Summary
ここでは、チップ Seq を実行する方法について記述して ES 細胞の CARIP-Seq、次世代シーケンシング ライブラリ準備も含めて世界的なエピゲノムとクロマチン関連 RNA を生成するマップします。
Abstract
胚性幹 (ES) 細胞の自己複製と分化は細胞外シグナルと転写因子やエピジェネティックなレギュレータ叙述遺伝子に影響を及ぼすヒストンの翻訳後修飾の組み込みネットワークによって支配されます。近くの遺伝子の発現状態。RNA は、クロマチン動態と遺伝子発現を調節する様々 な蛋白質と相互作用を示されています。クロマチン関連 RNA 法 (CARIP) を次世代シーケンサー (CARIP-Seq) 続いて、次世代シーケンス (続いてクロマチン免疫沈降中のクロマチン蛋白質に関連付けられている Rna を調査する手法ChIP-Seq) ES 細胞におけるグローバル規模でのエピジェネティックな修飾子、転写因子、ヒストン翻訳後修飾の場所をマップする強力なゲノミクス手法です。ここでは、我々 は CARIP Seq とチップ Seq、次世代シーケンス、図書館建設を含む ES 細胞におけるグローバル クロマチン関連 RNA とエピゲノムのマップを生成するを実行する方法を説明します。
Introduction
胚性幹 (ES) 細胞の運命決定は、細胞外のシグナルと転写制御因子、ヒストン修飾子、およびヒストンの尾の翻訳後修飾を含むホスト間の通信によって規制されています。これらの相互作用を容易にして 2 つの状態のいずれかにクロマチンの包装: オープンと転写活性状態にあるユークロマチンと異質染色質、コンパクトで一般に transcriptionally であります。トランスクリプション要因 DNA シーケンス固有結合親和性と遺伝子発現の制御に参加するユークロマチン領域のエピジェネティックな修飾子准。チップ Seq1, を含む次世代シーケンシング方法は ES 細胞の自己複製と多能性2,3,4 の基礎ゲノムの転写ネットワークのマッピングに尽力されています。 ,5,6。さらに、RNA immunopreciation RNA 蛋白質の相互作用の次世代シーケンス (Seq-RIP)7評価が続く中 DNA 結合タンパク質が Rna 転写イベント7,を規制すると対話することを示唆します。8,9,10,11,12、いくつかの研究は、クロマチン12、または RNA およびヒストンの修正の世界的な相互作用に関連付けられている Rna のゲノムの局在を検討しました。長い非コード Rna (lncRNAs) は、クロマチン蛋白13,14,15の活動を規制する発見されている Rna の 1 つのクラスです。たとえば、Xist は、女性哺乳類細胞におけるエピジェネティックなリプレッサー16,17の募集を通じて、1 つの X 染色体の不活性化を調節する lncRNA です。しかし、クロマチンに関連付けられている Rna の完全なスペクトルはほとんど知られてないです。ここでは、新しいプロトコル、クロマチン関連 RNA 法 (CARIP) の次世代シーケンサー (CARIP-Seq)、ライブラリの準備も含めて、ES 細胞のゲノムにクロマチン結合 Rna を識別するために続いてについて述べる次世代シーケンシング、およびヒストンの修正、転写因子やエピジェネティックな修飾子のグローバル占有をマップするチップ Seq。その他 RIP Seq 方法7とは異なり CARIP Seq には、クロマチンに関連付けられている Rna の直接同定架橋と超音波処理の手順が含まれます。一緒に、チップ Seq はゲノム蛋白質 DNA の相互作用を識別するために強力なツールをクロマチンのコンポーネントに関連付けられている Rna CARIP Seq は調査する強力な方法です。
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Protocol
1. 文化マウス ES 細胞フィーダー無料条件。
注: マウスの ES 細胞を細胞培養皿ゼラチンとマウス萌芽期の繊維芽細胞 (MEF) の有糸分裂活性化されているの単層コーティング (iMEFs) にメディアで培養している従来。ただし、MEF によるクロマチンと RNA の汚染を防ぐために下流のエピジェネティックなまたは式解析前に MEFs を削除必要があります。
- 送り装置の層の作製: ゼラチン、水に 0.1% ゼラチンの 2 mL を追加して 6 も細胞培養プレートをコートし、20-30 分の 37 ° C でプレートを孵化させなさい。
- 2 mM L グルタミン、10% 牛胎児血清 (FBS)、および 1 x ペニシリン/ストレプトマイシンを含む 10 %dmem 高グルコース メディアを準備します。
- E14.5 マウス18,19 E13.5 から MEFs を分離や商用ベンダーから取得します。有糸分裂マイトマイシン C または標準プロトコル19を使用して γ 線照射と扱うことによって MEFs を不活性化します。また、不活化有糸分裂 MEFs (iMEFs) から入手できます商業ベンダー。
- MEFs を培養します。37 ° C で MEF メディアをあらかじめ暖かく、iMEFs の凍結バイアルを解凍し、10% で 5% CO2と 37 ° C で FBS MEF メディア文化します。6 ウェル培養皿の井戸あたり 〜 200,000 セル、プレート MEFs。
- フィーダー細胞 (iMEFs) のレイヤーに ES 細胞を培養します。
- iMEFs、めっき後 12-24 時間前暖かい ES 細胞媒体の 50 mL のチューブ (LIF 高グルコース DMEM (10 ng/mL)、15 %es 細胞修飾 FBS、1 × ペニシリン/ストレプトマイシン非必須アミノ酸 (NEAA), 1 × グルタミン 1 × 修飾培養 2-メルカプトエタノール)、37 ° C で5% CO2。
- IMEFs を含む細胞培養皿からメディアを吸引、再 (37 ° C で融解) 後、メディアの 2 mL で ES 細胞を中断し、iMEFs の層の細胞をプレートします。インキュベーターで培養皿を置き、セルを均等に分散し、料理の中心に向かって凝集を予防する"t"の形のお皿を移動することが重要です。
- 皿の送り装置無料ゼラチン コーティングに ES 細胞を通路します。コンフルエントになる前に ES 細胞を通路します。ES 細胞コロニーは、コロニーが等間隔と合流しない場合自己再生最高を維持します。触れている多くの ES 細胞コロニーの存在は、細胞密度が高すぎることを示します。
- 前述のようにゼラチンで 6 ウェル培養皿をコートします。37 10 ~ 15 ° C で 0.25% トリプシン-EDTA を孵化済み暖かいトリプシンに分。
- 次に、最初のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) × 1 で洗浄と 0.25% トリプシン-EDTA 溶液の 1 mL を追加で ES 細胞を通路します。デタッチするコロニーのための 1-2 分を待ちます。先端が 1 mL ピペットによる単一細胞懸濁液にコロニーを切り離して考える 〜 5 回。
- 顕微鏡を使用して、ES 細胞の単一細胞解離を確認します。反応を抑制したり、""、トリプシンを中和するためには、10% FBS MEF メディアを追加します。3 5 分間、室温で 300 x g で細胞を遠心し、メディアを吸引します。
- グリコーゲン合成酵素キナーゼ 3 (GSK3) 阻害剤 (CHIR99021; を添加したメディア (ES 細胞) の 2 mL の細胞ペレットを再停止します。GSK3i)、または 2i (MEKi/GSK3i) 条件 (2-3 μ M GSK3i: CHIR99021、1 μ M MEKi: PD0325901)。
- 細胞培養ディッシュからゼラチンを吸引し皿に Esc を含むメディアの 2 mL を追加し、37 ° C の定温器 (図 1 a~ D) で皿を置きます。GSK3i と MEKi のデュアル阻害は、フィーダー細胞 (iMEFs) と血清20なしの不在で ES 細胞の基底状態素朴な多能性を推進しています。ES 細胞は、架橋に進む前に MEFs 3 回継代 2 をする必要があります。
2. 架橋 ES の細胞チップと CARIP
- PBS でそれらを洗浄することにより ES 細胞を収穫し、37 ° C に加温 0.25% トリプシンを追加セル数分室温で孵化させなさい。ES 細胞を細胞死につながるの trypsinization を避けてください。顕微鏡を使用して、単一の細胞解離を評価します。
- ES 細胞を継のため上記のようにトリプシンの消化力を消すし、3-5 分間室温で 300 x g で細胞を遠心分離します。
- 予め温めておいた (37 ° C) MEF メディア内のセルを再停止 (10 %fbs/DMEM) 2 × 106セル/mL で。
- クロスリンクするセル、37% ホルムアルデヒド溶液を最終濃度は 1% に追加、8 分は、同種の固定を達成するために 8 分の期間中に数回チューブを反転の 37 ° C で (15 mL や 50 mL) 円錐管の細胞を孵化させなさい。
注: 固定時間は、経験的 CARIP を最適化することができます。固定時間を変更すると、超音波処理サイクル数も調整する必要があります。また、37 ° C の温度は常温架橋に比べ架橋効率を高めます。固定の温度を経験的に最適化できます。 - 1.25 M を追加固定反応を停止するには、0.125 M の濃度 (4 ° C であらかじめ冷やして) グリシンは、室温で 5 分間、回転子を使用して 8 の rpm でチューブを反転します。室温で 5 分間 300 x g でサンプルを遠心し、メディアを吸引します。
- あらかじめ冷やした PBS (4 ° C) で細胞ペレットを洗って、室温で 5 分間 300 x g でサンプルを遠心分離機 PBS を吸引します。PBS のセルをもう一度洗浄します。次に、分注 15 × 106セル 15 mL チューブあたりです。
- 1 分、5 分、ドライアイス、液体窒素中でそれを配置することによって細胞のペレットを凍結または-80 ° c. ですぐに配置
注: 固定 ES 細胞ペレットは、下流の実験で品質が低下することがなく、6 ヶ月の保存できます。
3. クロマチン超音波チップと CARIP
- 氷の上の固定の ES 細胞ペレットを解凍します。再超音波処理バッファー (2.5 mL) 細胞ペレットを中断します。転写因子やエピジェネティックな調節物質 (タンパク質因子) は、再 1 x テ、1 mM PMSF、プロテアーゼ阻害剤のカクテル × 1 でペレットを中断します。ヒストン修飾の再テ ・ x 1、0.1 %sds、1 mM PMSF、1 x プロティナーゼの抑制剤でペレットを中断します。
注: SDS の追加は、超音波処理効率を向上、それできない場合があります特定のクロマチン成分や転写因子の評価のために有益。 - クロマチン免疫沈降 (チップ) の 14-18 サイクルとクロマチンを超音波照射 (30 s、30 s の残り) 40% 振幅で。クロマチン関連 RNA 法 (CARIP)、超音波処理サイクル (8-10 サイクル) の数を減らします。携帯、固定、sonifier 変動などにより超音波処理の条件べきである経験的に決まります。
- タンパク質因子、- デオキシ コール酸ナトリウム 28 μ、10% トリトン X100、よく混ぜる 0.28 mL 10 %sds のサプリメント 28 μ L で超音波処理バッファー。
注: 超音波処理バッファーにこれらのコンポーネントの追加は、RIPA バッファーを生成します。 - クロマチンをオフに事前に 4 ° C で 10 分間の 10,000 x g でサンプルを遠心します。新鮮なチューブに上清を移動、クロマチン免疫沈降に進みます。
- また、使用するまで-80 ° C で熱量クロマチンを格納できます。ただし、熱量クロマチン-80 ° c のストレージは蛋白質因子チップの質の低下につながる可能性があります。
4. チップと CARIP プロセス
- 1.5 mL、低いバインド チューブに 40 μ L 蛋白質 A のまたは G 磁気ビーズを追加します。ビーズを洗浄する PBS の 600 μ L を追加します。磁石を含むラックの上にチューブを置き、部屋の温度で 1 分の管を孵化させなさい、PBS、削除および再 100 μ L の PBS の磁気ビーズを中断します。
- マグネティック ビーズを用いてチューブに抗体の 2-4 μ g を追加します。インキュベート、ローテーターを使用して磁気ビーズに結合する抗体を容易に 8 回転で 40 分間室温でチューブを回転させます。磁気ラックにチューブを挿入、1 分、室温でインキュベートし、PBS を削除します。
- 磁気ビーズを洗浄する PBS の 200 μ L を追加します。無料 Igg を削除に PBS で洗浄を行います。インキュベート、洗浄手順の間 5 分間室温でチューブを回転させます。磁石にチューブを添付し、PBS を削除します。
- 熱量のクロマチンの孵化によって Immunoprecipitate クロマチン結合蛋白質はセルの抽出 (4 × 106チップあたり)、磁気ビーズ、4 ° c (一晩) サンプルを回転させます。
- 磁気ビーズを洗浄します。次のバッファーを室温でサンプルをインキュベートさせ、各バッファーと 10 分のためのサンプル: RIPA バッファーの 1 つの mL で 2 回 (TE (10 mM 小児-塩酸、1 mM EDTA) pH 8.0、1% トリトン X-100, 0.1% ナトリウム deocycholate、0.1 %sds)、RIPA バッファー c の 1 mL を 2 回報告 0.3 M 塩化ナトリウム、1 mL の LiCl バッファー (0.5% ナトリウム deocycholate、0.5 %np40、0.25 M LiCl)、TE の 1 mL と 1 回で 2 回バッファーを 0.2% トリトン X-100 と TE の 1 mL。
- チップ ・ デ ・架橋。再テの 100 μ L の磁気ビーズを中断します。10 %sds の 3 μ L、5 μ L のプロティナーゼ K (20 mg/mL) を追加します。65 ° c (一晩) サンプルをインキュベートします。
注: パラフィルムまたは蒸発を防ぐためにプラスチック製のラップでこの手順の間にチューブをカバーするために重要です。- 次の日は、ミックスに数回チューブを反転します。次に、新鮮なチューブに上清を転送するのにマグネット ラックを使用します。磁気ビーズを洗浄するには、0.5 M の NaCl を含む TE の 100 μ L を追加し、その後 2 つの培養上清を組み合わせます。
- CARIP のデ架橋。再テの 100 μ L の磁気ビーズを中断します。10 %sds の 3 μ L、5 μ L のプロティナーゼ K (20 mg/mL) を追加します。4 に 12 セル型、超音波処理と固定条件などの変動による経験的決定する必要があります 65 ° C で時間インキュベーションのための 65 ° C でサンプルをインキュベートします。
- 3-5 回チューブを反転ミックス磁気ラックにチューブを適用し、その後新鮮なチューブに上清を移動します。
- 磁気ビーズを洗浄するには、0.5 M の NaCl を含む TE の 100 μ L を追加し、その後 2 つの培養上清を組み合わせます。
注: ヌクレアーゼ フリー試薬を使用することが重要だ (e.g。、TE バッファー、SDSなど。) ・ デ ・架橋ステップ中に DNA または RNA の損失を防ぐため。
- フェノール: クロロホルム: イソアミル アルコール (PCI) (25:24:1, v/v) 200 μ L を使用して DNA ・ RNA を抽出します。
注: RNA も抽出できます製造元の指示を使用して商業キットを使用しています。30 のために振る s、10,000 x g で 10 分間、室温でのスピンし、新鮮なチューブに上清を移動します。- DNA ・ RNA の沈殿物、GlycoBlue、20 μ L の 3 M 酢酸ナトリウム、エタノールの 600 μ L の 2 μ L を追加します。5 〜 8 の反転によってミックスの回、ドライアイスまたは-80 ° C 少なくとも 1-2 時間でサンプルを置くと。
- 冷蔵 (4 ° C) テーブル トップ遠心分離機を使用して 30 分間、10,000 × g でサンプルを遠心します。空気乾燥用ペレット < 1 分と再バッファー (10 mM トリス-HCl) の EB の 40 μ L でそれを中断します。チップ Seq ライブラリの準備のためには、手順 6 に進みます。
- DNase を用いたクロマチン関連 RNA IP 試料からの DNA を削除します。CARIP サンプルでは 1 倍の濃度に 10 x DNase バッファーを追加します。RNA (50 μ L 反応) の 10 μ g までの DNase の 1 μ L を追加します。PCI と RNA サンプル 37 ° c 30 分抽出サンプルをインキュベートします。ヌクレアーゼ フリー H で再懸濁します2o.
5. 二重鎖 cDNA CARIP Seq の合成
- 最初繊維の cDNA の統合。逆転写反応 PCR マシン用に設計された管の次の反応を設定: 10.5 μ L の RNA と 1 μ L hexamer プライマー (3 μ g/μ L) のランダム。
- 二次構造を変性する 5 分の 65 ° C でチューブを孵化させなさい、次のコンポーネント 2 分ミックスの氷に保存: 最初繊維のバッファーの 4 μ L、0.1 M の DTT の 2 μ、1 μ L、dNTP の 0.5 RNase を。次に、PCR チューブ マスター ミックスの 7.5 μ L を追加します。25 ° C で 2 分間チューブを孵化させなさい上付きの II の 1 μ L を追加 (200 U/μ L) 以下の通り孵化させなさい、: 10 分、50 分、70 ° C、4 ° C で 15 分押しの 42 ° C の 25 ° C
- 第 2 鎖 cDNA を合成します。氷の上には、チューブを配置します。次に、次の順序でコンポーネントを追加: 91 μ ピロ炭酸ジエチルエステル (DEPC) 処理水、第 2 鎖反応バッファー、dNTP ミックス (10 mM) の 3 μ L、エシェリヒア属大腸菌DNA リガーゼ (10 U/μ L)、エシェリヒア属大腸菌DNA ポリメラーゼ (10U/μ L) の 4 μ L の 1 μ L × 5 の 30 μ L、と大腸菌RNase H の 1 μ L (2 u/μ L)。軽くボルテックスによって混合し、16 ° C 2 時間で孵化させなさい。
注: フリックまたはチューブを反転による混合できない場合があります完全に試薬を混合するのに十分です。 - 2 μ L の T4 DNA ポリメラーゼを追加し、, PCR 精製キットを使用して 5 分浄化 cdna (二重鎖 dscDNA) 16 ° C で。EB バッファーの 40 μ L で dscDNA を溶出します。
- 二本鎖 cDNA をフラグメントします。水お風呂 sonifier と跪く 250 500 dscDNA の超音波のサイズに 1.5 mL チューブを使用してせん断 cDNA (dscDNA) が全体の RNA 転写産物の配列のためのフラグメント サイズを減らすために重要です。
- 超音波照射の 3 × 10 分、または 4 × 10 分サンプル水お風呂 sonifier の標準的なモデルを使用します。
注: 4 サイクルをお勧めしますの総 RNA の 1-5 μ g 中、3 つのサイクルを総 RNA の最大 1 μ g を使用してください。遠心分離機管の超音波サイクルごとに簡単に、新鮮な氷を追加することによって冷水風呂を維持します。 - 総 RNA の次のサイクリング条件 1-5 μ g に 6 サイクルを使用する勧めしますピコ sonifier を使用している場合 (30 s、90 s オフ)。2-3 超音波処理サイクル後で簡潔にチューブを遠心します。超音波照射の効率は agarose のゲルの剪断 dscDNA (3-4 μ L) の一部 (2%) をロードすることによって決定できます。経験的 sonifiers 間の可変性のための超音波処理条件をテストすることが重要です。
- 次世代シーケンサーのステップ 6 で説明するようにライブラリの準備を実行します。
6. チップ Seq と CARIP Seq ライブラリーの構築
- DNA 終わり修理キットを使用して DNA の両端を修復します。このキットを使用して、DNA の鈍終了を生成します。1.5 mL に次を設定、この反応の低い管をバインド: 34 μ L の DNA、2.5 mM dNPTs の 5 μ L、5 μ L の 10 mM ATP、最後修理バッファー (5 mM DTT、100 mM 酢酸マグネシウム、酢酸カリウム 660 mM x 10 の 5 μ L の、300 ミリメートル pH 7.8 トリス酢酸)、と終わり修復酵素ミックス (T4 ポリヌクレオチド キナーゼ、T4 DNA ポリメラーゼ) の 1 μ L。
- 常温で 45 分間サンプルをインキュベートします。
- 反応クリーンアップ キットを使用して DNA を浄化します。予め温めておいた (65 ° C) EB バッファーの 32 μ L で終わり修理 DNA を溶出します。一方、DNA チップ、またはライブラリの準備の前に次の CARIP、RNA 濃度が通常量的いない我々 は、チップ DNA または RNA の CARIP の少なくとも 5-10 ng で開始することをお勧めします。
- 最後修理 DNA の 3'"A"張り出しの追加。1.5 mL、低いバインド チューブにコンポーネントを追加: 上記、NEB バッファー 2、1 μ L から 10 mM、H2O、11 μ L と 5 U の 3 μ L dATP の x 10 の 5 μ L の DNA の 30 μ/μ L Klenow のフラグメント (3' 5' エキソ-)、、軽くピペッティングで混ぜます。
- 37 ° C で 30 分間サンプルをインキュベートします。
- DNA を浄化するのに反応クリーンアップ キットを使用します。予め温めておいた (65 ° C) EB バッファーの 25 μ L の DNA を溶出します。
- アダプターを縛る。氷の上の次のコンポーネントを追加: 上から DNA の 23 μ、10 x T4 DNA リガーゼ バッファー、焼なまし PE または多重アダプター (4 μ M) の 1 μ L の 3 μ L、T4 DNA リガーゼ (400 U/μ L) と軽くピペッティングによるミックスの 3 μ L。
注: アダプター シーケンスは、商業ソースからも取得可能性があります。
オリゴヌクレオチドのシーケンス:
PE アダプター
5' P GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAGGAATGCCGAG
5 ' ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
多重アダプター
5' P GATCGGAAGAGCACACGTCT
5 ' ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT - 室温で 30 分間サンプルをインキュベートします。
- 既製 (2%) agarose のゲルを用いた DNA のサイズの選択を実行します。10 分のためのゲルを実行します。
- 250-450 bp に対応する領域を切除します。
注: 上記 200 以上のゲルを切断することによって、bp unligated アダプター二量体からの汚染の減少の可能性があります。PCR のステップの前に unligated アダプターを削除することが重要です。 - DNA を浄化するためにゲルの抽出キットを使用します。20 μ L の EB バッファーで溶出します。
- 結紮 DNA の PCR およびライブラリの浄化は、含むペアエンド (PE) アダプターをサンプリングします。PCR チューブ内のコンポーネントを追加: PE PCR プライマー 2.0 の 1 μ L、PE PCR プライマーを 1.0、1 μ L マスター ミックス (Phusion HF) を 25 μ l 添加 12 μ L 水の上から DNA の 50% の 12 μ L。
注: オリゴヌクレオチド シーケンスは、商業ソースからも取得可能性があります。
オリゴヌクレオチドのシーケンス:
PE PCR プライマー 1.0
5 ' AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
PE PCR プライマー 2.0
5 ' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT - インデックス PE アダプターを含む結紮のサンプルの PCR およびライブラリの浄化。コンポーネントの追加: 12 μ L の DNA 上から 50% の水 12 μ、1 μ L の PCR プライマー InPE 1.0 (希釈 1:2)、1 μ L の PCR プライマー InPE 2.0 (希釈 1:2)、1 μ L の PCR プライマー インデックス (希釈 1:2)。
注: オリゴヌクレオチド シーケンスは、商業ソースからも取得可能性があります。
オリゴヌクレオチドのシーケンス:
多重 PCR プライマー 1.0
5 ' AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
多重 PCR プライマー 2.0
5 ' GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
PCR のプライマーのインデックスのシーケンス 1-12
PCR プライマー、インデックス 1
5 ' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTC
PCR プライマー、インデックス 2
5 ' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTC
PCR プライマー、インデックス 3
5 ' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTC
PCR プライマー、インデックス 4
5 ' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTC
PCR プライマー、インデックス 5
5 ' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTC
PCR プライマー、インデックス 6
5 ' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTC
PCR プライマー、インデックス 7
5 ' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGATCTGGTGACTGGAGTTC
PCR プライマー、インデックス 8
5 ' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCAAGTGTGACTGGAGTTC
PCR プライマー、目次 9
5 ' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCGTGACTGGAGTTC
PCR プライマー、インデックス 10
5 ' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCTAGTGACTGGAGTTC
PCR プライマー、インデックス 11
5 ' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGCCGTGACTGGAGTTC
PCR プライマー、インデックス 12
5 ' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACAAGGTGACTGGAGTTC - PCR を行う次の条件を使用してサイクリング (30 の変性 98 ° c、10 の 18 サイクル s 98 ° c、30 秒 65 ° c、30 秒 s 72 ° c、72 ° C で 5 分間保持 4 ° c)。
注: PCR のサイクル数を経験的決定する必要があります。 - PCR の製品のサイズの選択。自家製の 2% (agarose) のゲルし、300 500 bp の領域をまたは実行 DNA、プレキャスト E ゲル EX (2%)。
- ゲルから DNA を浄化するためにゲルの抽出キットを使用します。EB バッファーの 20 μ L の最終の PCR の製品を溶出します。
- 蛍光光度計を使用して、ライブラリの濃度を測定します。次世代シーケンスを実行します。
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Representative Results
私たちは正常にこのチップ Seq プロトコル6を用いた ES 細胞で KDM5B、H3K4me2、H3K4me3 ゲノムワイドなバインディングを尋問しました。ES 細胞はフィーダー無料条件 (図 1) で培養し、前述のように架橋します。超音波処理後チップ Seq プロトコルの 3.2 で説明した実行され 2% の agarose のゲル (図 2) の DNA を実行することによって評価されます。次に、手順 4 で説明したようにチップが行ったし、手順 6 で説明したライブラリの準備を行った。チップ Seq ライブラリは、次世代シーケンシングのプラットフォームで配列されました。代表的なカスタム UCSC ブラウザー ビューでは、濃縮 H3K4me3、H3K4me2、および KDM5B のコア多能性遺伝子POU5F1 (図 3 a)、HOXC クラスター (図 3 b) を明らかにします。CARIP Seq は 4-6 の手順で説明するようにプロトコルを次も行った。代表 UCSC ブラウザー ビューでは、ES 細胞 (図 4) の座位で H4K20me3 関連 RNA (CARIP-Seq) と H4K20me3 (チップ Seq) の濃縮を明らかにします。CARIP Seq 信号は、その RNA は H4K20me3 に関連付けられてが、それ必ずしも示す軌跡と対話することを示します。CARIP Seq データセットは、チップ Seq データセットとして同様の方法で分析できます。マウス ES から生成されたデータ セル CARIP Seq とチップ Seq 実験することができます両方の参照ゲノムに配置する (e.g。、mm9、mm10) bowtie221を使用して。チップ Seq と濃縮 CARIP Seq 地域両方識別できます「空間クラスタ リングのための識別の ChIP-Enriched 地域」(SICER)22または MAC23,24などピーク呼び出し元プログラムを使用。広いピーク CARIP Seq データセット可能性が高いため、広範かつシャープなピークを識別することができますアルゴリズムを使用することが重要です。一方、本稿で説明されているプロトコルはチップ Seq と CARIP Seq を実行するために最適化されている ES 細胞を使用すると、これらのプロトコル必要があります蛋白質 DNA とクロマチン関連 RNA 相互作用他のセルタイプを評価に適しています。
図 1: ES 細胞のフィーダー フリー培養。(A) 実験的なデザイン。(B) ES 細胞 ES で iMEFs 上で培養した細胞、LIF を含む媒体または ES とフィーダー無料条件で細胞 LIF と GSK3i (C) や (D) GSK3i と MEKi (2 i) を含む媒体。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 超音波照射架橋 ES 細胞クロマチン。架橋 ES 細胞、sonifier、陰極を用いた 18 サイクル用超音波処理された (40% 振幅、30、s と 30 s の残り)。架橋が逆転し、RNA を削除する RNase 消化を行った後。DNA は、PCI を使用して agarose のゲル (2%) の実行を精製しました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: ES 細胞の酵素およびヒストンの修正を修正するヒストンの代表チップ Seq 解析します。多能性-レギュレータ (A) POU5F1 と ES 細胞 (正規化されたタグ密度 (RPBM)、百万のリードの基本 1 を読む) HOXC (B) クラスターで KDM5B、H3K4me2、H3K4me3 UCSC ブラウザー ビューをカスタム。KDM5B バインドと H3K4me3/2 入居間の重複に注意してください。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: ヒストン修飾の ES 細胞におけるチップ Seq と関連付けられている RNA の代表 CARIP Seq 解析します。ES 細胞 (正規化されたタグ密度 (RPBM)、百万のリードの基本 1 を読む) の H4K20me3 CARIP Seq と H4K20me3 チップ Seq 信号の UCSC ブラウザー ビュー。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
チップ Seq はグローバル蛋白質 DNA の相互作用の場所を評価するための有用な方法 (e.g、トランスクリプション要因/ヒストン/ヒストン修飾酵素と DNA の変更) ES 細胞、新開発の CARIP Seq プロトコルは便利で。クロマチンの成分と Rna のゲノム広い連合を尋問します。チップ Seq は ES 細胞のエピジェネティックな風景や他の細胞型を評価するために使用する基本的なツールです。チップ Seq と CARIP Seq ライブラリの品質、チップ グレード抗体に大きく依存します。チップ PCR、空いている地域を基準にして正のコントロール領域で割増濃縮 ≥ 3 が高品質チップ Seq データ25を生成するための十分なする必要がありますを実行することによって、チップ Seq の抗体の適合性は経験的に決まります。同様に、抗体テストできますその適合性について CARIP Seq の同様の方法でマイナーな修正とチップ Seq のとおり。上記の方法で説明したよう、CARIP プロトコルの RNA IP の手順を次逆転写 PCR は cDNA は、Q RT-PCR 法を実行するテンプレートとして使用することができますを生成する実行必要があります。次のチップまたはいくつかのゲノム領域で CARIP 濃縮を評価することをお勧めします。チップまたは CARIP の抗体の品質を評価するときにテストするのには追加の考慮事項があります。たとえば、チップと CARIP のために使用されるバッファーの金詰りは NaCl の濃度を変えることによって最適化可能性があります: 高 NaCl 濃度が付いている抗体のために有用かもしれない間、低 NaCl 濃度が高い特異抗体に適した非特異的結合。次世代シークエンシングのため図書館準備に関するカスタム プライマーとインデックスも使用できます市販のオリゴヌクレオチドの代わりに。しかし、3' 端に 2 つの拠点間ホスホロチオエート修正を含むはヌクレアーゼ消化26を防ぐために示されていることに注意してくださいすることが重要です。サードパーティ RNA シーケンスまたはチップ Seq ライブラリ構築キットは、CARIP の配列のためのライブラリを生成し、それぞれのサンプルのチップにも使えます。ただし、経験的次世代シーケンスの生成の質の高いライブラリでその有効性を評価するためのキットをテストすることが重要です。追加のプロトコルは、ChIPmentation27などのチップ Seq 図書館準備を実行に用いることができます。しかし、ここで記述されているチップ Seq プロトコル ChIPmentation の適応は、追加修正と更なる最適化が要求されます。
ここでは、適度な数のセル (4 × 106セル単位、IP) を使用してに最適化されているチップと CARIP プロトコルについて述べる.チップ プロトコルは、中間に低いセル番号を使用して実行できます (105 106セル)、我々 は CARIP Seq 未満 2 × 106セルを使用してを実行していません。ただし、経験的テスト様々 な固定および超音波処理の条件によっては、このプロトコルが少数の細胞を使用して正常に動作可能性があります不可能です。
要約すると、チップ Seq と CARIP Seq それぞれ ES 細胞のクロマチン関連タンパク質と Rna の世界地図を生成するために便利です。これらのプロトコルは、ES 細胞に最適化されています中、は、さまざまな哺乳類細胞および組織の種類を使用してクロマチン マップを生成する最適化できます。これらのプロトコルは、単一細胞チップ Seq や CARIP Seq ライブラリを生成するも最適化可能性があります。
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Disclosures
著者は利益相反を宣言しません。
Acknowledgments
この仕事は、ウェイン州立大学、バーバラアンカルマノスがん研究所、国立心臓、肺、血液研究所 (1K22HL126842 01A1) B.L.K. に与えられるからの助成金によって支えられました。この作品はウェイン州立大学高パフォーマンス コンピューティング グリッド計算資源の活用 (< https://www.grid.wayne.edu/>)。CARIP Seq データ分析支援ありがとうジジ ロッグマン。
著者の貢献:
B.L.K. は、CARIP Seq 法の考案し設計チップ Seq と CARIP Seq 実験を実施し、シーケンス データを分析した原稿を起草しました。すべての著者を読むし、この原稿の最終バージョンを承認しました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse leukemia inhibitory factor (ESGRO LIF) | EMD Millipore | 106 or 107 units | |
| GSK3β inhibitor CHIR99021 (GSK3i) | Stemgent | Solvent: DMSO 10mM | |
| MEK inhibitor PD0325901 (MEKi) | Stemgent | Solvent: DMSO 10mM | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose | Invitrogen | 11965092 | |
| PBS (phosphate buffered saline) | Invitrogen | 10010031 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| 2-Mercaptoethanol (50 mM) | Gibco | 31350010 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140076 | |
| EmbryoMax ES Cell Qualified Fetal Bovine Serum, 500 ml | EMD Millipore | ES-009-B | |
| EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | EMD Millipore | ES-006-B | |
| Glycine | Sigma | G7126-500G | 1.25 M stock conentration in water |
| Formaldehyde solution | Sigma | F8775-500ML | |
| TE (Tris EDTA) pH 8.0 1X | Quality Biological | 351-011-131 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) solution | Sigma | 93482-250ML-F | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697498001 | |
| Sodium dodecyl sulfate solution (20%) | Quality Biological | A611-0837-10 | |
| Q125 sonifier | Qsonica | 4422 | |
| Triton X-100 solution | Sigma | 93443-100ML | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation | Invitrogen | 10004D | |
| Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation | Invitrogen | 10002D | |
| Dynabeads Protein A/Protein G and Magnet Starter Pack | Invitrogen | 10015D | |
| Lithium chloride | Sigma | L4408 | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma | I8896 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Dynabeads mRNA Purification Kit (for mRNA purification from total RNA preps) | Invitrogen | 61006 | |
| SuperScript Double-Stranded cDNA Synthesis Kit | Invitrogen | 11917010 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| End-It DNA End-Repair Kit | Lucigen | ER81050 | |
| Klenow Fragment (3'→5' exo-) | NEB | M0212L | |
| dATP (10 mM) | Invitrogen | 18252015 | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202L | |
| TrackIt 1 Kb Plus DNA Ladder | Invitrogen | 10488085 | |
| E-gel EX agarose gels, 2% | Invitrogen | G402002 | |
| Phusion high-fidelity 2X master mix with HF buffer | Thermo Fisher | F531LPM | |
| ChIPAb+ Trimethyl-Histone H3 (Lys4) - ChIP Validated Antibody | EMD Millipore | 17-614 | |
| Anti-Histone H3 (di methyl K4) antibody [Y47] - ChIP Grade (ab32356) | Abcam | ab32356 | |
| Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-well) | Fisher | 720083 | |
| Falcon Standard Tissue Culture Dishes (10cm) | Fisher | 08772E | |
| Bioruptor pico | Diagenode | B01010001 | |
| Qubit Flurometer 2.0 | Thermo Fisher | ||
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32851 | |
| MinElute Reaction Cleanup Kit | Qiagen | 28204 | |
| MinElute Gel Extraction Kit | Qiagen | 28604 | |
| Anti-Histone H4 (tri methyl K20) antibody - ChIP Grade (ab9053) | Abcam | ab9053 | |
| Labquake rotator | Thermo Fisher | 400110Q | |
| Illumina HiSeq platform | Illumina | ||
| TURBO DNase | Invitrogen | AM2238 |
References
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