Summary
Aquí, describimos los métodos para realizar ChIP-Seq y mapas de CARIP-Seq, incluyendo preparación de biblioteca para secuenciación de próxima generación, generar global epigenómica y RNA asociada a la cromatina en células madre embrionarias.
Abstract
Auto-renovación de células madre embrionarias (ES) y diferenciación se rige por señales extrínsecas e intrínsecas redes de factores de transcripción, reguladores epigenéticos y traducción posteriores modificaciones de las histonas que influyen combinatorially en el gene Estado de expresión de los genes cercanos. RNA se ha demostrado también al interactuar con diversas proteínas para regular la dinámica de la cromatina y expresión génica. Asociada a la cromatina RNA inmunoprecipitación (CARIP) seguida por secuenciación de próxima generación (CARIP-Seq) es un método novedoso para la encuesta de ARN asociado a proteínas de cromatina, mientras que de inmunoprecipitación de cromatina, seguida por secuenciación de próxima generación ( ChIP-Seq) es una técnica poderosa genómica para asignar la ubicación de modificaciones post-traduccionales de las histonas, factores de transcripción y epigenéticos modificadores a escala mundial en células madre embrionarias. Aquí, describimos los métodos para realizar CARIP-Seq y ChIP-Seq, incluyendo la construcción de la biblioteca para secuenciación de próxima generación, para generar ARN cromatina asociado global y mapas epigenómicos en células madre embrionarias.
Introduction
Las decisiones de destino de células madre embrionarias (ES) son reguladas por la comunicación entre las señales extracelulares y un anfitrión de transcripcional reguladores, como modificadores de histonas, modificación post traducción de colas de las histonas. Estas interacciones facilitan la accesibilidad de la cromatina y empaquetado de la cromatina en uno de dos Estados: eucromatina, que es abierto y transcripcionalmente activo, y la heterocromatina, que es compacto y generalmente transcripcionalmente inactiva. Factores de transcripción con afinidades de unión de la secuencia específica de ADN y modificadores epigenéticos asociados con regiones euchromatic para participar en el control de la expresión génica. Métodos de secuenciación de próxima generación, incluyendo ChIP-Seq1, han sido fundamentales en la asignación de redes transcripcionales del genoma que son fundamentales para ES celular auto renovación y pluripotencia2,3,4 ,5,6. Por otra parte, mientras que immunopreciation RNA seguido por generación de secuenciación (RIP-Seq)7 las evaluaciones de las interacciones RNA-proteína sugieren que proteínas ADN interactuarán con RNAs regulación transcripcional eventos7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12, pocos estudios han investigado la localización de todo el genoma de ARN asociado con cromatina12o interacciones globales entre el ARN y la histona modificación. ARN largo no codificante (lncRNAs) es una clase de RNAs que se han encontrado para regular la actividad de las proteínas asociadas a cromatina13,14,15. Por ejemplo, Xist es un lncRNA que regula, en células de mamífero femenino, la inactivación de un cromosoma de X, a través de la contratación de represores epigenéticos16,17. Sin embargo, el espectro completo de RNAs asociados con cromatina es desconocido. Aquí, describimos un protocolo nuevo, asociada a la cromatina RNA inmunoprecipitación (CARIP) seguida por secuenciación de próxima generación (CARIP-Seq), para identificar ARN cromatina asociados sobre una base de todo el genoma en células madre embrionarias, incluyendo preparación de biblioteca para secuenciación de próxima generación y ChIP-Seq mapa ocupación global de modificaciones de las histonas, factores de transcripción y modificadores de la epigenéticos. A diferencia de otros métodos de RIP-Seq7, CARIP-Seq incluye pasos de reticulación y sonicación, que permiten la identificación directa de ARN asociada a la cromatina. Juntos, ChIP-Seq es una poderosa herramienta para identificar las interacciones de la proteína del genoma-ADN, mientras que CARIP-Seq es un método poderoso para RNAs asociados con componentes de la cromatina.
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Protocol
1. cultura de ES de ratón células en condiciones libres de alimentador.
Nota: Las células de ratón ES convencionalmente son cultivadas en medios de comunicación en una placa de cultivo celular recubierta de gelatina y una mono capa de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF), que han sido inactivados mitotically (iMEFs). Sin embargo, MEFs deben eliminarse antes de abajo análisis epigenéticos o expresión para evitar la contaminación de la cromatina asociados por el MEF y el ARN.
- Preparación de una capa de alimentador: gelatina cubra una placa de cultivo celular 6-bien mediante la adición de 2 mL de 0.1% de gelatina en agua e incubar la placa a 37 ° C durante 20-30 minutos.
- Preparación de medios de alta glucosa 10% DMEM que contenía 2 mM L-glutamina, 10% suero bovino fetal (FBS) y 1 x penicilina/estreptomicina.
- Aislar la MEFs de E13.5 E14.5 ratones18,19 o adquirir de un vendedor comercial. Inactive mitotically MEFs por tratamiento con mitomicina C o irradiación gamma utilizando protocolos estándar19. Por otra parte, mitotically inactivado MEFs (iMEFs) pueden ser adquiridos de un vendedor comercial.
- Cultivo de MEFs. Caliente previamente la media de la MEF a 37 ° C, descongelar vial congelado de iMEFs y cultura en 10% los medios de comunicación FBS MEF a 37 ° C con 5% CO2. Placa de MEFs en el ~ 200.000 células por pocillo de una placa de cultivo de 6 pozos.
- Cultivo de células madre embrionarias en una capa de células de alimentador (iMEFs).
- 12-24 h después de la iMEFs, la galjanoplastia caliente previamente un tubo de 50 mL de medios de comunicación de la célula ES (DMEM alta glucosa, LIF (10 ng/mL), 15% ES calificado de célula FBS, calificado de cultivo de células de 1 × 2-Mercaptoetanol, 1 × glutamina, aminoácidos no esenciales (AANE), 1 × penicilina/estreptomicina), a 37 ° C con 5% CO2.
- Aspire los medios de comunicación de las placas de cultivo celular que contiene iMEFs, Resuspenda las células madre embrionarias en 2 mL de medio (después de la descongelación a 37 º C) y las células de la capa de iMEFs de la placa. Al colocar la placa de cultivo en la incubadora, es importante mover el plato en forma de "t" para distribuir las células y a prevenir la agregación hacia el centro del plato.
- Paso de las células madre embrionarias en platos libres de alimentador cubierto de gelatina. Paso de las células madre embrionarias antes de que sean confluentes. Colonias de células ES mantienen la auto renovación mejor si las colonias son uniformemente espaciados y no confluentes. La presencia de muchas colonias de células ES que están tocando indica que la densidad celular es demasiado alta.
- Cubrir una placa de cultivo de 6 pocillos con gelatina como se describió anteriormente. Incubar 0.25% tripsina-EDTA a 37 ° C por aproximadamente 10-15 minutos de precalentamiento tripsina.
- Paso a continuación, las células madre embrionarias primer lavado con 1 x de tampón fosfato salino (PBS) y añadiendo 1 mL de solución al 0.25% tripsina-EDTA. Esperar 1-2 min para las colonias separar. Disociar las colonias a una suspensión unicelular mediante pipeteo con una punta de 1 mL para ~ 5 veces.
- Utilice un microscopio para confirmar la disociación de la célula de las células madre embrionarias. Para calmar la reacción, o para "neutralizar" la tripsina, añadir media de 10% FBS MEF. Centrifugar las células a 300 x g a temperatura ambiente durante 3-5 min y aspire los medios de comunicación.
- Resuspenda el sedimento celular en 2 mL de medio (células ES) complementado con inhibidor de glicógeno sintasa quinasa 3 (GSK3) (CHIR99021; GSK3i), o 2i (MEKi/GSK3i) las condiciones (2-3 μm GSK3i: CHIR99021, 1 μm MEKi: PD0325901).
- Aspirar la gelatina de la placa de cultivo celular, agregar 2 mL de medio conteniendo CES al plato y coloque el plato en la incubadora de 37 ° C (figura 1A-D). Inhibición dual de GSK3i y MEKi promueve estado ingenuo pluripotencia de células madre embrionarias en ausencia de células de alimentador (iMEFs) y sin suero20. Células madre embrionarias deben ser los dos a tres veces para quitar MEFs antes de proceder a la reticulación.
2. entrecruzamiento de ES Cells ChIP y CARIP
- Cosechar las células madre embrionarias por lavado con PBS, luego agregar 0.25% tripsina calentado previamente a 37 ° C. Incube las células durante varios minutos a temperatura ambiente. No tripsinización de células madre embrionarias, que conducirá a la muerte celular. Utilice un microscopio para evaluar disociación unicelular.
- Calmar la digestión tripsina como se describió anteriormente para pases de células madre embrionarias y centrifugar las células a 300 x g a temperatura ambiente durante 3-5 minutos.
- Resuspenda las células en medios de comunicación MEF precalentado (37 ° C) (10% FBS/DMEM) 2 × 106 células/ml.
- Para reticular las células, Agregar solución de formaldehído 37% a una concentración final de 1% e incubar las células en un tubo cónico (15 mL o 50 mL) a 37 ° C por 8 minutos invertir el tubo varias veces durante el período de 8 minutos para lograr la fijación homogénea.
Nota: El tiempo de fijación puede ser empíricamente optimizado de CARIP. Si se altera el tiempo de fijación, también se debe ajustar el número de ciclos de sonicación. También, la temperatura de 37 ° C aumenta la eficiencia de la reticulación en comparación con el cura a temperatura ambiente. La temperatura de fijación puede optimizarse empíricamente. - Para detener la reacción de fijación, agregar 1,25 M glicina (previamente enfriada a 4 ° C) a una concentración de 0,125 M. invertir el tubo a 8 rpm usando un agitador durante 5 minutos a temperatura ambiente. Centrifugar la muestra a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente y aspirar los medios de comunicación.
- Lavar el precipitado de células con PBS previamente refrigerada (4 ° C), centrifugar la muestra a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente y aspirar PBS. Lavar las células con PBS otra vez. A continuación, alícuota 15 × 106 células por tubo de 15 mL.
- Congelar el precipitado de células colocando en nitrógeno líquido durante 1 minuto, en hielo seco durante 5 minutos, o poner inmediatamente a-80 ° C.
Nota: ES fijo celular pellets pueden almacenarse por hasta 6 meses sin disminución calidad en experimentos posteriores.
3. sonicación cromatina ChIP y CARIP
- Descongelar el precipitado de células ES fijo en el hielo. Resuspenda el precipitado de células en tampón de sonicación (2,5 mL). Para factores de transcripción o reguladores epigenéticos (Factores proteicos), vuelva a suspender el sedimento en TE 1 x, 1 mM PMSF, 1 x inhibidor de la proteinasa cóctel. Para modificaciones de las histonas, vuelva a suspender el sedimento en 1 x TE, 0.1% SDS, 1 mM PMSF, inhibidor de la proteinasa de 1 x.
Nota: Mientras que la adición de SDS mejora la eficiencia de la sonicación, puede no ser beneficioso para la evaluación de ciertos componentes de la cromatina o factores de transcripción. - Someter a ultrasonidos de inmunoprecipitación de cromatina (ChIP), cromatina con ciclos de 14-18 (30 s en 30 resto de s) en amplitud 40%. Para cromatina asociado RNA inmunoprecipitación (CARIP), reducir el número de ciclos de sonicación (8-10 ciclos). Celular, la fijación y variabilidad sonifier, condiciones para la sonicación deben determinarse empíricamente.
- Suplemento el búfer de sonicación con 28 μl de SDS 10% por factores proteicos, 28 μl de desoxicolato de sodio y 0,28 mL de 10% Triton-X100 y mezclar bien.
Nota: Además de estos componentes en el búfer de sonicación genera almacenador intermediario RIPA. - Centrifugar la muestra a 10.000 x g por 10 min a 4 ° C para eliminar previamente la cromatina. Trasladar el sobrenadante a un tubo nuevo y proceder a inmunoprecipitación de cromatina.
- Como alternativa, cromatina sonicación puede almacenarse a-80 ° C hasta su uso. Sin embargo, el almacenamiento de la cromatina sonicado a-80 ° C puede llevar a disminución de la calidad para ChIP de proteína-factor.
4. chIP y proceso CARIP
- Agregar 40 μl de proteína A o G de perlas magnéticas a un 1,5 mL, tubo de baja obligatoria. Añadir 600 μl de PBS para lavar los granos. Coloque el tubo en un rack que contiene un imán, incubar el tubo durante 1 min a temperatura ambiente, quitar PBS y vuelva a suspender las bolas magnéticas en 100 μl de PBS.
- Añadir 2-4 μg de anticuerpo al tubo con granos magnéticos. Incubar y gire el tubo a temperatura ambiente durante 40 min a 8 rpm usando un agitador para facilitar la Unión de anticuerpos a las bolas magnéticas. Inserte el tubo sobre la rejilla magnética, incubar durante 1 min a temperatura ambiente y luego retire PBS.
- Añadir 200 μL de PBS para lavar las bolas magnéticas. Se realiza lavado con PBS para eliminar depósitos gratis. Incubar y gire el tubo a temperatura ambiente durante 5 minutos entre pasos de lavado. Conecte el tubo al imán y retirar el PBS.
- Immunoprecipitate proteínas de cromatina-limite por incubando la cromatina sonicación extracción (4 × 106 células por ChIP), con las bolas magnéticas y giran la muestra a 4 ° C (noche).
- Lavar las bolas magnéticas. Incubar la muestra a temperatura ambiente con los siguientes buffers y rotar la muestra durante 10 min con cada tampón: dos veces con 1 mL de tampón RIPA (pH de TE (10 mM Tric-HCl, 1 mM EDTA) 8.0, 1% Tritón X-100, deocycholate de sodio 0.1%, 0.1% SDS), dos veces con 1 mL de RIPA buffer c ontaining 0,3 M NaCl, dos veces con 1 mL de tampón de LiCl (0.5% sodio deocycholate, 0.5% NP40, 0.25 M LiCl), una vez con 1 mL de TE del almacenador intermediario con 0,2% Tritón X-100 y una vez con 1 mL de TE.
- De-reticulación para ChIP. Vuelva a suspender las bolas magnéticas en 100 μl de TE. Agregar 3 μl de SDS 10% y 5 μl de proteinasa K (20 mg/mL). Incubar la muestra a 65 ° C (noche).
Nota: Es importante cubrir los tubos durante este paso con parafilm o envoltura de plástico para evitar la evaporación.- Al día siguiente, invertir el tubo varias veces para mezclar. A continuación, use la parrilla de imán para transferir el sobrenadante a un tubo nuevo. Para lavar las bolas magnéticas, añada 100 μl de TE que contiene 0.5 M NaCl y posteriormente se combinan los dos sobrenadantes.
- De-reticulación de CARIP. Vuelva a suspender las bolas magnéticas en 100 μl de TE. Agregar 3 μl de SDS 10% y 5 μl de proteinasa K (20 mg/mL). Incubar la muestra a 65 ° C durante 4 a 12 h. incubación hora a 65 ° C debe ser determinado empíricamente debido a la variabilidad entre los tipos de células, sonicación y fijación de las condiciones, etcetera.
- Invertir el tubo de 3 - 5 veces para mezclar, aplicar el tubo a la rejilla magnética y posteriormente pasar el sobrenadante a un tubo nuevo.
- Para lavar las bolas magnéticas, añada 100 μl de TE que contiene 0.5 M NaCl y posteriormente se combinan los dos sobrenadantes.
Nota: Es importante utilizar reactivos libres de nucleasas (e.g., buffer TE, SDS, etcetera.) para evitar la pérdida de ADN o ARN durante la etapa de reticulación.
- Extracto de ADN/ARN con 200 μL de fenol: cloroformo: isoamílico alcohol (PCI) (25:24:1, v/v).
Nota: RNA puede también ser extraído utilizando kits comerciales utilizando las instrucciones del fabricante. Agitar durante 30 s, centrifugado a 10.000 x g a temperatura ambiente durante 10 minutos y pasar el sobrenadante a un tubo nuevo.- Para precipitar el ADN/ARN, añadir 2 μl de GlycoBlue, 20 μl de acetato de sodio de 3 M y 600 μl de etanol. Mezclar por inversión 5 ~ 8 veces y coloque la muestra en hielo seco o a-80 ° C durante al menos 1-2 h.
- Centrifugar la muestra a 10.000 x g durante 30 minutos utilizando una centrífuga de mesa refrigerada (4 ° C). Secar el pellet para < 1 min y resuspender en 40 μl de EB buffer (10 mM Tris-HCl). Para la preparación de la biblioteca de ChIP-Seq, continúe con paso 6.
- Sacar ADN de muestras de ARN IP asociada a la cromatina con DNasa. Añadir el tampón de DNasa de 10 x a 1 concentración de x en la muestra CARIP. Añadir 1 μl de DNasa para hasta 10 μg de ARN (reacción de 50 μL). Incubar la muestra a 37 ° C durante 30 minutos de extracto de la muestra de RNA con PCI. Resuspender en libre de nucleasa H2O.
5. double-stranded cDNA síntesis de CARIP-Seq
- Síntesis de cDNA de primera línea. Para la reacción de transcripción reversa, establecer la siguiente reacción en un tubo diseñado para una máquina PCR: 10.5 μl de ARN y 1 μl al azar del hexamer primers (3 μg/μl).
- Incubar el tubo a 65 ° C por 5 min desnaturalizar la estructura secundaria y almacenar en hielo durante 2 minutos mezcla los siguientes componentes: 4 μL de tampón de primera-filamento, 2 μl de 0,1 M TDT, 1 μl de dNTP y 0.5 Rnasa a. A continuación, en el tubo PCR, añadir 7,5 μl de la mezcla principal. Incubar los tubos durante 2 min a 25 ° C. Añadir 1 μl de superíndice II (200 U/μL) y se incuba como sigue: 25 ° C durante 10 min, 42 ° C por 50 min, 70 º C durante 15 minutos y mantenga a 4 º C.
- Síntesis de la segunda cadena de cDNA. Coloque el tubo en hielo. A continuación, agregue los siguientes componentes en orden: 91 de μl de dietil pirocarbonato (DEPC) tratado de agua, 30 μl de 5 x buffer de reacción del segundo filamento, 3 μl de mezcla de dNTP (10 mM), 1 μl de ligase de la DNA de e. Coli (10 U/μL), 4 μL de polimerasa de la DNA de e. Coli (10U/μL) y 1 μl de Rnasa H de E.coli (2U/μL). Mezcle suavemente Vortex e incubar a 16 ° C por 2 h.
Nota: Mezcla por chasquear o por inversión del tubo puede no ser suficiente para mezclar bien los reactivos. - Añadir 2 μl de T4 DNA polimerasa e incubar a 16 ° C por 5 min Purify cDNA (bicatenario, dscDNA) utilizando el kit de purificación de PCR. Eluir la dscDNA en 40 μl de tampón de EB.
- Fragmento de cDNA de doble hebra. Corte cDNA (dscDNA) usando un sonifier del baño de agua y un tubo de 1,5 mL a un tamaño de 250-500 BP sonicación de dscDNA es fundamental para reducir el tamaño de fragmento para facilitar la secuencia de la transcripción de RNA total.
- Cuando se utiliza un modelo estándar de un sonifier baño de agua, someter a ultrasonidos la muestra para el 3 × 10 min o 4 × 10 min.
Nota: Tres ciclos se deben usar para hasta 1 μg de ARN total, mientras cuatro ciclos se recomiendan 1-5 μg de ARN total. El tubo de centrífuga brevemente después de cada ciclo de sonicación y mantener un baño de agua fría añadiendo hielo fresco. - Cuando se utiliza un Pico sonifier, se recomienda usar seis ciclos de 1-5 μg de ARN total y las siguientes condiciones de ciclismo (30 s en 90 s apagado). El tubo de centrífuga brevemente después de 2-3 ciclos de sonicación. La eficacia de la sonicación se puede determinar por la carga de una fracción de la dscDNA esquilado (3-4 μL) en un gel de agarosa (2%). Es importante probar empíricamente las condiciones sonicación debido a la variabilidad entre sonifiers.
- Realizar preparación de biblioteca como se describe en el paso 6 para secuenciación de próxima generación.
6. chIP-Seq y construcción de biblioteca de CARIP-Seq
- Reparación de extremos de la DNA usando un kit de reparación final de ADN. Este kit se utiliza para generar ADN de punta Roma. Para esta reacción, configurar los siguientes de 1,5 mL, bajo tubo de enlace: 34 μl de ADN, 5 μl de 2, 5 mM dNPTs, 5 μl de 10 mM ATP, 5 μl de 10 x tampón final-reparación (5 mM DTT, acetato de magnesio de 100 mM, 660 mM potasio acetato 300 mM acetato de Tris, pH 7.8) y 1 μl de mezcla de enzima (cinasa de T4 Polinucleótido, polimerasa de la DNA de T4) final-reparación.
- Incubar la muestra durante 45 min a temperatura ambiente.
- Purificar el ADN utilizando un kit de limpieza de la reacción. Eluir el ADN reparado final en 32 μl de tampón de EB precalentado (65 ° C). Mientras que generalmente no cuantificar la concentración de la DNA después del ChIP, o RNA después de CARIP, antes de la preparación de la biblioteca, se recomienda comenzar con al menos 5-10 ng de ChIP de ADN o ARN de CARIP.
- Además de una proyección de 3' "A" al final reparar ADN. Agregar los componentes a un 1,5 mL, tubo de baja obligatoria: 30 μL del ADN desde arriba, 5 μl de 10 x tampón de NEB 2, 1 μl de dATP de stock de 10 mM, 11 μl de H2O y 3 μl de 5 U / fragmento de Klenow μl (3' - 5' Exo-) y mezclar pipeteando suavemente.
- Incubar la muestra durante 30 min a 37 ° C.
- Utilice un kit de limpieza de reacción para purificar DNA. Eluir el ADN en 25 μl de tampón de EB precalentado (65 ° C).
- Ligar el adaptador. Añadir los siguientes componentes en el hielo: 23 μl de ADN desde arriba, 3 μl de tampón de ligasa de T4 ADN de x 10, 1 μl de recocido PE o multiplexación adaptador (4 μm) y 3 μl de T4 ADN ligasa (400 U/μL) y mezclar suavemente por pipeteo.
Nota: Las secuencias adaptador también pueden obtenerse de una fuente comercial.
Secuencias de oligonucleótidos:
Adaptadores de PE
5' P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAGGAATGCCGAG
5' ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
Adaptadores de multiplexación
5' P-GATCGGAAGAGCACACGTCT
5' ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT - Incubar la muestra durante 30 min a temperatura ambiente.
- Realizar la selección del tamaño de ADN utilizando un gel de agarosa (2%) pre-cast. Correr el gel durante 10 minutos.
- Impuestos especiales de la región correspondiente a bp 250-450.
Nota: al cortar el gel por encima por encima de 200 bp, existe la posibilidad de disminución de la contaminación de los dímeros de unligated adaptador. Es importante eliminar cualquier adaptadores unligated antes el paso de la polimerización en cadena. - Utilice un kit de extracción de gel para purificar DNA. Eluir en 20 μl de tampón de EB.
- Biblioteca y PCR purificación de ADN ligado muestras con adaptadores de extremo apareado (PE). Añadir los componentes en un tubo PCR: 12 μl del 50% del ADN de arriba, 12 μl de agua, 25 μl de la mezcla principal (Phusion HF), 1 μl de la cartilla de PCR PE 1.0 y 1 μl de la cartilla de PCR PE 2.0.
Nota: Las secuencias del oligonucleótido también pueden obtenerse de una fuente comercial.
Secuencias de oligonucleótidos:
Cartilla PCR PE 1.0
5' AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
Cartilla PCR PE 2.0
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT - Biblioteca y PCR purificación para muestras ligadas con adaptadores índice PE. Agregar los componentes: 12 μl del 50% del ADN de arriba, 12 μl de agua, 1 μl de la cartilla PCR InPE 1.0 (diluido 1:2), 1 μl de la cartilla PCR InPE 2.0 (diluido 1:2) y 1 μl de la cartilla PCR índice (diluido 1:2).
Nota: las secuencias del oligonucleótido también pueden obtenerse de una fuente comercial.
Secuencias de oligonucleótidos:
Multiplexación de PCR Primer 1.0
5' AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
Multiplexación de PCR Primer 2.0
5' GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
Secuencias de PCR Primer Índice 1-12
Cartilla de la polimerización en cadena, Índice 1
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTC
Cartilla de la polimerización en cadena, índice 2
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTC
Cartilla de la polimerización en cadena, índice 3
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTC
Cartilla de la polimerización en cadena, índice 4
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTC
Cartilla de la polimerización en cadena, índice 5
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTC
Cartilla de la polimerización en cadena, índice 6
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTC
Cartilla de la polimerización en cadena, índice 7
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGATCTGGTGACTGGAGTTC
Cartilla de la polimerización en cadena, índice 8
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCAAGTGTGACTGGAGTTC
Cartilla de la polimerización en cadena, índice 9
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCGTGACTGGAGTTC
Cartilla de la polimerización en cadena, índice 10
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCTAGTGACTGGAGTTC
Cartilla de la polimerización en cadena, índice 11
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGCCGTGACTGGAGTTC
Cartilla de la polimerización en cadena, índice 12
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACAAGGTGACTGGAGTTC - Realizar PCR ciclo usando las siguientes condiciones (desnaturalice durante 30 s a 98 ° C, 18 ciclos de 10 s a 98 ° C, 30 s a 65° C, 30 s a 72 ° C, 5 min a 72 ° C, mantener a 4 ° C).
Nota: El número de ciclos PCR debe determinarse empíricamente. - Selección del tamaño de los productos PCR. Ejecutar el ADN en un Gel E prefabricado EX (2%) o casero 2% gel (agarosa) e impuestos especiales de la región de 300-500 bp.
- Utilice un kit de extracción de gel para purificar el ADN desde el gel. Eluir el producto final de PCR en 20 μl de tampón de EB.
- Utilice un Fluorímetro para medir la concentración de la biblioteca. Realizar la secuenciación de próxima generación.
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Representative Results
Nos interrogó con éxito la Unión de todo el genoma de H3K4me3, H3K4me2 y KDM5B en células madre embrionarias usando este ChIP-Seq protocolo6. Células madre embrionarias fueron cultivados en condiciones libres de alimentación (figura 1) y reticulado como se describió anteriormente. Sonicación fue posteriormente realizado como se describe en el paso 3.2 del protocolo ChIP-Seq y evaluada mediante la ejecución de DNA en gel de agarosa al 2% (figura 2). A continuación, ChIP fue realizado como se describe en el paso 4 y preparación de la biblioteca se realizó como se describe en el paso 6. ChIP-Seq bibliotecas fueron ordenadas en una plataforma de secuenciación de próxima generación. Representante vistas personalizadas del explorador UCSC revelan enriquecimiento de H3K4me3, H3K4me2 y KDM5B en el gen de la pluripotencia de núcleo POU5F1 (Figura 3A) y en el cluster HOXC (figura 3B). También se realizó siguiendo el protocolo como se describe en los pasos 4-6 CARIP-Seq. Una vista de explorador UCSC representativa revela enriquecimiento de RNA asociada a H4K20me3 (CARIP-Seq) y ocupación H4K20me3 (ChIP-Seq) en un locus en células madre embrionarias (figura 4). La señal de CARIP-Seq demuestra que mientras que el ARN está asociado con H4K20me3, no necesariamente indica que interacciona con el locus que se muestra. Conjuntos de datos de CARIP-Seq pueden analizarse de una manera similar como conjuntos de ChIP-Seq. Datos generados por el ratón ES la célula de CARIP-Seq y ChIP-Seq experimentos pueden tanto ser alineados con un genoma de referencia (por ej., mm9, mm10) usando bowtie221. ChIP-Seq y regiones de CARIP-Seq enriquecido pueden tanto identificarse mediante programas llamando al pico como "Espacial Clustering para identificación de ChIP-Enriched regiones" (SICER)22 o MACS23,24. Porque conjuntos de CARIP-Seq probables incluyen picos grandes, es importante utilizar un algoritmo que puede identificar grandes y afilados picos. Mientras que los protocolos descritos en este manuscrito se han optimizado para ChIP-Seq y CARIP-Seq con células madre embrionarias, estos protocolos también deben ser adecuados para evaluar la proteína ADN y cromatina asociada interacciones RNA en otros tipos celulares.
Figura 1: cultura libre de alimentador de células ES. (A) diseño experimental. (B) ES las células cultivadas en iMEFs en ES célula medios conteniendo LIF, o en condiciones libres de alimentador con ES celular medios conteniendo LIF y MEKi (2i), (C) GSK3i o (D) GSK3i. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: sonicación de la cromatina celular reticulado ES. Reticulado ES cells se sonicó con un sonifier una micropunta de 18 ciclos (amplitud 40%, 30 s en y 30 resto de s). Entrecruzamiento se revirtió, y digestión Rnasa se realizó posteriormente para eliminar RNA. ADN fue purificado con PCI y correr en un gel de agarosa (2%). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Análisis de representante ChIP-Seq de una histona modificación enzima e histona modificaciones en las células ES. UCSC browser vistas personalizadas de H3K4me3, H3K4me2 y KDM5B en el regulador de pluripotencia POU5F1 (A) y (B) HOXC se agrupan en células madre embrionarias (etiqueta normalizada densidad (RPBM), leído por base por millones Lee). Observe el traslapo entre el enlace de KDM5B y ocupación H3K4me3/2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Representante CARIP-Seq análisis de ARN asociada a una modificación de las histonas y ChIP-Seq en las células ES. Vistas del navegador UCSC de señales H4K20me3 CARIP-Seq y H4K20me3 ChIP-Seq en células madre embrionarias (etiqueta normalizada densidad (RPBM), leído por base por millones Lee). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
ChIP-Seq es un método útil para evaluar la situación de las interacciones proteína-ADN global (por ej., factores de transcripción/histona modificación de enzimas/histona modificaciones y ADN) en células madre embrionarias, mientras que el nuevo protocolo de CARIP-Seq es útil en interrogatorio de Asociación de genoma de ARN con los componentes de la cromatina. ChIP-Seq es una herramienta fundamental que se utiliza para evaluar paisaje epigenético de células madre embrionarias y otros tipos de células. La calidad del ChIP-Seq y bibliotecas de CARIP-Seq depende en gran medida de anticuerpos ChIP-grado. La idoneidad de los anticuerpos para ChIP-Seq puede determinarse empíricamente mediante la realización de ChIP-polimerización en cadena, donde una ≥ 3 enriquecimiento 5-fold en regiones de control positivo en relación con las regiones desocupadas debería ser suficiente para generar alta calidad ChIP-Seq datos25. Además, anticuerpos pueden analizarse para su conveniencia de CARIP-Seq de manera similar como se describe para ChIP-Seq con modificaciones menores. Tras el paso de ARN IP en el protocolo CARIP como se describe en la sección métodos, transcripción reversa PCR debe realizarse para generar cDNA, que puede utilizarse como plantilla para realizar RT-Q-PCR. Se recomienda evaluar el enriquecimiento después de ChIP o CARIP en varias regiones genómicas. Hay consideraciones adicionales para poner a prueba al evaluar la calidad de los anticuerpos para ChIP o CARIP. Por ejemplo, el rigor de búferes para ChIP y CARIP puede optimizarse mediante la alteración de la concentración de NaCl: una baja concentración de NaCl es conveniente para anticuerpos altamente específicos, mientras que una alta concentración de NaCl puede ser útil para los anticuerpos con fijación no específica. Con respecto a la preparación de la biblioteca para secuenciación de próxima generación, cartillas personalizados e índices pueden usarse en lugar de oligonucleótidos comercialmente adquiridas. Sin embargo, es importante tener en cuenta que incluye una modificación del fosfotioato entre dos bases en el extremo 3' se ha demostrado para prevenir la nucleasa digestión26. Kits de construcción biblioteca RNA-Seq o ChIP-Seq de terceros pueden usarse para generar bibliotecas para secuenciación de CARIP y ChIP muestras, respectivamente. Sin embargo, es importante comprobar empíricamente los kits para evaluar su eficacia en generar bibliotecas de calidad para secuenciación de próxima generación. Protocolos adicionales pueden emplearse también para la preparación de la biblioteca de ChIP-Seq, como ChIPmentation27. Sin embargo, adaptación de ChIPmentation en el protocolo de ChIP-Seq descrito aquí requiere de modificaciones adicionales y mayor optimización.
Aquí, describimos la viruta y CARIP protocolos que han sido optimizados utilizando un número moderado de células (4 x 106 por IP). Mientras que el protocolo de ChIP se puede realizar un número bajo a intermedio de células (105 106 células), no hemos realizado de CARIP-Seq con menos de 2 × 106 células. Sin embargo, empíricamente, probando varias condiciones de fijación y sonicación, es posible que este protocolo puede funcionar con éxito usando un pequeño número de células.
En Resumen, ChIP-Seq y CARIP-Seq son útiles para la generación de mapas mundiales de proteínas asociadas a cromatina y ARN en células madre embrionarias, respectivamente. Mientras que estos protocolos han sido optimizados para células madre embrionarias, puede ser optimizadas para generar mapas de cromatina con una amplia variedad de líneas de células de mamífero y tipos de tejidos. Estos protocolos también pueden ser optimizados para generar bibliotecas de CARIP-Seq o unicelular ChIP-Seq.
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Disclosures
Los autores no declaran conflicto de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por Wayne estado Universidad, Karmanos Cancer Institute, una beca de la National Heart, Lung and Blood Institute (1K22HL126842-01A1) a B.L.K. Este trabajo utiliza el Wayne estado Universidad alto rendimiento Computación Grid de recursos computacionales (< https://www.grid.wayne.edu/>). Agradecemos Jiji Kurup ayuda con análisis de datos de CARIP-Seq.
CONTRIBUCIONES DE LOS AUTORES:
B.L.K. concibió el método de CARIP-Seq, diseñado y llevado a cabo los experimentos de ChIP-Seq y CARIP-Seq, analizó los datos de secuenciación y redactó el manuscrito. Todos los autores han leído y aprobado la versión final de este manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse leukemia inhibitory factor (ESGRO LIF) | EMD Millipore | 106 or 107 units | |
| GSK3β inhibitor CHIR99021 (GSK3i) | Stemgent | Solvent: DMSO 10mM | |
| MEK inhibitor PD0325901 (MEKi) | Stemgent | Solvent: DMSO 10mM | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose | Invitrogen | 11965092 | |
| PBS (phosphate buffered saline) | Invitrogen | 10010031 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| 2-Mercaptoethanol (50 mM) | Gibco | 31350010 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140076 | |
| EmbryoMax ES Cell Qualified Fetal Bovine Serum, 500 ml | EMD Millipore | ES-009-B | |
| EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | EMD Millipore | ES-006-B | |
| Glycine | Sigma | G7126-500G | 1.25 M stock conentration in water |
| Formaldehyde solution | Sigma | F8775-500ML | |
| TE (Tris EDTA) pH 8.0 1X | Quality Biological | 351-011-131 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) solution | Sigma | 93482-250ML-F | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697498001 | |
| Sodium dodecyl sulfate solution (20%) | Quality Biological | A611-0837-10 | |
| Q125 sonifier | Qsonica | 4422 | |
| Triton X-100 solution | Sigma | 93443-100ML | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation | Invitrogen | 10004D | |
| Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation | Invitrogen | 10002D | |
| Dynabeads Protein A/Protein G and Magnet Starter Pack | Invitrogen | 10015D | |
| Lithium chloride | Sigma | L4408 | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma | I8896 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Dynabeads mRNA Purification Kit (for mRNA purification from total RNA preps) | Invitrogen | 61006 | |
| SuperScript Double-Stranded cDNA Synthesis Kit | Invitrogen | 11917010 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| End-It DNA End-Repair Kit | Lucigen | ER81050 | |
| Klenow Fragment (3'→5' exo-) | NEB | M0212L | |
| dATP (10 mM) | Invitrogen | 18252015 | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202L | |
| TrackIt 1 Kb Plus DNA Ladder | Invitrogen | 10488085 | |
| E-gel EX agarose gels, 2% | Invitrogen | G402002 | |
| Phusion high-fidelity 2X master mix with HF buffer | Thermo Fisher | F531LPM | |
| ChIPAb+ Trimethyl-Histone H3 (Lys4) - ChIP Validated Antibody | EMD Millipore | 17-614 | |
| Anti-Histone H3 (di methyl K4) antibody [Y47] - ChIP Grade (ab32356) | Abcam | ab32356 | |
| Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-well) | Fisher | 720083 | |
| Falcon Standard Tissue Culture Dishes (10cm) | Fisher | 08772E | |
| Bioruptor pico | Diagenode | B01010001 | |
| Qubit Flurometer 2.0 | Thermo Fisher | ||
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32851 | |
| MinElute Reaction Cleanup Kit | Qiagen | 28204 | |
| MinElute Gel Extraction Kit | Qiagen | 28604 | |
| Anti-Histone H4 (tri methyl K20) antibody - ChIP Grade (ab9053) | Abcam | ab9053 | |
| Labquake rotator | Thermo Fisher | 400110Q | |
| Illumina HiSeq platform | Illumina | ||
| TURBO DNase | Invitrogen | AM2238 |
References
- Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
- Chen, X., et al. Integration of external signaling pathways with the core transcriptional network in embryonic stem cells. Cell. 133 (6), 1106-1117 (2008).
- Boyer, L. A., et al. Core transcriptional regulatory circuitry in human embryonic stem cells. Cell. 122 (6), 947-956 (2005).
- Kim, J., Chu, J., Shen, X., Wang, J., Orkin, S. H. An extended transcriptional network for pluripotency of embryonic stem cells. Cell. 132 (6), 1049-1061 (2008).
- Kidder, B. L., Hu, G., Yu, Z. X., Liu, C., Zhao, K. Extended self-renewal and accelerated reprogramming in the absence of Kdm5b. Mol Cell Biol. 33, 4793-4810 (2013).
- Kidder, B. L., Hu, G., Zhao, K. KDM5B focuses H3K4 methylation near promoters and enhancers during embryonic stem cell self-renewal and differentiation. Genome Biol. 15 (2), R32 (2014).
- Zhao, J., et al. Genome-wide identification of polycomb-associated RNAs by RIP-seq. Mol Cell. 40 (6), 939-953 (2010).
- Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Mol Cell. 46 (5), 674-690 (2012).
- Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).
- Hudson, W. H., Ortlund, E. A. The structure, function and evolution of proteins that bind DNA and RNA. Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (11), 749-760 (2014).
- Khalil, A. M., et al. Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression. P Natl Acad Sci USA. 106 (28), 11667-11672 (2009).
- Hendrickson, D. G., Kelley, D. R., Tenen, D., Bernstein, B., Rinn, J. L. Widespread RNA binding by chromatin-associated proteins. Genome Biol. 17, 28 (2016).
- Kelley, R. L., Kuroda, M. I. Noncoding RNA genes in dosage compensation and imprinting. Cell. 103 (1), 9-12 (2000).
- Koziol, M. J., Rinn, J. L. RNA traffic control of chromatin complexes. Curr Opin Genet Dev. 20 (2), 142-148 (2010).
- Mercer, T. R., Mattick, J. S. Structure and function of long noncoding RNAs in epigenetic regulation. Nat Struct Mol Bio. 20 (3), 300-307 (2013).
- Chu, C., et al. Systematic discovery of Xist RNA binding proteins. Cell. 161 (2), 404-416 (2015).
- Mak, W., et al. Reactivation of the paternal X chromosome in early mouse embryos. Science. 303 (5658), 666-669 (2004).
- Garfield, A. S. Derivation of primary mouse embryonic fibroblast (PMEF) cultures. Methods Mol Biol. 633, 19-27 (2010).
- Conner, D. A. Mouse embryo fibroblast (MEF) feeder cell preparation. Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 23 Unit 23 22 (2001).
- Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Zang, C., et al. A clustering approach for identification of enriched domains from histone modification ChIP-Seq data. Bioinformatics. 25 (15), 1952-1958 (2009).
- Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
- Liu, T. Use model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS) to analyze short reads generated by sequencing protein-DNA interactions in embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 1150, 81-95 (2014).
- Kidder, B. L., Hu, G., Zhao, K. ChIP-Seq: technical considerations for obtaining high-quality data. Nat Immunol. 12 (10), 918-922 (2011).
- Quail, M. A., et al. A large genome center's improvements to the Illumina sequencing system. Nat Methods. 5 (12), 1005-1010 (2008).
- Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors. Nat Methods. 12 (10), 963-965 (2015).
