Summary
여기, 우리는 칩 Seq를 수행 하는 방법을 설명 및 CARIP-Seq, 다음-세대 시퀀싱, 라이브러리 준비 등 글로벌 epigenomic 및 chromatin 관련 RNA 생성 하 ES 세포에 지도.
Abstract
배아 줄기 (ES) 세포 자체 갱신 및 차별화 외부 신호 및 녹음 방송 요인, 후 레 귤 레이 터, 및 combinatorially 유전자에 영향을 주는 히스톤의 포스트 번역 수정 내장 네트워크에 의해 규율 됩니다. 근처 유전자의 표현 상태입니다. RNA도 chromatin 역학 및 유전자 발현을 조절 하는 다양 한 단백질 상호 작용을 보였다. Chromatin 관련 RNA immunoprecipitation (CARIP) 다음-세대 시퀀싱 (CARIP-Seq) 다음 RNAs chromatin 단백질, 뒤에 다음-세대 시퀀싱 (chromatin immunoprecipitation 동안과 관련 된 조사를 소설 방법입니다. ChIP-Seq) 히스톤, 녹음 방송 요인과 ES 세포에서 글로벌 규모에 epigenetic 한정자의 포스트 번역 상 수정 위치를 매핑하는 강력한 유전체학 기술입니다. 여기, 우리는 CARIP-Seq와 칩 Seq, 다음-세대 시퀀싱, 도서관 건축을 포함 하 여 ES 세포에서 글로벌 chromatin 관련 RNA 및 epigenomic 지도 생성 하기 위해 수행 하는 방법을 설명 합니다.
Introduction
배아 줄기 (ES) 세포 운명 결정 extracellular 신호 및 transcriptional-레 귤 레이 터, 히스톤 한정자 및 히스톤 꼬리의 사후 번역 수정 포함 하 여 호스트 간의 통신에 의해 통제 된다. 이러한 상호 작용 촉진 chromatin 접근성 및 두 가지 상태 중 하나로 chromatin의 포장: euchromatin 열리고 transcriptionally 활성 되 고 섬으로, 콤팩트 하 고 transcriptionally 일반적으로 비활성 이다. 녹음 방송 요인 DNA 시퀀스 특정 바인딩 선호도와 epigenetic 한정자 연결 대상 euchromatic 지구 유전자 발현 조절에 참여 하. 다음-세대 시퀀싱 방법, 칩 Seq1를 포함 하 여 ES 세포 자체 갱신 및 pluripotency2,3,4에 대 한 근본적인 게놈 넓은 transcriptional 네트워크 매핑 수단이 ,,56. 또한, RNA immunopreciation RNA-단백질 상호 작용의 다음-세대 시퀀싱 (RIP-Seq)7 평가 뒤 동안 DNA 의무적인 단백질 transcriptional 이벤트7, 를 규제 하는 RNAs 상호 작용 제안 8 , 9 , 10 , 11 , 12, 몇 가지 연구 RNAs chromatin12또는 RNA와 히스톤 수정 사이 글로벌 상호 연관의 게놈 넓은 지역화를 조사 했습니다. 오래 비 코딩 RNAs (lncRNAs)는 있으면 chromatin 관련 단백질13,,1415의 활동을 규제 하는 RNAs의 한 클래스. 예를 들어 Xist epigenetic repressors16,17의 채용을 통해 하나의 X 염색체의 비활성화를 여성 포유류 세포에서 조절 하는 lncRNA 이다. 그러나, chromatin와 관련 된 RNAs의 전체 스펙트럼 크게 불명 하다. 여기, 우리는 새로운 프로토콜, chromatin 관련 RNA immunoprecipitation (CARIP)에 대 한 다음-세대 시퀀싱 (CARIP-Seq), 라이브러리 준비를 포함 하 여 ES 세포의 게놈 넓은 기준 chromatin 관련 RNAs를 식별 하기 위해 다음 설명 차세대 시퀀싱, 그리고 칩 Seq 매핑할 히스톤 수정, 녹음 방송 요인과 epigenetic 한정자의 글로벌 인. 달리 다른 RIP Seq 방법7, CARIP-Seq chromatin와 관련 된 RNAs의 직접 식별을 위해 허용 가교 및 쥡니다 단계를 포함 합니다. 함께, 칩 Seq 게놈 넓은 단백질 DNA 상호 작용을 식별 하는 강력한 도구, RNAs chromatin 구성 요소와 관련 된 CARIP-Seq는 조사 하는 강력한 방법.
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Protocol
1. 마우스 ES의 문화 급지대 무료 조건에서 세포.
참고: 마우스 ES 세포 세포 문화 접시 젤라틴와 마우스 미 발달 섬유 아 세포 (MEF), mitotically 활성화 되었습니다의 모노 레이어 코팅 (iMEFs)에 미디어에 교양 통상. 그러나, MEFs는 MEF 관련 chromatin와 RNA의 오염을 방지 하기 위해 다운스트림 epigenetic 또는 식을 분석 하기 전에 제거 되어야 한다.
- 급지대 계층의 준비: 젤라틴 물에 0.1% 젤라틴의 2 개 mL를 추가 하 여 6-잘 셀 문화 플레이트 코트와 20-30 분 동안 37 ° C에서 접시를 품 어.
- 2 m m L-글루타민, 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 그리고 1 x 페니실린/스 10 %DMEM 높은 포도 당 미디어를 준비 합니다.
- E14.5 쥐18,19 E13.5에서 MEFs를 격리 또는 상업용 공급 업체에서 취득. Mitotically 미토마이신 C 또는 감마 방사선 표준 프로토콜19를 사용 하 여 처리 하 여 MEFs을 비활성화. 또는 비활성화 mitotically MEFs (iMEFs) 취득 수 있다 될 상업용 공급 업체에서.
- MEFs 배양 37 ° C에서 MEF 미디어를 미리 따뜻하게 하 고, iMEFs의 냉동된 유리병을 녹여 10%에서 5% CO2와 37 ° C에서 FBS MEF 미디어 문화. 6 잘 문화 접시의 당 ~ 200000 셀에서 플레이트 MEFs.
- 층의 피더 세포 (iMEFs)에 자란 ES 세포.
- 12-24 h iMEFs, 도금 후 미리 따뜻한 ES 세포 미디어의 50 mL 튜브 (LIF DMEM 높은 포도 당 (10 ng/mL), 15 %ES 세포 자격 FBS, 1 × 셀 문화 자격 2-mercaptoethanol, 1 × 글루타민, 불필요 한 아미노산 (NEAA), 1 × 페니실린/스), 37 ° C에서 와 5% CO2.
- IMEFs를 포함 하는 세포 배양 배지에서 미디어를 발음, 다시 (후 37 ° C에 녹고), 미디어의 2 mL에 ES 세포를 중단 하 고 iMEFs의 층에 세포 격판덮개. 인큐베이터에서 문화 요리 때, 그것은 셀을 균등 하 게 배포 하 고 접시의 중심을 향해 집계를 방지 하기 위해 "t" 모양에 접시를 이동 하는 것이 중요.
- 젤라틴 코팅 급지대 무료 요리에 ES 세포 통로 Confluent 되기 전에 ES 세포를 통과. ES 세포 식민지 식민지는 균등 하지 confluent 경우 자체 갱신 최고를 유지 한다. 접하는 많은 ES 세포 식민지의 존재 셀 밀도 너무 높은 임을 나타냅니다.
- 위에서 설명한 대로 젤라틴 6 잘 문화 접시를 코트. ~ 10-15 37 ° C에서 0.25% trypsin EDTA를 품 어 미리 따뜻한 트립 신 분.
- 다음, 처음 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) x 1 세척 하 고 0.25% trypsin EDTA 용액 1 mL를 추가 하 여 ES 세포를 통과. 분리를 식민지에 대 한 1-2 분 기다립니다. 단일 세포 현 탁 액을 식민지에 대 한 1 mL 팁 pipetting으로 해리 ~ 5 번.
- 현미경을 사용 하 여 ES 세포의 단일 세포 분리를 확인. 끄다 반응, 또는 "중화"는 트립 신, 10% FBS MEF 미디어를 추가 합니다. 3-5 분, 실 온에서 300 x g에서 세포를 원심 하 고 미디어를 발음.
- 다시 글 리 코겐 synthase 키 니 아 제 3 (GSK3) 억제제 (CHIR99021; 보충 2 ml 미디어 (ES 세포)의 세포 펠 릿을 일시 중단 GSK3i), 또는 2i (め/GSK3i) 조건 (2-3 µ M GSK3i: CHIR99021, 1 µ M め: PD0325901).
- 세포 배양 접시에서 젤라틴 발음 접시, ESCs를 포함 하는 미디어의 2 개 mL를 추가 하 고 37 ° C 배양 기 (그림 1A-D)에 접시를 놓고. GSK3i 및 め의 듀얼 억제 및 혈 청20없이 피더 세포 (iMEFs)의 부재에 ES 세포의 바닥 상태 순진한 pluripotency를 촉진합니다. ES 세포 passaged 2 가교를 진행 하기 전에 MEFs를 제거 하는 데 세 번을 해야 합니다.
2. 가교 es 세포 칩 및 CARIP에 대 한
- 0.25% trypsin 37 ° c.에 미리 예 열을 추가한 다음, PBS로 세척 하 여 ES 세포를 수확 실 온에서 몇 분 동안 세포를 품 어. 세포 죽음으로 이어질 것입니다 ES 세포의 trypsinization 이상 하지 마십시오. 현미경을 사용 하 여 단일 셀 분리 평가.
- ES 세포를 뿌리고 위에 설명 된 대로 트립 신 소화를 담금질 하 고 3-5 분 동안 실 온에서 300 x g에서 세포를 원심.
- 다시 미리 따뜻하게 (37 ° C) MEF 미디어에 셀을 일시 중단 (10 %FBS / DMEM) 2 × 106 셀/mL에서.
- Crosslink를 셀, 1% 최종 농도를 37% 포름알데히드 솔루션을 추가 하 고 동질적인 고정 달성 하기 8 분 기간 동안 여러 번 튜브를 반전 하는 8 분에 대 한 37 ° C에서 15 mL (50 mL) 원뿔 튜브에 세포를 품 어.
참고: 고정 시간 수 경험적으로 최적화 된 CARIP. 고정 시간을 변경 하는 경우에 쥡니다 사이클 수 조정 한다. 또한, 37 ° C 온도 실내 온도에서 가교에 비해 가교 효율을 증가 시킵니다. 고정 온도 경험적으로 최적화할 수 있습니다. - 1.25 M 추가 고정 반응을 중지 하려면 글리신 (-4 ° C에서 냉장) 0.125 M.의 농도에 회전자를 사용 하 여 실 온에서 5 분 동안 8 rpm에서 튜브 반전. 실 온에서 5 분에 대 한 300 x g에서 샘플 원심 하 고 미디어를 발음.
- 미리 냉장된 PBS (4 ° C)를 가진 셀 펠 릿을 세척 하 고 실 온에서 5 분에 대 한 300 x g에서 샘플 원심 PBS 발음. 다시 PBS로 세포를 씻어. 다음, aliquot 15 × 106 셀 15 mL 튜브 당.
- 1 분, 5 분, 대 드라이 아이스에 액체 질소에 그것을 배치 하 여 셀 펠 릿을 동결 하거나 즉시-80 ° c.에
참고: 고정된 ES 세포 펠 릿 다운스트림 실험에서 감소 품질 없이 최대 6 개월 동안 저장할 수 있습니다.
3. chromatin 쥡니다 칩 및 CARIP에 대 한
- 녹여 얼음에 ES 세포 pellet을 고정. 다시 쥡니다 버퍼 (2.5 mL)에 셀 펠 릿을 일시 중단 합니다. 녹음 방송 요인 또는 후 레 귤 레이 터 (단백질 요인), 다시 일시 1 x 테, 1 밀리미터 PMSF, 가수분해 억제 물 칵테일 x 1에에서는 펠 릿을 중단 합니다. 히스톤 수정에 대 한 다시 일시 1 x 테, 0.1 %SDS, 1 밀리미터 PMSF, 1 x 가수분해 억제 물에에서는 펠 릿을 중단 합니다.
참고: SDS의 추가 쥡니다 효율성 강화, 하는 동안 그것은 수 없습니다 특정 chromatin 성분 또는 녹음 방송 요인 평가 하는 데 도움이. - Chromatin immunoprecipitation (칩)에 대 한 14-18 사이클 chromatin sonicate (30 초, 30 초 휴식) 40% 진폭에서. Chromatin 관련 RNA immunoprecipitation (CARIP), 대 한 쥡니다 사이클 (주기 8-10)의 수를 줄입니다. 휴대, 고정, 및 sonifier 다양성, 쥡니다 조건은 실험적으로 결정 되어야 합니다.
- 보충 쥡니다 버퍼 28 µ L 10 %sds 단백질 요소, 나트륨 deoxycholate의 28 µ L, 0.28 mL 10% 트리톤 X100와 섞어 잘.
참고: 쥡니다 버퍼에 이러한 구성 요소를 추가 RIPA 버퍼를 생성합니다. - 예약 취소는 chromatin 4 ° C에서 10 분 동안 10000 x g에서 샘플 원심 신선한 튜브에는 상쾌한을 이동 하 고 chromatin immunoprecipitation 진행.
- 또는, 사용까지-80 ° C에서 sonicated chromatin은 저장할 수 있습니다. 그러나,-80 ° C에서 sonicated chromatin의 저장 품질 저하 요인은 단백질 칩에 대 한 발생할 수 있습니다.
4. 칩 및 CARIP 프로세스
- 40 µ L의 단백질 A 또는 G 자석 구슬 낮은 바인딩 튜브 1.5 mL를 추가 합니다. 구슬 씻어 PBS의 600 µ L를 추가 합니다. 자석 포함 된 걸 튜브, 실 온에서 1 분 동안 튜브를 품 어, PBS를 제거 놓고 다시 PBS의 100 µ L에 자석 구슬을 일시 중단 합니다.
- 마그네틱 구슬 튜브에 항 체의 2-4 µ g를 추가 합니다. 품 어 고 자성 구슬에 항 체 바인딩을 촉진 하는 회전자를 사용 하 여 8 rpm에서 40 분 동안 실내 온도에 튜브를 회전. 자기 걸 튜브 삽입, 실내 온도에 1 분 동안 품 어 다음 PBS를 제거 합니다.
- 마그네틱 구슬 씻어 PBS의 200 µ L를 추가 합니다. PBS로 세척 무료 IgGs을 제거 수행 됩니다. 품 어 및 세척 단계 사이 5 분 동안 실내 온도에 튜브를 회전. 자석에 튜브를 연결 하 고 PBS를 제거 합니다.
- Immunoprecipitate chromatin-바인딩 단백질 sonicated chromatin를 배양 하 여 자석 구슬 (4 × 106 세포 칩 당), 추출 하 고 (하룻밤) 4 ° C에서 샘플을 회전.
- 마그네틱 구슬 워시. 다음 버퍼와 실 온에서 샘플을 품 어와 회전 각 버퍼와 10 분 동안 샘플: RIPA 버퍼의 1 mL로 두 번 (테 (10 mM 특성과-HCl, 1 mM EDTA) pH 8.0, 1% 트라이 톤 X-100, 0.1% 나트륨 deocycholate, 0.1 %SDS), RIPA 버퍼 c의 1 mL로 두 번 ontaining 0.3 M NaCl, 테의 1 mL를 한번 LiCl 버퍼 (0.5% 나트륨 deocycholate, 0.5 %NP40, 0.25 M LiCl)의 1 mL로 두 번 버퍼 0.2% 트라이 톤 X-100와 테의 1 mL에 한 번.
- 드-칩에 대 한 가교입니다. 다시 테의 100 µ L에 자석 구슬을 일시 중단 합니다. 10 %SDS 3 µ L 5 µ L의 성분 K (20 mg/mL)을 추가 합니다. 65 ° C (하룻밤)에서 샘플을 품 어.
참고: 그것은 parafilm 또는 증발을 방지 하기 위해 플라스틱 랩이이 단계 동안 튜브를 커버 하는 것이 중요입니다.- 다음 날, 반전 튜브를 섞어 여러 번. 다음, 자석 선반을 사용 하 여 신선한 튜브는 상쾌한 전송. 씻어 자석 구슬, 0.5 M NaCl를 포함 하는 테의 100 µ L을 추가 하 고 이후 두 supernatants 결합.
- CARIP에 대 한 데 가교입니다. 다시 테의 100 µ L에 자석 구슬을 일시 중단 합니다. 10 %SDS 3 µ L 5 µ L의 성분 K (20 mg/mL)을 추가 합니다. 4 ~ 12 헤 보육 시간 65 ° C에서 세포 유형, 쥡니다 및 고정 상태, 등등 사이 가변성 때문에 실험적으로 결정 될 필요가 대 한 65 ° C에서 샘플을 품 어.
- 반전 튜브 3-5 회 혼합, 자기 랙 튜브를 적용 하 고 이후에 신선한 튜브는 상쾌한 이동 하.
- 씻어 자석 구슬, 0.5 M NaCl를 포함 하는 테의 100 µ L을 추가 하 고 이후 두 supernatants 결합.
참고: 그것은 nuclease 무료 시 약을 사용 하는 것이 중요 (예., 테 버퍼, SDS, 등.) 드 가교 단계 동안 DNA 또는 RNA의 손실을 방지 하기 위해.
- 페 놀: 클로 프롬: isoamyl 알콜 (PCI) (25:24:1, v/v)의 200 µ L를 사용 하 여 DNA/RNA를 추출 합니다.
참고: RNA 또한 추출할 수 있습니다 제조업체의 지침을 사용 하 여 상업용 키트를 사용 하 여. 흔들어 30 s, 10 분 동안 실내 온도에 10000 x g에서 회전 하 고 상쾌한 신선한 튜브에 이동.- DNA/RNA 침전, GlycoBlue, 20 µ L 3 M 나트륨 아세테이트, 에탄올의 600 µ L의 2 µ L를 추가 합니다. 반전 ~ 5-8에 의해 혼합 시간, 또는 적어도 1-2 h-80 ° C에서 드라이 아이스에 샘플을 놓습니다.
- 냉장된 (4 ° C) 탁상 원심 분리기를 사용 하 여 30 분 10000 x g에서 샘플 원심 공기 건조에 대 한 펠 릿 < 1 분 하 고 다시 EB의 40 µ L에 버퍼 (10 mM Tris HCl) 일시 중단. 칩 Seq 라이브러리 준비를 위한 6 단계를 계속 합니다.
- Chromatin 관련 RNA IP DNase를 사용 하 여 샘플에서 DNA를 제거 합니다. CARIP 샘플에서는 1 배 농도를 10 x DNase 버퍼를 추가 합니다. RNA (50 µ L 반응)의 10 µ g까지 대 한 DNase의 1 µ L를 추가 합니다. PCI와 RNA 샘플 30 분 추출에 대 한 37 ° C에서 샘플을 품 어. Resuspend nuclease 무료 h에서2o.
5. 더블-좌초 된 cDNA 합성 CARIP-Seq에 대 한
- 첫번째 물가 cDNA의 합성입니다. 반전 녹음 방송 반응에 대 한 PCR 기계를 위한 관에서 다음 반응 설정: RNA와 1 µ L hexamer 뇌관 (3 µ g / µ L)의 무작위의 10.5 µ L.
- 이차 구조 변성을 5 분 동안 65 ° C에서 튜브를 품 어을 2 분 믹스에 대 한 얼음에 다음과 같은 구성 요소: 첫 번째 가닥 버퍼의 4 µ L, 0.1 M DTT의 2 µ L, 1 µ L dNTP의 그리고 0.5 RNase 밖으로. 다음, PCR 튜브에 마스터 믹스의 7.5 µ L를 추가 합니다. 25 ° c.에 2 분 동안 튜브를 품 어 위 첨자 2 1 µ L 추가 (200 U / µ L)와 다음과 같이 품 어: 10 분, 50 분, 15 분 및 4 ° c.에 보류에 대 한 70 ° C에 대 한 42 ° C 25 ° C
- 두 번째 물가 cDNA 합성입니다. 얼음에 튜브를 놓습니다. 다음 순서 대로 다음 구성 요소 추가: 91 µ L diethyl pyrocarbonate (DEPC)의 취급 물, 두번째 물가 반응 버퍼, dNTP 믹스 (10mm)의 3 µ L, 대장균 DNA 리가 (10 U / µ L), 대장균 DNA 중 합 효소 (10U / µ L)의 4 µ L의 1 µ L x 5의 30 µ L 고 1 µ L의 대장균 RNase H (2U / µ L). 부드럽게 vortexing에 의해 혼합 그리고 16 ° C 2 h에서 품 어.
참고: flicking 또는 튜브를 거꾸로 하 여 혼합 수 없습니다 철저 하 게 믹스 된 시 약을 충분 한. - 2 µ L T4 DNA 중 합 효소의 추가 하 고 5 분 Purify cDNA (더블-좌초, dscDNA) PCR 정화 키트를 사용 하 여 16 ° C에서 품 어. EB 버퍼의 40 µ L에서 dscDNA elute
- 더블-좌초 된 cDNA 조각화. 전단 cDNA (dscDNA) 물 목욕 sonifier 및 250-500 bp. dscDNA의 쥡니다의 크기에 1.5 mL 튜브를 사용 하 여 전체 RNA 사본의 시퀀싱을 촉진 하기 위하여 조각 크기를 줄이기 위해 매우 중요 하다.
- 물 목욕 sonifier의 표준 모델을 사용할 때 3 × 10 분, 또는 4 × 10 분에 대 한 샘플을 sonicate.
참고: 3 주기 총 RNA의 최대 1 µ g에 대 한 4 사이클 총 RNA의 1-5 µ g에 대 한 권장 하는 동안 사용 해야 합니다. 짧게 쥡니다 주기 각 후 튜브를 원심 고 신선한 얼음을 추가 하 여 찬물 목욕을 유지 합니다. - 피코 sonifier를 사용 하는 것이 좋습니다 총 RNA와 자전거 다음과의 1-5 µ g에 대 한 6 개의 사이클을 사용 하 여 (30 초, 90에서 s). 잠시 후 2-3 쥡니다 주기 튜브 원심. 쥡니다의 효율성 (2%)는 agarose 젤에 깎인된 dscDNA (3-4 µ L)의 일부만 로드 하 여 확인할 수 있습니다. 그것은 경험적으로 sonifiers 사이 가변성 때문 쥡니다 조건을 테스트 해야 합니다.
- 차세대 시퀀싱을 위한 6 단계에 설명 된 대로 라이브러리 준비를 수행 합니다.
6. 칩 Seq와 CARIP-Seq 도서관 건축
- DNA 최종 수리 키트를 사용 하 여 DNA의 끝을 복구 합니다. 이 키트는 무뚝뚝한 끝난 DNA를 생성 하는 데 사용 됩니다. 이 반응, 1.5 mL에 다음 설정에 대 한 낮은 바인딩 튜브: DNA, 2.5 m m dNPTs의 5 µ L, 10 mM ATP, 최종 수리 버퍼 (5mm DTT, 100 m m 마그네슘 아세테이트, 칼륨 아세테이트 660 mM x 10의 5 µ L의 5 µ L의 34 µ L 300 mM Tris-아세테이트, pH 7.8), 그리고 최종 복구 효소 믹스 (T4 polynucleotide 키 니 아 제, T4 DNA 중 합 효소)의 1 µ L.
- 실 온에서 45 분에 대 한 샘플을 품 어.
- 반응 정리 키트를 사용 하 여 DNA를 정화. 미리 데워 진된 (65 ° C) EB 버퍼의 32 µ L에서 최종 수리 DNA elute 우리가 일반적으로 DNA 칩, 또는 RNA 라이브러리 준비, 이전 CARIP, 다음 다음의 농도 quantitate 하지 않습니다 동안 칩 DNA 또는 CARIP RNA의 적어도 5-10 ng와 함께 시작 하는 것이 좋습니다.
- 3' "A" 오버행 최종 수리 dna의 추가. 1.5 ml 튜브 낮은 바인딩 구성 요소를 추가: 코 버퍼 2, 10 m m, H2O 11 µ L 및 U 5의 3 µ L에서 dATP의 1 µ L x 10의 5 µ L에서 DNA의 30 µ L / µ L Klenow 파편 (3'-5' 엑 소-) pipetting으로 부드럽게 섞는다.
- 37 ° c.에 30 분에 대 한 샘플을 품 어
- 반응 정리 키트를 사용 하 여 DNA를 정화. 미리 데워 진된 (65 ° C) EB 버퍼의 25 µ L에서 DNA을 elute.
- 어댑터 선 얼음에 다음 구성 요소 추가: 위에서 DNA의 23 µ L, 10 x T4 DNA 리가 버퍼, 단련 PE 또는 다중화 어댑터 (4 µ M), 1 µ L의 3 µ L 및 T4 DNA 리가 (400 U / µ L), 및 pipetting으로 부드럽게 혼합의 3 µ L.
참고: 어댑터 시퀀스 또한 상업적인 소스에서 얻을 수 있습니다.
Oligonucleotide 시퀀스:
PE 어댑터
5' P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAGGAATGCCGAG
5 ' ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
어댑터를 멀티플렉싱
5' P-GATCGGAAGAGCACACGTCT
5 ' ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT - 실 온에서 30 분에 대 한 샘플을 품 어.
- 프리 카스트 (2%) agarose 젤을 사용 하 여 DNA의 크기 선택을 수행 합니다. 10 분 동안 젤을 실행 합니다.
- 250-450 혈압에 해당 영역을 삭제하시오
참고: 200 이상 위에 젤을 절단 하 여 혈압, unligated 어댑터 이합체에서 오염의 감소 가능성이 있다. 그것은 PCR 단계에 앞서 어떤 unligated 어댑터를 제거 해야 합니다. - 젤 추출 키트를 사용 하 여 DNA를 정화. EB 버퍼의 20 µ L에 elute.
- 합자 dna PCR 및 라이브러리 정화 포함 (PE) 쌍-엔드 어댑터를 샘플링합니다. PCR 튜브에 구성 요소 추가: 위에서 DNA의 50%의 12 µ L, 물 12 µ L, 마스터 믹스 (Phusion HF)의 25 µ L, 1.0, PE PCR 뇌관의 1 µ L 및 PE PCR 뇌관 2.0의 1 µ L.
참고: Oligonucleotide 시퀀스 또한 상업적인 소스에서 얻을 수 있습니다.
Oligonucleotide 시퀀스:
PE PCR 뇌관 1.0
5 ' AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
PE PCR 뇌관 2.0
5 ' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT - PCR 및 라이브러리 인덱스 PE 어댑터를 포함 하는 합자 샘플에 대 한 정화. 구성 요소 추가: 위에서 DNA의 50%의 12 µ L, 물 12 µ L, PCR 뇌관 외 1.0 (희석된 1:2)의 1 µ L, 1 µ L PCR 뇌관 외 2.0의 (희석된 1:2), 및 1 µ L의 PCR 뇌관 인덱스 (희석된 1:2).
참고: oligonucleotide 시퀀스 또한 상업적인 소스에서 얻을 수 있습니다.
Oligonucleotide 시퀀스:
멀티플렉싱 PCR 뇌관 1.0
5 ' AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
PCR 뇌관 2.0 멀티플렉싱
5 ' GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
PCR 뇌관 인덱스 시퀀스 1-12
PCR 뇌관, 인덱스 1
5 ' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTC
PCR 뇌관, 인덱스 2
5 ' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTC
PCR 뇌관, 색인 3
5 ' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTC
PCR 뇌관, 인덱스 4
5 ' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTC
PCR 뇌관, 색인 5
5 ' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTC
PCR 뇌관, 색인 6
5 ' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTC
PCR 뇌관, 색인 7
5 ' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGATCTGGTGACTGGAGTTC
PCR 뇌관, 색인 8
5 ' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCAAGTGTGACTGGAGTTC
PCR 뇌관, 색인 9
5 ' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCGTGACTGGAGTTC
PCR 뇌관, 색인 10
5 ' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCTAGTGACTGGAGTTC
PCR 뇌관, 인덱스 11
5 ' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGCCGTGACTGGAGTTC
PCR 뇌관, 색인 12
5 ' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACAAGGTGACTGGAGTTC - PCR을 수행 다음 조건을 사용 하 여 자전거 (30 변성 98 ° C, 10의 18 주기에서 s s 98 ° C, 30에서 65 ° C, 30에서 s s 72 ° C, 72 ° C에서 5 분에서 4 ° C에서 개최).
참고: PCR 주기 수 실험적으로 결정 되어야 합니다. - PCR 제품의 크기 선택입니다. 프리 카스트 E-젤 전 (2%)에서 DNA를 실행 또는 만든 2% 젤 (agarose) 300-500 bp 지역 소비 세.
- 젤 추출 키트를 사용 하 여 젤에서 DNA를 정화. EB 버퍼의 20 µ L에서 최종 PCR 제품 elute
- 라이브러리의 농도 측정 하는 fluorometer를 사용 합니다. 차세대 시퀀싱을 수행 합니다.
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Representative Results
우리는 성공적으로 H3K4me3, H3K4me2, 및 KDM5B이 칩 Seq 프로토콜6을 사용 하 여 ES 세포에서의 게놈 넓은 바인딩 심문. ES 세포 급지대 무료 조건 (그림 1)에서 경작 그리고 십자가 위에서 설명한 대로. 쥡니다 했다 이후 칩 Seq 프로토콜의 3.2 단계에 설명 된 대로 수행 하 고 2 %agarose 젤 (그림 2)에서 DNA를 실행 하 여 평가. 다음, 칩 4 단계에 설명 된 대로 수행 하 고 라이브러리 준비는 6 단계에 설명 된 대로 수행한 합니다. 칩 Seq 라이브러리 다음-세대 시퀀싱 플랫폼에 시퀀싱 했다. 대표적인 사용자 지정 UCSC 브라우저 보기 HOXC 클러스터 (그림 3B)와 코어 pluripotency 유전자 POU5F1 (그림 3A)에 H3K4me3, H3K4me2, 및 KDM5B의 농축 공개. CARIP-Seq는 또한 4-6 단계에 설명 된 대로 프로토콜을 수행 하 여 수행 됩니다. 대표 UCSC 브라우저 보기 ES 세포 (그림 4)에서 loci에서 H4K20me3 관련 된 RNA (CARIP-Seq)와 H4K20me3 인 (칩 Seq)의 농축을 보여준다. CARIP-Seq 신호는 RNA, H4K20me3와 연결 되는 동안 반드시 나타내지 않습니다 그것은 표시 된 로커 스와 상호 작용 하는 방법을 보여 줍니다. CARIP-Seq 데이터 집합 칩 Seq 데이터 집합으로 유사한 방식으로 분석할 수 있습니다. 마우스 ES에서에서 생성 된 데이터 셀 CARIP-Seq와 칩 Seq 실험 모두 맞출 수 있습니다 참조 게놈 (예., mm9, mm10) bowtie221을 사용 하 여. 칩 Seq와 CARIP-Seq 농축 지역 모두 식별할 수 있습니다 "공간 클러스터링에 대 한 식별의 ChIP-Enriched 지역" (SICER)22 또는 맥23,24피크 호출 프로그램을 사용 하 여. CARIP-Seq 데이터 집합 가능성이 광범위 한 봉우리를 포함 하기 때문에 광범위 하 고 날카로운 봉우리를 식별할 수 있는 알고리즘을 사용 하 여 중요 하다. 이 원고에 설명 된 프로토콜 칩 Seq 시퀀스 (Seq) CARIP을 수행 하기 위한 최적화 되었습니다 동안 ES 세포를 사용 하 여 이러한 프로토콜 또한 적합 해야한다 단백질 DNA와 다른 세포 유형에 RNA 상호 작용 chromatin 관련 평가.
그림 1: ES 세포의 급지대 무료 문화. (A) 실험적인 디자인입니다. (B) ES 세포 ES에 iMEFs에 교양 LIF, 포함 된 미디어를 셀 또는 ES 급지대 무료 조건에서 세포 LIF 및 (C) GSK3i 또는 (D) GSK3i め (2i)을 포함 하는 미디어. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 가교 된 ES 세포 chromatin의 쥡니다. 가교 된 ES 세포는 sonifier를 사용 하 여 18 주기를 한 microtip와 sonicated 했다 (40% 진폭, 30 초, 그리고 30 s 나머지). 가교 반전 했다, 그리고 RNase 소화 이후 RNA를 제거 하기 위해 수행 되었다. DNA는 agarose 젤 (2%)에서 실행 하 고 PCI를 사용 하 여 순화 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: ES 세포에서 효소 및 히스톤 수정 수정 히스톤의 대표 칩 Seq 분석. Pluripotency-레 귤 레이 터에서 H3K4me3, H3K4me2, 및 KDM5B의 사용자 지정 UCSC 브라우저 보기 POU5F1 (A)와 (B) HOXC ES 세포 (정규화 태그 밀도 (RPBM), 읽기 자료 읽기 백만 당 당)에 클러스터. KDM5B 바인딩 및 H3K4me3/2 인 간의 중복 note 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: RNA의 대표 CARIP-Seq 분석 및 관련 된는 히스톤 수정 ES 세포에 칩 Seq. ES 세포 (정규화 태그 밀도 (RPBM), 읽기 자료 읽기 백만 당 당)에서 H4K20me3 CARIP-Seq 및 H4K20me3 칩 Seq 신호 UCSC 브라우저 전망. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
칩 Seq 글로벌 단백질 DNA 상호 작용의 위치를 평가 하는 유용한 방법입니다 (예., 녹음 방송 요인/히스톤 수정 효소/히스톤 수정 DNA) ES 세포, 새로 개발된 된 CARIP-Seq 프로토콜에 유용 하는 동안에 질의 게놈 넓은 협회 RNAs의 chromatin 성분. 칩 Seq는 ES 세포의 epigenetic 풍경과 다른 세포 유형 평가 하는 데 사용 되는 기본 도구입니다. 칩 Seq 및 CARIP-Seq 라이브러리의 품질이 크게 칩 급 항 체에 의존 합니다. 칩 Seq에 대 한 항 체의 적합성 빈된 지역에 상대적으로 긍정적인 통제 지역에서 5 농축에 ≥ 3 고품질 칩 Seq 데이터25를 생성 하기에 충분 해야 칩 PCR을 수행 하 여 경험적으로 확인할 수 있습니다. 마찬가지로, 항 체 테스트할 수 있습니다 그들의 적합성에 대 한 CARIP-Seq에 대 한 비슷한 방식으로 사소한 수정 칩 Seq에 설명 된 대로. 위의 방법 섹션에 설명 된 대로 CARIP 프로토콜에서 RNA IP 단계에 따라, 리버스 전사 PCR cDNA, Q-RT-PCR을 수행 하는 서식 파일로 사용 될 수 있는 생성을 수행 되어야 합니다. 칩 또는 여러 게놈 지역에 CARIP 다음 농축을 평가 하는 것이 좋습니다. 칩 또는 CARIP에 대 한 항 체의 품질을 평가할 때 테스트 추가 고려 사항이 있습니다. 예를 들어 칩과 CARIP에 사용 되는 버퍼의 엄중 NaCl의 농도 변경 하 여 최적화할 수 있습니다: 높은 NaCl 농도와 항 체에 대 한 도움이 될 수 있습니다 낮은 NaCl 농도 매우 특정 항 체에 적합 일반적인 바인딩입니다. 차세대 시퀀싱의 라이브러리 준비에 관한 사용자 지정 뇌관 및 인덱스 사용할 수 있습니다 또한 상업적으로 취득된 oligonucleotides 대신. 그러나, 그것은 3' 끝에 두 기지 사이 phosphorothioate 수정 등 표시 되었습니다 nuclease 소화26을 방지 하기 위해 주의 하는 것이 중요. 제 3-파티 RNA-Seq 또는 칩 Seq 라이브러리 건설 키트 CARIP의 시퀀싱에 대 한 라이브러리를 생성 하 고 각각 샘플, 칩을 사용할 수 있습니다. 그러나, 그것은 경험적으로 차세대 시퀀싱에 대 한 생성 품질 라이브러리에서 그들의 효능을 평가 하는 키트를 테스트 하는 것이 중요입니다. 추가 프로토콜 ChIPmentation27같은 칩 Seq 라이브러리 준비를 수행 하기 위해 또한 채택 될지도 모른다. 그러나, 여기에 설명 된 칩 Seq 프로토콜에 ChIPmentation의 적응 추가 수정 및 추가 최적화 필요 합니다.
여기, 우리는 셀 (IP 당 4 × 106 세포)의 적당 한 수를 사용 하 여 최적화 된 칩 및 CARIP 프로토콜을 설명 합니다. 칩 프로토콜 중간에 낮은 셀 번호를 사용 하 여 수행할 수 있지만 (10 106 셀에5 ), 우리가 하지 CARIP-Seq 2 × 106 셀을 사용 하 여 수행 했습니다. 그러나, 경험적으로 다양 한 고정 및 쥡니다 조건 테스트,이 프로토콜 세포의 작은 수를 사용 하 여 성공적으로 작동 수 있습니다 가능 하다.
요약 하자면, 칩 Seq와 CARIP-Seq는 ES 세포에 각각 chromatin 관련 단백질 및 RNAs의 글로벌 지도 생성 하는 데 유용 합니다. 이러한 프로토콜 ES 세포에 최적화 되어, 하는 동안 그들은 chromatin 지도 다양 한 포유류 세포 및 조직 종류를 사용 하 여 생성을 최적화할 수 있습니다. 이러한 프로토콜 또한 단일 셀 칩 Seq 또는 CARIP-Seq 라이브러리 생성 하 최적화 될 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 충돌의 관심을 선언합니다.
Acknowledgments
이 작품 웨인 주립 대학, Karmanos 암 연구소, 국가 심 혼, 폐 및 혈액 학회 (1K22HL126842-01A1) B.L.K.에 게 수 여에서 교부 금에 의해 지원 되었다 웨인 주립 대학 높은 성능 컴퓨팅 그리드 계산 리소스를 활용 하는이 작품 (< https://www.grid.wayne.edu/>). CARIP-Seq 데이터 분석 지원에 감사 연합 Kurup 하 고.
저자의 기여:
B.L.K.는 CARIP-Seq 방법의 임신, 시퀀싱 데이터 분석 그리고 원고 초안, 설계 및 칩 Seq와 CARIP-Seq 실험을 실시. 모든 저자는 읽고 있고이 원고의 최종 버전을 승인.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse leukemia inhibitory factor (ESGRO LIF) | EMD Millipore | 106 or 107 units | |
| GSK3β inhibitor CHIR99021 (GSK3i) | Stemgent | Solvent: DMSO 10mM | |
| MEK inhibitor PD0325901 (MEKi) | Stemgent | Solvent: DMSO 10mM | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose | Invitrogen | 11965092 | |
| PBS (phosphate buffered saline) | Invitrogen | 10010031 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| 2-Mercaptoethanol (50 mM) | Gibco | 31350010 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140076 | |
| EmbryoMax ES Cell Qualified Fetal Bovine Serum, 500 ml | EMD Millipore | ES-009-B | |
| EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | EMD Millipore | ES-006-B | |
| Glycine | Sigma | G7126-500G | 1.25 M stock conentration in water |
| Formaldehyde solution | Sigma | F8775-500ML | |
| TE (Tris EDTA) pH 8.0 1X | Quality Biological | 351-011-131 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) solution | Sigma | 93482-250ML-F | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697498001 | |
| Sodium dodecyl sulfate solution (20%) | Quality Biological | A611-0837-10 | |
| Q125 sonifier | Qsonica | 4422 | |
| Triton X-100 solution | Sigma | 93443-100ML | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation | Invitrogen | 10004D | |
| Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation | Invitrogen | 10002D | |
| Dynabeads Protein A/Protein G and Magnet Starter Pack | Invitrogen | 10015D | |
| Lithium chloride | Sigma | L4408 | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma | I8896 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Dynabeads mRNA Purification Kit (for mRNA purification from total RNA preps) | Invitrogen | 61006 | |
| SuperScript Double-Stranded cDNA Synthesis Kit | Invitrogen | 11917010 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| End-It DNA End-Repair Kit | Lucigen | ER81050 | |
| Klenow Fragment (3'→5' exo-) | NEB | M0212L | |
| dATP (10 mM) | Invitrogen | 18252015 | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202L | |
| TrackIt 1 Kb Plus DNA Ladder | Invitrogen | 10488085 | |
| E-gel EX agarose gels, 2% | Invitrogen | G402002 | |
| Phusion high-fidelity 2X master mix with HF buffer | Thermo Fisher | F531LPM | |
| ChIPAb+ Trimethyl-Histone H3 (Lys4) - ChIP Validated Antibody | EMD Millipore | 17-614 | |
| Anti-Histone H3 (di methyl K4) antibody [Y47] - ChIP Grade (ab32356) | Abcam | ab32356 | |
| Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-well) | Fisher | 720083 | |
| Falcon Standard Tissue Culture Dishes (10cm) | Fisher | 08772E | |
| Bioruptor pico | Diagenode | B01010001 | |
| Qubit Flurometer 2.0 | Thermo Fisher | ||
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32851 | |
| MinElute Reaction Cleanup Kit | Qiagen | 28204 | |
| MinElute Gel Extraction Kit | Qiagen | 28604 | |
| Anti-Histone H4 (tri methyl K20) antibody - ChIP Grade (ab9053) | Abcam | ab9053 | |
| Labquake rotator | Thermo Fisher | 400110Q | |
| Illumina HiSeq platform | Illumina | ||
| TURBO DNase | Invitrogen | AM2238 |
References
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