Summary
Здесь мы описываем методы для выполнения чип-Seq и CARIP-Seq, включая подготовку библиотека для виртуализации нового поколения, для создания глобального epigenomic и связанные хроматина РНК карт в ES клеток.
Abstract
Эмбриональных стволовых (ES) мобильный самообновления и дифференциация регулируется внешние сигналы и внутренней сети факторов транскрипции, эпигеномные регуляторов и после перевода модификаций гистонами влияют combinatorially гена Выражение состояния близлежащих генов. Также было показано, что РНК взаимодействовать с различными белками, чтобы регулировать динамику хроматина и экспрессии генов. Хроматин связанные РНК иммунопреципитации (CARIP) следуют секвенирование нового поколения (CARIP-Seq) — роман метод обследования РНК, связывается с белками хроматина, а иммунопреципитации chromatin, следуют (секвенирование нового поколения ChIP-Seq) является мощным геномики техника для сопоставления расположения столб-поступательные изменения гистонов, факторов транскрипции и эпигеномные модификаторов в глобальном масштабе в ES клеток. Здесь мы описываем методы для выполнения CARIP-Seq и чип-Seq, включая строительство библиотеки для виртуализации нового поколения, для создания глобальных хроматина связанные РНК и epigenomic карт в ES клеток.
Introduction
Решения судьбы клетки эмбриональных стволовых (ES), регулируются связь между внеклеточных сигналов и множество transcriptional регуляторы, включая модификаторы гистонов и после перевода изменения гистона хвосты. Эти взаимодействия облегчить доступность хроматина и упаковка хроматина в одном из двух состояний: euchromatin, которая является открытой и транскрипционно активных, и гетерохроматина, который является компактным и вообще транскрипционно неактивным. Факторы транскрипции с ДНК последовательности конкретные привязки сходство и эпигеномные модификаторы ассоциированных с эухроматиновых регионов участвовать в контроле экспрессии генов. Секвенирование нового поколения методов, в том числе чип-Seq1, сыграли важную роль в картирования генома общесистемной транскрипционный анализ сетей, которые являются основополагающими для ES клеток самообновления и плюрипотентности2,3,4 ,5,6. Кроме того во время immunopreciation РНК, следуют следующего поколения виртуализации (RIP-Seq)7 оценок РНК белковых взаимодействий предположить, что протеины дна binding взаимодействуют с РНК регулировать транскрипционный анализ событий7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12, несколько исследований изучили генома всей локализации РНК, связанные с хроматином12, или глобальных взаимодействий между изменения РНК и гистонов. Один класс молекул РНК, которые были найдены регулировать активность хроматина связанных белков13,,1415длиной некодирующих РНК (lncRNAs). К примеру Xist является lncRNA, который регулирует, в женских mammalian клеток, инактивацию одной Х-хромосомы, путем набора эпигеномные подавляющего16,17. Однако полный спектр РНК, связанные с хроматином практически неизвестны. Здесь мы описываем Роман протокол, связанные хроматина РНК иммунопреципитации (CARIP) следуют секвенирование нового поколения (CARIP-Seq), чтобы идентифицировать связанные хроматина РНК в масштабах геном-ES клеток, включая подготовку библиотека для Секвенирование нового поколения и чип-Seq для сопоставления глобальные размещение изменения гистона, факторов транскрипции и эпигеномные модификаторы. В отличие от других методов RIP-Seq7CARIP-Seq включает сшивки и sonication меры, которые позволяют для прямого определения РНК, связанные с хроматином. Вместе чип-Seq является мощным инструментом для выявления генома общесистемной протеин дна взаимодействий, в то время как CARIP-Seq является мощный метод обследования РНК, связанные с компонентами хроматина.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Культура мыши ES клеток в условиях свободной подачи.
Примечание: Клетки мыши ES условно культивировали в СМИ на клетки культуры блюдо покрытием с желатином и моно слой мыши эмбриональных фибробластов (MEF), которые были mitotically инактивированных (iMEFs). Однако MEFs должны быть удалены перед течению эпигеномные или выражение анализы для предотвращения загрязнения, связанных с MEF хроматина и РНК.
- Подготовка фидер слоя: желатин Пальто плиты культуры клеток 6-хорошо, добавив 2 мл 0,1% желатина в воде и инкубировать пластины при 37 ° C для 20-30 мин.
- Подготовьте DMEM 10% глюкозы высокого СМИ содержащие 2 мм L-глютамином, 10% плода бычьим сывороточным (ФБС) и 1 x пенициллина/стрептомицина.
- Изолировать MEFs от E13.5 до E14.5 мышей18,19 или приобрести от коммерческих поставщиков. Mitotically инактивирует MEFs, рассматривая с митомицин C или гамма-облучения, используя стандартные протоколы19. Кроме того mitotically инактивированная MEFs (iMEFs) могут быть приобретены у коммерческих поставщиков.
- Культивирование MEFs. Предварительно теплой MEF СМИ при 37 ° C, оттепель замороженных флакона iMEFs и культура в 10% FBS MEF СМИ при 37 ° C с 5% CO2. Пластина MEFs на ~ 200 000 ячеек на хорошо 6-ну культуры блюдо.
- Культивирование клеток ES на слое фидер клеток (iMEFs).
- 12-24 ч после покрытия iMEFs, предварительно теплой 50 мл трубки ES клеток СМИ (DMEM высокой глюкоза, LIF (10 нг/мл), 15% ES клеток квалифицированные FBS, 1 × 2 клетки культура квалифицированных-меркаптоэтанол, 1 × глутамина, заменимые аминокислоты (NEAA), 1 × пенициллина/стрептомицина), при 37 ° C с 5% CO2.
- Аспирационная СМИ от плиты культуры клеток, содержащих iMEFs, вновь приостановить ES клеток в 2 мл СМИ (после оттаивания при 37 ° C) и плиты клетки в слое iMEFs. При размещении культуры блюдо в инкубаторе, важно переместить блюдо в форме «t» для равномерно распределить клетки и предотвращения агрегации, отношению к центру блюдо.
- Проход клетки ES на фидер бесплатно желатин покрытием блюда. Проход ES клеток, прежде чем они станут вырожденная. Колонии клеток ES поддерживать самообновлению лучше если колоний равномерно и не вырожденная. Наличие многих колоний клеток ES, которые соприкасаются указывает, что плотность ячеек слишком высока.
- Покройте 6-ну культуры блюдо с желатином, как описано выше. Инкубировать 0,25% трипсина ЭДТА при 37 ° C ~ 10-15 мин до предварительно теплой трипсина.
- Далее проход клетки ES первой стирки с 1 x-фосфатный буфер (PBS) и добавление 1 мл 0,25% раствора трипсина ЭДТА. Подождите 1-2 мин для колоний для отсоединения. Отделить колоний к приостановке одноклеточных, дозирование с 1 мл подсказка для ~ 5 раз.
- Использование микроскопа для подтверждения одноклеточного диссоциации клеток ES. Чтобы утолить реакции, или «нейтрализовать» трипсина, добавьте 10% FBS MEF СМИ. Центрифуга клетки на 300 x g при комнатной температуре 3-5 мин и аспирационная средств массовой информации.
- Вновь приостановить сотовой гранулы в 2 мл СМИ (ES клеток) дополнены гликогена синтазы киназы-3 (GSK3) ингибиторы (CHIR99021; GSK3i), или 2i условия (MEKi/GSK3i) (2-3 мкм GSK3i: CHIR99021, 1 мкм MEKi: PD0325901).
- Аспирационная желатин из клетки культуры блюдо и добавить 2 мл средства массовой информации, содержащие ЭСК в блюдо и поместите блюдо в инкубаторе 37 ° C (рис. 1A-D). Двойной ингибитирование GSK3i и MEKi способствует основное состояние наивно плюрипотентности ES клеток в отсутствие подачи клеток (iMEFs) и без сыворотки20. ES клеток должно быть пассированный два-три раза, чтобы удалить MEFs прежде чем сшивки.
2. сшивки ES клеток для чипа и CARIP
- Урожай клетки ES промывкой PBS, а затем добавить трипсин 0.25%, предварительно нагревают при 37 ° C. Инкубируйте клетки в течение нескольких минут при комнатной температуре. Избегайте над trypsinization ES клеток, которые приведут к клеточной гибели. Используйте микроскоп для оценки диссоциации одной ячейки.
- Утолить Пищеварение трипсина, как описано выше для пассированый ES клеток и центрифуги клетки на 300 x g при комнатной температуре 3-5 мин.
- Вновь приостановить клетки в СМИ MEF подогретым (37 ° C) (10% FBS/DMEM) на 2 × 106 клеток/мл.
- Чтобы crosslink клетки, добавить 37% раствор формальдегида в конечной концентрации 1% и инкубации клеток в коническую пробирку (15 мл или 50 мл) при 37 ° C за 8 минут перевернуть трубку несколько раз в период 8 мин для достижения однородной фиксации.
Примечание: Время фиксации могут быть эпирически оптимизированы для CARIP. Если изменяется время фиксации, следует также скорректировать число циклов sonication. Кроме того 37 ° C температуры увеличивает эффективность сшивки, по сравнению с сшивки при комнатной температуре. Температура фиксации могут быть оптимизированы эмпирически. - Чтобы остановить фиксацию реакции, добавить 1,25 М глицин (предварительно охлаждается при температуре 4 ° C) к концентрации 0,125 м. инвертировать трубку 8 об/мин, с использованием ротатор для 5 мин при комнатной температуре. Центрифугуйте образцы на 300 g x 5 мин при комнатной температуре и аспирационная средств массовой информации.
- Вымыть клетки лепешка с PBS предварительно охлажденные (4 ° C), Центрифугуйте образцы на 300 g x 5 мин при комнатной температуре и аспирационная PBS. Снова Вымойте клетки с PBS. Далее, аликвота 15 × 106 клеток на 15 мл.
- Замораживание клеток Пелле, поместив ее в жидком азоте за 1 мин., на сухой лед для 5 мин, или сразу же месте-80 ° C.
Примечание: Фиксированная ES клеток гранулы могут храниться на срок до 6 месяцев без снижения качества в нижнем течении экспериментов.
3. chromatin sonication для чипа и CARIP
- Оттепель фиксированной Пелле клеток ES на льду. Вновь приостановите Пелле ячейки в буфер sonication (2,5 мл). Для факторов транскрипции или эпигенетическая регуляторы (белок факторы), вновь приостановите гранулы в 1 x TE, 1 мм PMSF, 1 x ингибитора протеиназы коктейль. Для изменения гистона, вновь приостановите гранулы в 1 x TE, 0.1% SDS, 1 мм PMSF, 1 x ингибитора протеиназы.
Примечание: Хотя добавлением SDS повышает эффективность sonication, может оказаться полезным для оценки определенных составляющих хроматина или факторов транскрипции. - Для иммунопреципитации chromatin (обломока), sonicate хроматина с 14-18 циклов (30 s на, отдых 30 s) на 40% амплитуды. Для связанных хроматина РНК иммунопреципитации (CARIP) уменьшить количество циклов sonication (8-10 циклов). Благодаря сотовых, фиксации и sonifier изменчивость условия для sonication должен решаться эмпирически.
- Дополнение sonication буфер с 28 мкл 10% SDS для белка факторы, 28 мкл Дезоксихолат натрия и 0,28 мл 10% Тритон-X100, и смесь хорошо.
Примечание: Добавление этих компонентов в буфер sonication создает буфер RIPA. - Центрифуга для выборки в 10 000 x g 10 мин при 4 ° C для предварительной очистки хроматина. Переместить супернатант свежие трубки и продолжите иммунопреципитации chromatin.
- Кроме того sonicated хроматина может храниться при температуре-80 ° C до использования. Однако хранения sonicated хроматина в-80 ° C может привести к снижению качества для обломока протеина фактор.
4. чип и CARIP процесс
- Добавьте 40 мкл белка A или G магнитные шарики в 1,5 мл, низкий привязка трубки. 600 мкл PBS мыть бисер. Поместите трубку на стойку, содержащие магнит, инкубировать трубки для 1 мин при комнатной температуре, удалить PBS и вновь приостановить магнитные шарики в 100 мкл PBS.
- Добавьте 2-4 мкг антитела к трубке с магнитной бусины. Инкубировать и поверните трубку при комнатной температуре за 40 мин при 8 об/мин, с использованием ротатор для облегчения антитела связывая к магнитной бусины. Вставьте трубу на магнитные стойки, инкубировать 1 мин при комнатной температуре, а затем удалите PBS.
- 200 мкл PBS мыть магнитные бусы. Стирка с PBS производится для удаления бесплатно IgGs. Инкубировать и поверните трубку при комнатной температуре за 5 мин между мыть шаги. Подсоедините трубку к магнит и удалить PBS.
- Immunoprecipitate хроматина прыгните белки путем инкубации sonicated хроматина экстракт (4 × 106 клеток на чип), с магнитной бусины и поворота образца при температуре 4 ° C (на ночь).
- Вымойте магнитные бусы. Проинкубируйте образцы при комнатной температуре с следующие буферы и вращать образец для 10 мин с каждого буфера: дважды с 1 мл раствора Буфер RIPA (TE (10 мм Tric-HCl, ЭДТА 1 мм) рН 8,0, 1% тритон X-100, 0.1% натрия deocycholate, 0.1% SDS), дважды с 1 мл раствора c Буфер RIPA ontaining 0,3 М NaCl, дважды с 1 мл один раз в 1 мл TE LiCl буфера (0,5% натрия deocycholate, 0,5% NP40, 0.25 M LiCl), буфер с 0,2% Тритон X-100 и один раз с 1 мл раствора TE.
- Де сшивки для чипа. Вновь приостановите магнитные шарики в 100 мкл TE. Добавьте 3 мкл 10% SDS и 5 мкл протеиназы K (20 мг/мл). Инкубируйте образца при температуре 65 ° C (на ночь).
Примечание: Важно покрыть трубы во время этого шага с парафина или полиэтиленовой пленкой для предотвращения испарения.- Следующий день, Инвертируйте трубки несколько раз перемешать. Далее используйте магнит стойку для передачи супернатант свежие трубки. Мыть магнитные бусы, 100 мкл TE, содержащих 0,5 М NaCl и впоследствии объединить два supernatants.
- Де сшивки для CARIP. Вновь приостановите магнитные шарики в 100 мкл TE. Добавьте 3 мкл 10% SDS и 5 мкл протеиназы K (20 мг/мл). Инкубируйте образца при 65 ° C для 4-12 ч инкубации время при температуре 65 ° C необходимо эмпирически определить вследствие изменчивости между типы клеток, sonication и фиксации условий и т.д.
- Инвертировать трубку 3 - 5 раз смешивать, применить трубку к магнитной стойке, и впоследствии перейти супернатант свежие трубки.
- Мыть магнитные бусы, 100 мкл TE, содержащих 0,5 М NaCl и впоследствии объединить два supernatants.
Примечание: Важно использовать бесплатно нуклеиназы реагенты (например., TE буфера, SDS, и т.д.) для предотвращения потери ДНК или РНК во время шага де сшивки.
- Извлечь ДНК/РНК с помощью 200 мкл фенола: хлороформ: изоамилового спирта (PCI) (25:24:1, v/v).
Примечание: РНК можно также извлечь коммерческие наборы, с помощью инструкции производителя. Shake для 30 s, спина на 10000 x g при комнатной температуре в течение 10 мин и переместить супернатант свежие трубки.- Чтобы осадить ДНК/РНК, 2 мкл GlycoBlue, 20 мкл ацетат натрия 3 M и 600 мкл этанола. Микс по преобразованию ~ 5-8 раз и поместите образец на сухой лед или в-80 ° C для по крайней мере 1-2 ч.
- Центрифугуйте образцы на 10000 x г за 30 мин с помощью центрифуги Настольные холодильные (4 ° C). Воздух сухой гранулы для < 1 мин и вновь приостановить его в 40 мкл EB буфера (10 мм трис-HCl). Для приготовления чип-Seq библиотека перейдите к шагу 6.
- Удалите из хроматина связанные образцов РНК IP с помощью DNase ДНК. Добавьте 10 x DNase буфер 1 x концентрации в CARIP образце. Мкл DNase для 1 до 10 мкг РНК (50 мкл реакции). Инкубируйте образца при 37 ° C для 30 min. извлечение RNA образца с PCI. Ресуспензируйте в свободной от нуклеиназы H2O.
5. double-stranded синтез для CARIP-Seq cDNA
- Синтез cDNA перв стренги. Для реакции, реверс транскрипция, настройте следующие реакции в трубу, предназначенные для ПЦР машины: 10,5 мкл РНК и 1 мкл случайных праймеров hexamer (3 мкг/мкл).
- Инкубировать трубки при 65 ° C за 5 мин до денатурировать вторичную структуру и хранить его на льду на 2 мин Mix следующие компоненты: 4 мкл буфера перв стренги, 2 мкл 0,1 м DTT, 1 мкл dNTP и 0,5 РНКазы OUT. Далее для ПЦР-пробирку, мкл 7,5 Мастер смеси. Инкубировать трубки для 2 мин при 25 ° C. 1 мкл надстрочный II (200 U/мкл) и инкубировать следующим: 25 ° C в течение 10 мин, 42 ° C 50 мин, 70 ° C на 15 мин и провести на 4 ° C.
- Синтез cDNA стренги второй. Место труб на льду. Затем добавьте следующие компоненты в порядке: 91 мкл диэтиловым pyrocarbonate (DEPC) лечение водой, 30 мкл 5 x второй стренги реакции буфера, 3 мкл dNTP смеси (10 мм), 1 мкл E. Coli ДНК лигаза (10 U/мкл), 4 мкл ДНК-полимеразы кишечной палочки (10У/мкл) и 1 мкл E. Coli РНКазы H (2U/мкл). Смешайте нежно vortexing и Инкубируйте на 16 ° C в течение 2 ч.
Примечание: Смешивание, стряхивая или инвертирование трубка не может быть достаточно тщательно смешать реактивы. - 2 мкл T4 ДНК-полимеразы и Инкубируйте на 16 ° C в течение 5 минут очистить cDNA (double-stranded, dscDNA) с помощью ПЦР очистка kit. Элюировать dscDNA в 40 мкл буфера EB.
- Фрагмент двойной мель cDNA. Сдвига cDNA (dscDNA) с помощью sonifier ванна воды и 1,5 мл размер 250-500 bp. Sonication dscDNA имеет решающее значение для уменьшения размеров фрагмента для облегчения последовательности всей стенограммы РНК.
- При использовании стандартной модели sonifier ванну водой, sonicate образец для 3 × 10 мин, или 4 × 10 мин.
Примечание: Три цикла должны использоваться для до 1 мкг всего РНК, тогда как четыре циклы рекомендуются для 1-5 мкг всего РНК. Центрифуга трубки кратко после каждого цикла sonication и поддерживать ванну прохладной водой, добавляя свежий лед. - При использовании sonifier Пико, рекомендуется использовать шесть циклов для 1-5 мкг всего РНК и следующих условий Велоспорт (30 s на, 90 s выкл). Центрифуга трубки кратко после 2-3 sonication циклов. Эффективность sonication можно определить путем загрузки часть стриженый dscDNA (3-4 мкл) на геле агарозы (2%). Важно, чтобы эмпирически тест sonication условий вследствие изменчивости между sonifiers.
- Выполните подготовку Библиотека, как описано в шаге 6 для виртуализации нового поколения.
6. чип Seq и CARIP-Seq библиотека строительство
- Ремонт заканчивается ДНК с помощью ДНК-конец-ремкомплект. Этот набор используется для создания туп законченному дна. Для этой реакции, созданы следующие 1,5 мл, низкая привязка трубки: 34 мкл ДНК, 5 мкл 2,5 мм dNPTs, 5 мкл 10 мм АТФ, 5 мкл 10 x ремонтно конец буфера (5 мм DTT, ацетат 100 мм магния, калия ацетат 660 мм Мм 300 трис ацетат, pH 7,8) и 1 мкл конец ремонт фермент смесь (T4 полинуклеотид киназы, T4 ДНК-полимеразы).
- Проинкубируйте образцы для 45 мин при комнатной температуре.
- Очищайте ДНК, используя комплект для очистки реакции. Элюировать отремонтированы конец ДНК в 32 мкл буфера EB подогретым (65 ° C). Хотя мы обычно не quantitate концентрации ДНК после чип, или РНК, после CARIP, до подготовки Библиотека, рекомендуется начать с по крайней мере 5-10 нг чип ДНК или РНК CARIP.
- Добавление навеса 3' «A», чтобы отремонтировать конце ДНК. Добавьте компоненты в 1,5 мл, низкий привязка трубки: 30 мкл ДНК сверху, 5 мкл 10 x НЭБ буфера 2, 1 мкл dATP от фондовой 10 мм, 11 мкл H2O и 3 мкл 5 U / мкл фрагменты фрагмент (3' - 5' Exo-) и осторожно перемешать, закупорить.
- Инкубировать образца на 30 минут при 37 ° C.
- Используйте комплект очистки реакции для того чтобы очистить ДНК. Элюировать ДНК в 25 мкл буфера EB подогретым (65 ° C).
- Перевязать адаптер. Добавьте следующие компоненты на льду: 23 мкл ДНК от выше, 3 мкл 10 x T4 ДНК лигаза буфера, 1 мкл отожженная PE или соединительный адаптер (4 мкм) и 3 мкл T4 ДНК лигаза (400 U/мкл), и смесь осторожно, закупорить.
Примечание: Адаптер последовательностей могут также быть получены из коммерческих источников.
Последовательности олигонуклеотида:
PE адаптеры
5' P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAGGAATGCCGAG
5' ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
Мультиплексирование адаптеры
5' P-GATCGGAAGAGCACACGTCT
5' ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT - Инкубируйте образца на 30 минут при комнатной температуре.
- Выполните выбор размера ДНК с помощью сборного геля агарозы (2%). Побегите гель на 10 мин.
- Акцизный региона соответствует 250-450 bp.
Примечание: путем разрезания гель выше выше 200 bp, снизилась вероятность загрязнения от unligated адаптера димеры. Важно удалить любые unligated адаптеры перед PCR шаг. - Используйте набор извлечения геля для очистки ДНК. Элюировать в 20 мкл буфера EB.
- PCR и библиотека очистки для перевязаны ДНК образцов содержащие парные конец (PE) Адаптеры. Добавьте компоненты в ПЦР-пробирку: 12 мкл 50% ДНК от выше, 12 мкл воды, 25 мкл главный микс (Phusion HF), 1 мкл праймера PE PCR 1.0 и 1 мкл праймера PE PCR 2.0.
Примечание: Последовательности олигонуклеотида также могут быть получены из коммерческих источников.
Последовательности олигонуклеотида:
Праймера PCR PE 1.0
5' AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
Праймера PCR PE 2.0
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT - PCR и библиотека очистки для перевязаны образцы, содержащие индекс PE адаптеры. Добавьте компоненты: 12 мкл 50% ДНК от выше, 12 мкл воды, 1 мкл PCR праймер ИНПЕ 1.0 (разбавленных 1:2), 1 мкл PCR праймер ИНПЕ 2.0 (разбавленных 1:2) и 1 мкл PCR праймер индекс (разбавленных 1:2).
Примечание: последовательности олигонуклеотида также могут быть получены из коммерческих источников.
Последовательности олигонуклеотида:
Мультиплексирование PCR праймер 1.0
5' AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
Мультиплексирование PCR праймер 2.0
5' GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
PCR праймер индекс последовательности 1-12
PCR праймер, индекс 1
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTC
PCR праймер, индекс 2
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTC
PCR праймер, индекс 3
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTC
PCR праймер, индекс 4
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTC
PCR праймер, индекс 5
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTC
PCR праймер, индекс 6
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTC
PCR праймер, индекс 7
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGATCTGGTGACTGGAGTTC
PCR праймер, индекс 8
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCAAGTGTGACTGGAGTTC
PCR праймер, индекс 9
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCGTGACTGGAGTTC
PCR праймер, индекс 10
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCTAGTGACTGGAGTTC
PCR праймер, индекс 11
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGCCGTGACTGGAGTTC
PCR праймер, индекс 12
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACAAGGTGACTGGAGTTC - Выполнять ПЦР Велоспорт с использованием следующих условий (денатурировать 30 s на 98 ° C, 18 циклов 10 s на 98 ° C, 30 s при 65° C, 30 s при 72 ° C, 5 мин при 72 ° C, удерживайте при температуре 4 ° C).
Примечание: Число циклов PCR должна определяться эмпирически. - Выбор размера продуктов ПЦР. Запустите ДНК на сборного E-гель EX (2%), или домашний 2% гель (агарозы) и акцизных регионе ВР 300-500.
- Используйте комплект извлечения гель для очистки дна от геля. Элюировать конечный продукт PCR в 20 мкл буфера EB.
- Используйте флуориметр для измерения концентрации библиотеки. Выполнение виртуализации нового поколения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы успешно допрашивали генома всей привязки H3K4me3, H3K4me2 и KDM5B в клетки ES, используя этот чип-Seq протокол6. Клетки ES были культивировали в условиях свободной подачи (рис. 1) и сшитого как описано выше. Sonication был впоследствии выполняется, как описано в шаге 3.2 чип-Seq протокола и оцениваются путем запуска ДНК на 2% агарозном геле (рис. 2). Далее чип была выполнена, как описано в шаге 4, и подготовка библиотека была выполнена, как описано в шаге 6. Чип-Seq библиотеки были упорядочены на платформе виртуализации нового поколения. Представитель пользовательские представления браузера UCSC показывают обогащение H3K4me3, H3K4me2 и KDM5B на основной плюрипотентности гена POU5F1 (Рисунок 3А) и на HOXC кластера (рис. 3B). CARIP-Seq также была исполнена, следуя протоколу, как описано в шагах 4-6. Представитель представление браузера UCSC показывает обогащения H4K20me3-связанные РНК (CARIP-Seq) и H4K20me3 размещение (чип-Seq) на локусов в ES клеток (рис. 4). CARIP-Seq сигнал показывает, что хотя РНК связана с H4K20me3, это не обязательно означает что она взаимодействует с Локус показано. CARIP-Seq наборы данных могут быть проанализированы подобным образом как чип-Seq наборы данных. Данные, полученные от мыши ES клеток CARIP-Seq и чип-Seq экспериментов можно оба выровнять ссылка генома (например., mm9, мм10) с помощью bowtie221. Чип-Seq и CARIP-Seq обогащенный регионов могут как быть идентифицированы с помощью пик вызывающей программы, такие как «Пространственной кластеризации для идентификации ChIP-Enriched регионов» (SICER)22 или23,Маки24. Потому что CARIP-Seq наборы данных могут включать широкие пиков, важно использовать алгоритм, который может идентифицировать широких и острых пиков. В то время как протоколы, описанные в этой рукописи были оптимизированы для выполнения чип-Seq и CARIP-Seq с использованием клеток ES, эти протоколы также должны быть пригодны для оценки протеин дна и связанные хроматина взаимодействия РНК в других типах клеток.
Рисунок 1: фидер свободной культуры клеток ES. (A) экспериментальный дизайн. (B) ES клетки культивировали на iMEFs в ES мобильных средств массовой информации, содержащие LIF, или в условиях свободной подачи с ES мобильных средств массовой информации, содержащие LIF и (C) GSK3i или (D) GSK3i и MEKi (2i). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Sonication высокоструктурированные ES клеток хроматина. Высокоструктурированные ES клеток были sonicated с помощью sonifier с microtip для 18 циклов (40% амплитуды, 30 s на и 30 s отдыха). Сшивки было отменено, а пищеварение РНКазы впоследствии была выполнена для удаления РНК. ДНК был очищен с помощью PCI и запустить на геле агарозы (2%). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: представитель чип-Seq анализ гистонов, изменяя фермента и гистонов изменения в ES клеток. Пользовательские представления браузера UCSC, H3K4me3, H3K4me2 и KDM5B на плюрипотентности регулятор (A) POU5F1 и (B) HOXC кластера в ES клеток (нормализованное тег плотность (RPBM), читать на базу на миллион прочтений). Обратите внимание на дублирование KDM5B привязки и размещение H3K4me3/2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: представитель CARIP-Seq анализ РНК, связанных с изменения гистона и чип-Seq в ES клеток. Вид браузера в UCSC H4K20me3 CARIP-Seq и H4K20me3 чип-Seq сигналов в ES клеток (нормализованное тег плотность (RPBM), читать на базу на миллион прочтений). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Чип-Seq является полезным методом для оценки местоположения глобального белка ДНК взаимодействий (например., транскрипция факторы/гистона модификации ДНК и ферменты/гистона изменения) в ES клеток, в то время как недавно разработанный протокол CARIP-Seq является полезным в допрос генома общесистемной Ассоциация РНК с избирателями хроматина. Чип-Seq является основным инструментом, который используется для оценки эпигеномные пейзажи клеток ES и других типов клеток. Качество CARIP-Seq библиотек и чип-Seq в значительной степени зависит от чип класс антител. Пригодность антител для чип-Seq может определяться эмпирически, выполняя чип-PCR, где ≥ 3 до 5 раз обогащения в регионах положительный контроль по отношению к незанятой регионов должно быть достаточно для создания высокого качества чип-Seq данных25. Кроме того антитела можно проверить на предмет их пригодности для CARIP-Seq аналогичным образом как описано для чип-Seq с незначительными изменениями. После шаг РНК IP в CARIP протоколе, как описано в предыдущем разделе методы, реверс транскрипция ПЦР должны быть выполнены для создания cDNA, который может использоваться в качестве шаблона для выполнения Q-RT-PCR. Рекомендуется оценить после чип или CARIP в нескольких регионах геномной обогащения. Существуют дополнительные соображения для тестирования при оценке качества антител для чипа или CARIP. К примеру, жесткость буферов, используемых для чипа и CARIP может быть оптимизирована путем изменения концентрации NaCl: низкой концентрации NaCl подходит для весьма специфических антител, в то время как высокая концентрация NaCl могут быть полезны для антител с без конкретной привязки. Относительно подготовки библиотека для виртуализации нового поколения пользовательские грунты и индексы могут также использоваться вместо коммерчески приобретенных олигонуклеотидов. Однако важно отметить, что включая фосфоротиоат изменения между двумя базами в конце 3' было показано для предотвращения нуклеиназы пищеварение26. Сторонних РНК-Seq или чип-Seq библиотека Строительство комплекты могут также использоваться для создания библиотек для последовательности CARIP и чип образцы, соответственно. Однако важно эмпирически тест-систем для оценки их эффективности в генерации качество библиотек для виртуализации нового поколения. Дополнительные протоколы также могут быть использованы для выполнения подготовки библиотека чип-Seq, таких как ChIPmentation27. Однако адаптации ChIPmentation к протоколу чип-Seq, описанные здесь потребует дополнительных изменений и дальнейшей оптимизации.
Здесь мы описываем чипа и CARIP протоколы, которые были оптимизированы с помощью умеренное количество клеток (4 × 106 клеток одного IP). В то время как протокол чип может производиться с использованием числа клеток низкого до среднего (105 – 106 клеток), мы не выполнили CARIP-Seq с использованием менее 2 × 106 клеток. Однако эмпирически тестируя различные условия фиксации и sonication, вполне возможно, что этот протокол может работать успешно используя небольшое количество клеток.
В резюме чип-Seq и CARIP-Seq полезны для создания глобальной карты хроматина связанных белков и РНК в клетки ES, соответственно. Хотя эти протоколы были оптимизированы для ES клеток, они могут быть оптимизированы для создания карты хроматина, используя широкий спектр линий клеток млекопитающих и типы тканей. Эти протоколы могут также быть оптимизированы для создания одной ячейки чип-Seq или CARIP-Seq библиотек.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют никакого конфликта интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Уэйн государственного университета, Карманос институт рака, Грант от национального сердца, легких и крови института (1K22HL126842-01A1) присуждена B.L.K. Эта работа использовали Уэйн государственного университета высокой производительности вычислительной сетки для вычислительных ресурсов (< https://www.grid.wayne.edu/>). Мы благодарим Jiji Куруп за помощь с CARIP-Seq анализа данных.
АВТОРОВ ВЗНОСОВ:
B.L.K. задуман метода CARIP-Seq, разработаны и проведены эксперименты чип-Seq и CARIP-Seq, проанализировали данные последовательности и составлен рукопись. Все авторы прочитал и одобрила окончательный вариант этой рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse leukemia inhibitory factor (ESGRO LIF) | EMD Millipore | 106 or 107 units | |
| GSK3β inhibitor CHIR99021 (GSK3i) | Stemgent | Solvent: DMSO 10mM | |
| MEK inhibitor PD0325901 (MEKi) | Stemgent | Solvent: DMSO 10mM | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose | Invitrogen | 11965092 | |
| PBS (phosphate buffered saline) | Invitrogen | 10010031 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| 2-Mercaptoethanol (50 mM) | Gibco | 31350010 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140076 | |
| EmbryoMax ES Cell Qualified Fetal Bovine Serum, 500 ml | EMD Millipore | ES-009-B | |
| EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | EMD Millipore | ES-006-B | |
| Glycine | Sigma | G7126-500G | 1.25 M stock conentration in water |
| Formaldehyde solution | Sigma | F8775-500ML | |
| TE (Tris EDTA) pH 8.0 1X | Quality Biological | 351-011-131 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) solution | Sigma | 93482-250ML-F | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697498001 | |
| Sodium dodecyl sulfate solution (20%) | Quality Biological | A611-0837-10 | |
| Q125 sonifier | Qsonica | 4422 | |
| Triton X-100 solution | Sigma | 93443-100ML | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation | Invitrogen | 10004D | |
| Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation | Invitrogen | 10002D | |
| Dynabeads Protein A/Protein G and Magnet Starter Pack | Invitrogen | 10015D | |
| Lithium chloride | Sigma | L4408 | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma | I8896 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Dynabeads mRNA Purification Kit (for mRNA purification from total RNA preps) | Invitrogen | 61006 | |
| SuperScript Double-Stranded cDNA Synthesis Kit | Invitrogen | 11917010 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| End-It DNA End-Repair Kit | Lucigen | ER81050 | |
| Klenow Fragment (3'→5' exo-) | NEB | M0212L | |
| dATP (10 mM) | Invitrogen | 18252015 | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202L | |
| TrackIt 1 Kb Plus DNA Ladder | Invitrogen | 10488085 | |
| E-gel EX agarose gels, 2% | Invitrogen | G402002 | |
| Phusion high-fidelity 2X master mix with HF buffer | Thermo Fisher | F531LPM | |
| ChIPAb+ Trimethyl-Histone H3 (Lys4) - ChIP Validated Antibody | EMD Millipore | 17-614 | |
| Anti-Histone H3 (di methyl K4) antibody [Y47] - ChIP Grade (ab32356) | Abcam | ab32356 | |
| Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-well) | Fisher | 720083 | |
| Falcon Standard Tissue Culture Dishes (10cm) | Fisher | 08772E | |
| Bioruptor pico | Diagenode | B01010001 | |
| Qubit Flurometer 2.0 | Thermo Fisher | ||
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32851 | |
| MinElute Reaction Cleanup Kit | Qiagen | 28204 | |
| MinElute Gel Extraction Kit | Qiagen | 28604 | |
| Anti-Histone H4 (tri methyl K20) antibody - ChIP Grade (ab9053) | Abcam | ab9053 | |
| Labquake rotator | Thermo Fisher | 400110Q | |
| Illumina HiSeq platform | Illumina | ||
| TURBO DNase | Invitrogen | AM2238 |
References
- Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
- Chen, X., et al. Integration of external signaling pathways with the core transcriptional network in embryonic stem cells. Cell. 133 (6), 1106-1117 (2008).
- Boyer, L. A., et al. Core transcriptional regulatory circuitry in human embryonic stem cells. Cell. 122 (6), 947-956 (2005).
- Kim, J., Chu, J., Shen, X., Wang, J., Orkin, S. H. An extended transcriptional network for pluripotency of embryonic stem cells. Cell. 132 (6), 1049-1061 (2008).
- Kidder, B. L., Hu, G., Yu, Z. X., Liu, C., Zhao, K. Extended self-renewal and accelerated reprogramming in the absence of Kdm5b. Mol Cell Biol. 33, 4793-4810 (2013).
- Kidder, B. L., Hu, G., Zhao, K. KDM5B focuses H3K4 methylation near promoters and enhancers during embryonic stem cell self-renewal and differentiation. Genome Biol. 15 (2), R32 (2014).
- Zhao, J., et al. Genome-wide identification of polycomb-associated RNAs by RIP-seq. Mol Cell. 40 (6), 939-953 (2010).
- Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Mol Cell. 46 (5), 674-690 (2012).
- Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).
- Hudson, W. H., Ortlund, E. A. The structure, function and evolution of proteins that bind DNA and RNA. Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (11), 749-760 (2014).
- Khalil, A. M., et al. Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression. P Natl Acad Sci USA. 106 (28), 11667-11672 (2009).
- Hendrickson, D. G., Kelley, D. R., Tenen, D., Bernstein, B., Rinn, J. L. Widespread RNA binding by chromatin-associated proteins. Genome Biol. 17, 28 (2016).
- Kelley, R. L., Kuroda, M. I. Noncoding RNA genes in dosage compensation and imprinting. Cell. 103 (1), 9-12 (2000).
- Koziol, M. J., Rinn, J. L. RNA traffic control of chromatin complexes. Curr Opin Genet Dev. 20 (2), 142-148 (2010).
- Mercer, T. R., Mattick, J. S. Structure and function of long noncoding RNAs in epigenetic regulation. Nat Struct Mol Bio. 20 (3), 300-307 (2013).
- Chu, C., et al. Systematic discovery of Xist RNA binding proteins. Cell. 161 (2), 404-416 (2015).
- Mak, W., et al. Reactivation of the paternal X chromosome in early mouse embryos. Science. 303 (5658), 666-669 (2004).
- Garfield, A. S. Derivation of primary mouse embryonic fibroblast (PMEF) cultures. Methods Mol Biol. 633, 19-27 (2010).
- Conner, D. A. Mouse embryo fibroblast (MEF) feeder cell preparation. Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 23 Unit 23 22 (2001).
- Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Zang, C., et al. A clustering approach for identification of enriched domains from histone modification ChIP-Seq data. Bioinformatics. 25 (15), 1952-1958 (2009).
- Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
- Liu, T. Use model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS) to analyze short reads generated by sequencing protein-DNA interactions in embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 1150, 81-95 (2014).
- Kidder, B. L., Hu, G., Zhao, K. ChIP-Seq: technical considerations for obtaining high-quality data. Nat Immunol. 12 (10), 918-922 (2011).
- Quail, M. A., et al. A large genome center's improvements to the Illumina sequencing system. Nat Methods. 5 (12), 1005-1010 (2008).
- Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors. Nat Methods. 12 (10), 963-965 (2015).
