Summary
Här beskriver vi metoder för att utföra ChIP-Seq och CARIP-Seq, inklusive bibliotek förberedelse för nästa generations sekvensering, skapa globala epigenetisk och kromatin-associerade RNA kartor i ES-celler.
Abstract
Embryonala stamceller (ES) cell självförnyelse och differentiering styrs av yttre signaler och inneboende nätverk av transkriptionsfaktorer, epigenetiska regulatorer och efter översättning modifieringar av histoner som combinatorially påverkar genen uttryck delstaten närliggande gener. RNA har också visat att interagera med olika proteiner att reglera kromatin dynamics och genuttryck. Kromatin-associerade RNA immunoprecipitation (CARIP) följt av nästa generations sekvensering (CARIP-Seq) är en ny metod att kartlägga RNAs associerade med kromatin proteiner, medan kromatin immunoprecipitation följt av nästa generations sekvensering ( ChIP-Seq) är en kraftfull genomik teknik att kartlägga placeringen av posttranslationella modifieringen av histoner, transkriptionsfaktorer och epigenetiska modifierare på en global skala i ES-celler. Här, beskriver vi metoder för att utföra CARIP-Seq och ChIP-Seq, inklusive bibliotek konstruktion för nästa generations sekvensering, för att skapa globala kromatin-associerade RNA och epigenetisk kartor i ES-celler.
Introduction
Embryonala stamceller (ES) cell öde beslut regleras av kommunikation mellan extracellulära signaler och en mängd transkriptionell-regulatorer, inklusive Histon modifierare och efter översättning modifiering av Histon svansar. Dessa interaktioner underlätta kromatin tillgänglighet och förpackning av kromatin in i ett av två stater: euchromatin, som är öppen och transcriptionally aktiv, och Heterokromatin, som är kompakt och allmänt transcriptionally inaktiva. Transkriptionsfaktorer med DNA sekvens-specifik bindning tillhörighet och epigenetiska modifierare förknippar med euchromatic regioner att delta i kontrollen av genuttryck. Nästa generations sekvenseringsmetoder, inklusive ChIP-Seq1, har varit avgörande för mappning av genome-wide transkriptionell nätverk som är grundläggande för ES cell självförnyelse och pluripotency2,3,4 ,5,6. Dessutom medan RNA immunopreciation följt av nästa generations sekvensering (RIP-Seq)7 utvärderingar av RNA-protein interaktioner föreslå att DNA-bindande proteiner interagerar med RNAs att reglera transkriptionell händelser7, 8 , 9 , 10 , 11 , 12, några studier har undersökt genome-wide localizationen av RNAs associerade med kromatin12eller globala samspelet mellan RNA och Histon ändringar. Långa icke-kodande RNAs (lncRNAs) är en klass av RNAs som har visat för att reglera aktiviteten av kromatin-associerade proteiner13,14,15. Xist är exempelvis ett lncRNA som reglerar, i kvinnliga däggdjursceller inaktivering av en X-kromosom, genom rekrytering av epigenetiska kvinnoförtryckarna16,17. Hela spektrumet av RNAs associerade med kromatin är dock till stor del okända. Här beskriver vi ett roman protokoll, kromatin-associerade RNA immunoprecipitation (CARIP) följt av nästa generations sekvensering (CARIP-Seq), att identifiera kromatin-associerade RNAs på basis av genome-wide i ES-celler, inklusive bibliotek beredning för nästa generations sekvensering och ChIP-Seq mappa globala beläggning av Histon modifieringar, transkriptionsfaktorer och epigenetiska modifierare. Till skillnad från andra RIP-Seq metoder7inkluderar CARIP-Seq crosslinking och ultraljudsbehandling steg, som medger direkt identifiering av RNAs associerade med kromatin. Tillsammans, ChIP-Seq är ett kraftfullt verktyg för att identifiera genome-wide protein-DNA interaktioner, medan CARIP-Seq är en kraftfull metod att kartlägga RNAs förknippas med kromatin komponenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. kultur för mus ES-celler i Feeder-fria villkor.
Obs: Mus ES-celler odlas konventionellt i media på en cell kultur maträtt belagd med gelatin och en mono-skikt av mus embryonala fibroblaster (MEF), som har varit mitotiskt inaktiverade (iMEFs). MEFs bör dock avlägsnas före nedströms epigenetiska eller uttryck analyser för att förhindra kontaminering av MEF-associerade kromatin och RNA.
- Beredning av en feeder lager: Gelatin coat en 6-väl cell kultur plattan genom att tillsätta 2 mL 0,1% gelatin i vatten och inkubera plattan vid 37 ° C i 20-30 min.
- Förbered 10% DMEM hög-glukos som innehåller 2 mM L-glutamin, 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1 x penicillin/streptomycin.
- Isolera MEFs från E13.5 till E14.5 möss18,19 eller förvärva från en kommersiell leverantör. Mitotiskt inaktivera MEFs genom att behandla med mitomycin C eller gammastrålning som använder standardprotokoll19. Alternativt, mitotiskt inaktiverat MEFs (iMEFs) kan förvärvas från en kommersiell leverantör.
- Odling MEFs. Pre värma MEF media vid 37 ° C, Tina frysta injektionsflaska med iMEFs och kultur i 10% FBS MEF media vid 37 ° C med 5% CO2. Plattan MEFs på ~ 200 000 celler per väl av en 6-väl kultur maträtt.
- Odling av ES-celler på ett lager av mataren celler (iMEFs).
- 12-24 h efter plätering iMEFs, pre värma en 50 mL tub av ES cell media (DMEM hög-glukos, LIF (10 ng/mL), 15% ES cell-kvalificerade FBS, 1 × cellkultur kvalificerade 2-merkaptoetanol, 1 × glutamin, onödiga aminosyror (NEAA), 1 × penicillin/streptomycin), vid 37 ° C med 5% CO2.
- Aspirera media från cell kultur plattorna som innehåller iMEFs, återsuspendering ES cellerna i 2 mL av media (efter upptining vid 37 ° C) och platta cellerna på lagret av iMEFs. När du placerar kultur skålen i inkubatorn, är det viktigt att flytta skålen i en ”t”-form att jämnt fördela cellerna och förhindra aggregering mot mitten av skålen.
- Passage av ES-celler på feeder-fri gelatin-belagd rätter. Passage av ES-celler innan de blir konfluenta. ES cell kolonier upprätthålla självförnyelse bästa om kolonierna är jämnt fördelad och inte konfluenta. Förekomsten av många ES cell kolonier som vidrör indikerar att cell densiteten är för hög.
- Coat en 6-väl kultur maträtt med gelatin som beskrivs ovan. Inkubera 0,25% trypsin-EDTA vid 37 ° C för ~ 10-15 min till pre varma trypsin.
- Nästa, passage av ES-celler genom första tvättning med 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och lägga till 1 mL 0,25% trypsin-EDTA lösning. Vänta 1-2 min för kolonierna att lossa. Separera kolonierna till en enskild cell suspension av pipettering med 1 mL spets för ~ 5 gånger.
- Använda Mikroskop för att bekräfta enda cell dissociation av de ES-cellerna. Att släcka reaktionen, eller att ”neutralisera” trypsin, lägga till 10% FBS MEF media. Centrifugera cellerna vid 300 x g i rumstemperatur i 3-5 min och aspirera media.
- Återsuspendering cellulära pelleten i 2 mL av media (ES cell) kompletteras med glykogen syntetas kreatinkinas-3 (GSK3) hämmare (CHIR99021; GSK3i), eller 2i (MEKi/GSK3i) villkor (2-3 µM GSK3i: CHIR99021, 1 µM MEKi: PD0325901).
- Aspirera gelatin från cell kultur skålen, tillsätt 2 mL av media som innehåller råden till skålen och placera skålen i 37 ° C inkubatorn (figur 1A-D). Dubbla hämning av GSK3i och MEKi främjar grundtillståndet naiva pluripotency av ES-celler i avsaknad av mataren celler (iMEFs) och utan serum20. ES-celler bör vara anpassade två till tre gånger för att ta bort MEFs innan du fortsätter till crosslinking.
2. Crosslinking av ES-celler för ChIP och CARIP
- Skörda de ES-cellerna genom att tvätta dem med PBS och sedan lägga till 0,25% trypsin pre värmas vid 37 ° C. Inkubera cellerna i flera minuter vid rumstemperatur. Undvika över trypsinization av ES-celler, vilket leder till celldöd. Använda Mikroskop för att utvärdera enstaka cell dissociation.
- Släcka trypsin matsmältningen som beskrivs ovan för passaging ES-celler och centrifugera cellerna vid 300 x g i rumstemperatur i 3-5 min.
- Slamma upp cellerna i förväg värmde (37 ° C) MEF media (10% FBS/DMEM) på 2 × 106 celler/mL.
- Till crosslink cellerna, lägga till 37% formaldehydlösning till en slutlig koncentration av 1%, och inkubera cellerna i ett koniskt rör (15 mL eller 50 mL) vid 37 ° C för 8 min. Vänd röret flera gånger under perioden 8 min att uppnå homogen fixering.
Obs: Fixering tiden kan optimeras empiriskt för CARIP. Om fixering tiden ändras, justeras också antalet ultraljudsbehandling cykler. 37 ° C temperatur ökar också, crosslinking effektivitet jämfört med crosslinking vid rumstemperatur. Temperaturen i fixering kan optimeras empiriskt. - Stoppa fixering reaktionen, lägga till 1,25 M glycin (pre kyld vid 4 ° C) till en koncentration av 0,125 M. Vänd röret på 8 varv med en rotator för 5 min i rumstemperatur. Centrifugera provet vid 300 x g för 5 min i rumstemperatur och aspirera media.
- Tvätta cellpelleten med pre kylda PBS (4 ° C), Centrifugera provet vid 300 x g för 5 min i rumstemperatur och aspirera PBS. Tvätta cellerna med PBS igen. Nästa, alikvotens 15 × 106 celler per 15 mL rör.
- Frysa cellpelleten genom att placera den i flytande kväve för 1 min, på torris i 5 minuter eller placera omedelbart vid-80 ° C.
Obs: Fast ES cell pellets kan lagras i upp till 6 månader utan minskad kvalitet i nedströms experiment.
3. kromatin ultraljudsbehandling för ChIP och CARIP
- Tina fast ES cellpelleten på is. Återsuspendering cellpelleten i ultraljudsbehandling buffert (2,5 mL). För transkriptionsfaktorer eller epigenetiska tillsynsmyndigheter (protein faktorer), resuspendera pelleten i 1 x TE, 1 mM PMSF, 1 x proteinas hämmare cocktail. Histon ändringar, resuspendera pelleten i 1 x TE, 0,1% SDS, 1 mM PMSF, 1 x proteinas hämmare.
Obs: Medan tillägg av SDS förbättrar ultraljudsbehandling effektivitet, det kan inte vara fördelaktigt för att utvärdera vissa kromatin beståndsdelar eller transkriptionsfaktorer. - För kromatin immunoprecipitation (ChIP), Sonikera kromatin med 14-18 cykler (30 s på, 30 s vila) på 40% amplitud. För kromatin-associerade RNA immunoprecipitation (CARIP), minska antalet ultraljudsbehandling cykler (8-10 cykler). På grund av mobilnät, fixering och sonifier variabilitet, bör förhållanden för ultraljudsbehandling bestämmas empiriskt.
- Tillägg ultraljudsbehandling bufferten med 28 µL av 10% SDS för protein-faktorer, 28 µL av natriumdeoxikolat och 0,28 mL 10% Triton-X100 och blanda väl.
Obs: Tillägg av dessa komponenter till ultraljudsbehandling bufferten genererar RIPA bufferten. - Centrifugera provet vid 10 000 x g i 10 minuter vid 4 ° C före rensa kromatinet. Flytta supernatanten till en frisk slang och fortsätt med kromatin immunoprecipitation.
- Alternativt kan sonicated kromatin lagras vid-80 ° C fram till användning. Dock kan lagring av sonicated kromatin vid-80 ° C leda till minskad kvalitet för protein-faktor-ChIP.
4. chIP och CARIP Process
- Lägga till 40 µL av protein A eller G magnetiska pärlor i en 1,5 mL, låg bindande tube. Tillsätt 600 µL av PBS att tvätta pärlorna. Placera röret på ett rack som innehåller en magnet, Inkubera röret för 1 min i rumstemperatur, ta bort PBS och resuspendera magnetiska pärlor i 100 µL av PBS.
- Tillsätt 2-4 µg av antikropp till röret med magnetiska pärlor. Inkubera och rotera röret i rumstemperatur i 40 min på 8 varv med en rotator för att underlätta antikropp bindningen till de magnetiska pärlorna. Infoga röret på det magnetiska racket, inkubera det 1 min i rumstemperatur och sedan ta bort PBS.
- Tillsätt 200 µL av PBS att tvätta de magnetiska pärlorna. Tvätt med PBS utförs för att ta bort gratis IgG. Inkubera och rotera röret i rumstemperatur i 5 min mellan tvätta stegen. Anslut röret till magneten och ta bort PBS.
- Immunoprecipitate kromatin-bundna proteiner av ruvning sonicated kromatinet extrahera (4 × 10-6 celler per ChIP), med magnetiska pärlor och rotera provet vid 4 ° C (över natten).
- Tvätta de magnetiska pärlorna. Inkubera provet vid rumstemperatur med följande buffertar och rotera provet för 10 min med varje buffert: två gånger med 1 mL av RIPA bufferten (TE (10 mM Tric-HCl, 1 mM EDTA) pH 8,0, 1% Triton x-100, 0,1% natrium deocycholate, 0,1% SDS), två gånger med 1 mL av RIPA bufferten c ontaining 0,3 M NaCl, två gånger med 1 mL av LiCl buffert (0,5% natrium deocycholate, 0,5% NP40, 0,25 M LiCl), en gång med 1 mL av TE buffert med 0.2% Triton x-100, och en gång med 1 mL av TE.
- De-crosslinking för ChIP. Återsuspendering magnetiska pärlor i 100 µL av TE. Lägga till 3 µL av 10% SDS och 5 µL av proteinas K (20 mg/mL). Inkubera provet vid 65 ° C (över natten).
Obs: Det är viktigt att täcka rören under detta steg med parafilm eller plastfolie för att förhindra avdunstning.- Följande dag, Invertera röret flera gånger för att blanda. Använd sedan magneten racket för att överföra supernatanten till en frisk slang. Att tvätta de magnetiska pärlorna, tillsätt 100 µL av TE som innehåller 0.5 M NaCl och därefter kombinera två supernatanterna.
- De-crosslinking för CARIP. Återsuspendering magnetiska pärlor i 100 µL av TE. Lägga till 3 µL av 10% SDS och 5 µL av proteinas K (20 mg/mL). Inkubera provet vid 65 ° C i 4 till 12 h. inkubation tid vid 65 ° C behöver bestämmas empiriskt beror på variabiliteten mellan celltyper, ultraljudsbehandling och fixering villkor, etc.
- Vänd röret 3 - 5 gånger att blanda, applicera röret till magnetiska rack och flytta därefter supernatanten till en frisk slang.
- Att tvätta de magnetiska pärlorna, tillsätt 100 µL av TE som innehåller 0.5 M NaCl och därefter kombinera två supernatanterna.
Obs: Det är viktigt att använda nuclease-fri reagens (t.ex., TE buffert, SDS, osv.) att förhindra förlusten av DNA eller RNA under de-crosslinking steg.
- Extrahera DNA/RNA med 200 µL av fenol: kloroform: isopentanol (PCI) (25:24:1, v/v).
Obs: RNA kan även utvinnas med hjälp av kommersiella kit med tillverkarens anvisningar. Skaka i 30 s, snurra på 10 000 x g i rumstemperatur i 10 min och flytta supernatanten till en frisk slang.- För att fälla ut DNA/RNA, tillsätt 2 µL av GlycoBlue, 20 µL av 3 M natriumacetat och 600 µL etanol. Blanda genom att vända ~ 5-8 gånger, och placera provet på torris eller vid-80 ° C i minst 1-2 tim.
- Centrifugera provet vid 10 000 x g i 30 min med en kyld (4 ° C) tabell-topp centrifug. Med luftbläster i pelleten för < 1 min och slamma det i EB 40 µL buffert (10 mM Tris-HCl). För ChIP-Seq bibliotek förberedelse, fortsätter du till steg 6.
- Ta bort DNA från kromatin-associerade IP RNA-prover med DNAS. Lägga till 10 x DNAS buffert 1 x koncentration i CARIP provet. Tillsätt 1 µL av DNAS för upp till 10 µg av RNA (50 µL reaktion). Inkubera provet vid 37 ° C i 30 min. extrahera RNA provet med PCI. Återsuspendera i nuclease-fri H2O.
5. dubbelsträngat cDNA syntes för CARIP-Seq
- Syntes av första-strand cDNA. För den omvända-transkription reaktionen, ställa in följande reaktion i en tub som utformats för en PCR-maskin: 10,5 µL av RNA och 1 µL slumpmässigt av hexamer primers (3 µg/µL).
- Inkubera röret vid 65 ° C för 5 min att denaturera det sekundära strukturerar, och lagra den på is för 2 min. Blanda följande komponenter: 4 µL av första-strand buffert, 2 µL 0,1 M DTT, 1 µL dNTP och 0,5 RNase ut. Nästa, till PCR-röret, tillsätt 7,5 µL av huvudmixen. Inkubera röret under 2 minuter vid 25 ° C. Tillsätt 1 µL av upphöjd II (200 U/µL) och inkubera som följer: 25 ° C i 10 min, 42 ° C i 50 min, 70 ° C i 15 min, och håll vid 4 ° C.
- Andra-strand cDNA syntes. Placera röret på is. Lägg sedan till följande komponenter i ordning: 91 µL av dietyleter pyrocarbonate (DEPC) behandlat vatten, 30 µL av 5 x andra-strand reaktion buffert, 3 µL av dNTP mix (10 mM), 1 µL av E. Coli DNA-ligase (10 U/µL), 4 µL av E. Coli DNA-polymeras (10U/µL) , och 1 µL av E. Coli RNase H (2U/µL). Blanda genom att försiktigt vortexa och inkubera vid 16 ° C under 2 h.
Obs: Blandning av snärta eller invertera röret kanske inte tillräckligt för att kunna blanda reagenserna. - Tillsätt 2 µL av T4 DNA-polymeras och inkubera vid 16 ° C i 5 min. rena cDNA (dubbelsträngat, dscDNA) med hjälp av PCR-rening kit. Eluera dscDNA i 40 µL EB buffert.
- Fragmentet dubbelsträngat cDNA. Skjuvning cDNA (dscDNA) använda ett vatten bad sonifier och en 1,5 mL tub till en storlek på 250-500 bp. ultraljudsbehandling av dscDNA är avgörande för att minska fragment storlekar för att underlätta sekvensering av hela RNA avskriften.
- När du använder en mall för ett vattenbad sonifier, Sonikera provet för 3 × 10 min, eller 4 × 10 min.
Obs: Tre cykler bör användas för upp till 1 µg totalt RNA, medan fyra cykler rekommenderas för 1-5 µg av total-RNA. Centrifugera röret kort efter varje ultraljudsbehandling cykel, och upprätthålla en cool vattenbad genom att lägga till färska is. - När du använder en Pico sonifier, det rekommenderas att använda sex cykler för 1-5 µg av total-RNA och följande cykling villkor (30 s på, 90 s off). Centrifugera röret kort efter 2-3 ultraljudsbehandling cykler. Effektiviteten av ultraljudsbehandling kan bestämmas genom att läsa en bråkdel av de klippt dscDNA (3-4 µL) på en agarosgel (2%). Det är viktigt att empiriskt testa ultraljudsbehandling villkor beror på variabiliteten mellan sonifiers.
- Utför bibliotek förberedelse som beskrivs i steg 6 för nästa generations sekvensering.
6. chIP-Seq och CARIP-Seq bibliotek konstruktion
- Reparera ändarna av DNA med hjälp av en DNA slutet-reparationssats. Detta kit används för att generera blunt-slutade DNA. För denna reaktion, ställa in följande i en 1,5 mL, låg bindande tube: 34 µL av DNA, 5 µL av 2,5 mM dNPTs, 5 µL 10 mM ATP, 5 µL 10 x slutet-reparation buffert (5 mM DTT, 100 mM magnesium acetat, 660 mM kalium acetat 300 mM Tris-acetat, pH 7,8), och 1 µL slutet-reparation enzym mix (T4 polynucleotide kinase, T4 DNA-polymeras).
- Inkubera provet för 45 min i rumstemperatur.
- Rena DNA med en reaktion rengöring kit. Eluera slutet-repareras DNA i 32 µL före värmde (65 ° C) EB buffert. Medan vi inte vanligtvis kvantifiera koncentration av DNA efter ChIP eller RNA efter CARIP, före bibliotek förberedelse, rekommenderas det att börja med minst 5-10 ng av ChIP DNA eller CARIP RNA.
- Tillägg av en 3' ”A” överhäng till slutet-repareras DNA. Lägga till komponenter i en 1,5 mL, låg bindande tube: 30 µL av DNA ovanifrån, 5 µL 10 x NEB buffert 2, 1 µL av dATP från 10 mM lager och 11 µL av H2O 3 µL av 5 U / µL Klenow fragmentet (3' - 5' Exo-) , och blanda försiktigt genom pipettering.
- Inkubera provet under 30 minuter vid 37 ° C.
- Använd en reaktion rengöring kit för att rena DNA. Eluera DNA i 25 µL före värmde (65 ° C) EB buffert.
- Ligera adapter. Lägg till följande komponenter på is: 23 µL av DNA från ovan, 3 µL av 10 x T4 DNA ligase buffert, 1 µL glödgad PE eller multiplexing adapter (4 µM) och 3 µL T4 DNA-ligase (400 U/µL), och blanda försiktigt genom pipettering.
Obs: Adapter sekvenser kan också erhållas från en kommersiell källa.
Oligonukleotid sekvenser:
PE-adaptrar
5' P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAGGAATGCCGAG
5' ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
Multiplexing adaptrar
5' P-GATCGGAAGAGCACACGTCT
5' ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT - Inkubera provet för 30 min i rumstemperatur.
- Utföra storlek urval av DNA med en förtillverkade (2%) agarosgel. Kör gelen i 10 min.
- Punktskatt regionen motsvarar 250-450 bp.
Obs: genom att skära gelen ovan över 200 bp, det finns en minskad möjlighet för kontaminering från unligated adapter dimerer. Det är viktigt att ta bort eventuella unligated kort före steget PCR. - Använd en gel utvinning kit för att rena DNA. Eluera i 20 µL av EB buffert.
- PCR och bibliotek rening för sammanskrivna DNA prover som innehåller Parade-slutet (PE) adaptrar. Lägga till komponenter i en PCR-röret: 12 µL av 50% av DNA från ovan, 12 µL av vatten, 25 µL av master mix (Phusion HF), 1 µL av PCR-PE primer 1.0 och 1 µL av PCR-PE primer 2.0.
Obs: Oligonukleotiden sekvenser kan också erhållas från en kommersiell källa.
Oligonukleotid sekvenser:
PE PCR Primer 1.0
5' AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
PE PCR Primer 2.0
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGAACCGCTCTTCCGATCT - PCR och bibliotek rening för sammanskrivna prover som innehåller Index PE adaptrar. Lägga till komponenter: 12 µL av 50% av DNA från ovan, 12 µL av vatten, 1 µL av PCR-primer InPE 1.0 (utspädd 1:2), 1 µL av PCR-primer InPE 2.0 (utspädd 1:2) och 1 µL av PCR-primer Index (utspädd 1:2).
Obs: oligonukleotiden sekvenser kan också erhållas från en kommersiell källa.
Oligonukleotid sekvenser:
Multiplex PCR Primer 1.0
5' AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT
Multiplex PCR Primer 2.0
5' GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
PCR-Primer Index sekvenser 1-12
PCR-Primer, Index 1
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTC
PCR-Primer, Index 2
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTC
PCR-Primer, Index 3
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTC
PCR-Primer, Index 4
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTC
PCR-Primer, Index 5
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTC
PCR-Primer, Index 6
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTC
PCR-Primer, Index 7
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGATCTGGTGACTGGAGTTC
PCR-Primer, Index 8
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCAAGTGTGACTGGAGTTC
PCR-Primer, Index 9
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCGTGACTGGAGTTC
PCR-Primer, Index 10
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCTAGTGACTGGAGTTC
PCR-Primer, Index 11
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGCCGTGACTGGAGTTC
PCR-Primer, Index 12
5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACAAGGTGACTGGAGTTC - Utföra PCR Cykling använder följande villkor (denaturera för 30 s vid 98 ° C, 18 cykler av 10 s på 98 ° C, 30 s vid 65° C, 30 s vid 72 ° C, 5 min vid 72 ° C, håll vid 4 ° C).
Anmärkning: Antalet PCR cykler bör fastställas empiriskt. - Storlek urval av PCR-produkter. Kör DNA på en förtillverkade E-Gel EX (2%) eller hemmagjord 2% gel (agaros) och punktskatter regionen 300-500 bp.
- Använd en gel utvinning kit för att rena DNA från gelen. Eluera PCR slutprodukten i 20 µL av EB buffert.
- Använd en fluorometer för att mäta koncentrationen av biblioteket. Utför nästa generations sekvensering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi förhörde framgångsrikt genome-wide bindningen av H3K4me3, H3K4me2 och KDM5B i ES-celler med hjälp av detta ChIP-Seq protokoll6. ES-celler var odlade i feeder-fria förhållanden (figur 1), och tvärbunden som beskrivs ovan. Ultraljudsbehandling utförs enligt beskrivningen i steg 3,2 av protokollet ChIP-Seq därefter och utvärderas genom att köra DNA på en 2% agarosgel (figur 2). Nästa, ChIP utfördes enligt beskrivningen i steg 4 och bibliotek förberedelse utfördes som beskrivs i steg 6. ChIP-Seq bibliotek var sekvenserade på en nästa generations sekvensering plattform. Representativ UCSC webbläsare Vyhanteraren avslöja anrikningen av H3K4me3, H3K4me2 och KDM5B vid core pluripotency genen POU5F1 (figur 3A) och vid HOXC klustret (figur 3B). CARIP-Seq utfördes också genom att följa protokollet som beskrivs i steg 4-6. En representativ UCSC webbläsare Visa avslöjar anrikning H4K20me3-associerade RNA (CARIP-Seq) och H4K20me3 beläggning (ChIP-Seq) på ett lokus i ES-celler (figur 4). CARIP-Seq signalen visar att medan RNA är associerade med H4K20me3, det inte behöver nödvändigtvis betyda att det interagerar med det locus som visas. CARIP-Seq datamängder kan analyseras på ett liknande sätt som ChIP-Seq datamängder. Data som genereras från mus ES cell CARIP-Seq och ChIP-Seq experiment kan båda justeras till en referens genomet (t.ex., mm9, mm10) använder bowtie221. ChIP-Seq och CARIP-Seq berikad regioner kan båda identifieras som använder peak anropande program såsom ”Spatial klustring för identifiering av ChIP-Enriched regioner” (SICER)22 eller Mac-23,24. Eftersom CARIP-Seq datamängder sannolikt innehåller breda toppar, är det viktigt att använda en algoritm som kan identifiera bred och skarpa toppar. Medan de protokoll som beskrivs i detta manuskript har optimerats för att utföra ChIP-Seq och CARIP-Seq med ES-celler, dessa protokoll bör också vara lämplig för att utvärdera protein-DNA och kromatin-associerade RNA interaktioner i andra celltyper.
Figur 1: Feeder-fri kultur av ES-celler. (A) experimentell design. (B) ES-celler som odlas på iMEFs i ES cell media som innehåller LIF eller feeder-fria förhållanden med ES cell media som innehåller LIF och (C) GSK3i eller (D) GSK3i och MEKi (2i). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: ultraljudsbehandling av tvärbunden ES cell kromatin. Tvärbundna ES-celler var sonicated med en sonifier med en microtip för 18 cykler (40% amplitud, 30 s på, och 30 s vila). Crosslinking återfördes och RNase matsmältningen genomfördes därefter för att ta bort RNA. DNA renades med PCI och köra på en agarosgel (2%). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: representant ChIP-Seq analys av en Histon modifiera enzymet och Histon ändringar i ES-celler. Anpassade UCSC webbläsare vyer av H3K4me3, H3K4me2 och KDM5B på den pluripotency-regulator (A) POU5F1 och (B) HOXC klustret i ES-celler (normaliserade tagg densitet (RPBM), läsa per bas per miljon läsningar). Observera överlappningen mellan KDM5B bindande och H3K4me3/2 beläggning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: representant CARIP-Seq analys av RNA är associerad med en Histon modifiering och ChIP-Seq i ES-celler. UCSC webbläsare visningar av H4K20me3 CARIP-Seq och H4K20me3 ChIP-Seq signaler i ES-celler (normaliserade tagg densitet (RPBM), läsa per bas per miljon läsningar). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ChIP-Seq är en användbar metod för att utvärdera placeringen av globala protein-DNA-interaktion (t.ex., transkription faktorer/Histon ändra enzymer/Histon modifieringar och DNA) i ES-celler, medan det nyutvecklade CARIP-Seq-protokollet är användbar i förhör genome-wide association mellan RNAs och kromatin beståndsdelar. ChIP-Seq är ett grundläggande verktyg som används för att utvärdera epigenetiska landskap av ES-celler och andra celltyper. Kvaliteten på ChIP-Seq och CARIP-Seq bibliotek är till stor del beroende av ChIP-grade antikroppar. Lämpligheten av antikroppar för ChIP-Seq kan empiriskt bestämmas genom att utföra ChIP-PCR, där en ≥ 3 till 5 gånger vinsten på positiv kontroll regioner i förhållande till obesatt regioner bör vara tillräcklig för att generera hög kvalitet ChIP-Seq data25. Jämväl, antikroppar kan testas för sin lämplighet för CARIP-Seq på ett liknande sätt som beskrivs för ChIP-Seq med smärre ändringar. Efter steget RNA IP i protokollet CARIP som beskrivs i avsnittet ovan, bör omvänd-Transkription PCR utföras för att generera cDNA, som kan användas som en mall för att utföra Q-RT-PCR. Det rekommenderas att utvärdera anrikningen efter ChIP eller CARIP på flera genomisk regioner. Det finns ytterligare överväganden att testa när du utvärderar kvaliteten på antikroppar för ChIP eller CARIP. Till exempel striktheten hos buffertar används för ChIP och CARIP kan optimeras genom att ändra koncentrationen av NaCl: en låg koncentration NaCl är lämplig för mycket-specifika antikroppar, medan en hög koncentration NaCl kan vara till hjälp för antikroppar med icke-specifik bindning. Beträffande bibliotek förberedelserna för nästa generations sekvensering, anpassade primers och index kan också användas i stället för kommersiellt förvärvade oligonukleotider. Det är dock viktigt att notera att även en phosphorothioate ändringar mellan två baser i slutet 3' har visat att förhindra nuclease matsmältningen26. Tredje part RNA-Seq eller ChIP-Seq bibliotek materialsatser kan också användas för att generera bibliotek för sekvensering av CARIP och ChIP prover, respektive. Det är dock viktigt att empiriskt testa kit för att utvärdera deras effektivitet i generera kvalitet bibliotek för nästa generations sekvensering. Tilläggsprotokollen kan också användas för att utföra ChIP-Seq bibliotek förberedelse, såsom ChIPmentation27. Anpassning av ChIPmentation i ChIP-Seq-protokollet som beskrivs här kräver dock ytterligare ändringar och ytterligare optimering.
Här beskriver vi ChIP och CARIP protokoll som har optimerats med måttligt antal (4 × 106 celler per IP). Medan protokollet ChIP kan utföras med låg till intermediär cell nummer (105 106 celler), vi har inte utfört CARIP-Seq med mindre än 2 × 106 celler. Dock genom att empiriskt testa olika fixering och ultraljudsbehandling villkor, är det möjligt att detta protokoll kan arbeta framgångsrikt med hjälp av ett litet antal celler.
Sammanfattningsvis är ChIP-Seq och CARIP-Seq användbara för att skapa globala kartor av kromatin-associerade proteiner och RNAs i ES-celler, respektive. Medan dessa protokoll har optimerats för ES-celler, kan de optimeras för att generera kromatin kartor med ett brett utbud av däggdjursceller linjer och vävnadstyper. Dessa protokoll kan också optimeras för att generera encelliga ChIP-Seq eller CARIP-Seq bibliotek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar någon intressekonflikt.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av Wayne State University, Karmanos Cancer Institute, ett bidrag från nationella hjärta, lungor och blod Institute (1K22HL126842-01A1) tilldelas B.L.K. Detta arbete utnyttjas Wayne State University hög prestanda Computing rutnätet för dataresurser (< https://www.grid.wayne.edu/>). Vi tackar Jiji Kurup för hjälp med CARIP-Seq dataanalys.
FÖRFATTARNAS BIDRAG:
B.L.K. utformades av metoden CARIP-Seq, designad och utförde de ChIP-Seq och CARIP-Seq experiment, analyseras sekvensering data och utarbetat manuskriptet. Alla författarna har läst och godkänt den slutliga versionen av detta manuskript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse leukemia inhibitory factor (ESGRO LIF) | EMD Millipore | 106 or 107 units | |
| GSK3β inhibitor CHIR99021 (GSK3i) | Stemgent | Solvent: DMSO 10mM | |
| MEK inhibitor PD0325901 (MEKi) | Stemgent | Solvent: DMSO 10mM | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), high glucose | Invitrogen | 11965092 | |
| PBS (phosphate buffered saline) | Invitrogen | 10010031 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | 25200056 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| 2-Mercaptoethanol (50 mM) | Gibco | 31350010 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140076 | |
| EmbryoMax ES Cell Qualified Fetal Bovine Serum, 500 ml | EMD Millipore | ES-009-B | |
| EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | EMD Millipore | ES-006-B | |
| Glycine | Sigma | G7126-500G | 1.25 M stock conentration in water |
| Formaldehyde solution | Sigma | F8775-500ML | |
| TE (Tris EDTA) pH 8.0 1X | Quality Biological | 351-011-131 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) solution | Sigma | 93482-250ML-F | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697498001 | |
| Sodium dodecyl sulfate solution (20%) | Quality Biological | A611-0837-10 | |
| Q125 sonifier | Qsonica | 4422 | |
| Triton X-100 solution | Sigma | 93443-100ML | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation | Invitrogen | 10004D | |
| Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation | Invitrogen | 10002D | |
| Dynabeads Protein A/Protein G and Magnet Starter Pack | Invitrogen | 10015D | |
| Lithium chloride | Sigma | L4408 | |
| IGEPAL CA-630 | Sigma | I8896 | |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | |
| Dynabeads mRNA Purification Kit (for mRNA purification from total RNA preps) | Invitrogen | 61006 | |
| SuperScript Double-Stranded cDNA Synthesis Kit | Invitrogen | 11917010 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| End-It DNA End-Repair Kit | Lucigen | ER81050 | |
| Klenow Fragment (3'→5' exo-) | NEB | M0212L | |
| dATP (10 mM) | Invitrogen | 18252015 | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202L | |
| TrackIt 1 Kb Plus DNA Ladder | Invitrogen | 10488085 | |
| E-gel EX agarose gels, 2% | Invitrogen | G402002 | |
| Phusion high-fidelity 2X master mix with HF buffer | Thermo Fisher | F531LPM | |
| ChIPAb+ Trimethyl-Histone H3 (Lys4) - ChIP Validated Antibody | EMD Millipore | 17-614 | |
| Anti-Histone H3 (di methyl K4) antibody [Y47] - ChIP Grade (ab32356) | Abcam | ab32356 | |
| Corning Costar Flat Bottom Cell Culture Plates (6-well) | Fisher | 720083 | |
| Falcon Standard Tissue Culture Dishes (10cm) | Fisher | 08772E | |
| Bioruptor pico | Diagenode | B01010001 | |
| Qubit Flurometer 2.0 | Thermo Fisher | ||
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fisher | Q32851 | |
| MinElute Reaction Cleanup Kit | Qiagen | 28204 | |
| MinElute Gel Extraction Kit | Qiagen | 28604 | |
| Anti-Histone H4 (tri methyl K20) antibody - ChIP Grade (ab9053) | Abcam | ab9053 | |
| Labquake rotator | Thermo Fisher | 400110Q | |
| Illumina HiSeq platform | Illumina | ||
| TURBO DNase | Invitrogen | AM2238 |
References
- Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
- Chen, X., et al. Integration of external signaling pathways with the core transcriptional network in embryonic stem cells. Cell. 133 (6), 1106-1117 (2008).
- Boyer, L. A., et al. Core transcriptional regulatory circuitry in human embryonic stem cells. Cell. 122 (6), 947-956 (2005).
- Kim, J., Chu, J., Shen, X., Wang, J., Orkin, S. H. An extended transcriptional network for pluripotency of embryonic stem cells. Cell. 132 (6), 1049-1061 (2008).
- Kidder, B. L., Hu, G., Yu, Z. X., Liu, C., Zhao, K. Extended self-renewal and accelerated reprogramming in the absence of Kdm5b. Mol Cell Biol. 33, 4793-4810 (2013).
- Kidder, B. L., Hu, G., Zhao, K. KDM5B focuses H3K4 methylation near promoters and enhancers during embryonic stem cell self-renewal and differentiation. Genome Biol. 15 (2), R32 (2014).
- Zhao, J., et al. Genome-wide identification of polycomb-associated RNAs by RIP-seq. Mol Cell. 40 (6), 939-953 (2010).
- Baltz, A. G., et al. The mRNA-bound proteome and its global occupancy profile on protein-coding transcripts. Mol Cell. 46 (5), 674-690 (2012).
- Castello, A., et al. Insights into RNA biology from an atlas of mammalian mRNA-binding proteins. Cell. 149 (6), 1393-1406 (2012).
- Hudson, W. H., Ortlund, E. A. The structure, function and evolution of proteins that bind DNA and RNA. Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (11), 749-760 (2014).
- Khalil, A. M., et al. Many human large intergenic noncoding RNAs associate with chromatin-modifying complexes and affect gene expression. P Natl Acad Sci USA. 106 (28), 11667-11672 (2009).
- Hendrickson, D. G., Kelley, D. R., Tenen, D., Bernstein, B., Rinn, J. L. Widespread RNA binding by chromatin-associated proteins. Genome Biol. 17, 28 (2016).
- Kelley, R. L., Kuroda, M. I. Noncoding RNA genes in dosage compensation and imprinting. Cell. 103 (1), 9-12 (2000).
- Koziol, M. J., Rinn, J. L. RNA traffic control of chromatin complexes. Curr Opin Genet Dev. 20 (2), 142-148 (2010).
- Mercer, T. R., Mattick, J. S. Structure and function of long noncoding RNAs in epigenetic regulation. Nat Struct Mol Bio. 20 (3), 300-307 (2013).
- Chu, C., et al. Systematic discovery of Xist RNA binding proteins. Cell. 161 (2), 404-416 (2015).
- Mak, W., et al. Reactivation of the paternal X chromosome in early mouse embryos. Science. 303 (5658), 666-669 (2004).
- Garfield, A. S. Derivation of primary mouse embryonic fibroblast (PMEF) cultures. Methods Mol Biol. 633, 19-27 (2010).
- Conner, D. A. Mouse embryo fibroblast (MEF) feeder cell preparation. Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 23 Unit 23 22 (2001).
- Ying, Q. L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Zang, C., et al. A clustering approach for identification of enriched domains from histone modification ChIP-Seq data. Bioinformatics. 25 (15), 1952-1958 (2009).
- Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).
- Liu, T. Use model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS) to analyze short reads generated by sequencing protein-DNA interactions in embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 1150, 81-95 (2014).
- Kidder, B. L., Hu, G., Zhao, K. ChIP-Seq: technical considerations for obtaining high-quality data. Nat Immunol. 12 (10), 918-922 (2011).
- Quail, M. A., et al. A large genome center's improvements to the Illumina sequencing system. Nat Methods. 5 (12), 1005-1010 (2008).
- Schmidl, C., Rendeiro, A. F., Sheffield, N. C., Bock, C. ChIPmentation: fast, robust, low-input ChIP-seq for histones and transcription factors. Nat Methods. 12 (10), 963-965 (2015).
