Summary
Aqui, descrevemos os métodos para executar o ChIP-Seq e CARIP-Seq, incluindo preparação de biblioteca para o sequenciamento de última geração, para gerar epigenomic global e cromatina associada RNA mapas em pilhas do ES.
Abstract
Autorenovação de células estaminais embrionárias (ES) e a diferenciação é regulada por sinais extrínsecos e intrínsecas redes de fatores de transcrição, epigenéticos reguladores e modificações pós-tradução das histonas que combinatóriamente influenciam o gene Estado de expressão de genes nas proximidades. RNA também foi mostrado para interagir com várias proteínas para regular a dinâmica da cromatina e expressão gênica. Associada a cromatina RNA imunoprecipitação (CARIP) seguida por sequenciamento de próxima geração (CARIP-Seq) é um novo método para o levantamento de RNAs associados a proteínas da cromatina, enquanto imunoprecipitação da cromatina, seguido por sequenciamento de próxima geração ( ChIP-Seq) é uma técnica poderosa genômica para mapear a localização de modificação pós-traducional de histonas, fatores de transcrição e modificadores epigenéticas em uma escala global em pilhas do ES. Aqui, descrevemos os métodos para executar CARIP-Seq e ChIP-Seq, incluindo a construção da biblioteca para geração de sequenciamento, para gerar o RNA global associada a cromatina e epigenomic mapas em pilhas do ES.
Introduction
Decisões de destino de células estaminais embrionárias (ES) são reguladas pela comunicação entre sinais extracelulares e uma série de reguladores transcricionais, incluindo modificadores de histona e modificação pós-tradução de caudas de histona. Essas interações facilitam a acessibilidade de cromatina e empacotamento da cromatina em um dos dois Estados: eucromatina, que é aberto e transcricionalmente ativo, e heterocromatina, que é compacto e geralmente transcricionalmente inativo. Factores de transcrição com afinidades de ligação de sequência específica de DNA e modificadores epigenéticas associado com as regiões de eucromatina a participar no controle da expressão gênica. Métodos de sequenciamento de próxima geração, incluindo ChIP-Seq1, têm sido fundamentais para mapear todo o genoma redes transcriptional que são fundamentais para ES célula auto-renovação e pluripotência2,3,4 ,5,6. Além disso, enquanto o RNA immunopreciation seguido de próxima geração sequenciamento (RIP-Seq)7 avaliações interações RNA-proteína sugerem que as proteínas de ligação do DNA interagem com RNAs de regulação transcricional eventos7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12, poucos estudos têm investigado a localização de todo o genoma de RNAs associados com cromatina12, ou interações globais entre RNA e histona modificações. Há muito tempo não-codificantes RNAs (lncRNAs) são uma classe de RNAs que foram encontrados para regular a atividade de proteínas da cromatina associada13,14,15. Por exemplo, a Xist é um lncRNA que regula, em células de mamíferos femininas, inativação de um cromossomo X, através do recrutamento de repressores epigenéticas16,17. No entanto, o espectro completo de RNAs associados a cromatina é desconhecido. Aqui, descrevemos um protocolo romance, associada a cromatina RNA imunoprecipitação (CARIP) seguido por sequenciamento de próxima geração (CARIP-Seq), para identificar a cromatina associada RNAs em uma base de todo o genoma em pilhas do ES, incluindo a preparação de biblioteca para sequenciamento de nova geração e ChIP-Seq para mapear ocupação global de modificações do histone, fatores de transcrição e epigenéticas modificadores. Ao contrário de outros métodos de RIP-Seq7, CARIP-Seq inclui etapas de reticulação e sonication, que permitem a identificação directa das RNAs associados a cromatina. Juntos, ChIP-Seq é uma poderosa ferramenta para identificar as interações proteína-ADN de todo o genoma, enquanto CARIP-Seq é um método poderoso para o levantamento RNAs associados a componentes de cromatina.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. cultura de Mouse ES células em condições de livre de alimentador.
Nota: As pilhas do rato ES convencionalmente são cultivadas nos meios de comunicação em um prato de cultura celular revestido com gelatina e uma mono-camada de fibroblastos embrionários do mouse (MEF), que foram mitotically inativado (iMEFs). No entanto, MEFs devem ser removidos antes da jusante análises epigenéticas ou expressão para evitar a contaminação do MEF-associado da cromatina e do RNA.
- Preparação de uma camada de alimentador: gelatina revestir uma placa de cultura de células de 6-poço, adicionando 2 mL de 0.1% de gelatina em água e incubar a placa a 37 ° C por 20-30 min.
- Prepare a mídia de alta-glicose DMEM 10% contendo 2 mM L-glutamina, 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1 x penicilina/estreptomicina.
- MEFs de E13.5 para E14.5 os ratos18,19 de isolar ou adquirir de um fornecedor comercial. Mitotically inativar MEFs, tratando com mitomicina C ou irradiação gama usando protocolos padrão19. Alternativamente, mitotically inativado MEFs (iMEFs) podem ser adquiridos de um fornecedor comercial.
- Cultivo de MEFs. Pré-aquecer a mídia MEF a 37 ° C, descongelar congelado frasco de iMEFs e cultura em 10% mídia FBS MEF a 37 ° C com 5% CO2. Placa MEFs no ~ 200.000 células por poço de um prato de cultura 6-poços.
- Cultivo de células ES em uma camada de células de alimentador (iMEFs).
- 12-24 h após o chapeamento do iMEFs, pre-aquecer um tubo de 50 mL de mídia de célula ES (DMEM alta-glicose, LIF (10 ng/mL), 15% ES célula qualificado FBS, qualificada em cultura de células de 1 × 2-Mercaptoetanol 1 × glutamina, aminoácidos não essenciais (timina), 1 × penicilina/estreptomicina), a 37 ° C com 5% de CO2.
- Aspire os meios das placas de cultura de células contendo iMEFs, re-suspender as células ES em 2 mL de mídia (após o descongelamento a 37 ° C) e as células na camada de iMEFs da placa. Ao colocar o prato de cultura na incubadora, é importante mover o prato em forma de "t" para distribuir as células e prevenir a agregação em direção ao centro do prato.
- Passagem das células ES para pratos livre de alimentador de gelatina-revestido. Passagem das células ES antes que eles se tornam confluentes. Colônias de células ES mantenham auto-renovação melhor se as colônias são uniformemente espaçadas e não confluente. A presença de muitas colônias de células ES que estão tocando indica que a densidade celular é muito alta.
- Revesti um prato de cultura 6-poços com gelatina conforme descrito acima. Incubar a 0,25% do trypsin-EDTA a 37 ° C por ~ 10-15 min de tripsina pre-aquecida.
- Em seguida, passagem das células ES primeira lavagem com 1 x salina tamponada fosfato (PBS) e adicionando 1 mL de solução de EDTA-tripsina 0,25%. Espere 1-2 min para as colônias desanexar. Dissociar as colônias para uma suspensão de célula única pipetando com uma ponta de 1 mL para ~ 5 vezes.
- Use um microscópio para confirmar a dissociação de célula única das células ES. Para saciar a reação, ou para "neutralizar" a tripsina, adicione 10% MEF FBS mídia. Centrifugar as células a 300 x g, à temperatura ambiente por 3-5 min e aspire a mídia.
- Ressuspender o sedimento celular em 2 mL de mídia (células ES) suplementado com inibidor de (GSK3) do glicogênio sintase quinase-3 (CHIR99021; GSK3i), ou 2i condições (MEKi/GSK3i) (2-3 µM GSK3i: CHIR99021, 1 µM MEKi: PD0325901).
- Aspire a gelatina do prato de cultura celular, adicionar 2 mL de mídia contendo CES no prato e coloque o prato na incubadora a 37 ° C (figura 1A-D). Dupla inibição da GSK3i e MEKi promove estado fundamental ingênuo pluripotência das células ES na ausência de células do alimentador (iMEFs) e sem soro20. As células ES devem ser passadas duas a três vezes para remover MEFs antes de prosseguir para a reticulação.
2. a reticulação de ES células para ChIP e CARIP
- Recolher as células ES por lavá-las com PBS e, em seguida, adicione a tripsina 0,25% pré aquecida a 37 ° C. Incube as celulas por vários minutos à temperatura ambiente. Evite o excesso de tripsinização de pilhas do ES, que levará à morte celular. Use um microscópio para avaliar a dissociação de célula única.
- Saciar a digestão do trypsin, como descrito acima para a passagem de células ES e centrifugar as células a 300 x g, à temperatura ambiente por 3-5 min.
- Ressuspender as células em meios MEF pré-aquecido (37 ° C) (10% FBS/DMEM) a 2 × 106 células/mL.
- A ligação cruzada das células, adicionar solução de formaldeído 37% para uma concentração final de 1% e as células em um tubo cónico (15 mL ou 50 mL), incubar a 37 ° C por 8 min. inverta o tubo várias vezes durante o período de 8 min para alcançar a fixação homogênea.
Nota: O tempo de fixação pode ser empiricamente otimizado para CARIP. Se o tempo de fixação é alterado, o número de ciclos de sonication também deve ser ajustado. Além disso, a temperatura de 37 ° C aumenta a eficiência de reticulação comparada a reticulação à temperatura ambiente. A temperatura de fixação pode ser otimizada empiricamente. - Para parar a reação de fixação, adicionar 1,25 M glicina (pre-refrigerada a 4 ° C) a uma concentração de 0,125 M. inverta o tubo a 8 rpm usando um rotador por 5 min à temperatura ambiente. Centrifugar a amostra a 300 x g durante 5 min à temperatura ambiente e Aspire os meios de comunicação.
- Lave o centrifugado com PBS pré-refrigerada (4 ° C), centrifugar a amostra a 300 x g durante 5 min à temperatura ambiente e Aspire PBS. Lave as células com PBS. Em seguida, alíquota 15 × 106 células por tubo de 15 mL.
- Congelar o centrifugado, colocando-o em nitrogênio líquido por 1 min, em gelo seco por 5 min, ou coloque imediatamente a-80 ° C.
Nota: ES fixo celular pelotas podem ser armazenadas por até 6 meses sem diminuição da qualidade em experimentos a jusante.
3. sonication cromatina para ChIP e CARIP
- Descongele o fixo centrifugado ES no gelo. Ressuspender o pellet de células no buffer sonication (2,5 mL). Para factores de transcrição ou epigenéticos reguladores (fatores de proteína), Ressuspender o sedimento em 1x TE, 1 mM PMSF, 1 x coquetel de inibidor de proteinase. Para modificações do histone, Ressuspender o sedimento em 1 x TE, 0,1% SDS, 1mm PMSF, 1 inibidor de proteinase de x.
Nota: Enquanto a adição de SDS aumenta a eficiência de sonication, pode não ser benéfico para avaliar determinados constituintes de cromatina ou fatores de transcrição. - Por imunoprecipitação da cromatina (ChIP), proceda à sonicação cromatina com ciclos de 14-18 (30 s na, resto de s 30) em amplitude de 40%. Para a cromatina associada RNA imunoprecipitação (CARIP), reduza o número de sonication ciclos (8-10). Devido ao celular, fixação e variabilidade sonifier, condições para sonication devem ser determinadas empiricamente.
- Suplemento o buffer sonication com 28 µ l de SDS 10% para a proteína-fatores, 28 µ l de sódio-Deoxycholate do e 0,28 mL 10% Triton-X100, e misture bem.
Nota: A adição destes componentes para o buffer de sonication gera o amortecedor de RIPA. - Centrifugar a amostra a 10.000 x g durante 10 minutos a 4 ° C para limpar previamente a cromatina. Mover o sobrenadante para um tubo novo e prosseguir com imunoprecipitação da cromatina.
- Alternativamente, lisada cromatina pode ser armazenada a-80 ° C até o uso. No entanto, o armazenamento da cromatina lisado a-80 ° C pode levar a qualidade reduzida para ChIP de proteína-fator.
4. chIP e processo CARIP
- Adicione 40 µ l de proteína A ou grânulos magnéticos G para um 1,5 mL, tubo de ligação de baixa. Adicione 600 µ l de PBS para lavar os grânulos. Coloque o tubo sobre um rack contendo um imã, incubar o tubo por 1 min à temperatura ambiente, remover o PBS e ressuspender as esferas magnéticas em 100 µ l de PBS.
- Adicione 2-4 µ g de anticorpo para o tubo com grânulos magnéticos. Incubar e gire o tubo em temperatura ambiente por 40 min a 8 rpm usando um rotador para facilitar a ligação de anticorpos para as esferas magnéticas. Inserir o tubo sobre o rack magnético, incube-lo por 1 min à temperatura ambiente e, em seguida, remover o PBS.
- Adicione 200 µ l de PBS para lavar as esferas magnéticas. Lavagem com PBS é realizada para remover IgGs livre. Incubar e gire o tubo em temperatura ambiente por 5 min entre as etapas de lavagem. Fixar o tubo ao ímã e remover a PBS.
- Proteínas de cromatina-limite immunoprecipitate incubando a cromatina lisada extrair (× 10 46 células por ChIP), com as esferas magnéticas e giram a amostra a 4 ° C (a noite).
- Lave os grânulos magnéticos. Incubar a amostra em temperatura ambiente com os seguintes buffers e girar a amostra durante 10 minutos com cada buffer: duas vezes com 1 mL de tampão RIPA (pH TE (10mm Tric-HCl, 1 mM EDTA) 8.0, 1% Triton X-100, deocycholate de 0,1% de sódio, 0,1% SDS), duas vezes com 1 mL de RIPA tampão c ontaining 0,3 M NaCl, duas vezes com 1 mL de tampão de LiCl (0,5% de sódio deocycholate, 0.5% NP40, 0,25 M LiCl), uma vez com 1 mL de TE buffer com 0,2% Triton X-100 e uma vez com 1 mL de et.
- De-reticulação para ChIP. Re-suspenda as esferas magnéticas em 100 µ l de TE. Adicione 3 µ l de SDS 10% e 5 µ l de proteinase K (20 mg/mL). Incube a amostra a 65 ° C (a noite).
Nota: É importante cobrir os tubos durante esta etapa com parafilme ou filme plástico para evitar a evaporação.- No dia seguinte, inverta o tubo várias vezes para misturar. Em seguida, utilize o cesto de ímã para transferir o sobrenadante para um tubo de fresco. Lave os grânulos magnéticos, adicionar 100 µ l de TE contendo 0,5 M de NaCl, e posteriormente combinar os dois sobrenadantes.
- De-ligando para CARIP. Re-suspenda as esferas magnéticas em 100 µ l de TE. Adicione 3 µ l de SDS 10% e 5 µ l de proteinase K (20 mg/mL). Incube a amostra a 65 ° C, durante 4 a 12 h de incubação tempo a 65 ° C precisa ser determinado empiricamente devido à variabilidade entre tipos de células, sonication e fixação de condições, etc.
- Inverter o tubo 3 - 5 vezes para misturar, aplicar o tubo ao rack magnético e posteriormente mudar o sobrenadante para um tubo de fresco.
- Lave os grânulos magnéticos, adicionar 100 µ l de TE contendo 0,5 M de NaCl, e posteriormente combinar os dois sobrenadantes.
Nota: É importante usar reagentes livre de nuclease (EG., buffer de TE, SDS, etc.) para evitar a perda de DNA ou RNA durante a etapa de reticulação.
- Extraia o DNA/RNA usando 200 µ l de álcool isoamílico: fenol: clorofórmio (PCI) (25:24:1, v/v).
Nota: RNA pode também ser extraído usando jogos comerciais usando as instruções do fabricante. Agitar durante 30 s, girar a 10.000 x g em temperatura ambiente por 10 min e mover o sobrenadante para um tubo de fresco.- Para precipitar o DNA/RNA, adicione 2 µ l de GlycoBlue, 20 µ l de acetato de sódio 3M e 600 µ l de etanol. Misturar por inversão ~ 5-8 vezes e colocar a amostra em gelo seco ou a-80 ° C durante pelo menos 1-2 h.
- Centrifugar a amostra a 10.000 x g, durante 30 min utilizando uma centrífuga de mesa refrigerada (4 ° C). Ar seco a pelota para < 1 min e ressuspender em 40 µ l de EB buffer (10 mM Tris-HCl). Para a preparação de biblioteca de ChIP-Seq, vá para a etapa 6.
- Remova o DNA da cromatina associada amostras de RNA IP usando DNase. Adicione o buffer de DNase 10 x 1 concentração de x na amostra CARIP. Adicione 1 µ l de DNase para até 10 µ g de RNA (reação de 50 µ l). Incube a amostra a 37 ° C por 30 min. extrato da amostra de RNA com PCI. Resuspenda em livre de nuclease H2O.
5. double-stranded cDNA síntese para CARIP-Seq
- Síntese do cDNA da primeiro-costa. Para a transcrição reversa reação, configurar a seguinte reação em um tubo projetado para uma máquina PCR: 10.5 µ l de RNA e 1 µ l aleatório de primers hexâmero (3 µ g / µ l).
- Incubar o tubo a 65 ° C por 5 min desnaturar a estrutura secundária e armazená-lo no gelo por 2 min. misturar os seguintes componentes: 4 µ l de buffer de primeiro-costa, 2 µ l de 0,1 M DTT, 1 µ l de dNTP e 0.5 RNase para fora. Em seguida, para o tubo PCR, adicione 7,5 µ l do mix principal. Incubar o tubo para 2 min a 25 ° C. Adicione 1 µ l de sobrescrito II (200 U / µ l) e incube como segue: 25 ° C por 10 min, 42 ° C, durante 50 min, 70 ° C durante 15 min e espera a 4 ° C.
- Síntese de cDNA da segundo-costa. Coloca o tubo no gelo. Em seguida, adicione os seguintes componentes em ordem: 91 µ l de pyrocarbonate de dietilo (DEPC) tratamento de água, 30 µ l de 5 x amortecedor da reação da segunda vertente, 3 µ l de dNTP mix (10 mM), 1 µ l de e. Coli DNA ligase (10 U / µ l), 4 µ l de e. Coli DNA polimerase (10U / µ l) e 1 µ l de Escherichia Coli RNase H (2U / µ l). Misture delicadamente vortexing e incubar a 16 ° C por 2 h.
Nota: Por agredir ou inversão do tubo de mistura pode não ser suficiente para homogeneizar completamente os reagentes. - Adicionar 2 µ l de T4 DNA polimerase e incubar a 16 ° C por 5 min. Purify cDNA (double-stranded, dscDNA), usando o kit de purificação de PCR. Eluir a dscDNA em 40 µ l de tampão EB.
- Fragmento de cDNA double-stranded. Cisalhamento do cDNA (dscDNA) usando um sonifier de banho de água e um tubo de 1,5 mL para um tamanho de 250-500 BP Sonication da dscDNA é fundamental para reduzir o tamanho do fragmento para facilitar o sequenciamento da transcrição do RNA inteira.
- Ao usar um modelo padrão de um sonifier de banho-Maria, proceda à sonicação a amostra para 3 × 10 min, ou 4 × 10 min.
Nota: Três ciclos devem ser usados para até 1 µ g de RNA total, enquanto quatro ciclos são recomendados para 1-5 µ g de RNA total. Centrifugar o tubo momentaneamente após cada ciclo de sonication e manter um banho de água fria, adicionando gelo fresco. - Ao usar um sonifier de Pico, é recomendável usar seis ciclos para 1-5 µ g de RNA total e as seguintes condições de ciclismo (30 s na, 90 s fora). Centrifugar o tubo momentaneamente após 2-3 ciclos de sonication. A eficiência do sonication pode ser determinada por carregar uma fração do dscDNA cortado (3-4 µ l) em um gel de agarose (2%). É importante testar empiricamente condições sonication devido à variabilidade entre sonificadors.
- Execute a preparação da biblioteca conforme descrito na etapa 6 para o sequenciamento de próxima geração.
6. chIP-Seq e construção da biblioteca CARIP-Seq
- Repare extremidades do ADN, usando um jogo de final-reparo do DNA. Este kit é usado para gerar o ADN sem corte-terminado. Para esta reação, configurar o seguinte em um 1,5 mL, tubo de ligação de baixa: 34 µ l de DNA, 5 µ l de dNPTs de 2,5 mM, 5 µ l de 10mm ATP, 5 µ l de 10 x final-reparo amortecedor (5 mM DTT, 100 milímetros magnésio acetato, acetato de potássio 660mm 300 mM Tris-Acetato, pH 7,8) e 1 µ l de reparação final mistura de enzima (quinase de polinucleotido T4, T4 DNA polimerase).
- Incube a amostra por 45 min à temperatura ambiente.
- Purifica DNA usando um kit de limpeza de reação. Eluir DNA final-reparado em 32 µ l de tampão EB pré-aquecido (65 ° C). Enquanto nós normalmente não dosar a concentração de DNA, ChIP, ou RNA CARIP, a seguir antes da preparação da biblioteca, a seguir é recomendável começar com pelo menos 5-10 ng de ChIP de DNA ou RNA CARIP.
- Adição de uma saliência de 3' "A" ao fim-reparação do DNA. Adicione os componentes a um 1,5 mL, tubo de ligação baixa: 30 µ l de DNA acima, 5 µ l de tampão de NEB 2, 1 µ l de dATP de estoque de 10 mM, 11 µ l de H2O e 3 µ l de 5 U de 10x / fragmento de Klenow µ l (3' - 5' Exo-) e misture suavemente pipetando.
- Incubar a amostra por 30 min a 37 ° C.
- Use um kit de limpeza de reação para purificar DNA. Eluir o DNA em 25 µ l de tampão EB pré-aquecido (65 ° C).
- Ligar o adaptador. Adicione os seguintes componentes no gelo: 23 µ l de DNA de cima, 3 µ l de buffer de ligase 10 x T4 DNA, 1 µ l de PE recozido ou multiplexação adaptador (4 µM) e 3 µ l de T4 DNA ligase (400 U / µ l) e misture suavemente pipetando.
Nota: Sequências de adaptador também podem ser obtidas de uma fonte comercial.
Sequências do oligonucleotide:
Adaptadores de PE
5' P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAGGAATGCCGAG
5' ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
Adaptadores de multiplexação
5' P-GATCGGAAGAGCACACGTCT
5' ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT - Incube a amostra por 30 min à temperatura ambiente.
- Realize a seleção de tamanho de DNA usando um gel de agarose (% 2) a pre-cast. Funcione o gel por 10 min.
- Impostos especiais de consumo na área correspondente ao bp 250-450.
Nota: cortando o gel acima acima de 200 bp, há uma diminuição da possibilidade de contaminação de dímeros de adaptador unligated. É importante remover quaisquer adaptadores de unligated antes da etapa PCR. - Use um kit de extração do gel para purificar DNA. Eluir em 20 µ l de tampão EB.
- Purificação do PCR e biblioteca de DNA ligado amostras contendo adaptadores emparelhado-final (PE). Adicione os componentes em um tubo PCR: 12 µ l de 50% do DNA de cima, 12 µ l de água, 25 µ l de mistura de mestre (Phusion HF), 1 µ l de primer PCR PE 1.0 e 1 µ l de primer PCR PE 2.0.
Nota: As sequências do Oligonucleotide também podem ser obtidas de uma fonte comercial.
Sequências do oligonucleotide:
PE do PCR Primer 1.0
5' AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
PE do PCR Primer 2.0
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT - Purificação do PCR e biblioteca para ligados amostras contendo adaptadores índice PE. Adicione os componentes: 12 µ l de 50% do DNA de cima, 12 µ l de água, 1 µ l de primer PCR InPE 1.0 (diluído 1:2), 1 µ l de primer PCR InPE 2.0 (diluído 1:2) e 1 µ l de primer PCR índice (diluído 1:2).
Nota: as sequências do oligonucleotide também podem ser obtidas de uma fonte comercial.
Sequências do oligonucleotide:
Multiplexação de PCR Primer 1.0
5' AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
Multiplexação de PCR Primer 2.0
5' GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
Sequências de índice da primeira demão do PCR 1-12
Primeira demão do PCR, índice 1
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTC
Primeira demão do PCR, índice 2
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTC
Primeira demão do PCR, índice 3
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTC
Primeira demão do PCR, índice 4
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTC
Primeira demão do PCR, índice 5
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTC
Primeira demão do PCR, índice 6
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTC
Primeira demão do PCR, índice 7
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGATCTGGTGACTGGAGTTC
Primeira demão do PCR, índice 8
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCAAGTGTGACTGGAGTTC
Primeira demão do PCR, índice 9
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCGTGACTGGAGTTC
Primeira demão do PCR, índice 10
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCTAGTGACTGGAGTTC
Primeira demão do PCR, índice 11
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGCCGTGACTGGAGTTC
Primeira demão do PCR, índice 12
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACAAGGTGACTGGAGTTC - Realizar PCR ciclismo usando as seguintes condições (desnaturação por 30 s a 98 ° C, 18 ciclos de 10 s a 98 ° C, 30 s a 65° C, 30 s a 72 ° C, 5 min a 72 ° C, manter a 4 ° C).
Nota: O número de ciclos PCR deve ser determinado empiricamente. - Seleção do tamanho dos produtos PCR. Faça o teste de DNA em um E-Gel pré-moldado EX (2%) ou caseiro 2% gel (agarose) e região de 300-500 bp impostos especiais de consumo.
- Use um kit de extração do gel para purificar o DNA do gel. Eluir o produto final da PCR em 20 µ l de tampão EB.
- Use um dados para medir a concentração da biblioteca. Execute a próxima geração sequenciamento.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Interrogámo com êxito a ligação de todo o genoma de H3K4me3, H3K4me2 e KDM5B em células ES usando este ChIP-Seq protocolo6. ES as células foram cultivadas em condições de livre de alimentador (Figura 1) e reticulado como descrito acima. Sonication posteriormente foi realizada conforme descrito na etapa 3.2 do protocolo ChIP-Seq e avaliado pela execução de DNA em um gel de agarose a 2% (Figura 2). Em seguida, o ChIP foi realizada conforme descrito na etapa 4 e preparação da biblioteca foi realizada conforme descrito na etapa 6. ChIP-Seq bibliotecas foram sequenciadas em uma plataforma de sequenciamento de próxima geração. Exibições personalizadas representativas do navegador UCSC revelaram enriquecimento de H3K4me3, H3K4me2 e KDM5B no gene de pluripotência núcleo POU5F1 (Figura 3A) e no cluster de HOXC (Figura 3B). CARIP-Seq também foi realizado seguindo o protocolo como descrito nos passos 4-6. Uma exibição de navegador UCSC representativa revela enriquecimento de RNA associado a H4K20me3 (CARIP-Seq) e ocupação H4K20me3 (ChIP-Seq) em um loci em pilhas do ES (Figura 4). O sinal de CARIP-Seq demonstra que enquanto o RNA é associado com H4K20me3, isso não indica necessariamente que interage com o locus mostrado. CARIP-Seq conjuntos de dados podem ser analisados em uma maneira similar como conjuntos de dados do ChIP-Seq. Célula de dados gerados a partir do mouse ES CARIP-Seq e ChIP-Seq experimentos podem ser alinhados de um genoma de referência (ex., mm9, mm10) usando bowtie221. ChIP-Seq e regiões CARIP-Seq enriquecido podem ambos ser identificadas usando programas chamada de pico como "Spatial Clustering para identificação de ChIP-Enriched regiões" (SICER)22 ou MACS23,24. Porque CARIP-Seq datasets prováveis incluir grandes picos, é importante usar um algoritmo que pode identificar picos grandes e afiados. Enquanto os protocolos descritos neste manuscrito foram otimizados para executar o ChIP-Seq e CARIP-Seq usando células ES, esses protocolos também devem ser adequados para a avaliação da proteína-ADN e cromatina associada a interações de RNA em outros tipos de células.
Figura 1: livre de alimentador de cultura de células ES. (A) desenho experimental. (B) ES células cultivadas em iMEFs no ES mídia contendo LIF de célula, ou em condições de livre de alimentador com ES célula mídia contendo LIF e (C) GSK3i ou GSK3i (D) e MEKi (2i). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Sonication da cromatina de célula de quitosana ES. As células ES de quitosana foram lisadas utilizando um sonifier com um microtip para 18 ciclos (amplitude de 40%, 30 s em e 30 s de descanso). Reticulação foi revertida, e digestão de RNase posteriormente foi realizada para remover o RNA. DNA foi purificada usando PCI e executar em um gel de agarose (2%). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: análise de representante ChIP-Seq de uma histona modificando a enzima e histona modificações nas células ES. Exibições personalizadas do navegador UCSC de H3K4me3, H3K4me2 e KDM5B a pluripotência-regulador (A) POU5F1 e o cluster HOXC (B) nas células ES (densidade marca normalizado (RPBM), leia-se por base por milhões leituras). Observe a sobreposição entre a ligação KDM5B e ocupação de H3K4me3/2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: representante CARIP-Seq análise do RNA associado a uma modificação do histone e ChIP-Seq em células ES. UCSC browser vistas de sinais H4K20me3 CARIP-Seq e H4K20me3 ChIP-Seq em pilhas do ES (densidade marca normalizado (RPBM), leia-se por base por milhões leituras). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ChIP-Seq é um método útil para avaliar o local de interações proteína-ADN global (ex., fatores de transcrição/histona modificando as modificações de histona/enzimas e DNA) em células ES, enquanto o protocolo de CARIP-Seq recentemente desenvolvido é útil em Associação de todo o genoma de RNAs com constituintes de cromatina a interrogar. ChIP-Seq é uma ferramenta fundamental que é usada para avaliar epigenéticas paisagens de pilhas do ES e outros tipos de células. A qualidade do ChIP-Seq e bibliotecas CARIP-Seq é largamente dependente de anticorpos de ChIP-grau. A adequação dos anticorpos para ChIP-Seq pode ser determinada empiricamente através da realização de ChIP-PCR, onde um ≥ 3 5-fold enriquecimento em regiões de controlo positivo em relação a regiões desocupadas deve ser suficiente para gerar alta qualidade ChIP-Seq dados25. Da mesma forma, os anticorpos podem ser testados para sua adequação para CARIP-Seq de maneira semelhante conforme descrito por ChIP-Seq com pequenas modificações. Seguindo o passo de RNA IP no protocolo CARIP, conforme descrito na seção de métodos acima, transcrição reversa PCR deve ser realizada para gerar cDNA, que pode ser usado como um modelo para executar Q-RT-PCR. Recomenda-se avaliar o enriquecimento seguindo o ChIP ou CARIP em várias regiões genômicas. Existem considerações adicionais para testar ao avaliar a qualidade dos anticorpos para ChIP ou CARIP. Por exemplo, o rigor dos buffers usados para ChIP e CARIP pode ser otimizado, alterando a concentração de NaCl: uma baixa concentração de NaCl é adequada para anticorpos altamente específicos, enquanto uma alta concentração de NaCl pode ser útil para detecção de anticorpos com ligação não-específica. Relativas à preparação da biblioteca para a próxima geração de sequenciamento, primers personalizados e índices também podem ser usados em vez de oligonucleotides adquiridos comercialmente. No entanto, é importante notar que incluindo uma modificação phosphorothioate entre duas bases na extremidade 3' tem sido mostrado para impedir nuclease digestão26. Kits de construção RNA-Seq ou ChIP-Seq do biblioteca terceiros também podem ser usados para gerar bibliotecas para sequenciamento de CARIP e ChIP amostras, respectivamente. No entanto, é importante testar empiricamente os kits para avaliar sua eficácia nas bibliotecas de qualidade geradora para a próxima geração de sequenciamento. Protocolos adicionais também podem ser empregados para executar a preparação da biblioteca de ChIP-Seq, tais como ChIPmentation27. No entanto, a adaptação de ChIPmentation para o protocolo de ChIP-Seq descrito aqui exigirá modificações adicionais e mais otimização.
Aqui, descrevemos o ChIP e CARIP protocolos que foram otimizados usando um número moderado de células (4 × 106 por IP). Enquanto o protocolo de ChIP pode ser executado usando números de telemóvel baixas a intermédias (105 106 células), que não temos realizado CARIP-Seq usando menos de 2 × 106 células. No entanto, testando diferentes condições de fixação e sonication empiricamente, é possível que este protocolo pode funcionar com êxito usando um pequeno número de células.
Em resumo, ChIP-Seq e CARIP-Seq são úteis para a geração de mapas globais de cromatina associada a proteínas e RNAs em pilhas do ES, respectivamente. Enquanto estes protocolos foram otimizados para células ES, eles podem ser otimizados para gerar mapas de cromatina usando uma grande variedade de linhas de células de mamíferos e tipos de tecido. Esses protocolos também podem ser otimizados para gerar monocelulares ChIP-Seq ou bibliotecas CARIP-Seq.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores declaram não haverá conflito de interesses.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por Wayne estado Universidade, Karmanos Cancer Institute, uma concessão do nacional do coração, pulmão e sangue Institute (1K22HL126842-01A1) atribuído a B.L.K. Este trabalho utilizou o Wayne estado Universidade High Performance Computing Grid para recursos computacionais (< https://www.grid.wayne.edu/>). Agradecemos Jiji Kurup assistência com análise de dados de CARIP-Seq.
CONTRIBUIÇÕES DOS AUTORES:
B.L.K. concebeu o método de CARIP-Seq, concebidos e realizados os experimentos de ChIP-Seq e CARIP-Seq, analisou os dados de sequenciamento e elaborou o manuscrito. Todos os autores leu e aprovou a versão final deste manuscrito.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse leukemia inhibitory factor (ESGRO LIF) | EMD Millipore | 106 or 107 units | |
| GSK3β inhibitor CHIR99021 (GSK3i) | Stemgent | Solvent: DMSO 10mM | |
| MEK inhibitor PD0325901 (MEKi) | Stemgent | Solvent: DMSO 10mM | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose | Invitrogen | 11965092 | |
| PBS (phosphate buffered saline) | Invitrogen | 10010031 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| 2-Mercaptoethanol (50 mM) | Gibco | 31350010 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140076 | |
| EmbryoMax ES Cell Qualified Fetal Bovine Serum, 500 ml | EMD Millipore | ES-009-B | |
| EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | EMD Millipore | ES-006-B | |
| Glycine | Sigma | G7126-500G | 1.25 M stock conentration in water |
| Formaldehyde solution | Sigma | F8775-500ML | |
| TE (Tris EDTA) pH 8.0 1X | Quality Biological | 351-011-131 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) solution | Sigma | 93482-250ML-F | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697498001 | |
| Sodium dodecyl sulfate solution (20%) | Quality Biological | A611-0837-10 | |
| Q125 sonifier | Qsonica | 4422 | |
| Triton X-100 solution | Sigma | 93443-100ML | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation | Invitrogen | 10004D | |
| Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation | Invitrogen | 10002D | |
| Dynabeads Protein A/Protein G and Magnet Starter Pack | Invitrogen | 10015D | |
| Lithium chloride | Sigma | L4408 | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma | I8896 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Dynabeads mRNA Purification Kit (for mRNA purification from total RNA preps) | Invitrogen | 61006 | |
| SuperScript Double-Stranded cDNA Synthesis Kit | Invitrogen | 11917010 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| End-It DNA End-Repair Kit | Lucigen | ER81050 | |
| Klenow Fragment (3'→5' exo-) | NEB | M0212L | |
| dATP (10 mM) | Invitrogen | 18252015 | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202L | |
| TrackIt 1 Kb Plus DNA Ladder | Invitrogen | 10488085 | |
| E-gel EX agarose gels, 2% | Invitrogen | G402002 | |
| Phusion high-fidelity 2X master mix with HF buffer | Thermo Fisher | F531LPM | |
| ChIPAb+ Trimethyl-Histone H3 (Lys4) - ChIP Validated Antibody | EMD Millipore | 17-614 | |
| Anti-Histone H3 (di methyl K4) antibody [Y47] - ChIP Grade (ab32356) | Abcam | ab32356 | |
| Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-well) | Fisher | 720083 | |
| Falcon Standard Tissue Culture Dishes (10cm) | Fisher | 08772E | |
| Bioruptor pico | Diagenode | B01010001 | |
| Qubit Flurometer 2.0 | Thermo Fisher | ||
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32851 | |
| MinElute Reaction Cleanup Kit | Qiagen | 28204 | |
| MinElute Gel Extraction Kit | Qiagen | 28604 | |
| Anti-Histone H4 (tri methyl K20) antibody - ChIP Grade (ab9053) | Abcam | ab9053 | |
| Labquake rotator | Thermo Fisher | 400110Q | |
| Illumina HiSeq platform | Illumina | ||
| TURBO DNase | Invitrogen | AM2238 |
References
- Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
- Chen, X., et al. Integration of external signaling pathways with the core transcriptional network in embryonic stem cells. Cell. 133 (6), 1106-1117 (2008).
- Boyer, L. A., et al. Core transcriptional regulatory circuitry in human embryonic stem cells. Cell. 122 (6), 947-956 (2005).
- Kim, J., Chu, J., Shen, X., Wang, J., Orkin, S. H. An extended transcriptional network for pluripotency of embryonic stem cells. Cell. 132 (6), 1049-1061 (2008).
- Kidder, B. L., Hu, G., Yu, Z. X., Liu, C., Zhao, K. Extended self-renewal and accelerated reprogramming in the absence of Kdm5b. Mol Cell Biol. 33, 4793-4810 (2013).
- Kidder, B. L., Hu, G., Zhao, K. KDM5B focuses H3K4 methylation near promoters and enhancers during embryonic stem cell self-renewal and differentiation. Genome Biol. 15 (2), R32 (2014).
- Zhao, J., et al. Genome-wide identification of polycomb-associated RNAs by RIP-seq. Mol Cell. 40 (6), 939-953 (2010).
- Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Mol Cell. 46 (5), 674-690 (2012).
- Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).
- Hudson, W. H., Ortlund, E. A. The structure, function and evolution of proteins that bind DNA and RNA. Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (11), 749-760 (2014).
- Khalil, A. M., et al. Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression. P Natl Acad Sci USA. 106 (28), 11667-11672 (2009).
- Hendrickson, D. G., Kelley, D. R., Tenen, D., Bernstein, B., Rinn, J. L. Widespread RNA binding by chromatin-associated proteins. Genome Biol. 17, 28 (2016).
- Kelley, R. L., Kuroda, M. I. Noncoding RNA genes in dosage compensation and imprinting. Cell. 103 (1), 9-12 (2000).
- Koziol, M. J., Rinn, J. L. RNA traffic control of chromatin complexes. Curr Opin Genet Dev. 20 (2), 142-148 (2010).
- Mercer, T. R., Mattick, J. S. Structure and function of long noncoding RNAs in epigenetic regulation. Nat Struct Mol Bio. 20 (3), 300-307 (2013).
- Chu, C., et al. Systematic discovery of Xist RNA binding proteins. Cell. 161 (2), 404-416 (2015).
- Mak, W., et al. Reactivation of the paternal X chromosome in early mouse embryos. Science. 303 (5658), 666-669 (2004).
- Garfield, A. S. Derivation of primary mouse embryonic fibroblast (PMEF) cultures. Methods Mol Biol. 633, 19-27 (2010).
- Conner, D. A. Mouse embryo fibroblast (MEF) feeder cell preparation. Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 23 Unit 23 22 (2001).
- Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Zang, C., et al. A clustering approach for identification of enriched domains from histone modification ChIP-Seq data. Bioinformatics. 25 (15), 1952-1958 (2009).
- Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
- Liu, T. Use model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS) to analyze short reads generated by sequencing protein-DNA interactions in embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 1150, 81-95 (2014).
- Kidder, B. L., Hu, G., Zhao, K. ChIP-Seq: technical considerations for obtaining high-quality data. Nat Immunol. 12 (10), 918-922 (2011).
- Quail, M. A., et al. A large genome center's improvements to the Illumina sequencing system. Nat Methods. 5 (12), 1005-1010 (2008).
- Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors. Nat Methods. 12 (10), 963-965 (2015).
