Summary
यहाँ, हम अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के लिए पुस्तकालय तैयारी सहित चिप Seq और CARIP-Seq, प्रदर्शन करने के लिए तरीकों का वर्णन, ES कोशिकाओं में वैश्विक epigenomic और क्रोमेटिन-जुड़े आरएनए नक्शे उत्पन्न करने के लिए.
Abstract
भ्रूण स्टेम (ते) सेल स्व नवीकरण और भेदभाव बाह्य संकेतों और प्रतिलेखन कारकों, epigenetic नियामकों के आंतरिक नेटवर्क द्वारा नियंत्रित किया जाता है, और histones के बाद अनुवाद संशोधनों कि combinatorially प्रभाव जीन आसपास के जीन की अभिव्यक्ति राज्य । आरएनए भी क्रोमेटिन गतिशीलता और जीन अभिव्यक्ति को विनियमित करने के लिए विभिन्न प्रोटीन के साथ बातचीत करने के लिए दिखाया गया है । क्रोमेटिन-एसोसिएटेड आरएनए immunoprecipitation (CARIP) अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (CARIP-Seq) द्वारा पीछा RNAs प्रोटीन के साथ जुड़े क्रोमेटिन सर्वेक्षण करने के लिए एक उपंयास विधि है, जबकि क्रोमेटिन immunoprecipitation अगली पीढ़ी के अनुक्रमण द्वारा पीछा ( चिप-Seq) ES कोशिकाओं में एक वैश्विक पैमाने पर histones, प्रतिलेखन कारकों, और epigenetic संशोधक के पोस्ट-शोधों के संशोधन के स्थान को मैप करने के लिए एक शक्तिशाली जीनोमिक्स तकनीक है । यहां, हम अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के लिए पुस्तकालय निर्माण सहित CARIP-Seq और चिप-Seq, प्रदर्शन करने के तरीकों का वर्णन, वैश्विक क्रोमेटिन-संबद्ध आरएनए और ES कोशिकाओं में epigenomic नक्शे उत्पन्न करने के लिए.
Introduction
भ्रूण स्टेम (ES) सेल भाग्य निर्णय extracellular संकेतों और transcriptional-नियामकों के एक मेजबान के बीच संचार द्वारा विनियमित रहे हैं, हिस्टोन संशोधक सहित, और हिस्टोन पूंछ के बाद अनुवाद संशोधन । ये बातचीत दो राज्यों में से एक में क्रोमेटिन की क्रोमेटिन पहुंच और पैकेजिंग की सुविधा प्रदान करते हैं: euchromatin, जो खुला और transcriptionally सक्रिय है, और heterochromatin, जो कॉम्पैक्ट है और आम तौर पर निष्क्रिय transcriptionally । डीएनए अनुक्रम के साथ प्रतिलेखन कारकों-विशिष्ट बाध्यकारी समानताएं और epigenetic संशोधक euchromatic क्षेत्रों के साथ सहयोगी जीन अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने में भाग लेने के लिए । अगली पीढ़ी के अनुक्रमण विधियों, चिप-Seq1सहित, जीनोम-वाइड transcriptional नेटवर्क है कि ES सेल सेल्फ नवीकरण और pluripotency2,3,4 के लिए मौलिक है मानचित्रण में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है ,5,6. इसके अलावा, जबकि आरएनए immunopreciation अगली पीढ़ी के अनुक्रमण द्वारा पीछा किया (चीर-Seq) शाही सेना के7 मूल्यांकन-प्रोटीन बातचीत सुझाव है कि डीएनए बंधन प्रोटीन RNAs के साथ बातचीत transcriptional घटनाओं को विनियमित करने के लिए7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12, कुछ अध्ययनों क्रोमेटिन12, या आरएनए और हिस्टोन संशोधनों के बीच वैश्विक बातचीत के साथ जुड़े RNAs के जीनोम व्यापक स्थानीयकरण की जांच की है । लंबे समय से गैर कोडिंग RNAs (lncRNAs) RNAs के एक वर्ग है जो क्रोमेटिन से जुड़े प्रोटीन13,14,15की गतिविधि को विनियमित पाया गया है । उदाहरण के लिए, Xist एक lncRNA है कि, महिला स्तनधारी कोशिकाओं में विनियमित, एक एक्स गुणसूत्र की निष्क्रियता, epigenetic दमन के16,17की भर्ती के माध्यम से । हालांकि, क्रोमेटिन से जुड़े RNAs का पूरा स्पेक्ट्रम काफी हद तक अनजान है । यहां, हम एक उपंयास प्रोटोकॉल, क्रोमेटिन-एसोसिएटेड आरएनए immunoprecipitation (CARIP) अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (CARIP-Seq), के बाद का वर्णन करने के लिए ES कोशिकाओं में एक जीनोम व्यापक आधार पर क्रोमेटिन संबद्ध RNAs की पहचान, पुस्तकालय की तैयारी सहित अगली पीढ़ी के अनुक्रमण, और चिप-Seq हिस्टोन संशोधनों, प्रतिलेखन कारकों, और epigenetic संशोधक के वैश्विक अधिभोग नक्शा करने के लिए । अंय चीर-Seq तरीकों के विपरीत7, CARIP-Seq में crosslinking और sonication के चरण शामिल हैं, जो RNAs से संबद्ध क्रोमेटिन की प्रत्यक्ष पहचान के लिए अनुमति देते हैं । एक साथ, चिप-Seq जीनोम-वाइड प्रोटीन-डीएनए बातचीत की पहचान करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है, जबकि CARIP-Seq क्रोमेटिन घटकों के साथ जुड़े सर्वेक्षण RNAs के लिए एक शक्तिशाली तरीका है ।
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Protocol
1. फीडर में माउस ES कोशिकाओं की संस्कृति-मुक्त शर्तों ।
नोट: माउस ES कोशिकाओं पारंपरिक मीडिया में एक सेल संस्कृति जिलेटिन और एक मोनो माउस की परत भ्रूण fibroblasts (MEF) है, जो mitotically निष्क्रिय किया गया है (iMEFs) के साथ लेपित पकवान पर संस्कृति रहे हैं । हालांकि, MEFs से पहले बहाव epigenetic या अभिव्यक्ति विश्लेषण करने के लिए MEF के संदूषण को रोकने के लिए हटाया जाना चाहिए-एसोसिएटेड क्रोमेटिन और आरएनए ।
- एक फीडर परत की तैयारी: जिलेटिन कोट एक 6-अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेट पानी में ०.१% जिलेटिन की 2 मिलीलीटर जोड़कर, और 20-30 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर थाली मशीन ।
- 10% DMEM उच्च ग्लूकोज मीडिया 2 मिमी एल-glutamine, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), और 1x पेनिसिलिन/streptomycin युक्त तैयार करें ।
- MEFs ई 13.5 से ई 14.5 चूहों18,19 या एक वाणिज्यिक विक्रेता से प्राप्त करने के लिए अलग । Mitotically मानक प्रोटोकॉल का उपयोग कर मीतोमयसीं सी या गामा विकिरण के साथ इलाज के द्वारा निष्क्रिय MEFs19. वैकल्पिक रूप से, mitotically निष्क्रिय MEFs (iMEFs) एक वाणिज्यिक विक्रेता से प्राप्त किया जा सकता है ।
- संवर्धन MEFs. ३७ डिग्री सेल्सियस पर पूर्व गर्म MEF मीडिया, iMEFs और संस्कृति के गल जमे हुए शीशी 10% FBS MEF मीडिया में ३७ ° c के साथ 5% CO2। थाली MEFs पर ~ २००,००० कोशिकाओं के प्रति अच्छी तरह से एक 6-अच्छी संस्कृति पकवान ।
- फीडर कोशिकाओं (iMEFs) की एक परत पर ES कोशिकाओं संवर्धन ।
- iMEFs चढ़ाना के बाद 12-24 ज, ES सेल मीडिया की एक ५० मिलीलीटर ट्यूब पूर्व गर्म (DMEM उच्च ग्लूकोज, लिफ (10 एनजी/एमएल), 15% ES सेल-योग्य FBS, 1 × सेल-संस्कृति योग्य 2-mercaptoethanol, 1 × glutamine, गैर आवश्यक अमीनो एसिड (NEAA), 1 × पेनिसिलिन/streptomycin), ३७ डिग्री सेल्सियस पर 5% सह2के साथ ।
- iMEFs युक्त सेल कल्चर प्लेट्स से मीडिया को महाप्राण करें, पुन: मीडिया के 2 एमएल में ES कोशिकाओं को सस्पेंड करें (३७ डिग्री सेल्सियस पर गल जाने के बाद), और कोशिकाओं को iMEFs की परत पर प्लेट कर लीजिये । जब मशीन में संस्कृति पकवान रखने, यह एक "टी" आकार में पकवान कदम समान रूप से कोशिकाओं को वितरित करने के लिए और पकवान के केंद्र की ओर एकत्रीकरण को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है ।
- फीडर पर ES कोशिकाओं-नि: शुल्क जिलेटिन-लेपित व्यंजन गद्यांश । ES कोशिकाओं बीतने से पहले वे धाराप्रवाह हो । ES सेल कालोनियों स्व नवीकरण बनाए रखने के सबसे अच्छा अगर कालोनियों समान रूप से स्थान और धाराप्रवाह नहीं कर रहे हैं । कई ES सेल कालोनियों कि छू रहे है की उपस्थिति इंगित करता है कि कोशिका घनत्व बहुत अधिक है ।
- कोट एक 6 के रूप में ऊपर वर्णित जिलेटिन के साथ अच्छी तरह से संस्कृति डिश । मशीन ०.२५% trypsin-EDTA ३७ ° c पर ~ 10-15 मिनट पूर्व गर्म trypsin के लिए ।
- अगले, 1x फास्फेट के साथ पहली धुलाई द्वारा ES कोशिकाओं गद्यांश (पंजाब) खारा और ०.२५% trypsin-EDTA समाधान की 1 मिलीलीटर जोड़ने । कालोनियों को अलग करने के लिए 1-2 मिनट रुको । अलग कर देना एक एकल सेल निलंबन के लिए एक 1 मिलीलीटर टिप के साथ pipetting द्वारा ~ 5 बार के लिए कालोनियों ।
- ES कोशिकाओं के एकल कोशिका पृथक्करण की पुष्टि करने के लिए एक माइक्रोस्कोप का प्रयोग करें । प्रतिक्रिया बुझाने के लिए, या "बेअसर" trypsin, जोड़ने के लिए 10% FBS MEF मीडिया । 3-5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ३०० x g पर कोशिकाओं के केंद्रापसारक, और मीडिया महाप्राण ।
- पुनः निलंबित मीडिया के 2 मिलीलीटर में सेलुलर गोली (ES सेल) ग्लाइकोजन सिंथेस कळेनासे के साथ पूरक-3 (GSK3) अवरोध करनेवाला (CHIR99021; GSK3i), या 2i (MEKi/GSK3i) अटी (2-3 µ मी GSK3i: CHIR99021, 1 µ m MEKi: PD0325901).
- सेल संस्कृति पकवान से जिलेटिन महाप्राण, और डिश के लिए ESCs युक्त मीडिया के 2 मिलीलीटर जोड़ने के लिए, और ३७ डिग्री सेल्सियस मशीन (चित्र 1a-डी) में पकवान जगह है । GSK3i और MEKi के दोहरे निषेध फीडर कोशिकाओं (iMEFs) और बिना सीरम20के अभाव में ES कोशिकाओं की जमीन राज्य भोले pluripotency को बढ़ावा देता है । ES कोशिकाओं crosslinking करने के लिए आगे बढ़ने से पहले MEFs को दूर करने के लिए दो से तीन बार गद्यांश किया जाना चाहिए.
2. चिप और CARIP के लिए ES कोशिकाओं का Crosslinking
- उन्हें पंजाबियों के साथ धुलाई द्वारा ES कोशिकाओं फसल, तो ३७ डिग्री सेल्सियस पर पूर्व गर्म ०.२५% trypsin जोड़ें. कमरे के तापमान पर कई मिनट के लिए कोशिकाओं की मशीन । ES कोशिकाओं के trypsinization पर से बचें, जो कोशिका मृत्यु के लिए नेतृत्व करेंगे । एक माइक्रोस्कोप का उपयोग करने के लिए एकल कोशिका पृथक्करण का मूल्यांकन.
- trypsin पाचन बुझाने के रूप में passaging ES कोशिकाओं के लिए ऊपर वर्णित है, और 3-5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ३०० x g पर कोशिकाओं केंद्रापसारक ।
- पुन: निलंबित कोशिकाओं में पूर्व गरम (३७ ° c) MEF मीडिया (10% FBS/DMEM) पर 2 × 106 कोशिकाओं/
- कोशिकाओं को crosslink करने के लिए, एक 1% अंतिम एकाग्रता के लिए ३७% formaldehyde समाधान जोड़ें, और एक शंकु ट्यूब (15 मिलीलीटर या ५० एमएल) में ३७ ° c में कोशिकाओं को गर्मी 8 मिनट के लिए । ट्यूब उलटा 8 मिनट के दौरान कई बार समरूप निर्धारण प्राप्त करने के लिए अवधि ।
नोट: निर्धारण समय CARIP के लिए empirically अनुकूलित किया जा सकता है । यदि निर्धारण समय बदल गया है, sonication चक्र की संख्या भी समायोजित किया जाना चाहिए । इसके अलावा, ३७ डिग्री सेल्सियस तापमान crosslinking दक्षता कमरे के तापमान पर crosslinking की तुलना में बढ़ जाती है । निर्धारण के तापमान empirically अनुकूलित किया जा सकता है । - के लिए निर्धारण की प्रतिक्रिया को रोकने के लिए, जोड़ें १.२५ एम glycine (4 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व ठंडा) ०.१२५ मीटर की एकाग्रता के लिए 8 rpm को कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए एक रोटेटर का उपयोग कर में ट्यूब पलटना । कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए ३०० x g पर नमूना केंद्रापसारक और मीडिया महाप्राण ।
- पूर्व ठंडा पंजाब (4 डिग्री सेल्सियस) के साथ सेल गोली धो, कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए ३०० x g पर नमूना केंद्रापसारक, और महाप्राण पंजाबियों । फिर से पंजाबियों के साथ कोशिकाओं को धो लें । अगले, aliquot 15 × 106 कोशिकाओं प्रति 15 मिलीलीटर ट्यूब ।
- 1 मिनट के लिए यह तरल नाइट्रोजन में रखने से सेल गोली फ्रीज, 5 मिनट के लिए सूखी बर्फ पर, या तुरंत जगह पर-८० ° c ।
नोट: बहाव प्रयोगों में गुणवत्ता में कमी के बिना फिक्स्ड ES सेल छर्रों अप करने के लिए 6 महीने के लिए संग्रहीत किया जा सकता है.
3. चिप और CARIP के लिए क्रोमेटिन sonication
- गल बर्फ पर तय ES सेल गोली । सेल गोली sonication बफ़र (२.५ एमएल) में पुन: निलंबित । प्रतिलेखन कारकों या epigenetic नियामकों (प्रोटीन कारकों) के लिए, 1x ते, 1mM PMSF, 1x proteinase अवरोधक कॉकटेल में फिर से गोली निलंबित । हिस्टोन संशोधनों के लिए, पुन: 1x में गोली निलंबित, ०.१% एसडीएस, 1mM PMSF, 1x proteinase अवरोध करनेवाला ।
नोट: एसडीएस के अलावा sonication दक्षता को बढ़ाता है, यह कुछ क्रोमेटिन घटक या प्रतिलेखन कारकों का मूल्यांकन करने के लिए फायदेमंद नहीं हो सकता है । - क्रोमेटिन immunoprecipitation (चिप) के लिए, 14-18 चक्र के साथ sonicate क्रोमेटिन (30 एस पर, 30 एस आराम) ४०% आयाम पर । क्रोमेटिन-एसोसिएटेड आरएनए immunoprecipitation (CARIP) के लिए, sonication चक्र (8-10 चक्र) की संख्या कम करें । सेलुलर, निर्धारण, और sonifier परिवर्तनशीलता के कारण, sonication के लिए शर्तों empirically निर्धारित किया जाना चाहिए ।
- sonication बफ़र के साथ 28 µ l के लिए 10% एसडीएस के प्रोटीन-कारक, 28 µ l के सोडियम-deoxycholate, और ०.२८ मिलीलीटर की 10% ट्राइटन-X100, और अच्छी तरह से मिश्रण ।
नोट: इन घटकों के अतिरिक्त sonication बफ़र के लिए RIPA बफ़र जनरेट करता है । - क्रोमेटिन के पूर्व स्पष्ट करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए १०,००० x g पर नमूना केंद्रापसारक । supernatant को एक फ्रेश ट्यूब पर ले जाएं और क्रोमेटिन immunoprecipitation के साथ आगे बढ़ें ।
- वैकल्पिक रूप से, sonicated क्रोमेटिन पर संग्रहीत किया जा सकता-८० ° c उपयोग तक । हालांकि, sonicated क्रोमेटिन पर-८० ° c का भंडारण प्रोटीन कारक चिप के लिए कम गुणवत्ता के लिए नेतृत्व कर सकते हैं ।
4. चिप और CARIP प्रक्रिया
- एक १.५ मिलीलीटर, कम बाध्यकारी ट्यूब करने के लिए प्रोटीन ए या जी चुंबकीय मोती के ४० µ एल जोड़ें । मोतियों को धोने के लिए पंजाब के ६०० µ एल जोड़ें । एक चुंबक युक्त रैक पर ट्यूब प्लेस, कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए ट्यूब मशीन, पंजाबियों को हटाने, और फिर से निलंबित १०० µ में चुंबकीय मोती पंजाबियों के एल ।
- चुंबकीय मोतियों के साथ ट्यूब करने के लिए एंटीबॉडी के 2-4 µ जी जोड़ें । मशीन और 8 rpm पर ४० मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ट्यूब घुमाने के लिए एक रोटेटर का उपयोग कर चुंबकीय मोतियों के लिए बाध्यकारी एंटीबॉडी की सुविधा । चुंबकीय रैक पर ट्यूब डालें, यह कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए मशीन, तो पंजाबियों को हटा दें ।
- चुंबकीय मोतियों को धोने के लिए पंजाब के २०० µ एल जोड़ें । पंजाबियों के साथ धुलाई मुक्त IgGs को दूर करने के लिए किया जाता है । मशीन और धो चरणों के बीच 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ट्यूब घुमाएं । चुंबक के लिए ट्यूब देते हैं और पंजाबियों को हटा दें ।
- Immunoprecipitate क्रोमेटिन-sonicated क्रोमेटिन उद्धरण (4 × 106 चिप प्रति कोशिकाओं), चुंबकीय मोतियों के साथ और 4 डिग्री सेल्सियस (रातोंरात) पर नमूना घुमाने के द्वारा मशीन से बंधे प्रोटीन ।
- चुंबकीय मोतियों को धो लें । निम्नलिखित बफ़र्स के साथ कमरे के तापमान पर नमूना मशीन और प्रत्येक बफर के साथ 10 मिनट के लिए नमूना घुमाएँ: RIPA बफर की 1 मिलीलीटर के साथ दो बार (ते (10 मिमी Tric-एचसीएल, 1 मिमी EDTA) पीएच ८.०, 1% ट्राइटन एक्स-१००, ०.१% सोडियम deocycholate, ०.१% एसडीएस), दो बार RIPA बफर सी की 1 मिलीलीटर के साथ ontaining ०.३ मीटर NaCl, दो बार LiCl बफर की 1 मिलीलीटर (०.५% सोडियम deocycholate, ०.५% NP40, ०.२५ एम LiCl) के साथ, एक बार ०.२% ट्राइटन X-१०० के साथ ते बफर के 1 मिलीलीटर के साथ, और एक बार के साथ 1 मिलीलीटर ।
- डी-चिप के लिए crosslinking । पुन: निलंबित करने के लिए चुंबकीय मोतियों की १०० µ l ते में. proteinase K (20 mg/एमएल) के 10% एसडीएस और 5 µ l के 3 µ l को जोड़ें । ६५ डिग्री सेल्सियस (रातोंरात) पर नमूना मशीन ।
नोट: यह parafilm या प्लास्टिक लपेटो के साथ इस कदम के दौरान ट्यूबों को कवर करने के लिए वाष्पीकरण को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है ।- अगले दिन, ट्यूब कई बार पलटना मिश्रण करने के लिए । अगले, चुंबक रैक का उपयोग करने के लिए एक ताजा ट्यूब supernatant हस्तांतरण । चुंबकीय मोतियों को धोने के लिए, ०.५ मीटर NaCl युक्त ते के १०० µ एल जोड़ें, और बाद में दो supernatants गठबंधन ।
- डे-crosslinking for CARIP. पुन: निलंबित करने के लिए चुंबकीय मोतियों की १०० µ l ते में. proteinase K (20 mg/एमएल) के 10% एसडीएस और 5 µ l के 3 µ l को जोड़ें । 4 से 12 घंटे के लिए ६५ ° c पर नमूना मशीन ६५ डिग्री सेल्सियस पर समय के लिए empirically की जरूरत है कोशिका प्रकार, sonication और निर्धारण की स्थिति, आदि के बीच परिवर्तनशीलता के कारण निर्धारित किया जाना चाहिए ।
- ट्यूब पलटना 3-5 बार मिश्रण करने के लिए, चुंबकीय रैक के लिए ट्यूब लागू करते हैं, और बाद में एक ताजा ट्यूब के लिए supernatant कदम ।
- चुंबकीय मोतियों को धोने के लिए, ०.५ मीटर NaCl युक्त ते के १०० µ एल जोड़ें, और बाद में दो supernatants गठबंधन ।
नोट: डी-crosslinking कदम के दौरान डीएनए या आरएनए की हानि को रोकने के लिए nuclease-फ्री रिएजेंट (उदा., ते बफर, एसडीएस, आदि) का उपयोग करना ज़रूरी है ।
- निकालें डीएनए/आरएनए का उपयोग २०० µ l of phenol: क्लोरोफॉर्म: isoamyl अल्कोहल (PCI) (25:24:1, v/
नोट: आरएनए भी निर्माता के निर्देशों का उपयोग कर वाणिज्यिक किट का उपयोग कर निकाला जा सकता है । 30 एस के लिए शेक, 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर १०,००० x g पर स्पिन, और एक ताजा ट्यूब के लिए कदम supernatant ।- डीएनए/आरएनए को हाला, GlycoBlue के 2 µ l को जोड़ने के लिए, 3 एम सोडियम एसीटेट के 20 µ l और इथेनॉल के ६०० µ l को जोड़ें । पलटने से मिश्रण ~ 5-8 बार, और सूखी बर्फ या पर-८० डिग्री सेल्सियस पर नमूना कम से 1-2 एच के लिए जगह है ।
- एक प्रशीतित (4 डिग्री सेल्सियस) तालिका शीर्ष केंद्रापसारक का उपयोग 30 मिनट के लिए १०,००० x g पर नमूना केंद्रापसारक । एयर गोली < 1 मिनट के लिए सूखी और EB बफर (10 मिमी Tris-HCl) के ४० µ एल में इसे फिर से निलंबित । चिप-Seq लाइब्रेरी तैयारी के लिए, चरण 6 पर जारी रखें ।
- DNase का उपयोग क्रोमेटिन से संबद्ध आरएनए आईपी नमूनों से डीएनए निकालें. CARIP नमूना में 1x एकाग्रता के लिए 10x DNase बफर जोड़ें । आरएनए के 10 µ g तक के लिए DNase के 1 µ l को जोड़ें (५० µ l reaction). 30 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर नमूना मशीन PCI के साथ आरएनए नमूना निकालें. nuclease-फ्री एच2ओ में पुनर्स्थगित ।
5. CARIP-Seq के लिए दोहरे कतरा सीडीएनए संश्लेषण
- प्रथम किनारा सीडीएनए का संश्लेषण. रिवर्स-प्रतिलेखन प्रतिक्रिया के लिए, एक पीसीआर मशीन के लिए तैयार ट्यूब में निम्नलिखित प्रतिक्रिया की स्थापना: १०.५ आरएनए के µ एल और 1 µ l hexamer प्राइमरों के यादृच्छिक (3 µ g/µ l).
- ६५ डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब मशीन माध्यमिक संरचना स्वभाव के लिए 5 मिनट के लिए, और यह 2 मिनट के लिए बर्फ पर स्टोर । मिश्रण निंनलिखित घटक: 4 µ पहले किनारा बफर के एल, 2 µ एल के ०.१ एम डीटीटी, 1 µ एल के dNTP, और ०.५ बाहर RNase । अगला, पीसीआर ट्यूब करने के लिए, मास्टर मिश्रण के ७.५ µ एल जोड़ें. 25 डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए ट्यूब मशीन । सुपरस्क्रिप्ट II के 1 µ l को जोड़ें (२०० U/µ l) और पालन के रूप में मशीन: 10 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस, ४२ डिग्री सेल्सियस के लिए ५० मिनट, ७० ° c 15 मिनट के लिए, और 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़.
- दूसरा-किनारा सीडीएनए संश्लेषण. ट्यूब को बर्फ पर लगाएं । अगला, क्रम में निंन घटक जोड़ें: ९१ µ l के diethyl pyrocarbonate (DEPC) का इलाज पानी, 5x के 30 µ एल दूसरी किनारा प्रतिक्रिया बफर, 3 µ एल के dNTP मिश्रण (10 मिमी), 1 µ एल के ई. कोलाई डीएनए ligase (10 यू/µ एल), 4 µ एल के ई. कोलाई डीएनए पोलीमरेज़ (10U/µ एल) , और 1 µ एल के ई. कोलाई RNase ज (2U/µ एल) । धीरे भंवर और 2 एच के लिए 16 डिग्री सेल्सियस पर गर्मी से मिश्रण
नोट: झटका या ट्यूब औंधा द्वारा मिश्रण अच्छी तरह से रिएजेंट मिश्रण करने के लिए पर्याप्त नहीं हो सकता है. - टी-4 डीएनए पोलीमरेज़ के 2 µ एल जोड़ें और 5 मिनट के लिए 16 ° c पर मशीन. शुद्ध सीडीएनए (डबल कतरा, dscDNA) पीसीआर शोधन किट का प्रयोग । Elute ने dscDNA के ४० µ l में EB बफर की.
- टुकड़ा डबल-कतरा सीडीएनए । कतरनी सीडीएनए (dscDNA) एक पानी के स्नान sonifier और एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब का उपयोग कर 250-500 bp. Sonication dscDNA के आकार को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है पूरे आरएनए प्रतिलिपि के अनुक्रमण की सुविधा के लिए टुकड़ा आकार ।
- जब एक पानी स्नान sonifier के एक मानक मॉडल का उपयोग कर, sonicate 3 × 10 मिनट, या 4 × 10 मिनट के लिए नमूना है ।
नोट: कुल आरएनए के 1 µ g के लिए तीन चक्रों का उपयोग किया जाना चाहिए, जबकि कुल आरएनए के 1-5 µ g के लिए चार चक्र अनुशंसित किए जाते हैं. प्रत्येक sonication चक्र के बाद संक्षेप में ट्यूब केंद्रापसारक, और ताजा बर्फ जोड़कर एक शांत पानी स्नान को बनाए रखने । - एक पिको sonifier का उपयोग करते समय, यह कुल आरएनए के 1-5 µ जी के लिए छह चक्र का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है और निम्नलिखित साइकिल चालन की स्थिति (30 एस पर, ९० s बंद). 2-3 sonication के चक्र के बाद संक्षेप में ट्यूब केंद्रापसारक । sonication की दक्षता एक agarose जेल (2%) पर कतरनी dscDNA (3-4 µ एल) का एक अंश लदान द्वारा निर्धारित किया जा सकता है । यह sonifiers के बीच परिवर्तनशीलता के कारण परीक्षण sonication शर्तों empirically करने के लिए महत्वपूर्ण है ।
- अगली पीढ़ी के sequencing के लिए चरण 6 में वर्णित के रूप में लायब्रेरी तैयारी निष्पादित करें ।
6. चिप-Seq और CARIP-Seq पुस्तकालय निर्माण
- डीएनए की मरंमत समाप्त होता है एक डीएनए अंत मरंमत किट का उपयोग कर । इस किट के लिए कुंद-समाप्त डीएनए उत्पंन किया जाता है । इस प्रतिक्रिया के लिए, एक १.५ मिलीलीटर में निम्न सेट करें, कम बाइंडिंग ट्यूब: ३४ डीएनए के µ एल, २.५ मिमी dNPTs के 5 µ एल, 10 मिमी एटीपी के 5 µ एल, 10x अंत मरम्मत बफर के 5 µ एल (5 मिमी डीटीटी, १०० मिमी मैग्नीशियम एसीटेट, ६६० मिमी पोटेशियम एसीटेट , ३०० मिमी Tris-एसीटेट, पीएच ७.८), और अंत की मरंमत एंजाइम मिश्रण (टी-4 polynucleotide कळेनासे, टी-4 डीएनए पोलीमरेज़) के 1 µ एल ।
- कमरे के तापमान पर ४५ मिनट के लिए नमूना मशीन ।
- एक प्रतिक्रिया सफाई किट का उपयोग डीएनए शुद्ध । Elute अंत की मरंमत डीएनए ३२ µ एल में पूर्व गर्म (६५ डिग्री सेल्सियस) EB बफर । जब तक हम आमतौर पर निंनलिखित चिप, या आरएनए निंनलिखित CARIP, पुस्तकालय की तैयारी से पहले डीएनए की एकाग्रता quantitate नहीं है, यह चिप डीएनए या CARIP आरएनए के कम से 5-10 एनजी के साथ शुरू करने के लिए सिफारिश की है ।
- एक के अलावा 3 ' "एक" समाप्त करने के लिए डीएनए की मरंमत बदस्तूर । एक १.५ मिलीलीटर, कम बाध्यकारी ट्यूब के लिए घटक जोड़ें: ऊपर से DNA के 30 µ l, 5 µ l की 10x नेब बफर 2, 1 µ l के dATP से 10 एमएम स्टॉक, 11 µ l के H2हे, और 3 µ l के 5 U/µ l Klenow अंश (3 '-5 ' Exo-) , और pipetting द्वारा धीरे से मिश्रण ।
- ३७ डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए नमूना मशीन ।
- डीएनए को शुद्ध करने के लिए एक रिएक्शन क्लीनअप किट का प्रयोग करें । Elute डीएनए के 25 µ एल में पूर्व गर्म (६५ डिग्री सेल्सियस) EB बफर ।
- Ligate एडेप्टर । बर्फ पर निंनलिखित घटक जोड़ें: उपरोक्त से डीएनए के 23 µ एल, 10x टी-4 डीएनए ligase बफर के 3 µ एल, annealed पीई या मल्टीप्लेक्सिंग अनुकूलक के 1 µ एल (४ µ मीटर), और टी-20 µ एल के 3 l ' डीएनए ligase (४०० यू/µ एल), और धीरे से pipetting द्वारा मिश्रण.
नोट: एडाप्टर अनुक्रम भी एक वाणिज्यिक स्रोत से प्राप्त किया जा सकता है ।
Oligonucleotide जुगाड़:
पीई एडेप्टर
5 ' पी-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAGGAATGCCGAG
5 ' ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
division एडेप्टर्स
5 ' पी-GATCGGAAGAGCACACGTCT
5 ' ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT - कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए नमूना मशीन ।
- एक पूर्व-कास्ट (2%) agarose जेल का उपयोग डीएनए का आकार चयन प्रदर्शन । 10 मिनट के लिए जेल चलाते हैं ।
- आबकारी क्षेत्र को इसी से 250-450 बीपी.
नोट: २०० बीपी के ऊपर के ऊपर जेल काटने से unligated एडेप्टर dimers से प्रदूषित होने की संभावना घटी है । पीसीआर स्टेप से पहले किसी भी unligated एडेप्टर को हटाना जरूरी है । - डीएनए को शुद्ध करने के लिए एक जेल निष्कर्षण किट का प्रयोग करें । EB बफर के 20 µ l में Elute ।
- ligated डीएनए नमूनों के लिए पीसीआर और लाइब्रेरी शुद्धि-युग्मित-end (PE) एडेप्टर । एक पीसीआर ट्यूब में घटक जोड़ें: 12 µ एल के ५०% से ऊपर से डीएनए की, 12 µ एल ऑफ वाटर, 25 µ एल ऑफ मास्टर मिक्स (Phusion HF), पीई पीसीआर प्राइमरी की 1 µ एल १.०, और पीई पीसीआर प्राइमरी की 1 µ एल २.० ।
नोट: Oligonucleotide अनुक्रम भी एक वाणिज्यिक स्रोत से प्राप्त किया जा सकता है ।
Oligonucleotide जुगाड़:
पे पीसीआर प्राइमरी १.०
5 ' AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
पे पीसीआर प्राइमरी २.०
5 ' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT - सूचकांक पीई एडेप्टर युक्त ligated नमूनों के लिए पीसीआर और पुस्तकालय शुद्धिकरण । घटक जोड़ें: 12 ऊपर से डीएनए के ५०% के µ एल, 12 µ l पानी की, 1 µ l की पीसीआर प्राइमरी InPE १.० (पतला 1:2), पीसीआर प्राइमरी InPE २.० की 1 µ एल (पतला 1:2), और 1 µ एल की पीसीआर प्राइमरी इंडेक्स (पतला 1:2).
नोट: oligonucleotide अनुक्रम भी एक वाणिज्यिक स्रोत से प्राप्त किया जा सकता है ।
Oligonucleotide जुगाड़:
मल्टीप्लेक्स की पीसीआर प्राइमरी १.०
5 ' AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
मल्टीप्लेक्स की पीसीआर प्राइमरी २.०
5 ' GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
पीसीआर प्राइमरी इंडेक्स का जुगाड़ 1-12
पीसीआर प्राइमर, सूचकांक 1
5 ' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTC
पीसीआर प्राइमर, 2 सूचकांक
5 ' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTC
पीसीआर प्राइमर, सूचकांक 3
5 ' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTC
पीसीआर प्राइमर, इंडेक्स 4
5 ' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTC
पीसीआर प्राइमर, इंडेक्स 5
5 ' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTC
पीसीआर प्राइमर, 6 सूचकांक
5 ' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTC
पीसीआर प्राइमर, 7 सूचकांक
5 ' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGATCTGGTGACTGGAGTTC
पीसीआर प्राइमरी, इंडेक्स 8
5 ' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCAAGTGTGACTGGAGTTC
पीसीआर प्राइमर, इंडेक्स 9
5 ' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCGTGACTGGAGTTC
पीसीआर प्राइमर, 10 सूचकांक
5 ' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCTAGTGACTGGAGTTC
पीसीआर प्राइमर, 11 सूचकांक
5 ' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGCCGTGACTGGAGTTC
पीसीआर प्राइमर, सूचकांक 12
5 ' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACAAGGTGACTGGAGTTC - निंनलिखित शर्तों का उपयोग कर पीसीआर सायक्लिंग प्रदर्शन (30 एस के लिए ९८ डिग्री सेल्सियस पर प्रकृति, 10 एस के 18 चक्रों में ९८ डिग्री सेल्सियस, 30 एस में 65 ° c, 30 एस पर ७२ ° c, 5 मिनट में ७२ ° c, 4 ° c पर पकड़ो) ।
नोट: पीसीआर साइकिल की संख्या empirically निर्धारित की जानी चाहिए । - पीसीआर उत्पादों के आकार का चयन । एक पूर्व कास्ट ई जेल पूर्व पर डीएनए भागो (2%) या घर का बना 2% जेल (agarose) और ३००-५०० बीपी क्षेत्र के उत्पाद ।
- जेल से डीएनए को शुद्ध करने के लिए एक जेल निष्कर्षण किट का प्रयोग करें । EB बफर के 20 µ एल में Elute अंतिम पीसीआर उत्पाद ।
- पुस्तकालय की एकाग्रता को मापने के लिए एक fluorometer का प्रयोग करें । अगली पीढ़ी के अनुक्रमण करते हैं ।
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Representative Results
हम सफलतापूर्वक H3K4me3, H3K4me2, और ES कोशिकाओं में KDM5B के जीनोम व्यापक बाध्यकारी इस चिप-Seq प्रोटोकॉल6का उपयोग कर पूछताछ की । ES कक्षों को फीडर-फ़्री शर्तों (चित्र 1) में कल्चरित किया गया था, और ऊपर बताए गए के रूप में क्रॉस-लिंक्ड । Sonication ने बाद में चिप-Seq प्रोटोकॉल के चरण ३.२ में वर्णित के रूप में किया गया था, और 2% agarose जेल (चित्र 2) पर डीएनए चलाकर मूल्यांकित । अगला, चिप चरण 4 में वर्णित के रूप में किया गया था और चरण 6 में वर्णित के रूप में लायब्रेरी की तैयारी की गई । चिप-Seq लाइब्रेरी को अगली पीढ़ी के sequencing प्लेटफ़ॉर्म पर अनुक्रम किया गया था । प्रतिनिधि कस्टम UCSC ब्राउज़र दर्शाव कोर pluripotency जीन POU5F1 (चित्रा 3) पर H3K4me3, H3K4me2, और KDM5B के संवर्धन का पता चलता है, और HOXC क्लस्टर पर (चित्र बी) । CARIP-Seq भी चरणों 4-6 में वर्णित के रूप में प्रोटोकॉल का पालन करके किया गया था । एक प्रतिनिधि UCSC ब्राउज़र दृश्य H4K20me3-एसोसिएटेड आरएनए (CARIP-Seq) और H4K20me3 अधिभोग (चिप-Seq) ES कोशिकाओं में एक loci (चित्रा 4) में से समृद्धता से पता चलता है । CARIP-Seq संकेत दर्शाता है कि आरएनए H4K20me3 के साथ जुड़ा हुआ है, यह जरूरी संकेत नहीं है कि यह दिखाया लोकस के साथ बातचीत करता है. CARIP-Seq datasets चिप-Seq डेटासेट के रूप में एक समान तरीके से विश्लेषण किया जा सकता है । माउस ES cell CARIP-Seq और चिप-Seq प्रयोगों से उत्पन्न डेटा दोनों को mm1021का उपयोग करके एक संदर्भ जीनोम (उदा., mm9, bowtie2) से संरेखित किया जा सकता है । चिप-Seq और CARIP-Seq समृद्ध क्षेत्रों दोनों ऐसे "के रूप में चिप समृद्ध क्षेत्रों की पहचान के लिए स्थानिक clustering" (SICER)22 या एमएसीएस23,24के रूप में बुला कार्यक्रम का उपयोग कर पहचाना जा सकता है । CARIP-Seq डेटासेट की संभावना व्यापक चोटियों शामिल हैं, क्योंकि यह व्यापक और तेज चोटियों की पहचान कर सकते हैं कि एक एल्गोरिथ्म का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है । इस पांडुलिपि में वर्णित प्रोटोकॉल ES कोशिकाओं का उपयोग चिप-Seq और CARIP-Seq प्रदर्शन के लिए अनुकूलित किया गया है, जबकि इन प्रोटोकॉल भी अन्य सेल प्रकार में प्रोटीन डीएनए और क्रोमेटिन-जुड़े आरएनए बातचीत के मूल्यांकन के लिए उपयुक्त होना चाहिए.
चित्रा 1: फीडर-ES कोशिकाओं की मुक्त संस्कृति. (क) प्रायोगिक डिजाइन । (ख) es सेल मीडिया में iMEFs पर कल्चरित लिफ युक्त, या फीडर से मुक्त शर्तों के साथ es सेल मीडिया लिफ युक्त और (ग) GSK3i या (घ) GSK3i और MEKi (2i) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्र 2: Sonication के crosslinked ES कक्ष क्रोमेटिन. Crosslinked ES कोशिकाओं sonicated 18 चक्रों के लिए एक microtip के साथ एक sonifier का उपयोग कर रहे थे (४०% आयाम, 30 एस पर, और 30 एस आराम) । Crosslinking उलट था, और RNase पाचन बाद में आरएनए को हटाने के लिए किया गया था । डीएनए PCI का उपयोग कर शुद्ध किया गया था और एक agarose जेल पर चलाने (2%) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3: प्रतिनिधि चिप-एक हिस्टोन संशोधित करने एंजाइम और ES कोशिकाओं में हिस्टोन संशोधनों के Seq विश्लेषण । कस्टम UCSC ब्राउज़र H3K4me3, H3K4me2, और KDM5B के pluripotency-नियामक (A) POU5F1 और (B) ES कोशिकाओं में HOXC क्लस्टर (सामान्यीकृत टैग घनत्व (RPBM), प्रति दस लाख पढ़ता प्रति आधार पढ़ें) । नोट KDM5B बाइंडिंग और H3K4me3/2 अधिभोग के बीच ओवरलैप । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 4: एक हिस्टोन संशोधन और ES कोशिकाओं में चिप Seq के साथ जुड़े आरएनए के प्रतिनिधि CARIP-Seq विश्लेषण. ES कोशिकाओं में H4K20me3 CARIP-Seq और H4K20me3 चिप-Seq संकेतों के UCSC ब्राउज़र विचार (सामान्यीकृत टैग घनत्व (RPBM), प्रति दस लाख पढ़ता प्रति आधार पढ़ें) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
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Discussion
चिप Seq वैश्विक प्रोटीन के स्थान का मूल्यांकन करने के लिए एक उपयोगी तरीका है डीएनए बातचीत (उदा, प्रतिलेखन कारकों/ES कोशिकाओं में एंजाइमों/हिस्टोन संशोधनों और डीएनए को संशोधित हिस्टोन), जबकि नव विकसित CARIP-Seq प्रोटोकॉल में उपयोगी है क्रोमेटिन घटकों के साथ RNAs के जीनोम चौड़ा एसोसिएशन पूछताछ । चिप Seq ES कोशिकाओं और अन्य सेल प्रकार के epigenetic परिदृश्य का मूल्यांकन करने के लिए प्रयोग किया जाता है कि एक मौलिक उपकरण है. चिप-Seq और CARIP-Seq पुस्तकालयों की गुणवत्ता काफी हद तक चिप ग्रेड एंटीबॉडी पर निर्भर है । चिप-Seq के लिए एंटीबॉडी की उपयुक्तता चिप-पीसीआर प्रदर्शन द्वारा निर्धारित empirically किया जा सकता है, जहां खाली क्षेत्रों के सापेक्ष सकारात्मक नियंत्रण क्षेत्रों में एक ≥ 3 से 5 गुना संवर्धन उच्च गुणवत्ता वाले चिप-Seq डेटा25उत्पन्न करने के लिए पर्याप्त होना चाहिए । इसी तरह, एंटीबॉडी CARIP के लिए उनकी उपयुक्तता के लिए परीक्षण किया जा सकता-Seq एक समान तरीके से चिप के लिए वर्णित के रूप में मामूली संशोधनों के साथ Seq. ऊपर विधियां अनुभाग में वर्णित के रूप में CARIP प्रोटोकॉल में आरएनए आईपी कदम के बाद, रिवर्स-प्रतिलेखन पीसीआर सीडीएनए उत्पन्न करने के लिए किया जाना चाहिए, जो क्यू आरटी-पीसीआर प्रदर्शन करने के लिए एक टेम्पलेट के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. यह कई जीनोमिक क्षेत्रों में चिप या CARIP निंनलिखित संवर्धन का मूल्यांकन करने के लिए सिफारिश की है । वहां अतिरिक्त विचार करने के लिए परीक्षण जब चिप या CARIP के लिए एंटीबॉडी की गुणवत्ता का मूल्यांकन कर रहे हैं । उदाहरण के लिए, stringency चिप और CARIP के लिए इस्तेमाल किया बफ़र्स NaCl की एकाग्रता में फेरबदल द्वारा अनुकूलित किया जा सकता है: एक कम NaCl एकाग्रता अत्यधिक विशिष्ट एंटीबॉडी के लिए उपयुक्त है, जबकि एक उच्च NaCl एकाग्रता के साथ एंटीबॉडी के लिए उपयोगी हो सकता है गैर-विशिष्ट बाइंडिंग । अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के लिए पुस्तकालय की तैयारी के बारे में, कस्टम प्राइमरों और अनुक्रमित भी व्यावसायिक रूप से अधिग्रहीत oligonucleotides के एवज में इस्तेमाल किया जा सकता है । हालांकि, यह ध्यान दें कि 3 ' अंत में दो कुर्सियां के बीच एक phosphorothioate संशोधन सहित महत्वपूर्ण है nuclease पाचन को रोकने के लिए दिखाया गया है26। तृतीय-पक्ष आरएनए-Seq या चिप-Seq पुस्तकालय निर्माण किट भी क्रमशः CARIP और चिप नमूनों के अनुक्रमण के लिए पुस्तकालयों उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । हालांकि, यह empirically परीक्षण किट अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के लिए गुणवत्ता पुस्तकालयों पैदा करने में उनके प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए महत्वपूर्ण है । अतिरिक्त प्रोटोकॉल भी चिप-Seq पुस्तकालय की तैयारी, जैसे ChIPmentation27प्रदर्शन करने के लिए नियोजित किया जा सकता है । हालांकि, चिप के लिए ChIPmentation के अनुकूलन-Seq प्रोटोकॉल यहां वर्णित अतिरिक्त संशोधनों और आगे अनुकूलन की आवश्यकता होगी ।
यहां, हम चिप और CARIP प्रोटोकॉल है कि कोशिकाओं की मध्यम संख्या (4 × आईपी प्रति 106 कोशिकाओं का उपयोग कर अनुकूलित किया गया है का वर्णन) । जबकि चिप प्रोटोकॉल मध्यवर्ती सेल संख्या (105 से 106 कोशिकाओं) के लिए कम का उपयोग कर प्रदर्शन किया जा सकता है, हम CARIP प्रदर्शन नहीं किया है-Seq से कम 2 × 106 कोशिकाओं का उपयोग कर । हालांकि, विभिन्न निर्धारण और sonication शर्तों का परीक्षण empirically द्वारा, यह संभव है कि इस प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक कक्षों की एक छोटी संख्या का उपयोग कर काम कर सकते हैं ।
सारांश में, चिप-Seq और CARIP-Seq क्रमशः ES कोशिकाओं में क्रोमेटिन-जुड़े प्रोटीन और RNAs के वैश्विक नक्शे पैदा करने के लिए उपयोगी होते हैं । इन प्रोटोकॉल ES कोशिकाओं के लिए अनुकूलित किया गया है, वे स्तनधारी सेल लाइनों और ऊतक प्रकार की एक विस्तृत विविधता का उपयोग क्रोमेटिन नक्शे उत्पन्न करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । इन प्रोटोकॉल भी एकल-सेल चिप Seq या CARIP-Seq पुस्तकालयों उत्पंन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।
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Disclosures
लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं की ।
Acknowledgments
यह काम वेन राज्य विश्वविद्यालय, Karmanos कैंसर संस्थान, राष्ट्रीय हार्ट, फेफड़े और रक्त संस्थान (1K22HL126842-01A1) से अनुदान का समर्थन किया गया था B.L.K. को संमानित किया इस काम की गणना संसाधनों के लिए वेन राज्य विश्वविद्यालय उच्च प्रदर्शन कंप्यूटिंग ग्रिड का उपयोग (< https://www.grid.wayne.edu/>) । CARIP-Seq डाटा एनालिसिस के साथ सहायता के लिए हम जीजी कुरुप को धन्यवाद देते हैं ।
लेखकों का योगदान:
B.L.K. CARIP-Seq विधि की कल्पना, डिजाइन और चिप Seq और CARIP-Seq प्रयोगों से बाहर किया, अनुक्रमण डेटा का विश्लेषण, और पांडुलिपि का मसौदा तैयार । सभी लेखकों को पढ़ा है और इस पांडुलिपि के अंतिम संस्करण को मंजूरी दे दी है ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse leukemia inhibitory factor (ESGRO LIF) | EMD Millipore | 106 or 107 units | |
| GSK3β inhibitor CHIR99021 (GSK3i) | Stemgent | Solvent: DMSO 10mM | |
| MEK inhibitor PD0325901 (MEKi) | Stemgent | Solvent: DMSO 10mM | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose | Invitrogen | 11965092 | |
| PBS (phosphate buffered saline) | Invitrogen | 10010031 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| 2-Mercaptoethanol (50 mM) | Gibco | 31350010 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140076 | |
| EmbryoMax ES Cell Qualified Fetal Bovine Serum, 500 ml | EMD Millipore | ES-009-B | |
| EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | EMD Millipore | ES-006-B | |
| Glycine | Sigma | G7126-500G | 1.25 M stock conentration in water |
| Formaldehyde solution | Sigma | F8775-500ML | |
| TE (Tris EDTA) pH 8.0 1X | Quality Biological | 351-011-131 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) solution | Sigma | 93482-250ML-F | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697498001 | |
| Sodium dodecyl sulfate solution (20%) | Quality Biological | A611-0837-10 | |
| Q125 sonifier | Qsonica | 4422 | |
| Triton X-100 solution | Sigma | 93443-100ML | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation | Invitrogen | 10004D | |
| Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation | Invitrogen | 10002D | |
| Dynabeads Protein A/Protein G and Magnet Starter Pack | Invitrogen | 10015D | |
| Lithium chloride | Sigma | L4408 | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma | I8896 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Dynabeads mRNA Purification Kit (for mRNA purification from total RNA preps) | Invitrogen | 61006 | |
| SuperScript Double-Stranded cDNA Synthesis Kit | Invitrogen | 11917010 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| End-It DNA End-Repair Kit | Lucigen | ER81050 | |
| Klenow Fragment (3'→5' exo-) | NEB | M0212L | |
| dATP (10 mM) | Invitrogen | 18252015 | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202L | |
| TrackIt 1 Kb Plus DNA Ladder | Invitrogen | 10488085 | |
| E-gel EX agarose gels, 2% | Invitrogen | G402002 | |
| Phusion high-fidelity 2X master mix with HF buffer | Thermo Fisher | F531LPM | |
| ChIPAb+ Trimethyl-Histone H3 (Lys4) - ChIP Validated Antibody | EMD Millipore | 17-614 | |
| Anti-Histone H3 (di methyl K4) antibody [Y47] - ChIP Grade (ab32356) | Abcam | ab32356 | |
| Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-well) | Fisher | 720083 | |
| Falcon Standard Tissue Culture Dishes (10cm) | Fisher | 08772E | |
| Bioruptor pico | Diagenode | B01010001 | |
| Qubit Flurometer 2.0 | Thermo Fisher | ||
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32851 | |
| MinElute Reaction Cleanup Kit | Qiagen | 28204 | |
| MinElute Gel Extraction Kit | Qiagen | 28604 | |
| Anti-Histone H4 (tri methyl K20) antibody - ChIP Grade (ab9053) | Abcam | ab9053 | |
| Labquake rotator | Thermo Fisher | 400110Q | |
| Illumina HiSeq platform | Illumina | ||
| TURBO DNase | Invitrogen | AM2238 |
References
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