Summary
Qui, descriviamo i metodi per eseguire ChIP-Seq e CARIP-Seq, compresa la preparazione di libreria per il sequenziamento di nuova generazione, per generare globale epigenomic e cromatina-associated RNA mappe in cellule ES.
Abstract
Cellule staminali embrionali (ES) auto-rinnovamento e differenziazione è regolata dai segnali estrinseci e intrinseci reti di fattori di trascrizione, regolatori epigenetici e modificazioni post-traduzionali degli istoni che combinatoriamente influenzano il gene stato di espressione di geni vicini. RNA ha anche dimostrato di interagire con diverse proteine per regolare la dinamica della cromatina ed espressione genica. Cromatina-associated RNA immunoprecipitazione (CARIP) seguite dal sequenziamento di nuova generazione (CARIP-Seq) è un nuovo metodo di indagine RNAs associato a proteine della cromatina, mentre immunoprecipitazione della cromatina seguita da sequenziamento di nuova generazione ( ChIP-Seq) è una tecnica potente genomica per mappare la posizione di modificazione post-traduzionale di istoni, fattori di trascrizione e modificatori epigenetici su una scala globale in cellule ES. Qui, descriviamo i metodi per eseguire CARIP-Seq e ChIP-Seq, tra cui la costruzione della libreria per la sequenziazione di prossima generazione, per generare mappe epigenomic e globale della cromatina-associated RNA in cellule ES.
Introduction
Le decisioni di destino delle cellule staminali embrionali (ES) sono regolate dalla comunicazione tra segnali extracellulari e una serie di regolatori trascrizionali, inclusi i modificatori dell'istone e modifica post-traduzionali degli istoni. Queste interazioni facilitano l'accessibilità della cromatina e impacchettamento della cromatina in uno dei due stati: l'eucromatina, che è aperta e trascrizionalmente attiva, e l'eterocromatina, che è compatto e generalmente trascrizionalmente inattiva. Fattori di trascrizione con affinità di legame al DNA sequenza-specifico e modificatori epigenetici associato con regioni eucromatiche di partecipare nel controllo dell'espressione genica. Metodi di sequenziamento di nuova generazione, tra cui ChIP-Seq1, sono state strumentali nella mappatura reti trascrizionali genoma che sono fondamentali per ES cella auto-rinnovamento e pluripotenza2,3,4 ,5,6. Inoltre, mentre RNA immunopreciation generazione sequenziamento (RIP-Seq)7 valutazioni delle interazioni RNA-proteina suggeriscono che proteine che legano il DNA interagiscono con RNA per regolare gli eventi trascrizionali7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12, pochi studi hanno studiato la localizzazione di genoma di RNA associati con cromatina12o interazioni globali tra modifiche di RNA e dell'istone. RNA lunghi non codificanti (lncRNAs) è una classe di RNA che sono stati trovati per regolare l'attività di proteine della cromatina associate13,14,15. Ad esempio, Xist è un lncRNA che regola, in cellule di mammifero femminile, l'inattivazione di un cromosoma di X, attraverso il reclutamento di repressori epigenetici16,17. Tuttavia, l'intero spettro degli RNA associati con cromatina è in gran parte sconosciuto. Qui, descriviamo un protocollo di romanzo, cromatina-associated RNA immunoprecipitazione (CARIP) seguita da sequenziamento di nuova generazione (CARIP-Seq), per identificare il RNAs cromatina-collegato su una base di genoma in cellule ES, compresa la biblioteca preparazione per sequenziamento di nuova generazione e ChIP-Seq per mappare occupazione globale di modificazioni istoniche, fattori di trascrizione e modificatori epigenetici. A differenza di altri metodi di RIP-Seq7, CARIP-Seq comprende fasi di reticolazione e sonicazione, che consentono l'identificazione diretta degli RNA associati della cromatina. Insieme, ChIP-Seq è un potente strumento per identificare le interazioni proteina-DNA del genoma, mentre CARIP-Seq è un potente metodo di indagine RNAs associato a componenti della cromatina.
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Protocol
1. cultura di Mouse ES cellule in condizioni prive di alimentatore.
Nota: Cellule di topo ES sono convenzionalmente coltivate in media su una piastra di coltura cellulare rivestita con gelatina e un mono-strato di fibroblasti embrionali del mouse (MEF), che sono stati inattivati mitotically (iMEFs). Tuttavia, MEFs dovrebbe essere rimosso prima dell'analisi epigenetiche o espressione a valle per evitare la contaminazione del MEF-collegata della cromatina e del RNA.
- Preparazione di uno strato dell'alimentatore: gelatina ricoprire una piastra di coltura delle cellule 6 pozzetti aggiungendo 2 mL di 0,1% di gelatina in acqua ed incubare la piastra a 37 ° C per 20-30 min.
- Preparare i supporti di alto-glucosio DMEM 10% contenente 2 mM L-Glutammina, 10% siero bovino fetale (FBS) e 1 x penicillina/streptomicina.
- Isolare MEFs da E13.5 a e 14.5 topi18,19 , o acquistare da un fornitore commerciale. Inattivare mitotically MEFs trattando con mitomicina C o irradiazione gamma utilizzando protocolli standard19. In alternativa, mitotically inattivato MEFs (iMEFs) può essere acquisito da un fornitore commerciale.
- Coltura MEFs. Pre-riscaldare media MEF a 37 ° C, scongelare i surgelati fiala di iMEFs e cultura in 10% FBS MEF media a 37 ° C con 5% CO2. Piastra MEFs presso ~ 200.000 cellule per pozzetto di una piastra di coltura 6 pozzetti.
- Coltura delle cellule di ES su uno strato di cellule di alimentatore (iMEFs).
- 12-24 h dopo il placcaggio iMEFs, pre-riscaldare un tubo da 50 mL di media delle cellule ES (DMEM alto-glucosio, LIF (10 ng/mL), 15% ES cella-qualificato FBS, 1 × coltura cellulare qualificato 2-mercaptoetanolo, 1 × glutammina, aminoacidi non essenziali (NEAA), 1 × penicillina/streptomicina), a 37 ° C con 5% CO2.
- Aspirare i media dalle piastre per colture cellulari contenenti iMEFs, risospendere le cellule ES in 2 mL di media (dopo lo scongelamento a 37 ° C) e le cellule sullo strato della iMEFs della lastra. Quando si posiziona la piastra di coltura nell'incubatrice, è importante spostare il piatto a forma di "t" per distribuire uniformemente le cellule e per impedire l'aggregazione verso il centro del piatto.
- Le cellule ES su piatti senza alimentatore gelatina rivestite del passaggio. Prima di diventare confluenti del passaggio le cellule ES. Le colonie delle cellule ES mantengono auto-rinnovamento migliore se le colonie sono equidistanti e non confluenti. La presenza di numerose colonie di cellule ES che stanno toccando indica che la densità cellulare è troppo alta.
- Cappotto, una piastra di coltura 6 pozzetti con gelatina come descritto sopra. Incubare 0,25% tripsina-EDTA a 37 ° C per circa 10-15 min per pre-riscaldare tripsina.
- Successivamente, passaggio le cellule ES primo lavaggio con 1x tamponato fosfato salino (PBS) e aggiungendo 1 mL di soluzione di tripsina-EDTA di 0,25%. Attendere 1-2 min per le colonie di staccare. Dissociare le colonie di una sospensione unicellulare di pipettaggio con una mancia di 1 mL per ~ 5 volte.
- Utilizzare un microscopio per confermare la dissociazione di singola cellula delle cellule ES. Per placare la reazione, o di "neutralizzare" la tripsina, aggiungere 10% FBS MEF media. Centrifugare le cellule a 300 x g e a temperatura ambiente per 3-5 min e aspirare i media.
- Risospendere il pellet cellulare in 2 mL di media (cellule ES) completato con inibitore di glicogeno sintasi chinasi-3 (GSK3) (CHIR99021; GSK3i), o 2i (MEKi/GSK3i) condizioni (2-3 µM GSK3i: CHIR99021, 1 µM MEKi: PD0325901).
- Aspirare la gelatina dalla piastra di coltura cellulare, aggiungere 2 mL di supporti contenenti ESCs al piatto e posizionare il piatto nell'incubatore 37 ° C (fig. 1A-D). Doppia inibizione di GSK3i e di MEKi promuove terra stato ingenuo pluripotenza delle cellule ES in assenza di cellule di alimentatore (iMEFs) e senza siero20. Cellule ES dovrebbero essere i due o tre volte per rimuovere MEFs prima di procedere alla reticolazione.
2. reticolazione di ES Cells per ChIP e CARIP
- Raccogliere le cellule ES lavandole con PBS, quindi aggiungere 0,25% tripsina pre-riscaldata a 37 ° C. Incubare le cellule per diversi minuti a temperatura ambiente. Evitare l'eccessivo trypsinization delle cellule di ES, che porterà alla morte delle cellule. Utilizzare un microscopio per valutare la dissociazione di singola cellula.
- Placare la digestione della tripsina come descritto sopra per il passaggio di cellule ES e centrifugare le cellule a 300 x g e a temperatura ambiente per 3-5 min.
- Risospendere le cellule in media MEF pre-riscaldata (37 ° C) (10% FBS/DMEM) a 2 × 106 cellule/mL.
- A reticolare le celle, aggiungere soluzione di formaldeide 37% ad una concentrazione finale di 1% e incubare le cellule in un tubo conico (15 mL o 50 mL) a 37 ° C per 8 min. Capovolgere la provetta diverse volte durante il periodo di 8 min per raggiungere omogenea fissazione.
Nota: Il tempo di fissazione può essere empiricamente ottimizzato per CARIP. Se il tempo di fissazione è alterato, il numero di cicli di sonicazione dovrebbe anche essere regolato. Inoltre, la temperatura di 37 ° C aumenta l'efficienza di reticolazione rispetto alla reticolazione a temperatura ambiente. La temperatura di fissaggio possa essere ottimizzata empiricamente. - Per interrompere la reazione di fissazione, aggiungere 1,25 M glicina (pre-refrigerata a 4 ° C) ad una concentrazione di 0,125 M. Capovolgere la provetta a 8 giri utilizzando un rotatore per 5 min a temperatura ambiente. Centrifugare il campione a 300 x g per 5 min a temperatura ambiente ed aspirare i media.
- Lavare il pellet cellulare con PBS pre-refrigerata (4 ° C), centrifugare il campione a 300 x g per 5 min a temperatura ambiente e aspirare PBS. Lavare le cellule con PBS nuovamente. Prossime, aliquotare 15 × 106 cellule per tubo da 15 mL.
- Congelare il pellet cellulare inserendolo in azoto liquido per 1 min, il ghiaccio secco per 5 min, o senza indugio e a-80 ° C.
Nota: Il pellet cellulare fisso ES possono essere memorizzati fino a 6 mesi senza riduzione della qualità negli esperimenti a valle.
3. sonicazione cromatina per ChIP e CARIP
- Scongelare il pellet di cellule ES fisso sul ghiaccio. Risospendere il pellet cellulare in tampone di sonicazione (2,5 mL). Per fattori di trascrizione o regolatori epigenetici (fattori proteici), risospendere il pellet in 1 x TE, 1 mM PMSF, 1 x cocktail di inibitore della proteinasi. Per le modifiche dell'istone, risospendere il pellet in 1 x TE, 0.1% SDS, 1 mM PMSF, 1 inibitore della proteinasi di x.
Nota: Mentre l'aggiunta di SDS aumenta l'efficienza di sonicazione, non può essere utile per la valutazione di alcuni costituenti della cromatina o fattori di trascrizione. - Per immunoprecipitazione della cromatina (ChIP), sottoporre ad ultrasuoni della cromatina con cicli di 14-18 (30 s su, resto di 30 s) al 40% ampiezza. Per cromatina-associated RNA immunoprecipitazione (CARIP), ridurre il numero di cicli di sonicazione (8-10 cicli). A causa di cellular, fissazione e variabilità sonifier, condizioni per sonicazione dovrebbero essere determinate empiricamente.
- Il tampone di sonicazione con 28 µ l di supplemento di 10% SDS per fattori proteici, 28 µ l di sodio desossicolato e 0,28 mL di 10% Triton-X100 e mescolare bene.
Nota: L'aggiunta di questi componenti nel buffer di sonicazione genera buffer di RIPA. - Centrifugare il campione a 10.000 x g per 10 min a 4 ° C per pre-cancellare la cromatina. Spostare il surnatante in una nuova provetta e procedere con immunoprecipitazione della cromatina.
- In alternativa, lisati mediante cromatina possa essere memorizzata a-80 ° C fino all'utilizzo. Tuttavia, il deposito della cromatina lisati mediante a-80 ° C può condurre alla diminuita qualità per ChIP di fattore della proteina.
4. chIP e CARIP processo
- Aggiungere 40 µ l di proteina A o branelli magnetici G un 1,5 mL, tubo obbligatoria bassa. Aggiungere 600 µ l di PBS per lavare le perle. Posizionare il tubo su un rack contenente un magnete, incubare la provetta per 1 min a temperatura ambiente, rimuovere PBS e risospendere i branelli magnetici in 100 µ l di PBS.
- Aggiungere 2-4 µ g di anticorpo al tubo con biglie magnetiche. Incubare e ruotare il tubo a temperatura ambiente per 40 min a 8 giri usando un rotatore per facilitare il grippaggio dell'anticorpo per le biglie magnetiche. Inserire il tubo sul rack magnetico, incubare per 1 min a temperatura ambiente, quindi rimuovere PBS.
- Aggiungere 200 µ l di PBS per lavare le biglie magnetiche. Lavaggio con PBS viene eseguito per rimuovere IgGs gratis. Incubare e ruotare il tubo a temperatura ambiente per 5 minuti tra fasi di lavaggio. Fissare il tubo al magnete e rimuovere il PBS.
- Proteine della cromatina associato immunoprecipitate incubando la cromatina lisati mediante estrarre (4 × 106 cellule per ChIP), con i branelli magnetici e ruotare il campione a 4 ° C (una notte).
- Lavare le biglie magnetiche. Incubare il campione a temperatura ambiente con i buffer seguenti e ruotare il campione per 10 min con ogni buffer: due volte con 1 mL di tampone RIPA (pH di TE (Tric-HCl 10 mM, 1 mM EDTA) 8.0, 1% Triton X-100, deocycholate di sodio 0,1%, 0,1% SDS), due volte con 1 mL di RIPA buffer c contenente 0,3 M NaCl, due volte con 1 mL di tampone di LiCl (0,5% sodio deocycholate, 0,5% NP40, 0.25 M LiCl), una volta con 1 mL di TE tampone con 0,2% Triton X-100 e una volta con 1 mL di TE.
- De-reticolazione per ChIP. Risospendere i branelli magnetici in 100 µ l di TE. Aggiungere 3 µ l di 10% SDS e 5 µ l di proteinasi K (20 mg/mL). Incubare il campione a 65 ° C (una notte).
Nota: È importante coprire i tubi durante questo passaggio con parafilm o involucro di plastica per evitare l'evaporazione.- Il giorno seguente, capovolgere la provetta diverse volte per mescolare. Successivamente, è possibile utilizzare il supporto di magnete per trasferire il surnatante in una nuova provetta. Lavare i branelli magnetici, aggiungere 100 µ l di TE contenenti 0.5 M NaCl, e successivamente unire i due surnatanti.
- De-reticolazione per CARIP. Risospendere i branelli magnetici in 100 µ l di TE. Aggiungere 3 µ l di 10% SDS e 5 µ l di proteinasi K (20 mg/mL). Incubare il campione a 65 ° C per 4-12 h. incubazione tempo a 65 ° C deve essere determinata empiricamente a causa della variabilità tra tipi cellulari, sonicazione e la fissazione di condizioni, ecc.
- Capovolgere la provetta 3 - 5 volte per mescolare, applicare il tubo al rack magnetico e successivamente spostare il surnatante in una nuova provetta.
- Lavare i branelli magnetici, aggiungere 100 µ l di TE contenenti 0.5 M NaCl, e successivamente unire i due surnatanti.
Nota: È importante utilizzare reagenti privo di nucleasi (ad es., buffer di TE, SDS, ecc.) per prevenire la perdita di DNA o RNA durante la fase di de-reticolazione.
- Estrarre DNA/RNA utilizzando 200 µ l di fenolo: cloroformio: alcool isoamilico (PCI) (25:24:1, v/v).
Nota: Possa anche essere estratte RNA usando i kit commerciali utilizzando le istruzioni del produttore. Agitare per 30 s, spin a 10.000 x g a temperatura ambiente per 10 min e spostare il surnatante in una nuova provetta.- Per precipitare il DNA/RNA, aggiungere 2 µ l di GlycoBlue, 20 µ l di acetato di sodio 3 M e 600 µ l di etanolo. Mix invertendo ~ 5-8 volte e il campione viene posto su ghiaccio secco o a-80 ° C per almeno 1-2 h.
- Centrifugare il campione a 10.000 x g per 30 min utilizzando una centrifuga di tavolo refrigerato (4 ° C). Asciugare all'aria il pellet per < 1 min e risospendere in 40 µ l di EB buffer (10 mM Tris-HCl). Per la preparazione di biblioteca di ChIP-Seq, procedere al passaggio 6.
- Rimuovere del DNA da campioni di RNA IP della cromatina-collegata usando dnasi. Aggiunge 10 x dnasi buffer a 1 concentrazione nel campione CARIP. Aggiungere 1 µ l di DNasi per fino a 10 µ g di RNA (reazione di 50 µ l). Incubare il campione a 37 ° C per 30 min. Estratto il campione di RNA con PCI. Risospendere in privo di nucleasi H2O.
5. double-stranded cDNA Synthesis for CARIP-Seq
- Sintesi del cDNA del primo-filo. Per la reazione d'inversione-trascrizione, impostare la seguente reazione in un tubo progettato per una macchina PCR: 10,5 µ l di RNA e 1 µ l casuale del hexamer primer (3 µ g / µ l).
- Incubare la provetta a 65 ° C per 5 min denaturare la struttura secondaria e memorizzarlo sul ghiaccio per 2 min Mix i seguenti componenti: 4 µ l di tampone di primo-filo, 2 µ l di 0,1 M DTT, 1 µ l di dNTP e 0,5 RNasi fuori. Successivamente, nella provetta PCR, aggiungere 7,5 µ l di master mix. Incubare la provetta per 2 min a 25 ° C. Aggiungere 1 µ l di Superscript II (200 U / µ l) e incubare come segue: 25 ° C per 10 min, 42 ° C per 50 min, 70 ° C per 15 min e tenere a 4 ° C.
- Sintesi del cDNA del secondo filo. Posizionare il tubo sul ghiaccio. Successivamente, aggiungere i seguenti componenti nell'ordine: 91 µ l di pirocarbonato dietilico (DEPC) trattati acqua, 30 µ l di tampone di reazione secondo-filo, 3 µ l di miscela del dNTP (10 mM), 1 µ l di e. Coli DNA ligasi (10 U / µ l), 4 µ l di e. Coli DNA polimerasi (10U / µ l): 5x e 1 µ l di e. Coli RNasi H (2U / µ l). Mescolare delicatamente nel vortex e incubare a 16 ° C per 2 h.
Nota: Miscelazione di sfogliando o invertendo il tubo può non essere sufficiente per mescolare accuratamente i reagenti. - Aggiungere 2 µ l di T4 DNA polimerasi e incubare a 16 ° C per 5 min. purificare cDNA (double-stranded, dscDNA) utilizzando il kit di purificazione di PCR. Eluire il dscDNA in 40 µ l di tampone EB.
- Frammento di cDNA double-stranded. Shear cDNA (dscDNA) usando un sonifier bagno di acqua e un tubo da 1,5 mL a una dimensione di 250-500 b.p. sonicazione di dscDNA è fondamentale per ridurre le dimensioni del frammento per facilitare l'ordinamento dell'intera trascrizione del RNA.
- Quando si utilizza un modello standard di un sonifier bagno d'acqua, Sonicare il campione per 3 × 10 min, o 4 × 10 min.
Nota: Tre cicli dovrebbero essere usati per fino a 1 µ g di RNA totale, mentre quattro cicli sono raccomandati per 1-5 µ g di RNA totale. Centrifugare la provetta brevemente dopo ogni ciclo di sonicazione e mantenere una vasca di acqua fredda con l'aggiunta di ghiaccio fresco. - Quando si utilizza un sonifier di Pico, si consiglia di utilizzare sei cicli per 1-5 µ g di RNA totale e le seguenti condizioni in bicicletta (30 s su, 90 s spento). Centrifugare la provetta brevemente dopo 2-3 cicli di sonicazione. L'efficienza di sonicazione può essere determinato da una frazione della dscDNA Tosato (3-4 µ l) su un gel di agarosio di caricamento (2%). È importante verificare empiricamente le condizioni di sonicazione a causa della variabilità tra sonifiers.
- Eseguire la libreria preparazione come descritto nel passaggio 6 per il sequenziamento di nuova generazione.
6. chIP-Seq e costruzione della libreria CARIP-Seq
- Riparare le punte di DNA usando un kit di fine-riparazione del DNA. Questo kit viene utilizzato per generare DNA smussato-conclusa. Per questa reazione, impostata le seguenti opzioni in un 1,5 mL, basso vincolante tubo: 34 µ l di DNA, 5 µ l di 2,5 mM dNPTs, 5 µ l di 10 mM ATP, 5 µ l di tampone di fine-riparazione (5 mM DTT, 100 millimetri Magnesio acetato, acetato di potassio di 660 mM 10x 300 mM Tris-acetato, pH 7,8) e 1 µ l di fine-riparazione mix di enzima (chinasi di polinucleotide T4, T4 DNA polimerasi).
- Incubare il campione per 45 min a temperatura ambiente.
- Purificare il DNA utilizzando un kit di pulitura di reazione. Eluire il DNA fine-riparato in 32 µ l di tampone EB pre-riscaldato (65 ° C). Mentre non abbiamo solitamente quantificare la concentrazione di DNA in seguito ChIP, o RNA seguito CARIP, prima della preparazione di libreria, si consiglia di iniziare con almeno 5-10 ng di ChIP DNA o RNA CARIP.
- Aggiunta di una sporgenza di 3' "A" alla fine-riparazione del DNA. Aggiungere i componenti a un 1,5 mL, tubo obbligatoria bassa: 30 µ l di DNA dall'alto, 5 µ l di tampone di NEB 2, 1 µ l di dATP dal magazzino di 10 mM, 11 µ l di H2O e 3 µ l di 5 U 10x / frammento di Klenow µ l (3' - 5' Exo-) e mescolare delicatamente pipettando.
- Incubare il campione per 30 min a 37 ° C.
- Utilizzare un kit di pulitura di reazione per purificare il DNA. Eluire il DNA in 25 µ l di tampone EB pre-riscaldato (65 ° C).
- Legare l'adattatore. Aggiungere i seguenti componenti sul ghiaccio: 23 µ l di DNA dall'alto, 3 µ l di 10 x T4 DNA ligasi buffer, 1 µ l di PE ricotto o multiplexing adattatore (4 µM) e 3 µ l di T4 DNA ligasi (400 U / µ l) e mescolare delicatamente pipettando.
Nota: Sequenze di adattatore possono essere ottenuti anche da una fonte commerciale.
Sequenze di oligonucleotidi:
Schede di PE
5' P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAGGAATGCCGAG
5' ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
Multiplexing adattatori
5' P-GATCGGAAGAGCACACGTCT
5' ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT - Incubare il campione a temperatura ambiente per 30 minuti.
- Eseguire la selezione della dimensione del DNA utilizzando un gel di agarosio (2%) prefabbricato. Esegua il gel per 10 min.
- Asportare la regione corrispondente a 250-450 bp.
Nota: tagliando il gel sopra sopra 200 bp, c'è la possibilità di una riduzione della contaminazione da dimeri deossiHb adattatore. È importante rimuovere eventuali schede di deossiHb prima il passo PCR. - Utilizzare un kit di estrazione del gel per purificare il DNA. Eluire in 20 µ l di tampone EB.
- Purificazione di PCR e biblioteca per il DNA dei campioni contenenti schede di accoppiato-fine (PE). Aggiungere i componenti in un tubo PCR: 12 µ l del 50% del DNA dall'alto, 12 µ l di acqua, 25 µ l di master mix (Phusion HF), 1 µ l di primer PCR PE 1.0 e 1 µ l di primer PCR PE 2.0.
Nota: Sequenze di oligonucleotidi possono essere ottenuti anche da una fonte commerciale.
Sequenze di oligonucleotidi:
Primer PCR PE 1.0
5' AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
Primer PCR PE 2.0
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT - Purificazione di PCR e biblioteca dei campioni contenenti schede indice PE. Aggiungere i componenti: 12 µ l del 50% del DNA dall'alto, 12 µ l di acqua, 1 µ l di primer PCR InPE 1.0 (diluito 1:2), 1 µ l di primer PCR InPE 2.0 (diluito 1:2) e 1 µ l di primer PCR indice (diluito 1:2).
Nota: sequenze di oligonucleotidi possono essere ottenuti anche da una fonte commerciale.
Sequenze di oligonucleotidi:
Funzionamento in multiplex PCR Primer 1.0
5' AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
Funzionamento in multiplex PCR Primer 2.0
5' GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
Sequenze PCR Primer indice 1-12
Primer PCR, indice 1
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTC
Primer PCR, indice 2
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTC
Primer PCR, indice 3
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTC
Primer PCR, indice 4
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTC
Primer PCR, indice 5
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTC
Primer PCR, Indice 6
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTC
Primer PCR, indice 7
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGATCTGGTGACTGGAGTTC
Primer PCR, indice 8
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCAAGTGTGACTGGAGTTC
Primer PCR, indice 9
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCGTGACTGGAGTTC
Primer PCR, indice 10
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCTAGTGACTGGAGTTC
Primer PCR, indice 11
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGCCGTGACTGGAGTTC
Primer PCR, indice 12
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACAAGGTGACTGGAGTTC - Eseguire PCR in bicicletta utilizzando le seguenti condizioni (denaturare per 30 s a 98 ° C, 18 cicli di 10 s a 98 ° C, 30 s a 65° C, 30 s a 72 ° C, 5 min a 72 ° C, tenere a 4 ° C).
Nota: Il numero di cicli PCR dovrebbe essere determinato empiricamente. - Selezione della dimensione dei prodotti di PCR. Esame del DNA su un E-Gel prefabbricato EX (2%) o fatti in casa 2% gel (agarosio) e asportare la regione di 300-500 bp.
- Utilizzare un kit di estrazione del gel per purificare il DNA dal gel. Eluire il prodotto finale di PCR in 20 µ l di tampone EB.
- Utilizzare un fluorimetro per misurare la concentrazione della biblioteca. Eseguire il sequenziamento di nuova generazione.
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Representative Results
Abbiamo interrogato con successo l'associazione genome-wide di H3K4me3, H3K4me2 e KDM5B in cellule ES utilizza questo ChIP-Seq protocollo6. Le cellule ES sono state coltivate in condizioni prive di alimentatore (Figura 1) e reticolato come descritto sopra. Sonicazione è stata successivamente eseguita come descritto al punto 3.2 del protocollo ChIP-Seq e valutata esaminando il DNA su un gel di agarosio al 2% (Figura 2). Successivamente, ChIP è stato effettuato come descritto nel passaggio 4 e preparazione della biblioteca è stata eseguita come descritto nel passaggio 6. ChIP-Seq librerie sono state sequenziate su una piattaforma di sequenziamento di nuova generazione. Rappresentante visualizzazioni personalizzate di browser UCSC rivelano arricchimento di H3K4me3, H3K4me2 e KDM5B al gene di pluripotenza core POU5F1 (Figura 3A) e presso il cluster HOXC (Figura 3B). CARIP-Seq inoltre è stata effettuata seguendo il protocollo, come descritto nei passaggi 4-6. Una rappresentanza Vista browser UCSC rivela arricchimento di RNA H4K20me3-collegata (CARIP-Seq) e H4K20me3 occupazione (ChIP-Seq) presso un loci in cellule ES (Figura 4). Il segnale di CARIP-Seq dimostra che mentre il RNA è associato con H4K20me3, esso non indica necessariamente che interagisce con il luogo indicato. CARIP-Seq DataSet possono essere analizzati in un modo simile come set di dati ChIP-Seq. I dati generati dal mouse ES cell CARIP-Seq e ChIP-Seq esperimenti possono essere allineati a un genoma di riferimento (ad es., mm9, mm10) utilizzando bowtie221. ChIP-Seq e regioni CARIP-Seq arricchita possono entrambi essere identificate utilizzando picco chiamata programmi come "Spatial Clustering per identificazione di ChIP-Enriched regioni" (SICER)22 o Mac23,24. Perché CARIP-Seq DataSet probabile includono ampia picchi, è importante utilizzare un algoritmo che consente di identificare picchi ampia e nitide. Mentre i protocolli descritti in questo manoscritto sono stati ottimizzati per l'esecuzione di ChIP-Seq e CARIP-Seq utilizzando cellule ES, questi protocolli dovrebbero anche essere adatti per la valutazione della proteina-DNA e della cromatina-collegata di interazioni RNA in altri tipi cellulari.
Figura 1: alimentatore senza cultura delle cellule ES. (A) disegno sperimentale. (B) ES cellule coltivate su iMEFs in ES cellulare supporti contenenti LIF, o in condizioni prive di alimentatore con ES cella supporti contenenti LIF e (C) GSK3i o (D) GSK3i e MEKi (2i). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: sonicazione della cromatina delle cellule reticolate ES. Cellule ES reticolato erano sonicate usando un sonifier con un microtip per 18 cicli (40% ampiezza, 30 s su e 30 s resto). Reticolazione è stata invertita, e digestione RNasi successivamente è stata effettuata per rimuovere RNA. DNA è stato purificato mediante PCI e funzionare su un gel di agarosio (2%). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: analisi di rappresentante ChIP-Seq di un istone modifica modifiche degli enzimi e degli istoni in cellule ES. Visualizzazioni personalizzate UCSC browser di H3K4me3, H3K4me2 e KDM5B presso la pluripotenza-regolatore (A) POU5F1 e il HOXC (B) del cluster in cellule ES (densità tag normalizzato (RPBM), leggere a base al milione letture). Si noti la sovrapposizione tra associazione KDM5B e H3K4me3/2 occupazione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: rappresentante CARIP-Seq analisi di RNA associati a una modifica dell'istone e ChIP-Seq in cellule ES. Visualizzazioni del browser UCSC di segnali H4K20me3 CARIP-Seq e H4K20me3 ChIP-Seq in cellule ES (densità tag normalizzato (RPBM), leggere a base al milioni letture). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
ChIP-Seq è un metodo utile per valutare la posizione delle interazioni proteina-DNA globale (ad es., fattori di trascrizione/istone modifica modifiche istoniche/enzimi e DNA) in cellule ES, mentre il protocollo di CARIP-Seq recente sviluppato è utile in interrogando associazione genome-wide di RNA con costituenti della cromatina. ChIP-Seq è uno strumento fondamentale che viene utilizzato per valutare epigenetici paesaggi delle celle di ES e altri tipi di cellule. La qualità del ChIP-Seq e librerie CARIP-Seq dipende in larga misura gli anticorpi ChIP-grado. L'idoneità degli anticorpi per ChIP-Seq può essere determinata empiricamente eseguendo ChIP-PCR, dove un ≥ 3 a 5 volte arricchimento alle regioni di controllo positivo rispetto a regioni non occupate dovrebbe essere sufficiente per generare dati di alta qualità ChIP-Seq25. Allo stesso modo, gli anticorpi possono essere testati per la loro idoneità per CARIP-Seq in un modo simile come descritto per il ChIP-Seq con modifiche minori. Seguendo il passo di RNA IP nel protocollo CARIP come descritto nella sezione metodi di cui sopra, PCR d'inversione-trascrizione dovrebbe essere eseguita per generare cDNA, che può essere utilizzato come modello per eseguire Q-RT-PCR. Si consiglia di valutare l'arricchimento seguito ChIP o CARIP alle diverse regioni genomiche. Ci sono considerazioni aggiuntive per verificare quando la valutazione della qualità degli anticorpi per ChIP o CARIP. Ad esempio, il rigore di buffer utilizzati per ChIP e CARIP potrebbe essere ottimizzato alterando la concentrazione di NaCl: una bassa concentrazione di NaCl è adatta per anticorpi altamente specifici, mentre un'alta concentrazione di NaCl può essere utile per gli anticorpi con legame non specifico. Per quanto riguarda la preparazione di libreria per il sequenziamento di nuova generazione, primer personalizzato e indici possono essere utilizzati anche al posto di oligonucleotidi commercialmente acquisite. Tuttavia, è importante notare che tra cui una modifica fosforotioato fra due basi all'estremità 3' ha dimostrato di prevenire nucleasi digestione26. Terze parti RNA-Seq o ChIP-Seq libreria costruzione kit può essere utilizzato anche per generare librerie per il sequenziamento di CARIP e ChIP campioni, rispettivamente. Tuttavia, è importante testare empiricamente i kit per valutare la loro efficacia nel generare librerie di qualità per il sequenziamento di nuova generazione. Protocolli aggiuntivi possono essere impiegati anche per la preparazione di biblioteca di ChIP-Seq, come ChIPmentation27. Tuttavia, adattamento di ChIPmentation per il protocollo di ChIP-Seq descritto qui richiederà ulteriori modifiche e ulteriore ottimizzazione.
Qui, descriviamo il ChIP e CARIP protocolli che sono stati ottimizzati con un numero moderato di celle (4 × 106 cellule per IP). Mentre il protocollo di ChIP può essere eseguito utilizzando numeri di cellulare basso a intermedio (105 106 cellule), non abbiamo effettuato utilizzando meno di 2 × 106 cellule CARIP-Seq. Tuttavia, empiricamente sperimentando le varie condizioni di fissazione e sonicazione, è possibile che questo protocollo potrebbe funzionare correttamente utilizzando un piccolo numero di cellule.
In sintesi, ChIP-Seq e CARIP-Seq sono utili per generare mappe globali di cromatina-collegato proteine ed RNA in cellule ES, rispettivamente. Mentre questi protocolli sono stati ottimizzati per le cellule ES, possono essere ottimizzati per generare mappe di cromatina usando un'ampia varietà di linee cellulari di mammifero e tipi di tessuto. Questi protocolli possono anche essere ottimizzati per generare cella singola ChIP-Seq o librerie CARIP-Seq.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da Wayne State University, Karmanos Cancer Institute, una borsa di studio dal National Heart, Lung e Istituto del sangue (1K22HL126842-01A1) assegnato a B.L.K. Questo lavoro utilizzata la Wayne State University alta Performance Computing Grid per risorse computazionali (< https://www.grid.wayne.edu/>). Ringraziamo Jiji Kurup per assistenza con l'analisi dei dati CARIP-Seq.
CONTRIBUTI DEGLI AUTORI:
B.L.K. concepì il metodo CARIP-Seq, progettato e realizzazione degli esperimenti di ChIP-Seq e CARIP-Seq, analizzati i dati di sequenziamento e redatto il manoscritto. Tutti gli autori hanno letto e approvato la versione finale di questo manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse leukemia inhibitory factor (ESGRO LIF) | EMD Millipore | 106 or 107 units | |
| GSK3β inhibitor CHIR99021 (GSK3i) | Stemgent | Solvent: DMSO 10mM | |
| MEK inhibitor PD0325901 (MEKi) | Stemgent | Solvent: DMSO 10mM | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose | Invitrogen | 11965092 | |
| PBS (phosphate buffered saline) | Invitrogen | 10010031 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| 2-Mercaptoethanol (50 mM) | Gibco | 31350010 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140076 | |
| EmbryoMax ES Cell Qualified Fetal Bovine Serum, 500 ml | EMD Millipore | ES-009-B | |
| EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | EMD Millipore | ES-006-B | |
| Glycine | Sigma | G7126-500G | 1.25 M stock conentration in water |
| Formaldehyde solution | Sigma | F8775-500ML | |
| TE (Tris EDTA) pH 8.0 1X | Quality Biological | 351-011-131 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) solution | Sigma | 93482-250ML-F | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697498001 | |
| Sodium dodecyl sulfate solution (20%) | Quality Biological | A611-0837-10 | |
| Q125 sonifier | Qsonica | 4422 | |
| Triton X-100 solution | Sigma | 93443-100ML | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation | Invitrogen | 10004D | |
| Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation | Invitrogen | 10002D | |
| Dynabeads Protein A/Protein G and Magnet Starter Pack | Invitrogen | 10015D | |
| Lithium chloride | Sigma | L4408 | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma | I8896 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Dynabeads mRNA Purification Kit (for mRNA purification from total RNA preps) | Invitrogen | 61006 | |
| SuperScript Double-Stranded cDNA Synthesis Kit | Invitrogen | 11917010 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| End-It DNA End-Repair Kit | Lucigen | ER81050 | |
| Klenow Fragment (3'→5' exo-) | NEB | M0212L | |
| dATP (10 mM) | Invitrogen | 18252015 | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202L | |
| TrackIt 1 Kb Plus DNA Ladder | Invitrogen | 10488085 | |
| E-gel EX agarose gels, 2% | Invitrogen | G402002 | |
| Phusion high-fidelity 2X master mix with HF buffer | Thermo Fisher | F531LPM | |
| ChIPAb+ Trimethyl-Histone H3 (Lys4) - ChIP Validated Antibody | EMD Millipore | 17-614 | |
| Anti-Histone H3 (di methyl K4) antibody [Y47] - ChIP Grade (ab32356) | Abcam | ab32356 | |
| Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-well) | Fisher | 720083 | |
| Falcon Standard Tissue Culture Dishes (10cm) | Fisher | 08772E | |
| Bioruptor pico | Diagenode | B01010001 | |
| Qubit Flurometer 2.0 | Thermo Fisher | ||
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32851 | |
| MinElute Reaction Cleanup Kit | Qiagen | 28204 | |
| MinElute Gel Extraction Kit | Qiagen | 28604 | |
| Anti-Histone H4 (tri methyl K20) antibody - ChIP Grade (ab9053) | Abcam | ab9053 | |
| Labquake rotator | Thermo Fisher | 400110Q | |
| Illumina HiSeq platform | Illumina | ||
| TURBO DNase | Invitrogen | AM2238 |
References
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