Summary
Burada, biz ChIP-Seq gerçekleştirmek için yöntemleri tarif ve CARIP-yeni nesil sıralama, Kütüphane hazırlık dahil olmak üzere küresel epigenomic ve kromatin ilişkili RNA oluşturmak için Seq, ES hücrelerde eşler.
Abstract
Embriyonik kök (ES) hücre kendini yenileme ve farklılaşma dışsal sinyalleri ve transkripsiyon faktörleri, epigenetik düzenleyiciler ve combinatorially gen etkisi histon sonrası çeviri değişiklikler iç ağlar tarafından yönetilir Yakındaki genlerin ifade durumu. Kromatin dinamikleri ve gen ekspresyonu düzenleyen çeşitli proteinler ile etkileşim için RNA da gösterilmiştir. Kromatin ilişkili RNA immunoprecipitation (CARIP) yeni nesil sıralama (CARIP-Seq) tarafından takip RNA'ların kromatin proteinleri kromatin immunoprecipitation ardından yeni nesil sıralama () tarafından süre ile ilgili ankete roman bir yöntemdir ChIP-Seq) histon, transkripsiyon faktörleri ve küresel ölçekte-ES hücrelerdeki epigenetik değiştiriciler translasyonel modifikasyon konumunu eşlemek için bir güçlü genomik tekniktir. Burada, CARIP-Seq ve ChIP-Seq yeni nesil sekanslama için Kütüphane inşaat dahil olmak üzere, küresel kromatin ilişkili RNA ve epigenomic haritalar ES hücreleri oluşturmak için gerçekleştirmek için yöntemleri açıklanmaktadır.
Introduction
Embriyonik kök (ES) hücre kader kararlar arasında ekstrasellüler sinyalleri ve transkripsiyon-düzenleyiciler, histon değiştiriciler ve histon kuyrukları sonrası çeviri değiştirilmesi de dahil olmak üzere bir dizi iletişim tarafından düzenlenmektedir. Bu etkileşimler kromatin erişilebilirlik ve kromatin paketlenmesi birine iki durumu kolaylaştırmak: euchromatin, açık ve transcriptionally etkin olan ve sık ve genellikle transcriptionally etkin olmayan heterochromatin. Transkripsiyon faktörleri DNA fingerprinting bağlama benzeşim ve euchromatic bölgeleri ile epigenetik değiştiriciler ortak Gen ifadesinin kontrolünde katılmak için. ChIP-Seq1, dahil olmak üzere yeni nesil sıralama yöntemleri, ES hücre kendini yenileme ve pluripotency2,3için,4 temel genom çapında transkripsiyon ağlar eşleştirmesi'nde vesile olmuştur ,5,6. Ayrıca, RNA immunopreciation yeni nesil (RIP-Seq) sıralama7 değerlendirme RNA-protein etkileşimlerinin tarafından takip ederken DNA bağlayıcı proteinler RNA'ların transkripsiyon olaylar7, düzenleyen ile etkileşim öneririm 8 , 9 , 10 , 11 , 12, kaç çalışmalar kromatin12veya RNA ve histon değişiklikler arasındaki küresel etkileşim ile ilişkili RNA'ların genom çapında lokalizasyonu araştırdı. Uzun kodlamayan RNA'ların (lncRNAs) olan proteinleri kromatin ilişkili13,14,15etkinliği düzenleyen bulduk RNA'ların bir sınıfıdır. Örneğin, Xist düzenleyen, kadın memeli hücrelerinde inactivation bir X kromozomunun, epigenetik repressors16,17alımı yoluyla bir lncRNA olur. Ancak, kromatin ile ilişkili RNA'ların tam spektrum büyük ölçüde bilinmemektedir. Burada, biz yeni bir protokol, kromatin ilişkili RNA immunoprecipitation (CARIP) için yeni nesil sıralama (CARIP-kromatin ilişkili RNA'lar Kütüphane hazırlık dahil olmak üzere ES hücrelerdeki genom-wide olarak tanımlamak için Seq), ardından tarif Yeni nesil sıralama ve histon değişiklikler, transkripsiyon faktörleri ve epigenetik değiştiriciler küresel doluluk eşlemek için ChIP-Seq. Diğer RIP-Seq yöntemleri7farklı olarak, CARIP-Seq kromatin ile ilişkili RNA'ların doğrudan tanımlanması için izin crosslinking ve sonication adımları içerir. Birlikte, ChIP-Seq genom çapında protein-DNA etkileşimleri tanımlamak için güçlü bir araçtır, CARIP-Seq anket için güçlü bir yöntem ise RNA'ların kromatin bileşenleriyle ilişkilendirilmiş.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. fare ES kültürünü koşullarda besleyici içermeyen hücreleri.
Not: Fare ES hücreleri geleneksel medya jelatin ve mitotically Inaktif olan fare embriyonik fibroblastlar (MEF), mono-tabakası ile kaplı bir hücre kültür tabak (iMEFs) üzerinde kültürlü. Ancak, MEFs RNA ve MEF ilişkili kromatin kontaminasyonu önlemek için aşağı akım epigenetik veya ifade analizleri önce kaldırılması gerekir.
- Besleyici katman hazırlanması: jelatin suda 2 mL % 0,1 jelatin ekleyerek bir 6-şey hücre kültür plaka ceket ve plaka için 20-30 dk 37 ° C'de kuluçkaya.
- 2 mM L-glutamin, % 10 fetal Sığır serum (FBS) ve 1 x penisilin/streptomisin içeren % 10 DMEM yüksek glikoz ortam hazırlamak.
- E14.5 fareler18,19 E13.5 üzerinden MEFs yalıtmak veya ticari bir satıcıdan satın almak. Mitotically mitomycin C veya standart protokolleri19kullanarak gama ışınlama ile davranarak MEFs devre dışı bırakabilirsiniz. Alternatif olarak, mitotically inaktive MEFs (iMEFs) ticari bir satıcıdan elde edilebilir.
- MEFs kültür. MEF medya 37 ° C'de önceden ısıtmak, donmuş iMEFs şişe çözülme ve % 10 ile % 5 CO237 ° C'de FBS MEF medya kültür. İyi bir 6-şey kültür yemeğin başına ~ 200.000 hücre, plaka MEFs.
- Besleyici hücreler (iMEFs) tabakası ES Hücre kültürü çalışmalarının.
- 12-24 saat sonra iMEFs, kaplama öncesi 50 mL tüp ES Hücre medya sıcak (DMEM yüksek-glikoz, LIF (10 ng/mL), % 15 ES Hücre nitelikli FBS, 1 × hücre kültürü nitelikli 2-mercaptoethanol, 1 × glutamin, önemli olmayan amino asitler (NEAA), 1 × penisilin/streptomisin), 37 ° c %5 CO2ile.
- İMEFs içeren hücre kültür plakaları medyadan Aspire edin, medya 2 mL ES hücrelerde (37 ° C'de çözdürme sonra) yeniden askıya alma ve iMEFs tabakası hücrelerdeyse plakası. Kültür bulaşık kuluçka makinesine yerleştirirken, çanak hücreleri olarak dağıtabilmenizi ve toplama yemeğin ortasına doğru önlemek için "t" şeklinde taşımak önemlidir.
- ES hücreleri besleyici ücretsiz jelatin kaplı yemekleri üzerine geçiş. Onlar konfluent haline gelmeden ES hücreleri geçiş. Kolonilerin eşit aralıklı ve değil konfluent ise ES Hücre kolonileri kendini yenileme en iyi koruyun. Dokunuyorsun birçok ES Hücre kolonileri varlığını hücre yoğunluğu çok yüksek olduğunu gösterir.
- 6-iyi kültür çanak jelatin ile yukarıda açıklandığı gibi kat. Kuluçkaya % 0.25 tripsin-EDTA 37 ° c ~ 10-15 dk önceden sıcak tripsin için.
- Ardından, ES hücre ilk 1 fosfat tamponlu tuz (PBS) x ile yıkama ve 1 mL % 0.25 tripsin-EDTA çözeltisi eklenerek geçiş. 1-2 dakika ayırmak colonies için bekleyin. Bir tek hücre süspansiyon sömürgelerine 1 mL bahşiş ile pipetting ayırmak ~ 5 kere.
- Mikroskop ES hücreleri tek hücre ayrılma onaylamak için kullanın. Reaksiyon gidermek veya "tripsin etkisiz hale getirmek için" % 10 FBS MEF medya ekleyin. 3-5 dakika oda sıcaklığında 300 x g de hücreleri santrifüj kapasitesi ve medya Aspire edin.
- Hücresel Pelet glikojen sentaz kinaz-3 (GSK3) inhibitörü (CHIR99021; desteklenen medya (ES hücre) 2 ml yeniden askıya alma GSK3i), veya 2i (MEKi/GSK3i) koşulları (2-3 µM GSK3i: CHIR99021, 1 µM MEKi: PD0325901).
- Jelatin hücre kültür çanak dan Aspire edin ve 2 mL ESCs yemek için içeren medya ekleyin ve 37 ° C inkübatör (Şekil 1A-B) çanak yerleştirin. GSK3i ve MEKi çift inhibisyonu zemin durumu saf pluripotency ES Hücre besleyici hücre (iMEFs) ve serum20olmadan yokluğunda teşvik etmektedir. ES hücreleri pasajlı iki ila crosslinking geçmeden önce MEFs kaldırmak için üç kat olmalıdır.
2. ES polietilenin ChIP ve CARIP hücreleri
- PBS ile yıkayarak ES hücre hasat sonra 37 ° C'de önceden ısınmış % 0.25 tripsin ekleyin Oda sıcaklığında birkaç dakika hücreleri kuluçkaya. Trypsinization hücre ölümüne yol açacak ES hücre üzerinde kaçının. Mikroskop tek hücre ayrılma değerlendirmek için kullanın.
- Tripsin sindirim ES hücreleri passaging için yukarıda açıklandığı gibi gidermek ve 300 x g 3-5 dakika oda sıcaklığında, hücreleri santrifüj kapasitesi.
- Önceden ısıtılmış (37 ° C) MEF medya hücrelerde yeniden askıya alma (% 10 FBS/DMEM), 2 × 106 hücre/mL.
- Crosslink için hücreleri % 1 son konsantrasyonu % 37 formaldehit çözüm ekleyin ve homojen fiksasyonu elde etmek için birkaç kez 8 dk döneminde tüp 8 dk. ters çevirmek için bir konik tüp (15 mL veya 50 mL) hücrelerde 37 ° C'de kuluçkaya.
Not: Fiksasyon zaman ampirik olarak CARIP için optimize edilebilir. Fiksasyon saatlerinde bir değişiklik yapıldığında sonication döngü sayısı da ayarlanmalıdır. Ayrıca, 37 ° C sıcaklık crosslinking oda sıcaklığında karşılaştırıldığında crosslinking verimliliği artırır. Fiksasyon sıcaklığını ampirik olarak getirilebilir. - (4 ° C'de önceden soğutulmuş) glisin 0,125 M. bir konsantrasyon için 1.25 M fiksasyon reaksiyonu durdurmak eklemek için 8 oda sıcaklığında 5 min için bir rotator kullanarak devirde tüp tersine çevirin. 300 x g oda sıcaklığında 5 min için de örnek santrifüj kapasitesi ve medya Aspire edin.
- Önceden soğutulmuş PBS (4 ° C) ile hücre Pelet yıkama, 300 x g oda sıcaklığında 5 min için de örnek santrifüj kapasitesi ve PBS Aspire edin. PBS hücrelerle tekrar yıkayın. Sonraki, aliquot 15 × 106 hücre başına 15 mL tüp.
- 1 dk, 5 dk, kuru buzda için sıvı azot yerleştirerek hücre Pelet dondurma veya hemen-80 ° C'de yer
Not: Sabit ES Hücre topakları aşağı akım deneylerde düşük kalite olmadan 6 aya kadar depolanabilir.
3. kromatin sonication için ChIP ve CARIP
- Sabit ES Hücre Pelet buz çözme. Hücre Pelet sonication arabellekte (2.5 mL) yeniden askıya alma. Transkripsiyon faktörleri veya epigenetik düzenleyiciler (protein faktörler) için pelet 1 x TE, 1 mM PMSF, 1 x İndinavir inhibitörü kokteyl yeniden askıya. Histon değişiklikler için yeniden 1 x TE, % 0,1 SDS, 1 mM PMSF, 1 x İndinavir inhibitörü Pelet askıya alma.
Not: SDS ilavesi sonication verimliliği artırır, bu belirli kromatin bileşenlerinin veya transkripsiyon faktörleri değerlendirmek için yararlı olmayabilir. - 14-18 çevrimleri ile kromatin kromatin immunoprecipitation (ChIP) için solüsyon içeren temizleyicide (30 s, 30 s dinlenme) % 40 genlik. Kromatin ilişkili RNA immunoprecipitation için (CARIP), sonication döngüsü (8-10 döngüleri) sayısını azaltın. Cep, fiksasyon ve sonifier değişkenlik nedeniyle sonication için koşullar ampirik olarak tespit edilmelidir.
- Ek sonication arabellek ile 28 µL % 10 SDS protein-faktörler, sodyum-deoxycholate 28 µL ve %10 Triton-X100 ve mix iyi 0,28 mL için.
Not: Bu bileşenler sonication arabelleğine RIPA arabellek oluşturur. - 10.000 x g 4 ° C'de kromatin önceden temizlemek için 10 dk da örneğine santrifüj kapasitesi. Süpernatant temiz bir tüp taşımak ve kromatin immunoprecipitation ile devam edin.
- Alternatif olarak, sonicated kromatin kadar kullanmak-80 ° C'de muhafaza edilebilir. Ancak,-80 ° C'de sonicated kromatin muhafazası için azalan kalite protein-faktör küçük parça için neden olabilir.
4. chIP ve CARIP süreci
- 40 µL protein A ya da G manyetik boncuklar 1,5 mL için düşük bağlama tüp ekleyin. Boncuk yıkamak için PBS 600 µL ekleyin. Tüp bir mıknatıs içeren bir raf üzerine yerleştirin, oda sıcaklığında 1 dk. için tüp kuluçkaya, PBS kaldırmak ve manyetik boncuklar PBS 100 µL içinde yeniden askıya alma.
- 2-4 µg antikor, manyetik boncuklar ile tüp ekleyin. Kuluçkaya ve tüp 8 manyetik boncuklar antikor bağlanma kolaylaştırmak için bir rotator kullanarak RPM 40 dakika oda sıcaklığında döndürün. Tüp manyetik raf üzerine yerleştirin, oda sıcaklığında 1 dk. için kuluçkaya sonra PBS kaldırın.
- Manyetik boncuklar yıkamak için PBS 200 µL ekleyin. Yıkama PBS ile ücretsiz IgGs kaldırmak için gerçekleştirilir. Kuluçkaya ve yıkama adımlar arasında 5 min için oda sıcaklığında tüp döndürün. Mıknatıs için tüp takmak ve PBS kaldırın.
- Sonicated kromatin kuluçka tarafından Immunoprecipitate kromatin bağlı proteinler (4 × 106 başına hücre ChIP), manyetik boncuklar ile ayıklamak ve örnek 4 ° c (gece) döndürün.
- Manyetik boncuklar yıkayın. Örnek olarak aşağıdaki arabellekleri oda sıcaklığında kuluçkaya ve örnek her arabellek ile 10 min için döndürün: RIPA arabelleği 1 mL ile iki kez (TE (10 mM Tric-HCl, 1 mM EDTA) pH 8.0, % 1 Triton X-100, % 0,1 Sodyum deocycholate, % 0,1 SDS), 1 mL RIPA arabellek c ile iki kez ontaining 0,3 M NaCl, iki kez ile LiCl arabellek (% 0.5 sodyum deocycholate, %0,5 NP40, 0.25 M LiCl), 1 mL 1 mL TE hemen ile tampon %0.2 Triton X-100 ve bir kez TE 1 mL ile.
- De-crosslinking çip için. Manyetik boncuklar TE 100 µL içinde yeniden askıya alma. 3 µL % 10 SDS ve 5 µL (20 mg/mL), İndinavir K ekleyin. 65 ° c (gece) örnek kuluçkaya.
Not: Bu adımda parafilm veya buharlaşma önlemek için plastik wrap ile tüplere karşılamak önemlidir.- Ertesi gün, tüp karıştırmak için birkaç kez tersine çevirin. Daha sonra mıknatıs raf süpernatant temiz bir tüp aktarmak için kullanın. Manyetik boncuklar yıkama 0.5 M NaCl içeren TE 100 µL eklemek ve daha sonra iki supernatants birleştirmek için.
- CARIP için de çapraz. Manyetik boncuklar TE 100 µL içinde yeniden askıya alma. 3 µL % 10 SDS ve 5 µL (20 mg/mL), İndinavir K ekleyin. Örnek 4-12 h. kuluçka hücre tipleri, sonication ve fiksasyon şartları, vb arasında değişkenlik nedeniyle ampirik olarak belirlenecek 65 ° C'de zamana ihtiyacı için 65 ° C'de kuluçkaya.
- Tüp 3 - 5 defa ters karıştırmak için manyetik raf tüp uygulayıp daha sonra süpernatant temiz bir tüp taşımak için.
- Manyetik boncuklar yıkama 0.5 M NaCl içeren TE 100 µL eklemek ve daha sonra iki supernatants birleştirmek için.
Not: Nükleaz ücretsiz reaktifler kullanmak önemlidir (Örn., TE arabellek, SDS, vb.) de-crosslinking adımı sırasında DNA veya RNA kaybını önlemek için.
- DNA/RNA 200 µL fenol: kloroform: izoamil alkol (PCI) (25:24:1, v/v) kullanarak ayıklayın.
Not: RNA da üreticinin yönergelerini kullanarak ticari kitleri kullanarak elde edilebilir. Sallamak için 30 s, 10.000 x g 10 dakika oda sıcaklığında, spin ve süpernatant temiz bir tüp taşıyın.- DNA/RNA çökelti GlycoBlue, 3 M sodyum asetat 20 µL ve etanol 600 µL 2 µL ekleyin. Tarafından ~ 5-8 ters çevirme Mix kere ve kuru buz üzerinde veya-80 ° c en az 1-2 h için örnek yerleştirin.
- 10.000 x g 30 dk buzdolabında (4 ° C) Masa Üstü Santrifüj kullanarak için de örnek santrifüj kapasitesi. Hava kuru Pelet için < 1 dk ve EB 40 µL içinde tampon (10 mM Tris-HCl) yeniden askıya alma. ChIP-Seq Kütüphane hazırlık için adım 6 ile devam edin.
- DNA kromatin ilişkili RNA IP örnekleri DNaz kullanarak kaldırın. 10 x DNaz arabellek CARIP örnek 1 x konsantrasyon ekleyin. DNaz için 1 µL RNA (50 µL reaksiyon) 10 µg kadar ekleyin. Örnek 30 dk. özü 37 ° C'de PCI RNA örnekle kuluçkaya. Nükleaz ücretsiz H resuspend2O.
5. çift iplikçikli cDNA sentezi CARIP Seq için
- İlk-strand cDNA sentezi. PCR makinesi için tasarlanmış bir tüp aşağıdaki reaksiyon Ters transkripsiyon tepki için ayarlayın: 10,5 µL RNA ve 1 µL hexamer astar (3 µg/µL) rastgele.
- İkincil yapı denatüre 5 min için 65 ° C'de tüp kuluçkaya verin ve buz 2 dk. Mix için aşağıdaki bileşenleri: 4 µL ilk iplikçikli arabelleği, 2 µL 0.1 m DTT, dNTP 1 µL ve 0,5 RNase dışarı. Sonra ana Mix 7.5 µL PCR tüp için ekleyin. 25 ° C'de 2 min için tüp kuluçkaya Üst simge II 1 µL ekleyin (200 U/µL) ve takip kuluçkaya: 10 min, 42 ° C 50 dk, 15 dk ve 4 ° C'de tutmak için 70 ° C için 25 ° C
- İkinci-strand cDNA sentezi. Tüp buza koyun. Sonra sırayla aşağıdaki bileşenleri ekleyin: 91 tedavi µL dietil pyrocarbonate (DEPC), su, 5 saniye-strand tepki tampon, 3 µL dNTP Mix (10 mM), E. Coli DNA ligaz (10 U/µL), E. Coli DNA polimeraz (10U/µL) 4 µL 1 µL x 30 µL ve E. Coli RNase H, 1 µL (2U/µL). Yavaşça vortexing tarafından mix ve 16 ° c 2 h için kuluçkaya.
Not: flicking veya tüp ters çevirme karıştırma reaktifleri iyice karıştırmak yeterli olabilir. - 2 µL T4 DNA polimeraz ekleyin ve PCR arıtma seti kullanarak 5 dk. arındırmak cDNA (çift iplikçikli dscDNA) için 16 ° C'de kuluçkaya. 40 µL EB arabelleği dscDNA elute.
- Çift iplikçikli cDNA parçası. Bir su banyosu sonifier ve 1,5 mL tüp boyutu 250-500 bp. dscDNA Sonication için kullanarak kesme cDNA (dscDNA) tüm RNA transkript nın kolaylaştırmak için parça boyutlarını azaltmak için önemlidir.
- Bir su banyosu sonifier standart bir model kullanırken, örnek 3 × 10 dk veya 4 × 10 min için solüsyon içeren temizleyicide.
Not: dört döngüleri için 1-5 µg toplam RNA'ın tavsiye edilir iken üç devir toplam RNA, en çok 1 µg için kullanılmalıdır. Tüp her sonication döngüsü kısa bir süre sonra santrifüj kapasitesi ve taze buz ekleyerek soğuk su banyosu korumak. - Pico sonifier kullanırken, bu altı döngüleri için 1-5 µg toplam RNA ve aşağıdaki Bisiklet koşullarını kullanmak için tavsiye edilir (30 s, 90 s off). Tüp kısaca 2-3 sonication döngüsünden sonra santrifüj kapasitesi. Sonication verimlilik (% 2) bir özel jel tarihinde yamultulmuş dscDNA (3-4 µL) bir kısmını yükleyerek belirlenebilir. Sonifiers arasında değişkenlik nedeniyle sonication koşullarda ampirik olarak test etmek önemlidir.
- Kütüphane hazırlık yeni nesil sıralama için 6. adımda açıklandığı gibi gerçekleştirin.
6. chIP-Seq ve CARIP-Seq Kütüphane İnşaat
- Bir DNA sonunda tamir takımı kullanarak DNA uçları onarın. Bu kit künt uçlu DNA üretmek için kullanılır. Tüp bağlama aşağıdaki 1,5 ml ayarlayın bu reaksiyon için düşük: DNA, 2.5 mM dNPTs 5 µL, 10 mm ATP, 10 son onarım arabellek (5 mM DTT, 100 mM magnezyum asetat, 660 mM potasyum asetat x 5 µL 5 µL 34 µL 300 mM Tris-asetat, pH 7.8) ve sonunda-onarım enzim karışımı (T4 polinükleotit kinaz, T4 DNA polimeraz) 1 µL.
- Örnek oda sıcaklığında 45 dk için kuluçkaya.
- Bir reaksiyon temizleme kiti kullanılarak DNA arındırmak. Sonunda tamir DNA önceden ısıtılmış (65 ° C) EB arabelleği 32 µL'elute. Biz genellikle DNA çip veya kitaplık hazırlama önce CARIP, ardından RNA aşağıdaki konsantrasyonu quantitate değil iken bu çip DNA veya RNA CARIP en az 5-10 ng ile başlatmak için tavsiye edilir.
- Ek 3' "A" çıkıntısı DNA sonunda tamir için. 1.5 mL için düşük bağlama tüp bileşenleri ekleyin: DNA 30 µL yukarıdan, 10 NF'leri tampon 2, dATP 10 mM hisse senedi, H2O 11 µL ve 5 U 3 µL 1 µL x 5 µL / µL Klenow parçası (3' - 5' Exo-) ve karışımı yavaşça pipetting tarafından.
- Örnek 37 ° C'de 30 dk için kuluçkaya
- DNA arındırmak için bir tepki temizleme seti kullanın. DNA önceden ısıtılmış (65 ° C) EB arabellek 25 µL içinde elute.
- Bağdaştırıcı ligate. Buz üzerinde aşağıdaki bileşenleri ekleyin: 23 µL DNA yukarıdan, 10 x T4 DNA ligaz arabellek, tavlanmış PE veya bağdaştırıcı (4 µM) çoğullama 1 µL 3 µL ve 3 µL T4 DNA ligaz (400 U/µL) ve karışımı yavaşça tarafından pipetting.
Not: Bağdaştırıcı dizileri aynı zamanda ticari bir kaynaktan temin edilebilir.
Oligonükleotid dizileri:
PE bağdaştırıcıları
5' P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAGGAATGCCGAG
5' ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
Çoğullama bağdaştırıcıları
5' P-GATCGGAAGAGCACACGTCT
5' ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT - Örnek oda sıcaklığında 30 dk için kuluçkaya.
- Boyut seçim öncesi döküm (% 2) özel jel kullanarak DNA'ın gerçekleştirin. Jel 10 min için çalıştırın.
- 250-450 bp için karşılık gelen bölge tüketim.
Not: yukarıda jel 200 yukarıda kesim tarafından bp, unligated bağdaştırıcısı dimer kirlenme düşük bir olasılık. PCR adım önce unligated bir bağdaştırıcı kaldırmak önemlidir. - Bir jel ekstraksiyon kiti DNA arındırmak için kullanın. EB arabellek 20 µL içinde elute.
- Ve birleştirilmiş DNA PCR ve Kütüphane arıtma içeren eşleştirilmiş uç (PE) bağdaştırıcıları örnekler. PCR tüp bileşenlerinde ekle: 12 µL yukarıdan DNA'ın % 50, 12 µL su, ana Mix (Phusion HF) 25 µL, 1 µL PE PCR astar 1.0 ve 1 µL PE PCR astar 2.0.
Not: Oligonükleotid dizileri aynı zamanda ticari bir kaynaktan temin edilebilir.
Oligonükleotid dizileri:
PE PCR astar 1.0
5' AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
PE PCR astar 2.0
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT - PCR ve Kütüphane arıtma ve birleştirilmiş örnek dizin PE bağdaştırıcıları içeren için. Bileşenleri Ekle: 12 µL yukarıdan DNA'ın % 50, 12 µL su, 1 µL PCR astar InPE 1.0 (seyreltilmiş 1:2), 1 µL PCR astar InPE 2.0 (seyreltilmiş 1:2) ve 1 µL PCR astar dizin (seyreltilmiş 1:2).
Not: oligonükleotid dizileri aynı zamanda ticari bir kaynaktan temin edilebilir.
Oligonükleotid dizileri:
Çoğullama PCR astar 1.0
5' AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
PCR astar 2.0 çoğullama
5' GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
PCR astar Dizin dizileri 1-12
PCR astar, Dizin 1
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTC
PCR astar, dizin 2
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTC
PCR astar, Dizin 3
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTC
PCR astar, dizin 4
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTC
PCR astar, Dizin 5
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTC
PCR astar, Dizin 6
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTC
PCR astar, Dizin 7
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGATCTGGTGACTGGAGTTC
PCR astar, Dizin 8
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCAAGTGTGACTGGAGTTC
PCR astar, dizin 9
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCGTGACTGGAGTTC
PCR astar, dizin 10
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCTAGTGACTGGAGTTC
PCR astar, Dizin 11
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGCCGTGACTGGAGTTC
PCR astar, Dizin 12
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACAAGGTGACTGGAGTTC - PCR gerçekleştirmek aşağıdaki koşullar kullanarak Bisiklete binme (30 için denatüre s 98 ° c, 10 18 döngüleri 98 ° c, 30 s s 65° c, 30 s 72 ° c, 72 ° C'de 5 dk. tutun 4 ° C'de).
Not: Ampirik ÇSYİ döngü sayısı tespit edilmelidir. - PCR ürünlerinin boyutu seçimi. Bir ön döküm E-jel EX (% 2) DNA'sını ya da ev yapımı %2 (özel) jel ve 300-500 bp bölge tüketim.
- Bir jel ekstraksiyon kiti jel DNA'dan arındırmak için kullanın. Son EB arabelleği 20 µL PCR üründe elute.
- Kütüphanede konsantrasyonu ölçmek için bir yer kullanın. Yeni nesil sıralama gerçekleştirir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Başarılı bir şekilde H3K4me3, H3K4me2 ve KDM5B bu çip Seq Protokolü6kullanarak ES hücrelerdeki genom çapında bağlama sorguladık. ES hücreler kültürlü besleyici-Alerjik koşullarda (Şekil 1) ve yukarıda açıklandığı gibi çapraz bağlı. Sonication daha sonra ChIP-Seq Protokolü 3.2. adımında açıklandığı gibi gerçekleştirilen ve DNA üzerinde bir % 2 özel jel (Şekil 2) çalıştırarak değerlendirilir. Daha sonra ChIP adım 4'te açıklandığı gibi gerçekleştirildi ve Kütüphane hazırlık 6. adımda açıklandığı gibi gerçekleştirildi. Çip Seq kitaplıkları bir nesil sıralama platformunda sıralı. Temsilcisi özel UCSC tarayıcı görünümler zenginleştirme çekirdek pluripotency gene POU5F1 (Şekil 3A) ve HOXC küme (Şekil 3B) H3K4me3, H3K4me2 ve KDM5B ortaya koyuyor. CARIP-Seq da 4-6 adımda açıklandığı gibi protokol sonrası tarafından gerçekleştirildi. Bir temsilci UCSC tarayıcı görünümü bir loci ES hücrelerdeki (Şekil 4), H4K20me3 ilişkili RNA (CARIP-Seq) ve H4K20me3 doluluk (ChIP-Seq) zenginleştirme ortaya koymaktadır. CARIP-Seq sinyal RNA H4K20me3 ile ilişkili olmakla birlikte, bu gösterilen odağı ile etkileşim gelmeyebilir olduğunu gösterir. CARIP-Seq veri kümeleri benzer bir şekilde ChIP-Seq veri kümeleri analiz edilebilir. Fare ES oluşturulan veri hücre CARIP-Seq ve ChIP-Seq deneyler her ikisi de uyumlu olabilir bir başvuru genom (Örn., mm9, mm10) kullanarak bowtie221. Çip Seq ve CARIP-Seq zenginleştirilmiş bölgeler her ikisi de "Kayma kümeleme için kimlik ChIP-Enriched bölgeler" (SICER)22 veya MAC'ler23,24gibi tepe arama programları kullanılarak belirlenebilir. CARIP-Seq veri kümeleri büyük olasılıkla geniş doruklarına içerdiğinden, geniş ve keskin doruklarına tanımlayabilirsiniz bir algoritma kullanmak önemlidir. Bu el yazması açıklanan protokoller ChIP-Seq ve CARIP-Seq gerçekleştirmek için optimize edilmiş iken ES hücreleri kullanarak, bu protokollerin de protein-DNA ve RNA etkileşimlerde kromatin ilişkili diğer hücre tipleri değerlendirmek için uygun olmalıdır.
Şekil 1: besleyici-Alerjik kültür ES hücre. (A) deneysel tasarım. (B) ES Hücre ES iMEFs kültürlü LIF içeren medya hücre veya koşullarda besleyici-Alerjik ES ile LIF ve (C) GSK3i veya (D) GSK3i ve MEKi (2i) içeren medya hücre. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: çapraz ES Hücre kromatin Sonication. Çapraz ES hücreleri sonicated bir sonifier bir microtip ile 18 devredir kullanarak (% 40 genlik, 30 s ve 30 s dinlenme). Crosslinking tersine ve RNase sindirim daha sonra RNA kaldırmak için gerçekleştirildi. DNA PCI kullanarak ve üzerinde bir özel jel (% 2) çalıştırın saflaştırıldı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 3: bir histon enzim ve histon değişiklikleri ES hücrelerdeki değiştirme analizini temsilcisi ChIP-Seq. Özel UCSC tarayıcı görünümlerini H3K4me3, H3K4me2 ve KDM5B pluripotency-Regülatör (A) POU5F1 ve (B) HOXC küme ES hücrelerdeki (normalleştirilmiş etiketi yoğunluğu (RPBM), Bankası milyon okuma başına başına okuyun). KDM5B bağlama ve H3K4me3/2 doluluk arasında örtüşme unutmayın. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: RNA'ın temsilcisi CARIP-Seq analiz ilişkili bir histon değişiklik ve ChIP-Seq ES hücrelerdeki. UCSC tarayıcı sayısı H4K20me3 CARIP-Seq ve H4K20me3 ChIP-Seq sinyallerinin ES hücrelerdeki (normalleştirilmiş etiketi yoğunluğu (RPBM), Bankası milyon okuma başına başına okuyun). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Çip Seq küresel protein-DNA etkileşimleri konumunu değerlendirmek için yararlı bir yöntemdir (Örn., transkripsiyon faktörleri/histon enzimler/histon modifikasyonları ve DNA değiştirme) ES hücrelerde, yeni geliştirilen CARIP-Seq Protokolü içinde yararlı iken RNA'ların genom çapında Derneği ile kromatin bileşenlerinin sorguluyor. Çip Seq ES Hücre epigenetik manzara ve diğer hücre tipleri değerlendirmek için kullanılan temel bir araçtır. ChIP-Seq ve CARIP-Seq kitaplıkları kalitesini büyük ölçüde ChIP-grade antikorlar üzerinde bağlıdır. ChIP-Seq antikor uygunluğu ChIP-PCR, nerede bir ≥ 3 pozitif kontrol bölgeler kullanılmayan bölgeleri göre 5-fold zenginleştirme için yüksek kaliteli çip Seq veri25oluşturmak için yeterli olmalıdır gerçekleştirerek ampirik olarak belirlenebilir. Aynı şekilde, antikorlar için uygunluk CARIP-Seq için benzer bir şekilde ChIP-Seq için küçük değişiklikler ile açıklandığı gibi test edilebilir. CARIP Protokolü RNA IP adımda yukarıdaki yöntemleri bölümünde açıklandığı gibi takip, Ters-transkripsiyon PCR Q-RT-PCR gerçekleştirmek için şablon olarak kullanılabilir cDNA oluşturmak için yapılmalıdır. Bu çip veya birden fazla genomik bölge, CARIP aşağıdaki zenginleştirme değerlendirmek için tavsiye edilir. Çip ya da CARIP için antikorlar kalitesini değerlendirirken test etmek için ek konuları vardır. Örneğin, ChIP ve CARIP için kullanılan arabellekleri sıkılık NaCl konsantrasyonu değiştirerek optimize: NaCl yoğun antikorlar ile için yararlı olsa da düşük bir NaCl konsantrasyon son derece özel antikorlar için uygundur Non-spesifik bağlama. Yeni nesil sıralama kitaplığı hazırlığı ile ilgili özel astar ve dizinler yerine ticari olarak elde oligonucleotides de kullanılabilir. Ancak, 3' ucunda iki bazlar arasındaki bir phosphorothioate değişiklik de dahil olmak üzere nükleaz sindirim26önlemek için gösterilmiştir olduğunu unutmamak gerekir. Üçüncü taraf RNA-Seq veya çip Seq Kütüphane inşaat kitleri CARIP nın için kitaplıkları oluşturmak ve örnekleri, sırasıyla çip için de kullanılabilir. Ancak, ampirik olarak test kitleri üreten kalite kütüphanelerinde yeni nesil sıralama için onların etkinliğini değerlendirmek için önemlidir. Ek protokoller de ChIP-Seq Kütüphane hazırlık, ChIPmentation27gerçekleştirmek için istihdam edilebilir. Ancak, ChIPmentation uyarlaması burada açıklanan ChIP-Seq protokolüne ek değişiklikler ve daha fazla optimizasyon gerektirir.
Burada, makul sayıda hücreleri (4 × 106 IP başına) kullanarak optimize ChIP ve CARIP iletişim kurallarını açıklar. ChIP protokolü için ara düşük hücre sayıları kullanarak gerkçekleştirilen iken (105 106 hücrelere), CARIP-Seq az 2 × 106 hücreler kullanarak yapmamış. Ancak, çeşitli fiksasyon ve sonication koşullar ampirik olarak test ederek, bu iletişim kuralını kullanarak başarıyla hücreleri az sayıda çalışabilir mümkündür.
Özetle, ChIP-Seq ve CARIP-Seq ES hücrelerde sırasıyla kromatin ilişkili protein ve RNA'ların küresel haritaları oluşturmak için yararlıdır. Bu iletişim kuralları ES hücreler için optimize edilmiş iken, kromatin haritalar çok çeşitli memeli hücre satırları ve doku türleri kullanarak oluşturmak için getirilebilir. Bu protokoller de tek hücreli yonga-Seq veya CARIP-Seq kitaplıkları oluşturmak için optimize.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir çıkar çatışması beyan ederim.
Acknowledgments
Bu eser Wayne State Üniversitesi, Karmanos Kanser Enstitüsü, Ulusal Kalp, akciğer ve kan Enstitüsü (1K22HL126842-01A1) B.L.K. için layık bir hibe tarafından desteklenmiştir Bu eser Wayne State Üniversitesi yüksek performans Grid bilgi sayısal kaynaklar için kullanılan (< https://www.grid.wayne.edu/>). Jiji logg CARIP Seq veri analizi ile yardım için teşekkür.
YAZARLARIN KATKILARI:
B.L.K. CARIP-Seq yöntemi gebe, tasarlanmış ve ChIP-Seq ve CARIP-Seq deneyler, sıralama veri analiz ve el yazması askere. Tüm yazarları okudum ve onaylanmış bu el yazması son sürüm.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse leukemia inhibitory factor (ESGRO LIF) | EMD Millipore | 106 or 107 units | |
| GSK3β inhibitor CHIR99021 (GSK3i) | Stemgent | Solvent: DMSO 10mM | |
| MEK inhibitor PD0325901 (MEKi) | Stemgent | Solvent: DMSO 10mM | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose | Invitrogen | 11965092 | |
| PBS (phosphate buffered saline) | Invitrogen | 10010031 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| 2-Mercaptoethanol (50 mM) | Gibco | 31350010 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140076 | |
| EmbryoMax ES Cell Qualified Fetal Bovine Serum, 500 ml | EMD Millipore | ES-009-B | |
| EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | EMD Millipore | ES-006-B | |
| Glycine | Sigma | G7126-500G | 1.25 M stock conentration in water |
| Formaldehyde solution | Sigma | F8775-500ML | |
| TE (Tris EDTA) pH 8.0 1X | Quality Biological | 351-011-131 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) solution | Sigma | 93482-250ML-F | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697498001 | |
| Sodium dodecyl sulfate solution (20%) | Quality Biological | A611-0837-10 | |
| Q125 sonifier | Qsonica | 4422 | |
| Triton X-100 solution | Sigma | 93443-100ML | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation | Invitrogen | 10004D | |
| Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation | Invitrogen | 10002D | |
| Dynabeads Protein A/Protein G and Magnet Starter Pack | Invitrogen | 10015D | |
| Lithium chloride | Sigma | L4408 | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma | I8896 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Dynabeads mRNA Purification Kit (for mRNA purification from total RNA preps) | Invitrogen | 61006 | |
| SuperScript Double-Stranded cDNA Synthesis Kit | Invitrogen | 11917010 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| End-It DNA End-Repair Kit | Lucigen | ER81050 | |
| Klenow Fragment (3'→5' exo-) | NEB | M0212L | |
| dATP (10 mM) | Invitrogen | 18252015 | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202L | |
| TrackIt 1 Kb Plus DNA Ladder | Invitrogen | 10488085 | |
| E-gel EX agarose gels, 2% | Invitrogen | G402002 | |
| Phusion high-fidelity 2X master mix with HF buffer | Thermo Fisher | F531LPM | |
| ChIPAb+ Trimethyl-Histone H3 (Lys4) - ChIP Validated Antibody | EMD Millipore | 17-614 | |
| Anti-Histone H3 (di methyl K4) antibody [Y47] - ChIP Grade (ab32356) | Abcam | ab32356 | |
| Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-well) | Fisher | 720083 | |
| Falcon Standard Tissue Culture Dishes (10cm) | Fisher | 08772E | |
| Bioruptor pico | Diagenode | B01010001 | |
| Qubit Flurometer 2.0 | Thermo Fisher | ||
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32851 | |
| MinElute Reaction Cleanup Kit | Qiagen | 28204 | |
| MinElute Gel Extraction Kit | Qiagen | 28604 | |
| Anti-Histone H4 (tri methyl K20) antibody - ChIP Grade (ab9053) | Abcam | ab9053 | |
| Labquake rotator | Thermo Fisher | 400110Q | |
| Illumina HiSeq platform | Illumina | ||
| TURBO DNase | Invitrogen | AM2238 |
References
- Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
- Chen, X., et al. Integration of external signaling pathways with the core transcriptional network in embryonic stem cells. Cell. 133 (6), 1106-1117 (2008).
- Boyer, L. A., et al. Core transcriptional regulatory circuitry in human embryonic stem cells. Cell. 122 (6), 947-956 (2005).
- Kim, J., Chu, J., Shen, X., Wang, J., Orkin, S. H. An extended transcriptional network for pluripotency of embryonic stem cells. Cell. 132 (6), 1049-1061 (2008).
- Kidder, B. L., Hu, G., Yu, Z. X., Liu, C., Zhao, K. Extended self-renewal and accelerated reprogramming in the absence of Kdm5b. Mol Cell Biol. 33, 4793-4810 (2013).
- Kidder, B. L., Hu, G., Zhao, K. KDM5B focuses H3K4 methylation near promoters and enhancers during embryonic stem cell self-renewal and differentiation. Genome Biol. 15 (2), R32 (2014).
- Zhao, J., et al. Genome-wide identification of polycomb-associated RNAs by RIP-seq. Mol Cell. 40 (6), 939-953 (2010).
- Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Mol Cell. 46 (5), 674-690 (2012).
- Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).
- Hudson, W. H., Ortlund, E. A. The structure, function and evolution of proteins that bind DNA and RNA. Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (11), 749-760 (2014).
- Khalil, A. M., et al. Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression. P Natl Acad Sci USA. 106 (28), 11667-11672 (2009).
- Hendrickson, D. G., Kelley, D. R., Tenen, D., Bernstein, B., Rinn, J. L. Widespread RNA binding by chromatin-associated proteins. Genome Biol. 17, 28 (2016).
- Kelley, R. L., Kuroda, M. I. Noncoding RNA genes in dosage compensation and imprinting. Cell. 103 (1), 9-12 (2000).
- Koziol, M. J., Rinn, J. L. RNA traffic control of chromatin complexes. Curr Opin Genet Dev. 20 (2), 142-148 (2010).
- Mercer, T. R., Mattick, J. S. Structure and function of long noncoding RNAs in epigenetic regulation. Nat Struct Mol Bio. 20 (3), 300-307 (2013).
- Chu, C., et al. Systematic discovery of Xist RNA binding proteins. Cell. 161 (2), 404-416 (2015).
- Mak, W., et al. Reactivation of the paternal X chromosome in early mouse embryos. Science. 303 (5658), 666-669 (2004).
- Garfield, A. S. Derivation of primary mouse embryonic fibroblast (PMEF) cultures. Methods Mol Biol. 633, 19-27 (2010).
- Conner, D. A. Mouse embryo fibroblast (MEF) feeder cell preparation. Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 23 Unit 23 22 (2001).
- Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Zang, C., et al. A clustering approach for identification of enriched domains from histone modification ChIP-Seq data. Bioinformatics. 25 (15), 1952-1958 (2009).
- Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
- Liu, T. Use model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS) to analyze short reads generated by sequencing protein-DNA interactions in embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 1150, 81-95 (2014).
- Kidder, B. L., Hu, G., Zhao, K. ChIP-Seq: technical considerations for obtaining high-quality data. Nat Immunol. 12 (10), 918-922 (2011).
- Quail, M. A., et al. A large genome center's improvements to the Illumina sequencing system. Nat Methods. 5 (12), 1005-1010 (2008).
- Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors. Nat Methods. 12 (10), 963-965 (2015).
