Summary
Her beskriver vi metoder for å utføre ChIP-Seq og CARIP-Seq, inkludert biblioteket forberedelse til neste generasjons sekvensering, genererer globale epigenomic og chromatin-assosiert RNA kart i ES celler.
Abstract
Embryonic stem (ES) celle selvtillit fornyelse og differensiering er underlagt ytre signaler og iboende nettverk av transkripsjonsfaktorer epigenetic regulatorer og post oversettelse modifikasjoner av histones som påvirker combinatorially genet uttrykket delstaten nærliggende gener. RNA har også vist seg å samhandle med ulike proteiner å regulere chromatin dynamikk og genuttrykk. Chromatin-assosiert RNA immunoprecipitation (CARIP) etterfulgt av neste generasjons sekvensering (CARIP-Seq) er en ny metode for undersøkelse RNAs tilknyttet chromatin proteiner, mens chromatin immunoprecipitation etterfulgt av neste generasjons sekvensering ( ChIP-Seq) er en kraftig genomics teknikk å kartlegge plasseringen av post-translasjonell modifikasjon av histones og transkripsjonsfaktorer epigenetic modifikatorer på en global skala i ES celler. Her beskriver vi metoder for å utføre CARIP-Seq og ChIP-Seq, inkludert biblioteket konstruksjon for neste generasjons sekvensering, vil generere globale chromatin-assosiert RNA og epigenomic kart i ES celler.
Introduction
Embryonic stem (ES) cellen skjebne beslutninger er regulert av kommunikasjon mellom ekstracellulære signaler og en rekke transcriptional-regulatorer, inkludert histone bestemmelsesord og post oversettelse modifikasjon av histone haler. Disse interaksjoner lette chromatin tilgjengelighet og pakking av chromatin inn i én av to måter: euchromatin, som er åpen og transcriptionally aktive, og heterochromatin, som er kompakt og generelt transcriptionally inaktive. Transkripsjonsfaktorer med DNA sekvens-spesifikke bindende slektskap og epigenetic modifikatorer forbinder med euchromatic regioner til å delta i å kontrollere genuttrykk. Neste generasjons sekvensering metoder, inkludert ChIP-Seq1, har vært medvirkende i kartlegging genomet hele transcriptional nettverk som er grunnleggende for ES celle selvtillit fornyelse og pluripotency2,3,4 ,5,6. Videre mens RNA immunopreciation etterfulgt av neste generasjons sekvensering (RIP-Seq)7 evalueringer av RNA-protein interaksjoner foreslå at DNA bindende proteiner samhandle med RNAs å regulere transcriptional hendelser7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12, få studier har undersøkt genomet hele lokalisering av RNAs knyttet til chromatin12eller globale samspillet mellom RNA og histone modifikasjoner. Lenge ikke-koding RNAs (lncRNAs) er en klasse av RNAs som har blitt funnet for å regulere aktiviteten til chromatin-assosiert proteiner13,14,15. Xist er for eksempel et lncRNA som regulerer, i kvinnelige pattedyrceller, inaktivering av en X-kromosom, gjennom rekruttering av epigenetic repressors16,17. Men er hele spekteret av RNAs forbundet med chromatin hovedsakelig ubekjent. Her beskriver vi en ny protokoll, chromatin-assosiert RNA immunoprecipitation (CARIP) etterfulgt av neste generasjons sekvensering (CARIP-Seq), til å identifisere chromatin-assosiert RNAs på genomet-bred basis i ES celler, inkludert biblioteket forberedelse for neste generasjons sekvensering, og ChIP-Seq tilordne globale belegget av histone modifikasjoner og transkripsjonsfaktorer epigenetic modifikatorer. I motsetning til andre RIP-Seq metoder7inkluderer CARIP-Seq crosslinking og sonication skritt, som tillater direkte identifisering av RNAs med chromatin. Sammen, ChIP-Seq er et kraftig verktøy for å identifisere genomet hele protein-DNA interaksjoner, mens CARIP-Seq er en kraftig metode å kartlegge RNAs forbundet med chromatin komponenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. kultur mus ES celler i arkmateren uten betingelser.
Merk: Mus ES celler er konvensjonelt kultivert i media på en celle kultur parabol belagt med gelatin og en mono-lag av mus embryonale fibroblaster (MEF), som har vært mitotically deaktivert (iMEFs). MEFs bør imidlertid fjernes før nedstrøms epigenetic eller uttrykk analyser å hindre forurensning av MEF-assosiert chromatin og RNA.
- Utarbeidelse av et mater lag: Gelatin coat en 6-vel celle kultur plate ved å legge 2 mL 0,1% gelatin i vannet, og ruge platen på 37 ° C i 20-30 min.
- Forberede 10% DMEM høy-glukose mediet som inneholder 2 mM L-glutamin, 10% fosterets bovin serum (FBS) og 1 x penicillin/streptomycin.
- Isolere MEFs fra E13.5 til E14.5 mus18,19 eller kjøpe fra en kommersiell leverandør. Mitotically deaktivere MEFs ved å behandle med mitomycin C eller gamma bestråling med standardprotokoller19. Eventuelt kan mitotically inaktivert MEFs (iMEFs) skaffes fra en kommersiell leverandør.
- Dyrking MEFs. Forvarm MEF medier på 37 ° C, tine frosne hetteglass med iMEFs og kultur i 10% FBS MEF medier på 37 ° C med 5% CO2. Platen MEFs på ~ 200 000 celler per brønn av en 6-brønnen rett.
- Dyrking ES celler på et lag av materen celler (iMEFs).
- 12-24 h etter plating iMEFs, forvarme en 50 mL tube ES cellen media (DMEM høy-glukose, LIF (10 ng/mL), 15% ES celle kvalifisert FBS, 1 × cellekultur kvalifisert 2-mercaptoethanol, 1 × glutamin, unødvendige aminosyrer (NEAA), 1 × penicillin/streptomycin), på 37 ° C med 5% CO2.
- Sug opp media fra celle kultur platene som inneholder iMEFs, å suspendere ES celler i 2 mL av media (etter tining på 37 ° C) og plate cellene på laget i iMEFs. Når du plasserer kultur parabol i inkubator, er det viktig å flytte rett i en "t" figur å jevnt distribuere cellene og hindre samling mot midten av parabolen.
- Passasje ES celler på materen-fri gelatin-belagt retter. Passasje ES celler før de blir confluent. ES celle kolonier opprettholde selvtillit fornyelse beste hvis koloniene er likt mellomrom og ikke confluent. Tilstedeværelsen av mange ES celle koloniene som berører angir at celle tetthet er for høy.
- Coat en 6-brønnen parabolen med gelatin som beskrevet ovenfor. Inkuber 0,25% trypsin-EDTA ved 37 ° C i ~ 10-15 min å pre varme trypsin.
- Deretter passasje ES celler ved første vask med 1 x fosfat bufret saltvann (PBS) og legge til 1 mL av 0,25% trypsin-EDTA løsning. Vent 1-2 min for koloniene koble. Distansere koloniene til en enkeltcelle suspensjon av pipettering med 1 mL tips for ~ 5 ganger.
- Bruke et mikroskop for å bekrefte enkeltcelle dissosiasjon ES celler. Å slukke reaksjonen, eller å «nøytralisere» trypsin, legge til 10% FBS MEF medier. Sentrifuge cellene på 300 x g ved romtemperatur for 3-5 minutter, og Sug opp media.
- Nytt suspendere det mobilnettet pellet i 2 mL av media (ES celler) med glykogen syntase kinase-3 (GSK3) hemmer (CHIR99021; GSK3i), eller 2i (MEKi/GSK3i) forhold (2-3 µM GSK3i: CHIR99021, 1 µM MEKi: PD0325901).
- Sug opp gelatin fra celle kultur fatet, og legge til 2 mL medier inneholder ESCs til parabolen, og plasser rett i 37 ° C inkubator (figur 1A-D). Dobbel hemming av GSK3i og MEKi fremmer bakken staten naiv pluripotency ES celler i fravær av materen celler (iMEFs) og uten serum20. ES celler skal passaged to til tre ganger å fjerne MEFs før du fortsetter til crosslinking.
2. Crosslinking av ES celler for ChIP og CARIP
- Høste ES celler ved å vaske dem med PBS, og deretter legge 0,25% trypsin pre varmet på 37 ° C. Inkuber cellene i flere minutter ved romtemperatur. Unngå over trypsinization ES celler, som fører til celledød. Bruk et mikroskop for å vurdere enkeltcelle dissosiasjon.
- Slukke trypsin fordøyelsen som beskrevet ovenfor for passaging ES celler og sentrifuge cellene på 300 x g ved romtemperatur for 3-5 minutter.
- Nytt suspendere cellene i forvarmes (37 ° C) MEF media (10% FBS/DMEM) på 2 × 106 celler/mL.
- Til krysskobling cellene, legge 37% formaldehyd løsning til en 1% siste konsentrasjon, og ruge cellene i en konisk tube (15 mL eller 50 mL) på 37 ° C for 8 min. Inverter røret flere ganger i 8 min perioden å oppnå homogene fiksering.
Merk: Fiksering tiden kan være empirisk optimalisert for CARIP. Hvis fiksering tiden endres, bør også antall sonication sykluser justeres. 37 ° C temperaturen øker også, crosslinking effektivitet sammenlignet crosslinking ved romtemperatur. Temperaturen på fiksering kan optimaliseres empirisk. - Stoppe fiksering reaksjonen, legge 1,25 M glysin (pre kjølt på 4 ° C) til en konsentrasjon av 0.125 M. Inverter røret på 8 rpm bruker et rotator for 5 min ved romtemperatur. Sentrifuge prøven på 300 x g i 5 minutter ved romtemperatur og Sug opp media.
- Vask celle pellets med pre kjølt PBS (4 ° C), sentrifuge prøven på 300 x g i 5 minutter ved romtemperatur og Sug opp PBS. Vask cellene med PBS igjen. Neste, aliquot 15 × 106 celler per 15 mL tube.
- Fryse celle pellet ved å plassere den i flytende nitrogen for 1 min, på tørris i 5 min, eller plasser umiddelbart-80 ° C.
Merk: Fast ES celle pellets kan lagres i opptil 6 måneder uten redusert kvalitet nedstrøms eksperimenter.
3. chromatin sonication for ChIP og CARIP
- Tine fast ES celle pellet på is. Nytt avbryte celle pellet sonication buffer (2.5 mL). Transkripsjonsfaktorer eller epigenetic regulatorer (protein faktorer), avbryte re pellet 1 x TE, 1 mM PMSF, 1 x proteinasen hemmer cocktail. For histone modifikasjoner, avbryte re pellet 1 x TE, 0,1% SDS, 1 mM PMSF, 1 x proteinasen hemmer.
Merk: Mens tillegg av SDS forbedrer sonication effektivitet, det kan ikke være gunstig for å evaluere bestemte chromatin bestanddeler eller transkripsjonsfaktorer. - For chromatin immunoprecipitation (ChIP), sonicate chromatin med 14-18 sykluser (30 s på, 30 søvn) på 40% amplitude. For chromatin-assosiert RNA immunoprecipitation (CARIP), kan du redusere antall sonication sykluser (8-10 sykluser). Cellular, fiksering og sonifier variasjon, bør vilkår for sonication empirisk fastsettes.
- Tillegg sonication buffer med 28 µL på 10% SDS for protein-faktorer, 28 µL av natrium-deoxycholate og 0,28 mL 10% Triton-X100, og bland godt.
Merk: Tillegg av disse komponentene til den sonication bufferen genererer RIPA buffer. - Sentrifuge prøven på 10.000 x g i 10 min på 4 ° C før fjerne chromatin. Flytt nedbryting slik frisk og fortsette med chromatin immunoprecipitation.
- Sonicated chromatin kan også lagres på-80 ° C før bruk. Men kan lagring av sonicated chromatin ved-80 ° C føre til redusert kvalitet for protein-faktor-brikken.
4. chIP og CARIP
- Legge til 40 µL av protein A eller G magnetiske perler en 1,5 mL, lav bindende rør. Legge til 600 µL av PBS å vaske perler. Sett røret på en reol som inneholder en magnet, ruge røret i 1 min i romtemperatur, fjerne PBS og å suspendere magnetiske perler i 100 µL av PBS.
- Legge til 2-4 µg antistoff røret med magnetiske perler. Ruge og rotere røret ved romtemperatur for 40 min 8 RPM bruker et rotator for å lette antistoff bindingen til magnetiske perler. Sett røret på magnetiske brettet, ruge det i 1 min i romtemperatur, deretter fjerne PBS.
- Legge til 200 µL av PBS å vaske de magnetiske perlene. Vask med PBS utføres for å fjerne gratis IgGs. Ruge og rotere røret ved romtemperatur for 5 min mellom vask trinn. Feste tuben til magneten og fjerne PBS.
- Immunoprecipitate chromatin-bundet proteiner av rugende den sonicated chromatin ekstrakt (4 × 106 celler per brikke), med magnetiske perler og rotere prøven på 4 ° C (overnatting).
- Vask de magnetiske perlene. Ruge prøven ved romtemperatur med følgende bufferne og rotere utvalget for 10 min med hver buffer: to ganger med 1 mL av RIPA buffer (TE (10 mM Tric-HCl, 1 mM EDTA) pH 8.0, 1% Triton X-100, 0,1% natrium deocycholate, 0,1% SDS), to ganger med 1 mL av RIPA buffer c ontaining 0,3 M NaCl, to ganger med 1 mL av LiCl buffer (0,5% natrium deocycholate, 0,5% NP40, 0,25 M LiCl), en gang med 1 mL av TE bufferen med 0,2% Triton X-100, og en gang med 1 mL av TE.
- De-crosslinking for brikken. Nytt avbryte de magnetiske perlene 100 µL av TE. Legg 3 µL av 10% SDS og 5 µL av proteinasen K (20 mg/mL). Inkuber prøven på 65 ° C (overnatting).
Merk: Det er viktig å dekke rør i dette trinnet med parafilm eller plastfolie mot fordampning.- Dagen Inverter røret flere ganger for å blande. Deretter Bruk magnet stativet overføre nedbryting slik frisk. For å vaske de magnetiske perlene, Legg 100 µL av TE inneholder 0,5 M NaCl, og deretter kombinere de to supernatants.
- De-crosslinking for CARIP. Nytt avbryte de magnetiske perlene 100 µL av TE. Legg 3 µL av 10% SDS og 5 µL av proteinasen K (20 mg/mL). Inkuber prøven ved 65 ° C i 4 til 12 h. inkubasjon tid på 65 ° C må bestemmes empirisk skyldes variasjon mellom celletyper, sonication og fiksering, etc.
- Invertere røret 3 - 5 ganger å blande, røret gjelder magnetiske stativet, og deretter flytte nedbryting slik frisk.
- For å vaske de magnetiske perlene, Legg 100 µL av TE inneholder 0,5 M NaCl, og deretter kombinere de to supernatants.
Merk: Det er viktig å bruke nuclease-fri reagenser (f.eks., TE buffer, SDS, osv.) til å hindre tap av DNA eller RNA under det de-crosslinking steget.
- Ekstra DNA/RNA bruker 200 µL av fenol: kloroform: isoamyl alkohol (PCI) (25:24:1, v/v).
Merk: RNA kan også hentes ved hjelp av kommersielle kits bruker produsentens instruksjoner. Riste for 30 s, spinn på 10 000 x g ved romtemperatur for 10 min, og Flytt nedbryting slik frisk.- For å utløse DNA/RNA, legge 2 µL GlycoBlue, 20 µL av 3 M natrium acetate og 600 µL av etanol. Blandingen av invertere ~ 5-8 ganger, og plasser prøven på tørris eller på-80 ° C i minst 1-2 h.
- Sentrifuge prøven på 10.000 x g i 30 min med en nedkjølt (4 ° C) bord sentrifuge. Lufttørke pellet for < 1 min og å suspendere det i 40 µL av EB buffer (10 mM Tris-HCl). ChIP-Seq biblioteket forberedelse, fortsette til trinn 6.
- Fjern DNA fra chromatin-assosiert RNA IP prøver ved DNase. Legge til 10 x DNase buffer 1 x konsentrasjonen i CARIP utvalget. Legg 1 µL av DNase for opptil 10 µg av RNA (50 µL reaksjon). Inkuber prøven ved 37 ° C i 30 min. ekstrakt RNA prøven med PCI. Resuspend i nuclease-fri H2O.
5. double-strandet cDNA syntese for CARIP-Seq
- Syntese av første-strand cDNA. Omvendt-transkripsjon reaksjonen, satt opp følgende reaksjon i et rør utformet for en PCR maskin: 10,5 µL av RNA og 1 µL tilfeldig i praktiske primere (3 µg/µL).
- Inkuber røret ved 65 ° C i 5 min til denature sekundære struktur, og lagre den på is 2 min. blanding følgende komponenter: 4 µL av første-strand buffer, 2 µL 0.1 m DTT, 1 µL av dNTP og 0,5 RNase ut. Deretter til PCR røret, legger du til 7,5 µL av master mix. Inkuber røret i 2 minutter på 25 ° C. Legge 1 µL av hevet II (200 U/µL) og Inkuber som følger: 25 ° C i 10 min, 42 ° C i 50 min, 70 ° C i 15 min, og holde på 4 ° C.
- Andre-strand cDNA syntese. Sett røret på is. Deretter legger til følgende komponenter i rekkefølge: 91 µL av diethyl pyrocarbonate (DEPC) behandlet vann, 30 µL av 5 x andre-strand reaksjon buffer, 3 µL dNTP mix (10 mM), 1 µL av E. Coli DNA ligase (10 U/µL), 4 µL av E. Coli DNA Polymerase (10U/µL) , og 1 µL av E. Coli RNase H (2U/µL). Blande av forsiktig vortexing og ruge på 16 ° C i 2 timer.
Merk: Blande flicking eller invertere røret kan ikke være tilstrekkelig til å grundig blande reagenser. - Legg 2 µL av T4 DNA Polymerase og ruge på 16 ° C i 5 min. rense cDNA (dobbelttrådet, dscDNA) bruker PCR rensing kit. Elute dscDNA i 40 µL EB bufferen.
- Fragment double-strandet cDNA. Skjær cDNA (dscDNA) bruker en vann bad sonifier og en 1,5 mL tube til en størrelse på 250-500 bp. Sonication av dscDNA er avgjørende for å redusere fragment størrelser for å lette sekvensering av hele RNA utskrift.
- Når du bruker en standard modell av et vannbad sonifier, sonicate utvalget for 3 × 10 min eller 4 × 10 min.
Merk: Tre sykluser bør brukes for opptil 1 µg av totalt, mens fire sykluser anbefales for 1-5 µg av totalt. Sentrifuge røret kort etter hver sonication syklus, og opprettholde en kul vannbad ved å legge friske is. - Når du bruker en Pico sonifier, anbefales det å bruke seks sykluser for 1-5 µg totale RNA og sykling følgende (30 s på, 90 s av). Sentrifuge røret kort etter 2-3 sonication sykluser. Effektiviteten av sonication kan bestemmes ved å legge en brøkdel av den skråstilte dscDNA (3-4 µL) på en agarose gel (2%). Det er viktig å teste empirisk sonication forholdene skyldes variasjon mellom sonifiers.
- Utføre biblioteket forberedelse som beskrevet i trinn 6 for neste generasjons sekvensering.
6. chIP-Seq og CARIP-Seq biblioteket konstruksjon
- Reparere endene av DNA ved hjelp av en DNA slutten-reparasjonssett. Dette settet brukes til å generere blunt endte DNA. For denne reaksjonen, definere følgende i en 1,5 mL, lav bindende rør: 34 µL av DNA, 5 µL av 2,5 dNPTs, 5 µL av 10 mM ATP, 5 µL av 10 x slutten-reparasjon buffer (5 mM DTT, 100 mM magnesium acetat, 660 mM kalium acetate 300 mM Tris-acetate, pH 7,8), og 1 µL av slutt-reparasjon enzym blanding (T4 polynucleotide kinase, T4 DNA polymerase).
- Inkuber utvalget for 45 min ved romtemperatur.
- Rense bruker en reaksjon opprydding kit. Elute end-reparert DNA i 32 µL forvarmes (65 ° C) EB bufferen. Mens vi ikke vanligvis quantitate konsentrasjonen av DNA etter ChIP eller RNA følgende CARIP, før biblioteket forberedelse, anbefales det å begynne med minst 5-10 ng ChIP DNA eller RNA CARIP.
- Tillegg av en 3 "A" overheng slutten-reparert DNA. Legge til komponenter i en 1,5 mL, lav bindende rør: 30 µL av DNA ovenfra, 5 µL av 10 x NB buffer 2, 1 µL av dATP fra 10 mM lager og 11 µL av H2O 3 µL av 5 U / µL Klenow fragment (3 - 5' Exo-) , og bland forsiktig av pipettering.
- Inkuber utvalget for 30 min på 37 ° C.
- Bruk en reaksjon opprydding kit til å rense. Elute DNA i 25 µL forvarmes (65 ° C) EB bufferen.
- Ligate kort. Legg til følgende komponenter på is: 23 µL av DNA fra oven, 3 µL av 10 x T4 DNA ligase buffer, 1 µL glødet PE eller multipleksing kort (4 µM) og 3 µL av T4 DNA ligase (400 U/µL), og bland forsiktig av pipettering.
Merk: Kortet sekvenser kan også hentes fra en kommersiell kilde.
Oligonucleotide sekvenser:
PE adaptere
5' P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAGGAATGCCGAG
5' ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
Multiplexing adaptere
5' P-GATCGGAAGAGCACACGTCT
5' ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT - Inkuber utvalget for 30 min ved romtemperatur.
- Utfør størrelse utvalg av DNA ved hjelp av en sandsekk (2%) agarose gel. Kjør gel for 10 min.
- Avgiftsdirektoratet regionen tilsvarer 250-450 bp.
Merk: ved å kutte gel over over 200 bp, det er en redusert mulighet for forurensning fra unligated kortet dimers. Det er viktig å fjerne noen unligated kort før PCR-trinn. - Bruke en gel utvinning kit til å rense. Elute i 20 µL EB bufferen.
- PCR og bibliotek rensing for samskrevet DNA prøver inneholder sammen-end (PE)-kort. Legger du til komponentene i et PCR-rør: 12 µL av 50% av DNA fra oven, 12 µL av vann, 25 µL av master mix (Phusion HF), 1 µL av PE PCR primer 1.0 og 1 µL av PE PCR primer 2.0.
Merk: Oligonucleotide sekvenser kan også hentes fra en kommersiell kilde.
Oligonucleotide sekvenser:
PE PCR Primer 1.0
5' AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
PE PCR Primer 2.0
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT - PCR og bibliotek rensing for samskrevet prøver som inneholder indeksen PE adaptere. Legge til komponenter: 12 µL av 50% av DNA fra oven, 12 µL av vann, 1 µL av PCR primer InPE 1.0 (fortynnes 1:2), 1 µL av PCR primer InPE 2.0 (fortynnes 1:2) og 1 µL av PCR primer indeks (fortynnes 1:2).
Merk: oligonucleotide sekvenser kan også hentes fra en kommersiell kilde.
Oligonucleotide sekvenser:
Multiplexing PCR Primer 1.0
5' AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
Multiplexing PCR Primer 2.0
5' GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
PCR Primer indeks sekvenser 1-12
PCR Primer, indeksen 1
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTC
PCR Primer, indeksen 2
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTC
PCR Primer, indeks 3
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTC
PCR Primer, indeks 4
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTC
PCR Primer, indeks 5
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTC
PCR Primer, indeks 6
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTC
PCR Primer, indeksen 7
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGATCTGGTGACTGGAGTTC
PCR Primer, indeksen 8
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCAAGTGTGACTGGAGTTC
PCR Primer, Index 9
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCGTGACTGGAGTTC
PCR Primer, Index 10
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCTAGTGACTGGAGTTC
PCR Primer, indeks 11
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGCCGTGACTGGAGTTC
PCR Primer, Index 12
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACAAGGTGACTGGAGTTC - Utføre PCR sykling bruker følgende (denature for 30 s på 98 ° C, 18 sykluser av 10 s på 98 ° C, 30 s på 65° C, 30 s ved 72 ° C, 5 min ved 72 ° C, holde på 4 ° C).
Merk: Antall PCR sykluser bør fastsettes empirisk. - Størrelse utvalg av PCR produkter. Kjøre DNA på en sandsekk E-Gel EX (2%) eller hjemmelaget 2% gel (agarose) og avgiftsdirektoratet 300-500 bp regionen.
- Bruke en gel utvinning kit for å rense DNA fra gel. Elute PCR sluttprodukt i 20 µL EB bufferen.
- Bruke en fluorometer til å måle konsentrasjonen av biblioteket. Utfør neste generasjons sekvensering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi avhørt ble genomet hele binding av H3K4me3, H3K4me2 og KDM5B i ES celler ved hjelp av denne ChIP-Seq protocol6. ES celler ble dyrket i arkmateren uten betingelser (figur 1) og krysskoblet som beskrevet ovenfor. Sonication ble senere fremført som beskrevet i trinn 3.2 av ChIP-Seq-protokollen og vurdert av kjører DNA på en 2% agarose gel (figur 2). Deretter ChIP ble utført som beskrevet i trinn 4 og biblioteket forberedelse ble utført som beskrevet i trinn 6. ChIP-Seq biblioteker var sekvensielt på en neste generasjons sekvensering plattform. Representant egendefinerte UCSC nettleser visninger avsløre anriking av H3K4me3, H3K4me2 og KDM5B ved kjernen pluripotency genet POU5F1 (figur 3A) og HOXC klyngen (figur 3B). CARIP-Seq ble også fremført av følger protokollen som beskrevet i trinn 4 til 6. En representant UCSC Leservisning avslører anriking av H4K20me3-assosiert RNA (CARIP-Seq) og H4K20me3 belegg (ChIP-Seq) på en loci i ES celler (Figur 4). CARIP-Seq signalet viser at mens RNA er forbundet med H4K20me3, det ikke indikerer nødvendigvis at den samvirker med locus vises. CARIP-Seq datasett kan analyseres på en lignende måte som ChIP-Seq datasett. Dataene som genereres fra mus ES celle CARIP-Seq og ChIP-Seq eksperimenter kan både være justert til en referanse genomet (f.eks., mm9, mm10) med bowtie221. ChIP-Seq og CARIP-Seq beriket regioner kan både identifiseres med topp kalle programmer som "Romlig klynging for identifikasjon av ChIP-Enriched regioner" (SICER)22 eller Mac23,24. Fordi CARIP-Seq datasett sannsynlig inkluderer bred topper, er det viktig å bruke en algoritme som kan identifisere bred og skarpe topper. Mens protokollene beskrevet i dette manuskriptet er optimalisert for ChIP-Seq og CARIP-Seq bruker ES celler, disse protokollene bør også være egnet for evaluering av protein-DNA og chromatin-assosiert RNA interaksjoner i andre celletyper.
Figur 1: mater-fri kultur ES celler. (A) eksperimentell design. (B) ES celler kultivert på iMEFs i ES celle mediet som inneholder LIF eller i mater-gratis forhold med ES celle mediet som inneholder LIF og (C) GSK3i eller (D) GSK3i og MEKi (2i). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Sonication av krysskoblet ES celle chromatin. Krysskoblet ES celler ble sonicated med en sonifier med en microtip for 18 sykluser (40% amplitude, 30 s på og 30 søvn). Crosslinking ble tilbakeført, og RNase fordøyelsen ble senere utført for å fjerne RNA. DNA ble renset bruker PCI og kjører på en agarose gel (2%). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: representant ChIP-Seq analyse av en histone endring av enzymet og histone endringer i ES celler. Egendefinerte UCSC nettleser visninger av H3K4me3, H3K4me2 og KDM5B på pluripotency-regulatoren (A) POU5F1 og (B) HOXC klyngen i ES celler (normalisert tag tetthet (RPBM), PR base per million leser). Merk overlapping mellom KDM5B bindende og H3K4me3/2 personer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: representant CARIP-Seq analyse av RNA forbundet med histone endring og ChIP-Seq i ES celler. UCSC leseren utsikt over H4K20me3 CARIP-Seq og H4K20me3 ChIP-Seq signaler i ES celler (normalisert tag tetthet (RPBM), PR base per million leser). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ChIP-Seq er en nyttig metode for å vurdere plasseringen av globale protein-DNA samhandlinger (f.eks., transkripsjon faktorer/histone endre enzymer/histone modifikasjoner og DNA) i ES celler, mens den nyutviklede CARIP-Seq-protokollen er nyttig i forhøre genomet-bred sammenslutning av RNAs med chromatin bestanddeler. ChIP-Seq er et grunnleggende verktøy som brukes til å evaluere epigenetic landskap av ES celler og andre celletyper. Kvaliteten på ChIP-Seq og CARIP-Seq biblioteker er i stor grad avhengig av ChIP-grade antistoffer. Hensiktsmessigheten av antistoffer for ChIP-Seq kan empirisk bestemmes ved å utføre ChIP PCR, der en ≥ 3 til 5-fold berikelse positiv kontroll regioner i forhold til ledige områder bør være tilstrekkelig til å generere høy kvalitet ChIP-Seq data25. Likeledes, antistoffer kan være testet for deres egnethet for CARIP-Seq på en lignende måte som ChIP-Seq med mindre modifikasjoner. Følgende RNA IP trinnet i CARIP protokollen som beskrevet i avsnittet metoder ovenfor, skal omvendt-transkripsjon PCR utføres for å generere cDNA, som kan brukes som en mal til å utføre Q-RT-PCR. Det anbefales å evaluere anriking etter ChIP eller CARIP på flere genomisk regioner. Det er flere hensyn å teste når du vurderer kvaliteten av antistoffer for ChIP eller CARIP. For eksempel stringens buffrene ChIP og CARIP kan optimaliseres ved å endre konsentrasjonen av NaCl: en lav NaCl konsentrasjon er egnet for svært spesifikke antistoffer, mens høy NaCl konsentrasjon kan være nyttig for antistoffer med Uspesifisert binding. Om biblioteket forberedelse til neste generasjons sekvensering, egendefinerte primere og indekser kan også brukes i stedet for kommersielt ervervet oligonucleotides. Det er imidlertid viktig å merke seg at inkludert en phosphorothioate endring mellom to baser på 3 slutten har vist å hindre nuclease fordøyelsen26. Tredjeparts RNA-Seq eller ChIP-Seq biblioteket byggesett kan også brukes til å generere biblioteker for sekvensering av CARIP og ChIP prøver, henholdsvis. Det er imidlertid viktig å teste empirisk prosjektpakker å vurdere deres effekt i generere kvalitet biblioteker neste generasjons sekvensering. Ytterligere protokoller kan også brukes til å utføre ChIP-Seq biblioteket forberedelse, som ChIPmentation27. Tilpasning av ChIPmentation av ChIP-Seq-protokollen beskrevet her vil imidlertid kreve ytterligere endringer og ytterligere optimalisering.
Her beskriver vi ChIP og CARIP protokoller som har blitt optimalisert med moderat antall celler (4 × 106 celler per IP). Mens ChIP protokollen utføres med lav til middels cellen tallene (105 til 106 celler), vi har ikke utført CARIP-Seq bruker mindre enn 2 × 106 celler. Av empirisk testing ulike fiksering og sonication forhold, er det imidlertid mulig at denne protokollen virker vellykket bruker et lite antall celler.
I sammendraget er ChIP-Seq og CARIP-Seq nyttig for å generere globale kart chromatin-assosiert proteiner og RNAs i ES celler, henholdsvis. Mens disse protokollene er optimalisert for ES celler, kan de være optimalisert for å generere chromatin kart med et bredt utvalg av pattedyr linjer og vev typer. Disse protokollene kan også være optimalisert for å generere encellede ChIP-Seq eller CARIP-Seq biblioteker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklære noen interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Wayne State University, Karmanos Cancer Institute, et stipend fra National hjerte, lunge og blod Institute (1K22HL126842-01A1) til B.L.K. Dette arbeidet utnyttet Wayne State University høy ytelse Computing rutenettet for beregningsressurser (< https://www.grid.wayne.edu/>). Vi takker Jiji Kurup for hjelp med CARIP-Seq dataanalyse.
FORFATTERNES BIDRAG:
B.L.K. unnfanget av metoden CARIP-Seq, utformet og utført av ChIP-Seq og CARIP-Seq eksperimenter, analysert sekvensering dataene og utarbeidet manuskriptet. Alle forfattere har lest og godkjent den endelige versjonen av dette manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse leukemia inhibitory factor (ESGRO LIF) | EMD Millipore | 106 or 107 units | |
| GSK3β inhibitor CHIR99021 (GSK3i) | Stemgent | Solvent: DMSO 10mM | |
| MEK inhibitor PD0325901 (MEKi) | Stemgent | Solvent: DMSO 10mM | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose | Invitrogen | 11965092 | |
| PBS (phosphate buffered saline) | Invitrogen | 10010031 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| 2-Mercaptoethanol (50 mM) | Gibco | 31350010 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140076 | |
| EmbryoMax ES Cell Qualified Fetal Bovine Serum, 500 ml | EMD Millipore | ES-009-B | |
| EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | EMD Millipore | ES-006-B | |
| Glycine | Sigma | G7126-500G | 1.25 M stock conentration in water |
| Formaldehyde solution | Sigma | F8775-500ML | |
| TE (Tris EDTA) pH 8.0 1X | Quality Biological | 351-011-131 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) solution | Sigma | 93482-250ML-F | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697498001 | |
| Sodium dodecyl sulfate solution (20%) | Quality Biological | A611-0837-10 | |
| Q125 sonifier | Qsonica | 4422 | |
| Triton X-100 solution | Sigma | 93443-100ML | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation | Invitrogen | 10004D | |
| Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation | Invitrogen | 10002D | |
| Dynabeads Protein A/Protein G and Magnet Starter Pack | Invitrogen | 10015D | |
| Lithium chloride | Sigma | L4408 | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma | I8896 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Dynabeads mRNA Purification Kit (for mRNA purification from total RNA preps) | Invitrogen | 61006 | |
| SuperScript Double-Stranded cDNA Synthesis Kit | Invitrogen | 11917010 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| End-It DNA End-Repair Kit | Lucigen | ER81050 | |
| Klenow Fragment (3'→5' exo-) | NEB | M0212L | |
| dATP (10 mM) | Invitrogen | 18252015 | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202L | |
| TrackIt 1 Kb Plus DNA Ladder | Invitrogen | 10488085 | |
| E-gel EX agarose gels, 2% | Invitrogen | G402002 | |
| Phusion high-fidelity 2X master mix with HF buffer | Thermo Fisher | F531LPM | |
| ChIPAb+ Trimethyl-Histone H3 (Lys4) - ChIP Validated Antibody | EMD Millipore | 17-614 | |
| Anti-Histone H3 (di methyl K4) antibody [Y47] - ChIP Grade (ab32356) | Abcam | ab32356 | |
| Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-well) | Fisher | 720083 | |
| Falcon Standard Tissue Culture Dishes (10cm) | Fisher | 08772E | |
| Bioruptor pico | Diagenode | B01010001 | |
| Qubit Flurometer 2.0 | Thermo Fisher | ||
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32851 | |
| MinElute Reaction Cleanup Kit | Qiagen | 28204 | |
| MinElute Gel Extraction Kit | Qiagen | 28604 | |
| Anti-Histone H4 (tri methyl K20) antibody - ChIP Grade (ab9053) | Abcam | ab9053 | |
| Labquake rotator | Thermo Fisher | 400110Q | |
| Illumina HiSeq platform | Illumina | ||
| TURBO DNase | Invitrogen | AM2238 |
References
- Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
- Chen, X., et al. Integration of external signaling pathways with the core transcriptional network in embryonic stem cells. Cell. 133 (6), 1106-1117 (2008).
- Boyer, L. A., et al. Core transcriptional regulatory circuitry in human embryonic stem cells. Cell. 122 (6), 947-956 (2005).
- Kim, J., Chu, J., Shen, X., Wang, J., Orkin, S. H. An extended transcriptional network for pluripotency of embryonic stem cells. Cell. 132 (6), 1049-1061 (2008).
- Kidder, B. L., Hu, G., Yu, Z. X., Liu, C., Zhao, K. Extended self-renewal and accelerated reprogramming in the absence of Kdm5b. Mol Cell Biol. 33, 4793-4810 (2013).
- Kidder, B. L., Hu, G., Zhao, K. KDM5B focuses H3K4 methylation near promoters and enhancers during embryonic stem cell self-renewal and differentiation. Genome Biol. 15 (2), R32 (2014).
- Zhao, J., et al. Genome-wide identification of polycomb-associated RNAs by RIP-seq. Mol Cell. 40 (6), 939-953 (2010).
- Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Mol Cell. 46 (5), 674-690 (2012).
- Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).
- Hudson, W. H., Ortlund, E. A. The structure, function and evolution of proteins that bind DNA and RNA. Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (11), 749-760 (2014).
- Khalil, A. M., et al. Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression. P Natl Acad Sci USA. 106 (28), 11667-11672 (2009).
- Hendrickson, D. G., Kelley, D. R., Tenen, D., Bernstein, B., Rinn, J. L. Widespread RNA binding by chromatin-associated proteins. Genome Biol. 17, 28 (2016).
- Kelley, R. L., Kuroda, M. I. Noncoding RNA genes in dosage compensation and imprinting. Cell. 103 (1), 9-12 (2000).
- Koziol, M. J., Rinn, J. L. RNA traffic control of chromatin complexes. Curr Opin Genet Dev. 20 (2), 142-148 (2010).
- Mercer, T. R., Mattick, J. S. Structure and function of long noncoding RNAs in epigenetic regulation. Nat Struct Mol Bio. 20 (3), 300-307 (2013).
- Chu, C., et al. Systematic discovery of Xist RNA binding proteins. Cell. 161 (2), 404-416 (2015).
- Mak, W., et al. Reactivation of the paternal X chromosome in early mouse embryos. Science. 303 (5658), 666-669 (2004).
- Garfield, A. S. Derivation of primary mouse embryonic fibroblast (PMEF) cultures. Methods Mol Biol. 633, 19-27 (2010).
- Conner, D. A. Mouse embryo fibroblast (MEF) feeder cell preparation. Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 23 Unit 23 22 (2001).
- Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Zang, C., et al. A clustering approach for identification of enriched domains from histone modification ChIP-Seq data. Bioinformatics. 25 (15), 1952-1958 (2009).
- Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
- Liu, T. Use model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS) to analyze short reads generated by sequencing protein-DNA interactions in embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 1150, 81-95 (2014).
- Kidder, B. L., Hu, G., Zhao, K. ChIP-Seq: technical considerations for obtaining high-quality data. Nat Immunol. 12 (10), 918-922 (2011).
- Quail, M. A., et al. A large genome center's improvements to the Illumina sequencing system. Nat Methods. 5 (12), 1005-1010 (2008).
- Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors. Nat Methods. 12 (10), 963-965 (2015).
