal autofluorescence when used with a LiCor Western blot scanning device
LiCl Grüssing GmbH 12083 Make a 5M stock solution
Odyssey CLx imaging system LI-COR N/A To scan Western blot membrane decorated with fluorophore-labeled antibody
Linear polyethylenimine (PEI) Polysciences 23966-2 Any other transfection reagent is also fine
Milk powder Carl Roth T145 To block Western blot membranes
MluI-HF New England Biolabs R3198 Restriction enzyme for cloning into the split-BioID plasmids (NBirA* fusion)
Na-deoxycholate Sigma 30970 Make a 10% (w/v) stock solution
NaCl Sigma 31434 Make a 5M stock solution
NP-40 (Nonidet P40 substitute) Sigma 74385 Make a 20% (v/v) stock solution
PacI New England Biolabs R0547 Restriction enzyme for cloning into the split-BioID plasmids (CBirA* fusion)
Phosphate buffer saline (PBS) Sigma 806552 To wash cells before scrapping
PmeI New England Biolabs R0560 Restriction enzyme for cloning into the split-BioID plasmids (CBirA* fusion)
Protease inhibitor cocktail Roche 4693132001 Added to the lysis buffer to prevent protein degradation
pSF3-Flag-CBir-FRB_Myc-NBir-FKBP Addgene 90003 Split-BioID plasmid, mediates the co-expression of NBirA*-FKBP and CBirA*-FRB, FKBP and FRB can be replaced by two other ORFs
pSF3-Flag-CBir-FRB_FKBP-Myc-Nbir Addgene 90004 Split-BioID plasmid, mediates the co-expression of FKBP-NBirA* and CBirA*-FRB, FKBP and FRB can be replaced by two other ORFs
pSF3-Flag-FRB-Cbir_Myc-NBir-FKBP Addgene 90008 Split-BioID plasmid, mediates the co-expression of NBirA*-FKBP and FRB-CBirA*, FKBP and FRB can be replaced by two other ORFs
pSF3-Flag-FRB-Cbir_FKBP-Myc-Nbir Addgene 90009 Split-BioID plasmid, mediates the co-expression of FKBP-NBirA* and FRB-CBirA*, FKBP and FRB can be replaced by two other ORFs
Q5 High-Fidelity PCR kit New England Biolabs E0555S To amplify the ORF coding for the proteins to be tested. Any other thermostable DNA polymerase is fine.
Quick ligation kit New England Biolabs M2200S To ligate DNA fragments into the split-BioID plasmids, any other DNA ligation system is fine.
RunBlue 4-20% SDS precast gels Expedeon BCG42012 To use when running samples for MS analysis
RunBlue LDS Sample Buffer Expedeon NXB31010 Running buffer for the RunBlue precast gels
SDS Sigma 5030 Comes as a 20% stock solution
tet-free serum Biowest S181T we use tet-free serum to minimize basal expression of the fusion proteins
Trans-Blot Turbo Transfer system Bio-Rad 1704150 High speed Western blotting transfer system, any other transfer system is also fine
Tris Carl Roth 4855 Make 1M stock solutions with adequate pH (7.4 and 8)
Triton X-100 Applichem A4975 Make a 20% (v/v) stock solution
Tween-20 Carl Roth 9127 Used in Western blot buffers, Tween 20 leads to high background fluorescence and should be omitted in the blocking and last wash step

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Scott, D. E., Bayly, A. R., Abell, C., Skidmore, J. Small molecules, big targets: drug discovery faces the protein-protein interaction challenge. Nat Rev Drug Discov. 15 (8), 533-550 (2016).
  2. Roux, K. J., Kim, D. I., Raida, M., Burke, B. A promiscuous biotin ligase fusion protein identifies proximal and interacting proteins in mammalian cells. J Cell Biol. 196 (6), 801-810 (2012).
  3. Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nat Methods. 12 (1), 51-54 (2015).
  4. Rhee, H. W., et al. Proteomic mapping of mitochondria in living cells via spatially restricted enzymatic tagging. Science. 339 (6125), 1328-1331 (2013).
  5. Kim, D. I., et al. Probing nuclear pore complex architecture with proximity-dependent biotinylation. P Natl Acad Sci USA. 111 (24), E2453-E2461 (2014).
  6. Kim, D. I., et al. An improved smaller biotin ligase for BioID proximity labeling. Mol Biol Cell. 27 (8), 1188-1196 (2016).
  7. Lambert, J. P., Tucholska, M., Go, C., Knight, J. D., Gingras, A. C. Proximity biotinylation and affinity purification are complementary approaches for the interactome mapping of chromatin-associated protein complexes. J Proteomics. 118, 81-94 (2015).
  8. Morriswood, B., et al. Novel bilobe components in Trypanosoma brucei identified using proximity-dependent biotinylation. Eukaryot Cell. 12 (2), 356-367 (2013).
  9. Schopp, I. M., et al. Split-BioID a conditional proteomics approach to monitor the composition of spatiotemporally defined protein complexes. Nat Commun. 8, (2017).
  10. Béthune, J., Artus-Revel, C. G., Filipowicz, W. Kinetic analysis reveals successive steps leading to miRNA-mediated silencing in mammalian cells. EMBO Rep. 13 (8), 716-723 (2012).
  11. Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene. 96 (1), 23-28 (1990).
  12. Weidenfeld, I., et al. Inducible expression of coding and inhibitory RNAs from retargetable genomic loci. Nucleic Acids Res. 37 (7), e50 (2009).
  13. Dyballa, N., Metzger, S. Fast and sensitive colloidal coomassie G-250 staining for proteins in polyacrylamide gels. J Vis Exp. (30), (2009).
  14. Jonas, S., Izaurralde, E. Towards a molecular understanding of microRNA-mediated gene silencing. Nat Rev Genet. 16 (7), 421-433 (2015).
  15. MacRae, I. J., Ma, E., Zhou, M., Robinson, C. V., Doudna, J. A. In vitro reconstitution of the human RISC-loading complex. P Natl Acad Sci USA. 105 (2), 512-517 (2008).
  16. Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nat Biotechnol. 26 (12), 1367-1372 (2008).
  17. Tyanova, S., et al. The Perseus computational platform for comprehensive analysis of (prote)omics data. Nat Methods. 13 (9), 731-740 (2016).
  18. Opitz, N., et al. Capturing the Asc1p/Receptor for Activated C Kinase 1 (RACK1) Microenvironment at the Head Region of the 40S Ribosome with Quantitative BioID in Yeast. Mol Cell Proteomics. 16 (12), 2199-2218 (2017).
  19. Mackmull, M. T., et al. Landscape of nuclear transport receptor cargo specificity. Mol Syst Biol. 13 (12), 962 (2017).
  20. Kim, D. I., et al. BioSITe: A Method for Direct Detection and Quantitation of Site-Specific Biotinylation. J Proteome Res. , (2017).
  21. Udeshi, N. D., et al. Antibodies to biotin enable large-scale detection of biotinylation sites on proteins. Nat Methods. 14 (12), 1167-1170 (2017).
  22. Chapat, C., et al. Cap-binding protein 4EHP effects translation silencing by microRNAs. P Natl Acad Sci USA. 114 (21), 5425-5430 (2017).
  23. Luker, K. E., et al. Kinetics of regulated protein-protein interactions revealed with firefly luciferase complementation imaging in cells and living animals. P Natl Acad Sci USA. 101 (33), 12288-12293 (2004).
  24. De Munter, S., et al. Split-BioID: a proximity biotinylation assay for dimerization-dependent protein interactions. FEBS Lett. 591 (2), 415-424 (2017).
  25. Xue, M., et al. Optimizing the fragment complementation of APEX2 for detection of specific protein-protein interactions in live cells. Sci Rep. 7 (1), 12039 (2017).
  26. Branon, T. C., et al. Directed evolution of TurboID for efficient proximity labeling in living cells and organisms. bioRxiv. , (2017).

Tags

Biokemi fråga 134 BioID proteomik proteinteknik protein-fragment komplettering assay protein-protein interaktioner närhet märkning
Split-BioID — Proteomiska analys av sammanhangsberoende proteinkomplex i deras infödda cellulära miljön
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schopp, I. M., Béthune, J.… More

Schopp, I. M., Béthune, J. Split-BioID — Proteomic Analysis of Context-specific Protein Complexes in Their Native Cellular Environment. J. Vis. Exp. (134), e57479, doi:10.3791/57479 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter