Summary
Hier beschreiben wir Methoden zum Ausführen von ChIP-Seq und CARIP-FF, einschließlich der Bibliothek Vorbereitung auf Next Generation Sequencing, global epigenomischen und Chromatin-assoziierter RNA zu generieren-Karten von ES-Zellen.
Abstract
Embryonale Stammzellen (ES) Zelle Selbsterneuerung und Differenzierung unterliegt extrinsische Signale und intrinsische Netzwerke von Transkriptionsfaktoren, epigenetische Regulatoren und Post-Übersetzung Modifikationen der Histone, die das Gen kombinatorisch beeinflussen Ausdruck Zustand des nahe gelegenen Gene. RNA hat sich auch gezeigt, zur Interaktion mit verschiedenen Proteinen, Chromatin Dynamik und Genexpression regulieren. Chromatin-assoziierter RNA Immunopräzipitation (CARIP) gefolgt von Next Generation Sequencing (CARIP-Seq) ist eine neuartige Methode zur RNA zugeordnete Chromatin Proteine, während Chromatin Immunopräzipitation gefolgt von Next Generation Sequencing (Umfrage ChIP-Seq) ist eine leistungsstarke Genomik-Technik, um den Lageplan des Post-translationale Modifikation der Histone, Transkriptionsfaktoren und epigenetische Modifikatoren auf einer globalen Skala in ES-Zellen. Hier beschreiben wir Methoden zum Ausführen von CARIP-Seq und ChIP-Seq, einschließlich Bibliotheksbau für Next-Generation Sequenzierung, um globale Chromatin-assoziierter RNA und epigenomischen Karten in Embryonaler Stammzellen zu erzeugen.
Introduction
Kommunikation zwischen extrazelluläre Signale und eine Reihe von transkriptionelle-Aufsichtsbehörden, einschließlich der Histon-Modifikatoren und Post-Übersetzung Änderung der Histone Tails sind embryonale Stammzellen (ES) Zelle Schicksal Entscheidungen geregelt. Diese Interaktionen Erleichterung Chromatin Zugänglichkeit und Verpacken von Chromatin in einen von zwei Zuständen: Euchromatin, das offen und transcriptionally aktiv ist, und Heterochromatin, das kompakt und in der Regel transcriptionally inaktiv ist. Transkriptionsfaktoren mit DNA-Sequenz-spezifische verbindliche Affinitäten und epigenetische Modifikatoren Associate bei euchromatisch Regionen zur Teilnahme bei der Kontrolle der Genexpression. Next Generation Sequencing-Methoden, einschließlich der ChIP-Seq1, haben bei der Kartierung genomweite transcriptional Netze, die grundlegend für ES Zelle Selbsterneuerung und Pluripotenz2,3,4 sind maßgeblich ,5,6. Darüber hinaus während der RNA Immunopreciation gefolgt von der nächsten Generation Sequenzierung (RIP-Seq)7 Bewertungen von RNA-Protein-Wechselwirkungen legen nahe, dass DNA-bindende Proteine RNAs interagieren regulieren transkriptionelle Ereignisse7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12, haben nur wenige Studien untersucht die genomweite Lokalisierung von RNAs Chromatin12oder globale Wechselwirkungen zwischen RNA und Histon Änderungen zugeordnet. Lange nicht-kodierende RNAs (LncRNAs) sind eine Klasse von RNAs, die gefunden wurden, um die Tätigkeit von Chromatin-assoziierte Proteine13,14,15Regeln. Xist ist beispielsweise eine LncRNA, die im weiblichen Säugerzellen, Inaktivierung eines x-Chromosoms durch die Rekrutierung von epigenetischen Repressoren16,17regelt. Das gesamte Spektrum der RNAs zugeordnete Chromatin ist jedoch weitgehend unbekannt. Hier beschreiben wir eine neuartige Protokoll, Chromatin-assoziierter RNA Immunopräzipitation (CARIP) gefolgt von Next Generation Sequencing (CARIP-Seq), Chromatin-assoziierten RNAs auf einer genomweiten Basis in ES-Zellen, einschließlich Bibliothek Vorbereitung zu identifizieren für Next Generation Sequencing und ChIP-Seq globale Belegung von Histon-Modifikationen, Transkriptionsfaktoren und epigenetische Modifikatoren zuordnen. Im Gegensatz zu anderen RIP-Seq Methoden7enthält CARIP-Seq Vernetzung und Beschallung Schritte, die für die direkte Identifizierung von RNAs Chromatin zugeordnet zu ermöglichen. Gemeinsam ChIP-Seq ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur genomweiten Protein-DNA-Wechselwirkungen zu identifizieren, während CARIP-Seq ist eine leistungsfähige Methode zur Übersicht RNAs mit Chromatin Komponenten verbunden.
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Protocol
(1) Kultur der Maus ES Zellen im Feeder-freien Bedingungen.
Hinweis: Maus-ES-Zellen sind konventionell in Medien auf eine Zelle Kulturschale mit Gelatine und eine Mono-Schicht der Maus embryonalen Fibroblasten (MEF), die mitotically inaktiviert wurden beschichtet (iMEFs) kultiviert. Jedoch sollten MEFs vor dem nachgeschalteten epigenetische oder Ausdruck Analysen der Verunreinigung des MEF-assoziierten Chromatin und RNA entfernt werden.
- Vorbereitung eines Feeder-Layers: Gelatine Mantel ein 6-Well Zellplatte Kultur durch Zugabe von 2 mL 0,1 % Gelatine in Wasser, und die Platte bei 37 ° C für 20-30 min inkubieren.
- Bereiten Sie 10 % DMEM High-Glukose Medien mit 2 mM L-Glutamin, 10 % fetalen bovine Serum (FBS) und 1 X Penicillin/Streptomycin vor.
- MEFs von E13.5 bis E14.5 Mäuse18,19 zu isolieren oder von einem kommerziellen Anbieter zu erwerben. Mitotically inaktivieren MEFs durch die Behandlung mit Mitomycin C oder Gammabestrahlung mit Standardprotokollen19. Alternativ können mitotically inaktiviert MEFs (iMEFs) von einem kommerziellen Anbieter erworben werden.
- Kultivierung MEFs. MEF-Medien bei 37 ° C vorwärmen, Auftauen von eingefrorenen Phiole mit iMEFs und Kultur in 10 % FBS MEF Medien bei 37 ° C mit 5 % CO2. Platte MEFs ~ 200.000 Zellen pro Bohrloch von einer 6-Well Kulturschale.
- Kultivierung Embryonaler Stammzellen auf eine Schicht von Feeder-Zellen (iMEFs).
- 12-24 h nach iMEFs, Plattieren Vorwärmen eine 50 mL Tube ES-Zelle-Media (DMEM High-Glukose, LIF (10 ng/mL), 15 % ES Zelle qualifiziert FBS, 1 × Zellkultur qualifiziert 2-Mercaptoethanol, 1 × Glutamin, unwesentlichen Aminosäuren (NEAA), 1 × Penicillin/Streptomycin), bei 37 ° C Mit 5 % CO2.
- Aspirieren Sie die Medien aus den Zellplatten Kultur mit iMEFs, wieder auszusetzen, die ES-Zellen in 2 mL Medien (nach dem Auftauen bei 37 ° C) und die Zellen auf der Ebene der iMEFs Platte. Wenn Sie der Kulturschale in den Inkubator zu platzieren, ist es wichtig, verschieben Sie die Schüssel in ein "t" Form, die Zellen gleichmäßig zu verteilen und Aggregation in Richtung der Mitte der Schale zu verhindern.
- Die ES-Zellen auf Feeder-freie Gelatine beschichtet Gerichte die Passage. Durchgang der ES-Zellen, bevor sie konfluierende werden. ES Zelle Kolonien pflegen Selbsterneuerung am besten, wenn die Kolonien gleichmäßig verteilte und nicht konfluierende sind. Die Anwesenheit von vielen ES Zelle Kolonien, die sich berühren zeigt, dass die Zelldichte zu hoch ist.
- Bestreichen Sie eine 6-Well Kulturschale mit Gelatine wie oben beschrieben. Inkubieren Sie 0,25 % Trypsin-EDTA bei 37 ° C für ca. 10-15 min zum Pre-warme Trypsin.
- Als nächstes Durchgang Embryonaler Stammzellen durch erste Waschen mit 1 x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und Hinzufügen von 1 mL Trypsin-EDTA-Lösung von 0,25 %. Warten Sie 1 – 2 min. für die Kolonien zu lösen. Trennen der Kolonien zu einer einzelligen Suspension durch Pipettieren mit 1 mL Spitze für ~ 5 Mal.
- Verwenden Sie ein Mikroskop um einzelne Zelle Dissoziation von ES-Zellen zu bestätigen. Um die Reaktion zu stillen, oder die Trypsin zu "neutralisieren", fügen Sie 10 % FBS MEF Medien hinzu. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 X g bei Raumtemperatur für 3-5 min und Aspirieren Sie die Medien.
- Wieder aussetzen der zellulären Pellets in 2 mL Medien (ES-Zellen) ergänzt mit Glykogen-Synthase Kinase 3 (GSK3) Inhibitor (CHIR99021; GSK3i), oder 2i (MEKi/GSK3i) Bedingungen (2-3 µM GSK3i: CHIR99021, 1 µM MEKi: PD0325901).
- Aspirieren Sie die Gelatine aus der Zelle Kulturschale fügen Sie 2 mL Medium mit WSR in die Schale hinzu und legen Sie die Schale in den Inkubator 37 ° C (Abbildung 1A-D). Duale Hemmung der GSK3i und MEKi fördert Grundzustand naiv Pluripotenz von ES-Zellen in der Abwesenheit von Feeder-Zellen (iMEFs) und ohne Serum20. ES-Zellen sollte passagiert zwei-bis dreimal, MEFs vor der Vernetzung zu entfernen.
2. Vernetzung von ES-Zellen für ChIP und CARIP
- Ernten Sie die ES-Zellen durch Waschen mit PBS, dann fügen Sie 0,25 % Trypsin bei 37 ° c vorgewärmt Inkubieren Sie die Zellen für einige Minuten bei Raumtemperatur. Vermeiden Sie über Trypsinization von ES-Zellen, die zum Zelltod führen wird. Verwenden Sie ein Mikroskop, um einzelne Zelle Dissoziation zu bewerten.
- Stillen Sie Trypsin-Verdauung zu, wie oben beschrieben für passagierung ES-Zellen, und Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 X g bei Raumtemperatur für 3-5 min.
- Wieder aussetzen der Zellen in den vorgewärmten (37 ° C) MEF Medien (10 % FBS/DMEM) bei 2 × 106 Zellen/mL.
- Zu Crosslink Zellen, eine Endkonzentration von 1 % 37 % Formaldehyd-Lösung hinzu, und die Zellen in einem konischen Rohr (15 mL oder 50 mL) bei 37 ° C inkubieren Sie für 8 min. invertieren das Rohr mehrmals den Zeitraum 8 min bis homogene Fixierung zu erreichen.
Hinweis: Die Fixierzeit kann empirisch für CARIP optimiert werden. Wenn die Fixierzeit geändert wird, sollte die Anzahl der Beschallung Zyklen auch angepasst werden. Auch steigt die Temperatur von 37 ° C vernetzungseffizienz im Vergleich zur Vernetzung bei Raumtemperatur. Die Temperatur der Fixierung kann empirisch optimiert werden. - Die Fixierung Reaktion zu stoppen hinzufügen 1,25 M Glycin (bereits bei 4 ° C gekühlt) zu einer Konzentration von 0,125 M. invertieren das Rohr 8 u/min mit einem Rotator für 5 min bei Raumtemperatur. Zentrifugieren der Probe bei 300 X g für 5 min bei Raumtemperatur und Aspirieren Sie die Medien.
- Waschen Sie die Zelle Pellet mit vorgekühlt PBS (4 ° C), Zentrifugieren der Probe bei 300 X g für 5 min bei Raumtemperatur und Aspirieren PBS. Waschen Sie die Zellen mit PBS wieder. Nächste, aliquoten 15 × 106 Zellen pro 15 mL-Tube.
- Einfrieren der Zelle Pellet indem man sie in flüssigem Stickstoff für 1 min auf Trockeneis für 5 min, oder legen Sie sofort bei-80 ° C.
Hinweis: Feste ES Zelle Pellets können für bis zu 6 Monaten ohne verminderte Qualität im nachgeschalteten Experimente gelagert werden.
(3) Chromatin Beschallung für ChIP und CARIP
- Tauen Sie feste ES Zelle Pellet auf Eis. Wieder aussetzen der Zelle Pellet in Beschallung Puffer (2,5 mL). Für Transkriptionsfaktoren oder epigenetische Regulatoren (Protein-Faktoren), erneut unterbrechen Sie das Pellet in 1 X TE, 1 mM PMSF, 1 x cocktail-Proteinase Inhibitor. Für Histon Änderungen wieder auszusetzen Sie das Pellet in 1 X TE, 0,1 % SDS, 1 mM PMSF, 1 X Proteinase Inhibitor.
Hinweis: Während die Zugabe von SDS Beschallung Effizienz erhöht, kann es nicht vorteilhaft für die Bewertung bestimmter Chromatin Bestandteile oder Transkriptionsfaktoren sein. - Für Chromatin Immunopräzipitation (ChIP), beschallen Chromatin mit 14-18 Zyklen (30 s auf 30 s Rest) bei 40 % Amplitude. Chromatin-assoziierter RNA Immunopräzipitation (CARIP) die Zahl der Beschallung (8 – 10 Zyklen). Durch Mobilfunk, Fixierung und Sonifier Variabilität sollten Bedingungen für Beschallung empirisch ermittelt werden.
- Ergänzung der Beschallung Puffer mit 28 µL 10 % SDS für Protein-Faktoren, 28 µL Natrium-Deoxycholate und 0,28 mL 10 % Triton-X100 und gut mischen.
Hinweis: Neben dieser Komponenten auf den Puffer, Beschallung generiert RIPA Puffer. - Zentrifugieren Sie die Probe bei 10.000 x g für 10 min bei 4 ° C, das Chromatin vorab zu löschen. Den überstand in ein frisches Tubus verschieben und mit Chromatin Immunopräzipitation fortfahren.
- Alternativ kann beschallten Chromatin bei-80 ° C bis zum Gebrauch gespeichert werden. Jedoch kann die Speicherung von beschallten Chromatin bei-80 ° C zu verminderter Qualität für Protein-Faktor ChIP führen.
(4) ChIP und CARIP Prozess
- Eine 1,5 mL, niedrige Bindung Rohr 40 µL Protein A oder G magnetische Beads hinzufügen. Fügen Sie 600 µL PBS, die Perlen zu waschen. Legen Sie das Rohr auf ein Rack mit einem Magneten, inkubieren Sie das Rohr für 1 min bei Raumtemperatur, entfernen Sie PBS zu und erneut aussetzen Sie der magnetischen Beads in 100 µL PBS.
- Das Rohr mit magnetischen Beads 2-4 µg des Antikörpers hinzufügen. Inkubieren Sie und drehen Sie das Rohr bei Raumtemperatur für 40 min mit 8 u/min mit einem Rotator die Antikörperbindung an der magnetischen Beads zu erleichtern. Legen Sie das Rohr auf die magnetische Rack, 1 min bei Raumtemperatur inkubieren, dann PBS zu entfernen.
- Fügen Sie 200 µL PBS, die magnetische Beads zu waschen. Waschen mit PBS wird durchgeführt, um kostenlose IgGs zu entfernen. Inkubieren Sie und drehen Sie das Rohr bei Raumtemperatur für 5 min zwischen den einzelnen Schritten zu waschen. Das Rohr an den Magneten befestigen und Entfernen der PBS.
- Immunoprecipitate Chromatin-gebundenen Proteine durch Inkubation der beschallten Chromatins (4 × 106 Zellen pro ChIP), mit magnetischen Beads zu extrahieren und drehen Sie die Probe bei 4 ° C (über Nacht).
- Waschen Sie die magnetischen Kügelchen. Inkubation die Probe bei Raumtemperatur mit den folgenden Puffern und drehen Sie die Probe für 10 min bei jeder Puffer: zweimal mit 1 mL RIPA Puffer (TE (10 mM Tric-HCl, 1 mM EDTA) pH 8.0, 1 % Triton x-100, 0,1 % Natrium Deocycholate, 0,1 % SDS), zweimal mit 1 mL RIPA Puffer c Ontaining 0,3 M NaCl, zweimal mit 1 mL LICI Puffer (0,5 % Natrium Deocycholate, 0,5 % NP40, 0,25 M LICI), einmal mit 1 mL TE-Puffer mit 0,2 % Triton x-100 und einmal mit 1 mL TE.
- De-Vernetzung für ChIP. Wieder aussetzen der magnetischen Beads in 100 µL TE. Fügen Sie 3 µL 10 % SDS und 5 µL Proteinase K (20 mg/mL). Inkubation der Probe bei 65 ° C (über Nacht).
Hinweis: Es ist wichtig zur Deckung der Rohre während dieses Schrittes mit Parafilm oder Plastikfolie um Verdunstung zu verhindern.- Invertieren Sie am folgenden Tag, die Röhre mehrmals um zu mischen. Verwenden Sie anschließend das Magnet-Rack den überstand auf eine frische Rohr übertragen. Waschen Sie die magnetische Beads, 100 µL TE mit 0,5 M NaCl hinzufügen und kombinieren Sie anschließend die beiden Überstände.
- De-Vernetzung für CARIP. Wieder aussetzen der magnetischen Beads in 100 µL TE. Fügen Sie 3 µL 10 % SDS und 5 µL Proteinase K (20 mg/mL). Inkubieren Sie die Probe bei 65 ° C für 4 bis 12 h Inkubation bei 65 ° C muss aufgrund der Variabilität zwischen Zelltypen, Beschallung und Fixierung usw. empirisch ermittelt werden.
- Invertieren die Röhre 3-5mal zu mischen, das Rohr auf die magnetische Rack anwenden und anschließend verschieben den überstand in ein frisches Tubus.
- Waschen Sie die magnetische Beads, 100 µL TE mit 0,5 M NaCl hinzufügen und kombinieren Sie anschließend die beiden Überstände.
Hinweis: Es ist wichtig, Nuklease-freie Reagenzien zu verwenden (zB., TE-Puffer, SDS, etc..) den Verlust von DNA oder RNA während der de-Vernetzung Schritt zu verhindern.
- DNA/RNA mit 200 µL Phenol: Chloroform: Isoamyl Alkohol (PCI) (25:24:1, V/V) zu extrahieren.
Hinweis: RNA kann auch mit kommerziellen Kits mit den Anweisungen des Herstellers extrahiert werden. Schütteln für 30 s, drehen sich mit 10.000 x g bei Raumtemperatur für 10 min und überstand in ein frisches Tubus verschieben.- Um DNA/RNA Niederschlag, fügen Sie 2 µL des GlycoBlue, 20 µL 3 M Natriumacetat und 600 µL Ethanol. Mix von invertierenden ~ 5-8 Mal, und legen Sie die Probe auf Trockeneis oder bei-80 ° C für mindestens 1-2 Stunden.
- Zentrifugieren Sie die Probe bei 10.000 x g für 30 min mit einer Tischplatte Zentrifuge gekühlt (4 ° C). Luft trocknen das Pellet für < 1 min und wieder auszusetzen es in 40 µL EB-Puffer (10 mM Tris-HCl). Fahren Sie für ChIP-Seq-Bibliothek-Vorbereitung mit Schritt 6.
- Entfernen Sie DNA aus Chromatin-assoziierten IP RNA-Proben mit DNase. 1 X-Konzentration in der Probe CARIP 10 X DNase Puffer hinzufügen. Fügen Sie 1 µL DNase für bis zu 10 µg RNA (50 µL Reaktion). Inkubieren Sie der Probe bei 37 ° C für 30 min. Extrakt der RNS-Probe mit PCI. Aufschwemmen Nuklease-freie h2O.
5. Double-Stranded cDNA Synthese für CARIP-Seq
- Der erste Strang cDNA Synthese. Für die Reverse Transkription Reaktion, richten Sie die folgende Reaktion in einem Rohr für eine PCR-Maschine entwickelt: 10,5 µL RNA und 1 µL random Hexamer Zündkapseln (3 µg/µL).
- Inkubieren Sie das Rohr bei 65 ° C für 5 min auf die Sekundärstruktur zu denaturieren und speichern Sie es auf dem Eis für 2 min. Mix die folgenden Komponenten: 4 µL der erste Strang Puffer, 2 µL 0.1 M DVB-t und 1 µL dNTP 0,5 RNase heraus. Fügen Sie in das PCR-Röhrchen, 7,5 µL des master-Mix. Inkubieren Sie das Rohr für 2 min bei 25 ° c Fügen Sie 1 µL hochgestellt II (200 U/µL) und inkubieren Sie wie folgt: 25 ° C für 10 min, 50 min, 70 ° C für 15 min und Halt bei 4 ° c 42 ° C
- Zweiten Strang cDNA Synthese. Platzieren Sie das Rohr auf dem Eis. Fügen Sie die folgenden Komponenten in der Reihenfolge: 91 µL Diethyl-Pyrocarbonate (DEPC) behandelt Wasser, 30 µL 5 x zweite Strangreaktion Puffer, 3 µL dNTP-Mix (10 mM), 1 µL E. Coli DNA-Ligase (10 U/µL) 4 µL E. Coli DNA-Polymerase (10U/µL) , und 1 µL E. Coli RNase H (2U/µL). Mischen Sie, indem Sie sanft aufschütteln und inkubieren Sie bei 16 ° C für 2 h.
Hinweis: Durch streichen oder Umkehrung der Röhre mischen kann nicht gründlich mischen der Reagenzien ausreichen. - Fügen Sie 2 µL des T4-DNA-Polymerase und inkubieren Sie bei 16 ° C für 5 min. Purify cDNA (doppelsträngige, DscDNA) mittels PCR Reinigung Kit. Eluieren Sie die DscDNA in 40 µL EB Puffer.
- Doppelsträngige cDNA Fragment. Scher cDNA (DscDNA) mit einer Wasser-Bad-Sonifier und ein 1,5 mL-Tube auf eine Größe von 250-500 BP. Beschallung des DscDNA ist entscheidend für Fragment Größen zur Sequenzierung des gesamten RNA-Transkript Erleichterung zu reduzieren.
- Bei der Verwendung eines Standardmodells ein Wasserbad Sonifier Beschallen Sie im Beispiel 3 × 10 min, oder 4 × 10 min.
Hinweis: Drei Zyklen sollte verwendet werden für bis zu 1 µg Gesamt-RNS, während vier Zyklen für 1-5 µg von Gesamt-RNS empfohlen werden. Zentrifugieren Sie das Rohr kurz nach jedem Zyklus Beschallung und pflegen Sie einen kühlen Wasserbad durch Zugabe von frischem Eis. - Bei der Verwendung von einem Pico-Sonifier es wird empfohlen, für 1-5 µg Gesamt-RNS und Radsport folgende sechs Zyklen verwenden (30 s, 90 s aus). Zentrifugieren Sie das Rohr kurz nach 2-3 Beschallung Zyklen. Die Effizienz der Beschallung kann bestimmt werden, indem Sie laden einen Bruchteil der geschoren DscDNA (3-4 µL) auf einem Agarosegel (2 %). Es ist wichtig, Beschallung Bedingungen aufgrund der Variabilität zwischen Sonifiers empirisch zu testen.
- Führen Sie Bibliothek Vorbereitung, wie in Schritt 6 für Next Generation Sequencing beschrieben.
6. ChIP-Seq und CARIP-Seq Bibliotheksbau
- Reparieren Sie die Enden der DNA mit Hilfe einer DNA-Ende-Reparatur-Set. Dieses Kit wird verwendet, um stumpf endete DNA zu generieren. Für diese Reaktion, richten Sie Folgendes in eine 1,5 mL, niedrige verbindliche Rohr: 34 µL DNA, 5 µL 2,5 mM dNPTs, 5 µL 10 mM ATP, 5 µL 10-fach Puffer Ende-Reparatur (5 mM DVB-t, 100 mM Magnesium-Acetat, 660 mM Kalium Acetat 300 mM Tris-Acetat, pH 7,8), und 1 µL der Ende-Reparatur-Enzym-Mix (T4-Polynukleotid-Kinase, T4-DNA-Polymerase).
- Inkubieren Sie die Probe für 45 Minuten bei Raumtemperatur.
- Reinigen Sie DNA mit einem Reaktion Cleanup-Kit. Eluieren Sie Ende repariert DNA in 32 µL vorgewärmten (65 ° C) EB Puffer. Während wir nicht in der Regel die Konzentration von DNA nach ChIP oder RNA nach CARIP, vor der Bibliothek Vorbereitung quantitate empfiehlt es sich, mit mindestens 5-10 ng von ChIP DNA oder RNA CARIP beginnen.
- Zusatz von einem 3' "A" Überhang an Ende repariert DNA. Eine 1,5 mL, niedrige Bindung Rohr die Komponenten hinzufügen: 30 µL DNA von oben, 5 µL 10 x NEB Puffer 2, 1 µL dATP ab 10 mM Lager, 11 µL H2O und 3 µL 5 U / µL Klenow Fragment (3' - 5' Exo-) , und durch pipettieren vorsichtig mischen.
- Inkubieren Sie die Probe für 30 min bei 37 ° c
- Verwenden Sie eine Reaktion Bereinigung Kit, um DNA zu reinigen. Eluieren Sie DNA in 25 µL vorgewärmten (65 ° C) EB Puffer.
- Verbinden Sie Adapter. Fügen Sie die folgenden Komponenten auf Eis: 23 µL DNA von oben, 3 µL 10 X T4 DNA-Ligase Puffer, geglühten PE oder Multiplex Adapter (4 µM) 1 µL und 3 µL T4 DNA-Ligase (400 U/µL) und Mischung sanft durch pipettieren.
Hinweis: Adapter-Sequenzen können auch eine kommerzielle Quelle entnommen werden.
Oligonukleotid-Sequenzen:
PE-Adapter
5' P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAGGAATGCCGAG
5' ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
Multiplexing Adapter
5' P-GATCGGAAGAGCACACGTCT
5' ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT - Inkubieren Sie die Probe für 30 min bei Raumtemperatur.
- Führen Sie die Größenauswahl von DNA mit Hilfe einer vorgegossenen (2 %) Agarose-Gels. Laufen Sie das Gel für 10 min.
- Verbrauchssteuern der Region entspricht 250-450 bp.
Hinweis: durch das Schneiden des Gels oben über 200 bp, besteht die Möglichkeit einer Kontamination von unligated Adapter Dimere verringerte. Es ist wichtig, alle unligated Adapter vor dem PCR-Schritt zu entfernen. - Verwenden Sie eine Gel Extraction Kit, um DNA zu reinigen. Eluieren Sie in 20 µL EB Puffer.
- Reinigung von PCR und Bibliothek für aufgespaltenen DNA-Proben mit gepaart-Ende (PE) Adapter. Fügen Sie die Komponenten in einem PCR-Röhrchen: 12 µL von 50 % der DNA von oben, 12 µL Wasser 25 µL des master-Mix (Phusion HF), 1 µL PE PCR Primer 1.0 und 1 µL PE PCR Primer 2.0.
Hinweis: Oligonukleotid-Sequenzen können auch eine kommerzielle Quelle entnommen werden.
Oligonukleotid-Sequenzen:
PE-PCR-Primer 1.0
5' AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
PE-PCR-Primer 2.0
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT - Reinigung von PCR und Bibliothek für aufgespaltenen Proben mit Index PE-Adapter. Fügen Sie die Komponenten: 12 µL von 50 % der DNA von oben, 12 µL Wasser 1 µL des PCR-Primer InPE 1.0 (verdünnt 1:2), 1 µL des PCR-Primer InPE 2.0 (verdünnt 1:2) und 1 µL des PCR-Primer Index (verdünnt 1:2).
Hinweis: Oligonukleotid-Sequenzen können auch eine kommerzielle Quelle entnommen werden.
Oligonukleotid-Sequenzen:
Multiplex PCR Primer 1.0
5' AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
Multiplex PCR Primer 2.0
5' GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
PCR-Primer-Index-Sequenzen 1-12
PCR-Primer, Index 1
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTC
PCR-Primer, Index 2
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTC
PCR-Primer, Index 3
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTC
PCR-Primer, Index 4
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTC
PCR-Primer, Index 5
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTC
PCR-Primer, Index 6
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTC
PCR-Primer, Index 7
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGATCTGGTGACTGGAGTTC
PCR-Primer, Index 8
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCAAGTGTGACTGGAGTTC
PCR-Primer, Index 9
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCGTGACTGGAGTTC
PCR-Primer, Index 10
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCTAGTGACTGGAGTTC
PCR-Primer, Index 11
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGCCGTGACTGGAGTTC
PCR-Primer, Index 12
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACAAGGTGACTGGAGTTC - Führen Sie PCR Radfahren mit den folgenden Bedingungen (denaturieren für 30 s bei 98 ° C, 18 Zyklen von 10 s bei 98 ° C, 30 s bei 65° C, 30 s bei 72 ° C, 5 min bei 72 ° C zu halten, bei 4 ° C).
Hinweis: Die Anzahl der PCR-Zyklen sollte empirisch ermittelt werden. - Größenauswahl der PCR-Produkte. DNA auf einer vorgegossenen E-Gel EX (2 %) oder hausgemachte 2 % gel (Agarose) und Verbrauchsteuern die 300-500 bp-Region.
- Verwenden Sie eine Gel Extraction Kit, um die DNA aus dem Gel zu reinigen. Eluieren Sie PCR Endprodukt in 20 µL EB Puffer.
- Verwenden Sie ein Fluorometer zur Messung der Konzentration der Bibliothek. Durchführen Sie Next Generation Sequencing.
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Representative Results
Wir verhört erfolgreich die genomweite Bindung von H3K4me3, H3K4me2 und KDM5B in ES-Zellen mit diesem ChIP-Seq-Protokoll-6. ES-Zellen wurden im Feeder-freien Bedingungen (Abbildung 1) und vernetzt wie oben beschrieben. Beschallung wurde anschließend wie in Schritt 3.2 des ChIP-Seq-Protokolls beschrieben durchgeführt und bewertet durch Ausführen von DNA auf einem 2 % Agarosegel (Abbildung 2). Als nächstes wurde ChIP wie in Schritt 4 beschrieben und Bibliothek Vorbereitung erfolgte wie in Schritt 6 beschrieben. ChIP-Seq-Bibliotheken wurden auf einer Plattform Next Generation Sequencing sequenziert. Repräsentative benutzerdefinierte UCSC Browser-Ansichten zeigen Anreicherung von H3K4me3, H3K4me2 und KDM5B im Kern Pluripotenz gen POU5F1 (Abbildung 3A) und am HOXC Cluster (Abb. 3 b). CARIP-Seq wurde ebenfalls durchgeführt, indem Sie das Protokoll folgen, wie in den Schritten 4-6 beschrieben. Eine repräsentative UCSC Browser-Ansicht zeigt Bereicherung des H4K20me3-assoziierte RNA (CARIP-Seq) und H4K20me3 Belegung (ChIP-Seq) an eine Loci in ES-Zellen (Abbildung 4). Das CARIP-Seq-Signal zeigt, dass während die RNA mit H4K20me3 verbunden ist, es nicht notwendigerweise, dass es mit dem Ort angezeigt interagiert. CARIP-Seq-Datasets können in ähnlicher Weise als ChIP-Seq-Datasets analysiert werden. Daten aus Maus-ES Handy-CARIP-Seq und ChIP-Seq-Experimente können zu einem Referenz-Genom ausgerichtet werden (zB., mm9, mm10) mit bowtie221. ChIP-Seq und CARIP-Seq bereichert Regionen können beide Gipfel aufrufenden Programme wie "Spatial Clustering für Identifikation der ChIP-Enriched Regionen" (SICER)22 oder MACS23,24identifiziert werden. Da CARIP-Seq Datasets wahrscheinlich breiten Gipfel enthalten, ist es wichtig, einen Algorithmus zu verwenden, der breitere und scharfen Spitzen identifizieren können. Während die Protokolle in dieser Handschrift beschrieben optimiert wurden, für die Durchführung von ChIP-Seq und CARIP-Seq Verwendung Embryonaler Stammzellen, diese Protokolle sollten geeignet sein für die Bewertung der Protein-DNA und Chromatin-assoziierter RNA Interaktionen in andere Zelltypen.
Abbildung 1: Feeder-freie Kultur der Embryonischen Stammzellen. (A) experimentelles Design. (B) ES-Zellen kultiviert auf iMEFs in ES Handy-Medien mit LIF oder Feeder-freien Bedingungen mit ES Handy-Medien mit LIF und (C) GSK3i oder (D) GSK3i und MEKi (2i). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Beschallung von vernetzt ES Zelle Chromatin. Vernetzt ES-Zellen wurden mit einer Sonifier mit einem Microtip für 18 Zyklen beschallt (40 % Amplitude, 30 s und 30 s Rest). Vernetzung und gewann RNase Verdauung wurde später durchgeführt, um die RNA zu entfernen. DNA wurde gereinigt, mit PCI und laufen auf einem Agarosegel (2 %). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Vertreter ChIP-Seq-Analyse der ein Enzym und Histon-Modifikationen in ES-Zellen ändern Histon. Benutzerdefinierte UCSC Browser-Ansichten von H3K4me3, H3K4me2 und KDM5B bei der Pluripotenz-Regler (A) POU5F1 und (B) HOXC Cluster in ES-Zellen (normalisierte Tag Dichte (RPBM), lesen pro Basis pro million mal gelesen). Beachten Sie die Überlappung zwischen KDM5B Bindung und H3K4me3/2 Belegung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Vertreter CARIP-Seq-Analyse der RNA ein Histon Änderungen und ChIP-Seq in ES-Zellen zugeordnet. UCSC Browser-Ansichten von H4K20me3 CARIP-Seq und H4K20me3 ChIP-Seq-Signalen in ES-Zellen (normalisierte Tag Dichte (RPBM), lesen pro Basis pro million mal gelesen). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
ChIP-Seq ist eine nützliche Methode, die Lage des globalen Protein-DNA-Wechselwirkungen zu bewerten (zB., Transkription Faktoren/Histon-modifizierende Enzyme/Histon Änderungen und DNA) in ES-Zellen, während der neu entwickelte CARIP-Seq-Protokoll nützlich ist abfragenden genomweite RNAs mit Chromatin Bestandteile. ChIP-Seq ist ein grundlegendes Instrument, das verwendet wird, um epigenetische Landschaften von ES-Zellen und andere Zelltypen zu bewerten. Die Qualität der ChIP-Seq und CARIP-Seq-Bibliotheken ist weitgehend abhängig von ChIP-Grade Antikörper. Die Eignung der Antikörper gegen ChIP-Seq kann empirisch ermittelt werden, durch Ausführen von ChIP-PCR, wo ein ≥ 3 5-fold Bereicherung an Positivkontrolle Regionen im Vergleich zu unbesetzten Regionen erzeugen qualitativ hochwertige ChIP-Seq Daten25ausreichen sollte. Ebenso können Antikörper auf ihre Eignung für CARIP-Seq in ähnlicher Weise getestet werden wie für ChIP-Seq mit geringfügigen Änderungen beschrieben. Nach dem RNA IP-Schritt in das CARIP-Protokoll, wie im Methodenabschnitt beschrieben, sollte Reverse Transkription PCR durchgeführt werden, um cDNA, erzeugen, die als Vorlage verwendet werden kann, um Q-RT-PCR durchzuführen. Es wird empfohlen, die Anreicherung nach ChIP oder CARIP bei mehreren genomische Regionen zu bewerten. Gibt es weitere Aspekte bei der Beurteilung der Qualität von Antikörpern für ChIP oder CARIP zu testen. Beispielsweise kann die Stringenz der Puffer verwendet für ChIP und CARIP durch Veränderung der Konzentration von NaCl optimiert werden: eine niedrige NaCl-Konzentration eignet sich für hochspezifische Antikörper, während eine hohe NaCl-Konzentration möglicherweise hilfreich für Antikörper mit unspezifische Bindung. Bezüglich der Bibliothek Vorbereitung für Next Generation Sequencing können benutzerdefinierte Grundierungen und Indizes auch anstelle von im Handel erworbenen Oligonukleotide verwendet werden. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass unter anderem eine Phosphorothioat Änderung zwischen zwei Basen am 3'-Ende gezeigt worden, um Nuklease Verdauung26zu verhindern. Drittanbieter-RNA-Seq oder ChIP-Seq-Bibliothek-Bausätze können auch Bibliotheken für die Sequenzierung von CARIP zu generieren und ChIP-Proben, bzw. verwendet werden. Es ist jedoch wichtig, die Kits zur Beurteilung ihrer Wirksamkeit bei Erzeugung von Qualität-Bibliotheken für Next Generation Sequencing empirisch zu testen. Zusätzliche Protokolle können auch eingesetzt werden, um ChIP-Seq-Bibliothek-Vorbereitung, wie ChIPmentation27durchzuführen. Anpassung der ChIPmentation an dem hier beschriebenen ChIP-Seq-Protokoll erfordern jedoch zusätzliche Änderungen und weitere Optimierung.
Hier beschreiben wir ChIP und CARIP Protokolle, die moderate Anzahl von Zellen (4 × 106 pro IP) optimiert wurden. Während der ChIP-Protokoll mit niedrigen bis mittleren Zellzahlen durchgeführt werden kann (105 106 Zellen), wir haben keinen CARIP-Seq mit weniger als 2 × 106 Zellen durchgeführt. Durch empirisch Testbedingungen verschiedene Fixierung und Beschallung, ist es jedoch möglich, dass dieses Protokoll arbeiten kann erfolgreich mit einer geringen Anzahl von Zellen.
Zusammenfassend lässt sich sagen eignen sich ChIP-Seq und CARIP-Seq zur Erzeugung von Weltkarten von Chromatin-assoziierten Proteinen und RNAs in ES-Zellen, beziehungsweise. Während dieser Protokolle für ES-Zellen optimiert wurden, können sie optimiert um Chromatin-Karten mit einer Vielzahl von Säugetieren Zelllinien und Gewebetypen zu generieren. Diese Protokolle können auch optimiert werden, um einzellige ChIP-Seq oder CARIP-Seq-Bibliotheken zu erzeugen.
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Disclosures
Die Autoren erklären keinen Interessenskonflikt.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von Wayne State University, Karmanos Cancer Institute, ein Stipendium des National Heart, Lung and Blood Institute (1K22HL126842-01A1) an B.L.K. vergeben unterstützt. Diese Arbeit genutzt, die Wayne State Universität High Performance Computing Grid für computational Ressourcen (< Https://www.grid.wayne.edu/>). Wir danken für die Unterstützung bei CARIP-Seq Datenanalyse Jiji Kurup.
AUTOREN-BEITRÄGE:
B.L.K. der CARIP-Seq-Methode konzipiert, entworfen und ChIP-Seq und CARIP-Seq Experimente durchgeführt die Sequenzierungsdaten analysiert und erarbeitet das Manuskript. Alle Autoren haben gelesen und genehmigt die Endfassung des Manuskripts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse leukemia inhibitory factor (ESGRO LIF) | EMD Millipore | 106 or 107 units | |
| GSK3β inhibitor CHIR99021 (GSK3i) | Stemgent | Solvent: DMSO 10mM | |
| MEK inhibitor PD0325901 (MEKi) | Stemgent | Solvent: DMSO 10mM | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose | Invitrogen | 11965092 | |
| PBS (phosphate buffered saline) | Invitrogen | 10010031 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| 2-Mercaptoethanol (50 mM) | Gibco | 31350010 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140076 | |
| EmbryoMax ES Cell Qualified Fetal Bovine Serum, 500 ml | EMD Millipore | ES-009-B | |
| EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | EMD Millipore | ES-006-B | |
| Glycine | Sigma | G7126-500G | 1.25 M stock conentration in water |
| Formaldehyde solution | Sigma | F8775-500ML | |
| TE (Tris EDTA) pH 8.0 1X | Quality Biological | 351-011-131 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) solution | Sigma | 93482-250ML-F | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697498001 | |
| Sodium dodecyl sulfate solution (20%) | Quality Biological | A611-0837-10 | |
| Q125 sonifier | Qsonica | 4422 | |
| Triton X-100 solution | Sigma | 93443-100ML | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation | Invitrogen | 10004D | |
| Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation | Invitrogen | 10002D | |
| Dynabeads Protein A/Protein G and Magnet Starter Pack | Invitrogen | 10015D | |
| Lithium chloride | Sigma | L4408 | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma | I8896 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Dynabeads mRNA Purification Kit (for mRNA purification from total RNA preps) | Invitrogen | 61006 | |
| SuperScript Double-Stranded cDNA Synthesis Kit | Invitrogen | 11917010 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| End-It DNA End-Repair Kit | Lucigen | ER81050 | |
| Klenow Fragment (3'→5' exo-) | NEB | M0212L | |
| dATP (10 mM) | Invitrogen | 18252015 | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202L | |
| TrackIt 1 Kb Plus DNA Ladder | Invitrogen | 10488085 | |
| E-gel EX agarose gels, 2% | Invitrogen | G402002 | |
| Phusion high-fidelity 2X master mix with HF buffer | Thermo Fisher | F531LPM | |
| ChIPAb+ Trimethyl-Histone H3 (Lys4) - ChIP Validated Antibody | EMD Millipore | 17-614 | |
| Anti-Histone H3 (di methyl K4) antibody [Y47] - ChIP Grade (ab32356) | Abcam | ab32356 | |
| Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-well) | Fisher | 720083 | |
| Falcon Standard Tissue Culture Dishes (10cm) | Fisher | 08772E | |
| Bioruptor pico | Diagenode | B01010001 | |
| Qubit Flurometer 2.0 | Thermo Fisher | ||
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32851 | |
| MinElute Reaction Cleanup Kit | Qiagen | 28204 | |
| MinElute Gel Extraction Kit | Qiagen | 28604 | |
| Anti-Histone H4 (tri methyl K20) antibody - ChIP Grade (ab9053) | Abcam | ab9053 | |
| Labquake rotator | Thermo Fisher | 400110Q | |
| Illumina HiSeq platform | Illumina | ||
| TURBO DNase | Invitrogen | AM2238 |
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