Summary
Hier presenteren we een protocol om een genetisch gelabelde subpopulatie van neuronen door een twee-foton laser vanaf Zebrafish larven lasertherapie.
Abstract
Ter identificatie van de rol van een subpopulatie van neuronen in gedrag, is het essentieel om te testen van de gevolgen van het blokkeren van de activiteit in levende dieren. Laser ablatie van neuronen is een effectieve methode voor dit doel als neuronen zijn selectief gelabeld met de fluorescerende sondes. In de huidige studie, worden protocollen voor laser geruineerd een subpopulatie van neuronen met behulp van een twee-foton microscoop en het testen van de functionele en gedragsmatige gevolgen daarvan beschreven. In deze studie, wordt prooi vangen gedrag in zebrafish larven gebruikt als een studie-model. Het pretecto-hypothalame circuit is bekend dat ten grondslag liggen aan deze visueel gestuurde prooi vangen van gedrag. Zebravis pretectum waren laser-ablated worden, en neuronale activiteit in de inferieure kwab van de hypothalamus (ILH; het doel van de pretectal projectie) werd onderzocht. Prooi vangen gedrag na pretectal ablatie werd ook getest.
Introduction
Om te begrijpen hoe gedrag vloeit voort uit de neuronale activiteit in de hersenen, is het noodzakelijk om te identificeren van de neurale circuits die bij de generatie van dat gedrag betrokken zijn. Het larvale stadium, de zebravis biedt een ideale dierlijk model voor het bestuderen van de hersenfunctie geassocieerd met het gedrag, omdat hun kleine, transparante hersenen maken het mogelijk om te onderzoeken van neuronale activiteit op een cellulaire resolutie op een breed gebied van de hersenen met inachtneming van de gedrag1. Beeldvorming van neuronale activiteit in specifieke neuronen is mogelijk door de uitvinding van genetisch gecodeerde calcium (Ca) indicatoren (GECIs) zoals GCaMP2geworden. GCaMP transgene zebrafish hebben bewezen nuttig voor het koppelen van het functionele neurale circuit met gedrag door het uitvoeren van Ca imaging in dieren3gedragen.
Terwijl Ca beeldvorming kan aantonen dat de correlaties tussen Neuronale activiteit en gedrag, om aan te tonen van causaliteit, onderdrukking van neuronale activiteit en haar gevolgen op gedrag testen zijn belangrijke stappen. Er zijn verschillende manieren om dit te bereiken: het gebruik van genetische mutatie die wijzigt van specifieke neurale circuits4, uitdrukking van neurotoxines in specifieke neuronen5,6, gebruik van optogenetic hulpmiddelen zoals halorhodopsin7, en laser ablatie van gerichte neuronen8,9. Laser Ablatie is bijzonder geschikt voor het elimineren van de activiteit in een relatief klein aantal specifieke neuronen. Onomkeerbare eliminatie van neuronale activiteit door het doden van neuronen vergemakkelijkt gedragsmatige gevolgen.
Een interessant gedrag dat kan worden waargenomen in het larvale stadium van zebravis is prooi vangen(Figuur 1). Deze visueel geleide, doelgericht gedrag biedt een gunstige experimenteel systeem voor de studie van de gezichtsscherpte10, visuomotor transformatie11,12,13, visuele perceptie en erkenning van objecten14,15,16,17,18en19van de besluitvorming. Hoe prooi wordt herkend door roofdieren en hoe prooi detectie leidt tot prooi vangen van gedrag is een centrale vraag in neuroethology20. In dit artikel focussen we op de rol van het pretecto-hypothalame circuit gevormd door projecties van een kern in de pretectum (nucleus pretectalis superficialis pars magnocellularis, hierna gewoon bekend als de pretectum) aan de ILH. Laser-ablatie van de pretectum bleek te verminderen prooi vangen activiteit en neuronale activiteit in de ILH die is gekoppeld aan de visuele prooi perceptie21af te schaffen. Hier, laser protocollen voor het uitvoeren van ablatie en testen zijn effect met behulp van Ca2 + beeldvorming en gedrags opname in zebrafish larven worden beschreven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ablatie van een subpopulatie van neuronen met behulp van een Laser van het twee-foton microscoop
Opmerking: Als gebruikers van plan over het uitvoeren van Ca imaging volgende ablatie, gebruiken de UAShspzGCaMP6s lijn21. Als gebruikers van plan over het uitvoeren van gedrags opname na het baarmoederslijmvlies, gebruik de UAS:EGFP-regel, zoals de ablatie van EGFP-positieve cellen eenvoudiger uit te voeren is dan uiten van GCaMP6s cellen.
- Beginnen met het opzetten van de paring van een Gal4 lijn labels van specifieke neuronen worden bestudeerd en UAS:EGFP of UAShspzGCaMP6s. Zorg ervoor dat u de achtergrond van de nacre voor beide ouders zodat parelmoer homozygotes kunnen worden verkregen.
Opmerking: Homozygotes van nacre bevatten geen melanophores op het lichaamsoppervlak (Figuur 1B). In de huidige studie, een Gal4 lijn gSAIzGFFM119B (waarmee de labels van de pretectum) en andere Gal4 line hspGFFDMC76A (waarmee de ILH van de labels) zijn gebruikte21. - Op de volgende dag van de paring setup, de zebravis eieren te verzamelen en hen te verhogen tot het larvale stadium op welk punt de neuronen van belang fluorescerende verslaggevers zal uitspreken.
- Monteer de larve van de zebravis in 2% lage smeltpunt-agarose (Figuur 1B).
- Begin door het opstellen van 2% agarose stockoplossing: los 2 g voor lage smeltpunt agarose powder in 100 mL systeem water (dat wil zeggen, het water gebruikt om volwassen zebrafish in een circulerende water systeem)22 of E3 water23, doordat het water de punt in een magnetron koken en krachtig mengen.
- Magnetron de 2% lage smeltpunt agarose voorraad tot het kookt. Giet de agarose op het deksel van een 6-cm petrischaal mL 3.5-4.0. Wacht totdat de agarose koelt zodat het is warm om aan te raken voordat u verdergaat.
- Vervolgens plaatst u een één larve (niet verdoofd bij deze stap) in de agarose. Houd de positie en oriëntatie van de larve aan te passen zodat het rechtop, met behulp van een ontleden naald (Figuur 1C), totdat de agarose stolt om ervoor te zorgen dat de juiste positionering van de larve.
Opmerking: De larve zal blijven zwemmen rond, terwijl de agarose stolt. - Zodra de larve is geplaatst, laat 5 min. voor de agarose te stollen volledig.
- Giet de agarose 5 mL van oplossing (0,4% op 1 x werken concentratie) van de tricaïne.
Opmerking: Voorkom bewegingen door de larven tijdens laser ablatie, moeten de larven narcose tijdens de NovaSure-procedure worden gehouden.
- Lasertherapie de larve bleken de functie in een twee-foton laser microscopie systeem.
- Plaats de larve agarose-embedded onder een twee-foton laser scanning microscoop en de microscopie is opgestart.
- Start de afbeelding acquisitie software en klik op de "On"-knop op het tabblad "Laser" inschakelen van de laser (Figuur 1D). Wachten op de 'Status' van de laser te wijzigen van "Bezet" naar "Mode-locked."
- Op het tabblad "Kanalen" vastgesteldop golflengte van de laser van 880 nm (maximumvermogen: ongeveer 2300 mW) voor EGFP ablatie, of bij 800 nm (maximumvermogen: ongeveer 2.600 mW) voor GCaMP ablatie.
- Selecteer de 20 X objectief door manueel het bewegen van de lens revolver. Klik op het tabblad "Locate", "GFP" te wijzigen de optische trajecten en direct de fluorescentie te bekijken met het blote oog.
- Zoek de zebravis larvale hersenen in het midden van weergave; Klik vervolgens op het tabblad van de "Overname" om terug te gaan naar de twee-foton-microscopie.
- Als een record van de 'before ablatie'-conditie, nemen een beeld van de z-stack met de 20 X objectief scannen-snelheid (warmte-om schade te voorkomen). Later vergelijken de beelden die zijn genomen vóór en na de ablatie experimenten(Figuur 2). Voor het verkrijgen van een z-stapel, klikt u op "Z-Stack" om de optie van z-stack en vouw de tab. de ondergrens (Klik op de "Set First" knoop") na het richten aan de ventrale zijde van de larvale hersenen ingesteld en de bovengrens (Klik op de"Set Last"knop) na zich te concentreren op de dorsale meeste-oppervlak van de hersenen. Klik vervolgens op de knop "Start Experiment" als u wilt uitvoeren de Beeldacquisitie z-stack.
- Selecteer de 63 X-objectief door manueel het bewegen van de lens revolver.
- Klik op de "Zoeken" tabblad overschakelen naar de epi-fluorescent microscopie, zoek de cellen moeten ablated worden in het midden van de weergave met het blote oog, dan klik op het tabblad van de "Overname" om terug te gaan naar laser scanning microscopie.
- Op het tabblad "Overname Mode" wordt de "framegrootte" vastgesteldop door 256 x 256. Klik op "Live" en observeren van de neuronen van belang.
- Vanaf de kant van de dorsale-meeste, vinden een brandvlak waarin de cellen moeten ablated worden zijn in focus.
- Het markeren van een kleine, cirkelvormige gebied ongeveer eenderde van de cel grootte diameter op elk neuron als een regio van belang (ROI) met behulp van het "Kennisregio's"-functie.
- De snelheid van de scan instelt in 13.93 s/256 x 256 pixels (134.42 µm x 134.42 µm), hetgeen overeenkomt met een laser Nadruktijd van ongeveer 200 µs/pixel of 200 µs/0,5 µm. Stel ook 4 herhalingen (' iteratiecyclus: 4'). U kunt ook het aantal iteraties en scansnelheid te optimaliseren, zodat voldoende ablatie wordt bereikt.
- De functie 'Bleaching' voor ablatie, in combinatie met de 'Time series (2 cycli)' uitvoeren naar image van het monster (voor en na de ablatie) en "Regions" (voor de ROIs) of gelijkwaardige functies in de software die wordt gebruikt (Figuur 1D).
- Door het vergelijken van de eerste afbeelding (vóór ablatie) en de tweede afbeelding (na ablatie) in de tijdreeks cyclus, zorgen ervoor dat na het ontkleuren aangebracht, de fluorescentie in de dalingen van de gerichte cellen aan die waargenomen bij het achtergrondniveau (Figuur 2B).
- Als fluorescentie nog steeds aanwezig is na de ablatie is, verhoogt u het aantal iteraties.
- Vervolgens verplaatst het brandvlak iets dieper (dat wil zeggen, naar de ventrale zijde), en kies het volgende brandvlak waar VN ablated cellen worden weergegeven.
- Het bleken functie uitvoeren zoals hierboven (stap 1.9) beschreven. Herhaal deze stappen totdat alle cellen in de neurale structuur van belang hebben zijn ablated worden.
- Na het doorlopen van alle de focal vliegtuigen die betrekking hebben op de neurale structuren moeten ablated worden, Controleer de cellen op afgeschaft fluorescentie. Als sommige cellen worden gevonden om nog steeds worden fluorescerend als gevolg van onvoldoende ablatie, laser-bestralen ze weer zoals hierboven beschreven.
- Als de larve worden hersteld van agarose na laser-bestraling moet, probeer niet te dwingen uit de agarose omdat dit de larve kan beschadigen. In plaats daarvan maken zorgvuldig kleine bezuinigingen in de agarose rond de larve loodrecht op het oppervlak van zijn lichaam. Dan, wacht op de larve uit agarose zwemmen op eigen wanneer de verdoving verdwijnt.
- Gaat u verder met de volgende larve voor ablatie of control-experimenten met behulp van een andere bevolking van neuronen die afzijdig in het gedrag onder onderzoek uit te voeren.
Opmerking: Hier, als een besturingselement, de bulbus olfactorius neuronen in UAS:EGFP; gSAIzGFFM119B larven waren laser-ablated worden met behulp van hetzelfde protocol beschreven (Figuur 2A, rechts). - Laat paar uur, of 1 dag voor nuttige toepassing voordat u verdergaat naar Ca imaging (sectie 2) of gedrags opname (sectie 3). Tijdens deze hersteltijd, controleren de larvale gezondheid (d.w.z., normale spontane zwemmen, geen duidelijk warmte-schade rond de ablated worden gebied, etc.) en verwijderen van de larven tekenen van een slechte gezondheid.
2. calcium Imaging prooi-opgeroepen Neuronale activiteit opnemen in de Pretectum-ablated worden Zebrafish larven
- Ter voorbereiding van een opname-kamer, een veilige-seal hybridisatie kamer pakking op een glasplaatje, met de klevende kant naar op het glas, en verwijderen van de bovenste zegel.
Opmerking: Hierdoor ontstaat een kleine opname-kamer 9 mm in diameter en 0,8 mm in diepte (Figuur 3A). - Vervolgens plaatst u een nylon gaas (grootte van de opening: 32 µm) op een 50 mL-buis met de onderkant opengesneden. Gebruik de dop te koppelen van de Maas op de buis (Figuur 3B).
- De paramecia (dat is de prooi moet worden gebruikt als de visuele stimuli voor larve) voor te bereiden.
Opmerking: Voorbereiden van de Paramecium cultuur (stappen 2.3.1 en 2.3.2) vooraf.- Verkrijgen van tevoren paramecia zaad cultuur uit commerciële bronnen of academische bio-resource centers24 .
- Cultuur de paramecium voor meerdere dagen in water met gesteriliseerde met autoclaaf rijst-stro en een pellet van droge bier-gist22 (Figuur 3C).
- Giet de paramecium cultuur door 2 zeven achtereenvolgens (met een opening van 150-µm, gevolgd door een ander met een diafragma van de 75-µm) verwijderen van puin uit de cultuur.
- Paramecia in de doorstroming van de vorige stap verzamelen op een nylon gaas (13-µm diafragma).
- Resuspendeer de paramecia op de nylon gaas in een bekerglas van glas, met behulp van een squeeze fles systeem water (Figuur 3D).
- Spoel de mazen (afbeelding 3B) in het systeem water 2 x (Figuur 3E).
Opmerking: Het doel van deze stap is om alle mogelijke reukstoffen en tastants die zijn opgenomen in het kweekmedium paramecium , aangezien het doel van de huidige studie is om te observeren visueel gedreven Neuronale activiteit. - De larve van een zebravis plaats in de tricaïne oplossing van anesthetize.
- Monteer een één larve in 2% lage smeltpunt agarose.
- Eerst, magnetron 2% lage smeltpunt agarose en voeg 1/10 volume van 10 x geconcentreerd tricaïne aan de agarose.
- Plaats één druppel van de tricaïne-bevattende agarose op de opname-zaal (Figuur 3A).
- Na het bevestigen van het agarose is niet te warm, de larve van de narcose (uit stap 2.5) plaats in de agarose, onmiddellijk verwijderen van eventuele overtollige agarose, zodat het oppervlak van het agarose ziet er enigszins convexe.
- Snel oriënteren de larve in een staande positie met een ontleden naald (Figuur 1C).
Opmerking: Deze procedures moeten worden afgerond binnen enkele seconden voordat de agarose stolt. - Zodra de larve is goed gepositioneerd, laat 5 min. voor de agarose te stollen volledig. Giet vervolgens een daling van 1 x tricaine-oplossing op de agarose.
- Verwijder de agarose rond het hoofd van de larve van de zebravis en maken ruimte voor de paramecium om te zwemmen met een chirurgisch mes. Om dit te doen, Controleer eerst een paar kleine bezuinigingen in de agarose (Figuur 3F). Vervolgens Verwijder voorzichtig de overtollige agarose door zachtjes water gieten systeem op de kamer.
Opmerking: Bij deze stap, zal de tricaïne worden uitgewassen. - Vervolgens zet één paramecium in de opname-zaal om te dienen als een visuele stimuli.
Opmerking: Wanneer de paramecium in de buurt van het hoofd van de larve van de zebravis zwemt, zal het een neuronale reactie (Figuur 3G) roepen. - Plaats de opname kamer onder een epi-fluorescentie Microscoop uitgerust met een wetenschappelijke CMOS camera (Figuur 3H) en selecteer een 2.5 X objectief (Figuur 3ik).
- Time-lapse-opnamen van de signalen van de fluorescentie GCaMP verzamelen.
- Start de toepassing overname beeld voor de uitgeruste camera.
- Klik op "Volgorde Pane" en selecteer "Harddisk Record" op de ruit. Stel de "Frame Count" tot 900 of een andere totale framenummer gewenst in de sectie instellingen van scanner.
Opmerking: Indien beschikbaar, time-lapse opnamesoftware gebruiken met een module (hier, "harde schijf opnemen") die het mogelijk maakt efficiënt opslaan van de gegevens op een harde schijf. - Klik in het deelvenster "Capture" vastgesteldop de belichtingstijd 30-ms (d.w.z., 33.3 fps) en weggooien van 2 x 2.
- De Microscoop aanrakingspaneel beheren, kies een filter instellen voor GFP, zoals de GCaMP soortgelijke excitatie/emissie spectra aan GFP heeft.
- Klik op "Live" in het deelvenster vastleggen om te vinden van de larve in de cameraweergave en focus (Figuur 4,A), klik op "Stop Live" en klik op de knop "Start". Sla de film in .cxd of enige andere vorm waarin informatie over de toestand van de overname.
- Na de opnames, analyseren de GCaMP6s fluorescerende signalen (Ca signalen) door het verkrijgen van gemiddelde pixelwaarden voor de ROI instellen op een hersenstructuur in de time-lapse film met behulp van de gratis software Fiji25.
Opmerking: Fiji is een versie voor ImageJ met veel nuttige plug-in is geïnstalleerd en .cxd indeling beeldbestanden met de Bio-formaten kan lezen plug-in. - Als de larve iets tijdens het opnemen verplaatsen, uitvoeren beeldregistratie door het uitvoeren van de TurboReg plug-in26 in Fiji. Selecteer in het menu 'Plugins', 'Registratie' en 'TurboReg'.
- Nagaan hoe de gegevens volgens het doel van de studie analyseert. Het volgende is een voorbeeld.
- De F/F0 (fluorescentie intensiteit op elk tijdstip, gedeeld door de intensiteit van de fluorescentie in rust of voordat elke voorbijgaande Ca opgetreden) wordt als volgt berekend:
- ROIs aangezet met de pretectum of de ILH gebruikend de Manager van de ROI: Selecteer in het menu "Analyze," 'Tools' "ROI Manager", en "Add" aan de lijst met de ROIs (Figuur 4A).
- Bereken de gemiddelde pixelwaarden voor de ROIs (dwz., fluorescentie intensiteiten van GCaMP6s) door te selecteren in het deelvenster ROI Manager: "Meer," "Multi maatregel" en "OK." De resultaten opslaan als een spreadsheet-bestand.
- Als de signalen lawaaierig zijn, gemiddelde de signalen voor 11 tijd-punten (voortschrijdend gemiddelde) met behulp van een toepassing die kan omgaan met gegevens uit een werkblad.
- F (intensiteit van de fluorescentie na verloop van tijd) delen door F0 (intensiteit van de fluorescentie op basaal niveau) voor de berekening van de intensiteit van de genormaliseerde fluorescentie. Een voorbeeld van data visualisatie, veranderingen in genormaliseerde intensiteit van de fluorescentie van de GCaMP6s in de pretectum en de ILH zijn vergelijkende en toegewezen op de paramecium trajecten (Figuur 4B - D).
3. beoordeling van de gedragsmatige gevolgen na Laser Ablatie
- Instellen van een gedrags-opname-systeem dat uit een stereoscoop uitgerust met een video camera bestaat. Het gebruik van een camera met een passende afbeelding acquisitie software, commerciële of op maat gemaakte (Figuur 5A).
- Optimaliseer de lichtomstandigheden zodat de paramecium kan worden gedetecteerd door de beeldverwerking. Gebruik bijvoorbeeld een ring wit LED licht met een spacer (Figuur 5B).
Opmerking: De afstand en de hoek van de LED bepaalt de vormgeving van het monster (dat wil zeggen, licht in donkere achtergrond of donkere in lichte achtergrond) en zijn daarom cruciaal voor succesvolle beeldverwerking. Bepaal de beste hoogte voor het tussenstuk (Figuur 5C). - Plaats een larve van de zebravis (hersteld van het experiment van de laser-ablatie beschreven in sectie 1) in een gedrags opname kamer (die was aangesloten op een glasplaatje) met het oorspronkelijke bovenste zegel verwijderd (Figuur 5D).
- 50 paramecia van de cultuur (stap 2.3.5) verzamelen met behulp van een micropipet en plaats ze in de zaal van de opname.
- Plaats een cover slip op de top van de kamer van de opname. Zet een kleine druppel water op de cover slip alvorens op het wateroppervlak van de opname kamer om te voorkomen dat de invoering van de lucht in de kamer te plaatsen.
Opmerking: In deze stap zal wat water met paramecia uit de zaal opnemen overlopen. Het resterende aantal paramecia in de zaal van de opname zal ongeveer 30-40. - Plaats het cupje van de opname (met een larve en paramecia) in de lighting system (Figuur 5D).
- De time-lapse opname op 10 fps voor 11 min (6.600 frames) te starten.
- (Optioneel) Voor elke larve die werd getest voor gedrag, observeren de fluorescentie van de laser-ablated worden gebieden door fluorescent microscopie te bevestigen de effectiviteit van de laser-ablatie (d.w.z., afwezigheid of aanzienlijk verminderd aantal, fluorescerende cellen in de laser-bestraalde gebied).
Opmerking: Zelfs na bestraling, kunnen nog steeds sommige fluorescerende cellen worden waargenomen als gevolg van latere begin van Gal4 genexpressie in cellen die gedifferentieerd na ablatie27. - Voer na het opnemen van de larve gedrag, te compenseren voor het gebrek aan uniformiteit in de achtergrond, een divisie van de pixel-bij-pixel van elk frame een gemiddelde beeld in Fiji: Klik op 'Verwerken', 'Afbeelding Calculator', ' operatie: verdelen ', ' 32-bits (float) resultaat ', en ' OK'. Een gemiddelde beeld, klik op 'Afbeelding', 'Gestapeld', 'Z-Project', 'Gemiddelde intensiteit' en 'OK' (Figuur 5E, F).
- Het aantal paramecia links in de kamer door te klikken op 'Analyseren', 'Analyseren deeltjes', de instelling voor aantal een gebied bereik dat betrekking heeft op alle de paramecia, de 'Toon: maskers' aan te vinken en op 'OK' te klikken. De optie 'Toon: maskers' zal zorgen voor een beeld van de uitgepakte paramecia (Figuur 5G), met een lijst van het aantal deeltjes (paramecia) in elk frame.
- Het aantal paramecia nog in de zaal van de opname worden uitgezet na verloop van tijd. Aangezien de ramingen van het aantal paramecia lawaaierig zijn, is het aan te raden het uitvoeren van een voortschrijdend gemiddelde op elk punt in een bereik van 600 frames (1 min) op het werkblad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Specifieke neuronen waren genetisch gelabeld met EGFP of GCaMP6s, waarvan de expressie werden verdreven in Gal4 lijnen. Een Gal4 lijn gSAIzGFFM119B werd gebruikt om de label van een nucleus in het pretectal gebied (magnocellular oppervlakkige pretectal kern), en een subpopulatie van bulbus olfactorius neuronen. Een andere lijn van de Gal4, hspGFFDMC76A, werd gebruikt om de label van de ILH. We laser-ablated worden de pretectal neuronen bilateraal (Figuur 2 linker paneel) en ablated u ook neuronen in de bulbus olfactorius bilateraal worden als een bedieningspaneel (Figuur 2 rechts) in zebrafish larven van een Gal4 lijn gSAIzGFFM119B die werden gekruist met UAS:EGFP verslaggever vis. Resultaten tonen aan dat twee-foton laser gerichte cellen kan lasertherapie terwijl het verlaten van aangrenzende cellen of neurites onaangetast (Figuur 2B).
De pretectal neuronen project hun axonen richting de ILH ipsilaterally. Hier, onderzochten we hun functionele verbindingen met Ca imaging. Neuronale activiteit in deze regio kan worden waargenomen als Ca signalen met een Ca sonde GCaMP6s (Figuur 4A), waarvan de expressie werd gedreven door een Gal4 lijn gSAIzGFFM119B (Figuur 4B) of een ander Gal4 lijn hspGFFDMC76A (Figuur 4 C). de gekleurde pijlpunten (Figuur 4) show zwemmen richtingen en trajecten van de paramecium, evenals de kleurgecodeerde Ca signaal-wijzigingen op het gebied van de opgegeven hersenen, die werden opgeroepen door de aanblik van het zwembad paramecium (Figuur 4B-D). Zowel de pretectum (Figuur 4B) en de ILH (Figuur 4C) toonde Neuronale activiteit in de proximale aanwezigheid van prooi, suggereren dat beide neuronale activiteiten visueel worden gedreven.
Met behulp van de dubbele Gal4 GCaMP6s larven (gSAIzGFFM119B; hspGFFDMC76A; UAShspzGCaMP6s), wij ablated worden de pretectal neuronen eenzijdig en verder uitgevoerd Ca imaging om neuronale activiteit in de pretectum en de ILH in de ablated larven te observeren. De linker pretectum dat laser-ablated worden was toonde residuele geen Neuronale activiteit (Figuur 4D, links boven), wat suggereert dat laser-ablatie was succesvol. De ipsilaterale ILH toonde echter drastisch verminderde Neuronale activiteit (Figuur 4D linksonder), wat suggereert dat de belangrijke inbreng op de ILH uit de ipsilaterale pretectum komt. In tegenstelling, de ILH aan de andere kant van de laser-ablated worden pretectum (Figuur 4D rechtsonder) toonden een neuronale activiteit vergelijkbaar met de neuronale activiteit in de ipsilaterale pretectum (Figuur 4D, rechtsboven), die stelt voor dat de juiste ILH ingangen is ontvangen door de juiste pretectum.
De keuze van welke gedrags test te gebruiken in een experiment is afhankelijk van de mogelijke rol(len) van de neuronen onderzochte. Hier, laten we een voorbeeld van een bepaling van de prooi-vangst na het baarmoederslijmvlies van de kern van een pretectal die werd geïdentificeerd als een prooi detector21. Met behulp van de verlichtingssysteem dat is afgebeeld in Figuur 5A-D, kan het aantal paramecium in de zaal van de opname worden geteld door beeldverwerking (Figuur 5E-G). Geautomatiseerd extractie van ogen en berekening van oog posities (dat wil zeggenwijzigingen in de hoeken van de ogen) is ook mogelijk omdat de ogen van de larve van de zebravis donkerder dan de achtergrond in deze verlichting voorwaarde (Figuur 5H ).
Resultaten van het experiment blijkt dat bilaterale-ablatie van de activiteit van de pretectum afgeschaft prooi-vangst (Fig. 5I, PT) terwijl ablatie van een subpopulatie van neuronen in de bulbus olfactorius niet (Figuur 5ik, OB). Deze resultaten, samen met experimenten afgebeeld in Figuur 4, suggereren dat het pretecto-hypothalame circuit essentieel in prooi-vangst gedrag is.
Figuur 1 . Zebravis larven. (A) vijf oude dag (5 dagen na bevruchting (5-dpf)) zebrafish larve en zijn prooi, een paramecium. (B) 4-dpf parelmoer larve ingebed in de 2% lage smeltpunt agarose. Merk op dat de nacre spanning zwarte pigmenten op het lichaam mist terwijl het retinale pigment epitheel intact is. Schaal bar: 0,5 mm. (C) ontrafeling naald gebruikt kunt u zebrafish larven in agarose. Schaal bar: 1 cm. (D) Screenshot van de software gebruikt in de twee-foton microscopie, "Bleaching", "Tijdreeks" en "Kennisregio's"-panelen die gebruikt werden in het baarmoederslijmvlies te tonen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 . Ablatie van een subpopulatie van neuronen met behulp van een laser van het twee-foton microscoop. ()A) EGFP fluorescerende beelden van 4-dpf zebrafish larven vóór en na de ablatie van neuronen. Bovenaanzicht en zijaanzicht van 3D gereconstrueerde z-stack beelden met behulp van beeld processing software. De z-stack beelden werden genomen met een 20 X-objectief. De ablated gebieden (de pretectum of bulbus olfactorius) zijn omcirkeld in het geel. Schaal bar: 100 µm. ()B) voorbeeld van laser ablatie bij een enkele brandvlak met behulp van de functie "Bleaching". Laser-bestraalde gebieden (instellen ROIs) worden weergegeven in kleuren op elke cel. Schaal bar: 10 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 . Voorbereiding van de zebravis larven en paramecia voor Ca imaging. (A) opname kamer. Een commercieel beschikbare 9 mm diameter x 0,8 mm diepte hybridisatie pakking met 8 kamers werd gebruikt als de kamer opnemen. De pakking werd gelegd op een glasplaatje en nageleefd. Het zegel op de bovenkant van de pakking was geschild uit. ()B) het nylon gaas (32 µm) gebruikt voor het spoelen van de paramecia. De Maas was geplaatst op een tube van 50 mL. (C) Paramecium cultuur met rijst-stro en droog gist pellets. (D) Paramecium voorraadoplossing bereid uit de cultuur weergegeven in C. (E) Paramecium stockoplossing werd gespoeld met systeem water tweemaal te verwijderen mogelijk reuk en smaak signalen in het medium. (F) Paramecium ingebed in de zaal van de opname. Als u wilt verwijderen een deel van agarose, werden verschillende bezuinigingen gedaan. (G) opname kamer met een larve van de zebravis en een paramecium. De meerderheid van de agarose werd verwijderd om de paramecium om te zwemmen. Het hoofd van de larve van de zebravis wordt blootgesteld. (H) rechtop fluorescente microscoop gebruikt in Ca beeldbewerking. De Microscoop is uitgerust met een wetenschappelijke CMOS-camera. (ik) Zebrafish larve in de zaal van de opname onder de microscoop met de excitatie licht op. Met een 2.5 X objectief is de verlichte ruimte iets groter dan de grootte van de kamer. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 . Vertegenwoordiger Ca imaging gegevens. (A) positie van de pretectum en de inferieure kwab van de hypothalamus (ILH), omcirkeld in het geel, in een dubbele Gal4 hspGFFDMC76A; gSAIzGFFM119B; UAShspzGCaMP6s zebrafish larve. (B) wijzigingen in het pretectum Ca signaal (gemiddeld bilateraal), kleur toegewezen op de trajecten van een paramecium in een gSAIzGFFM119B; UAShspzGCaMP6s de larve. Schaal bar: 1 mm. (C) wijzigingen in het ILH Ca signaal (gemiddeld bilateraal), kleur toegewezen op de trajecten van een paramecium in een hspGFFDMC76A; UAShspzGCaMP6s de larve. Schaal bar: 1 mm. (D) veranderingen in de pretectum en de ILH Ca signalen kleur toegewezen op de trajecten van een paramecium in een hspGFFDMC76A; gSAIzGFFM119B; UAShspzGCaMP6s larve die werd onderworpen aan twee-foton laser-ablatie van de linker pretectum. Schaal bar: 1 mm. Dit beeld werd gereproduceerd van dezelfde gegevens eerder gepubliceerd21. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 . Prooi assay en vertegenwoordiger opnamegegevens in laser-ablated worden zebrafish larven. (A) gedrags-opname-systeem. De stereomicroscoop was uitgerust met een CMOS camera. Beelden werden verkregen met behulp van een op maat gemaakte script. (B) onderdelen van het verlichtingssysteem. Een grijs gekleurd papier, een glazen diffusor, lichte witte LED-ring, diffuser, een op maat gemaakte spacer (karton) en plafondrooster met een gat in het midden. (C) het verlichtingssysteem samengesteld uit de onderdelen weergegeven in B. (D) opname kamer voor de prooi vangen assay. Een kamer (diameter: 20 mm, diepte: 2.5 mm) werd gelegd op een glasplaatje. Het oorspronkelijke bovenste zegel van de kamer was geschild uit. Een glasdeel werd gelegd op de opname-zaal. (E) Raw-afbeeldingen van een frame van de film opgenomen. (F) A frame verdeeld (pixel-door-pixel) door een gemiddelde beeld in een film. Merk op dat de niet-uniforme achtergrond verlichting kan worden gecompenseerd door deze beeldverwerking. (G) Paramecia geëxtraheerd uit een frame met behulp van de functie "Particle Analysis" in Fiji. (H) voorbeeld van afbeelding in Fiji met een toegepaste drempel. Paramecia verschijnen helder, overwegende dat de ogen van de larve van de zebravis verschijnen donker en de achtergrond grijs. Wijzigingen in oog posities (dat wil zeggen, de hoeken ten opzichte van de as van het lichaam) kunnen worden berekend, indien nodig. (ik) vertegenwoordiger experimentele gegevens van de paramecium consumptie in de larve van een olfactorische-lamp-ablated worden controle (OB) en een pretectum-ablated worden larve (PT). Pretectum ablatie aanzienlijk verminderd prooi jacht vermogen terwijl bulbus olfactorius ablatie het niet beïnvloedde. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hoewel de twee-foton laser een uitstekende ruimtelijke resolutie heeft te specifiek lasertherapie individuele neuronen, moet grote voorzichtigheid worden genomen om te voorkomen dat ongewenste schade op het hersenweefsel als gevolg van warmte. De belangrijkste stap in het baarmoederslijmvlies experiment is om te bepalen van de optimale hoeveelheid laser-bestraling. Onvoldoende bestraling mislukt om te doden van de neuronen. Te veel bestraling zal warmte-schade het omringende weefsel, die zal resulteren in ongewenste effecten. Het optimale aantal laser-bestraling (gebieden van de ROIs, aantal iteraties en scansnelheid) lijkt te zijn smal. Een paar factoren van invloed op de efficiëntie van de ablatie.
Eerst met behulp van verschillende TL verslaggever eiwitten, moeten de ablatie voorwaarden worden geoptimaliseerd voor elke verslaggever. GCaMP expressie wordt waargenomen in het cytoplasma verstoken van kernen. Daarentegen blijkt EGFP fluorescentie in de binnenkant van de cel, die kan nuttig zijn voor efficiënte en specifieke ablatie van de gerichte cellen, in vergelijking met GCaMP. Het gebruik van GCaMP is ook nadelig als een laser-ablated worden GCaMP-uiten cel verhoogde fluorescentie intensiteit als gevolg van directe massale toestroom van de Ca, in tegenstelling tot verminderde fluorescentie intensiteit vertonen kan toen EGFP werd gebruikt voor ablatie. Dus, kan de verandering in de fluorescentie een betrouwbare indicator van de omvang van het baarmoederslijmvlies met GCaMP niet. In dergelijke gevallen kan het nodig te valideren ablatie door het observeren van het verlies van fluorescerende cellen na een bepaalde periode zijn. Afwezigheid of aanzienlijke vermindering van de signalen van de Ca op de ablated gebied kan een ander criterium voor succesvolle ablatie met GCaMP.
Ten tweede, het bedrag (dat wil zeggen, snelheid van de scan, iteratie aantal scans) van laser-bestraling nodig is voor succesvolle ablatie kan variëren afhankelijk van de diepte van de locatie van de neuronen van het oppervlak van de hersenen. In vergelijking met cellen gelegen in de buurt van het oppervlak, vereisen die diep in de hersenen gelegen meer laser-bestraling, dus, waardoor het moeilijker voor lasertherapie hen. Optimalisatie voor het bedrag van laser-bestraling moet specifiek worden bepaald voor elke gerichte subpopulatie van neuronen.
Ten derde werd het empirisch waargenomen dat de instelling een aantal ROIs in een klein gebied in één scan vaak warmte-beschadigd het weefsel rond de cellen ook (beoordeeld door de verschijning van de bubbels in de laser-bestraalde gebied), overwegende dat gericht op één cel alleen, of dun gedistribueerde ROIs in een scan onder dezelfde voorwaarde had geen schadelijke effecten. In de huidige studie, was bleken alleen toegepast op een klein gebied (ongeveer een derde van de grootte van de cel lichaam) om te voorkomen dat schade aan weefsels buiten de gerichte cellen. Meestal waren 5-10 cellen gericht op elke brandvlak (4-8 vliegtuigen ter dekking van het hele pretectal gebied).
Naast het optimaliseren van de hoeveelheid laser-bestraling, is uitgebreide validatie van laser ablatie door controle experimenten uit te voeren van cruciaal belang. Een controle-experiment kan bevatten laser ablatie van een andere populaties van cellen die zijn waarschijnlijk niet betrokken bij het gedrag bestudeerd. Bulbus olfactorius neuronen label in dezelfde lijn Gal4 diende als besturingselement in de huidige studie (Figuur 2A, rechts, en Figuur 5ik). Echter, om bovenstaande reden geen groepen van neuronen kunnen dienen als een ideale besturingselement. Elke subpopulatie van neuronen verschilt van de anderen met betrekking tot hun positie in de hersenen, celdichtheid fluorescerende verslaggever transgenic expressie niveau, het tarief van de verspreiding en de timing van de verslaggever transgenic expressie. Deze verschillen maken het onmogelijk om te gebruiken van de exacte dezelfde instelling voor ablatie (de 'Bleaching'-functie) in controle experimenten. Dus, verschillende soorten controle experimenten moeten worden ook overwogen, zoals metingen van de reactie van de optokinetic, visuele gedrag28en basale activiteit in motoriek21 om ervoor te zorgen het specifieke effect van het baarmoederslijmvlies.
In onze ervaring duurt ablatie van de tientallen van de pretectal cellen bilateraal, ongeveer 1 uur (van insluiten in agarose, met behulp van een twee-foton microscoop, tot het ophalen uit de agarose na van het baarmoederslijmvlies met NovaSure). Maximaal 8 larven per dag (bijv., 4 larven voor experimentele en 4 voor controle) moeten ablated kan worden; Vandaar, een paar sets van experimenten mogelijk moet zorgen dat er genoeg larven voor een experimentele groep (bijvoorbeeldn = 12) en een controlegroep (bijvoorbeeldn = 12). Bovendien is het wenselijk dat de helft een dag of een dag voor de larven om te herstellen van ablatie (bijvoorbeeldlaser ablatie bij 4-dpf gevolgd door een gedrags opname op 5-dpf of van het baarmoederslijmvlies in de ochtend gevolgd door Ca beeldvorming in de namiddag). Tijdens deze hersteltijd, moeten slecht uitziende larven van de studie worden uitgesloten.
Het protocol dat wordt gebruikt voor het analyseren van de verkregen data, hangt volledig af van het doel van de studie. De huidige studie concentreerde zich op de relaties tussen de locatie van de paramecium in het gezichtsveld en neuronale activiteit in de pretectum en de ILH. Gezien het langzame verval (~ seconden) van de GCaMP6s signalen29, alleen de timing van de verhoging, maar niet de daling van de GCaMP6s signalen correleert met de locatie van de paramecium. De Ca-signalen kunnen hoog zijn, zelfs wanneer de paramecium opzijschuiven. Vandaar, wij alleen opgenomen verhoogde fluorescentie intensiteit van GCaMP6s in de presentatie van de gegevens. Dit type analyse vereist vaak op maat gemaakte scripts die zijn geschreven met specifieke programmeertalen of macrotalen. De scripts die worden gebruikt in dit document zijn beschikbaar op aanvraag.
De ingetogen voorwaarde (d.w.z., agarose-ingebedde) misschien wel belastend voor de larven van de zebravis tot op zekere hoogte; echter ging niet zien we duidelijk stress-geïnduceerde Neuronale activiteit of gedrag in deze voorwaarde, in vergelijking met de vrijzwemmende voorwaarde21,22. Agarose-embedded zebrafish larven kunnen overleven ten minste 24 h, (waarschijnlijk meer) zonder enig herkenbaar probleem. Paramecium-gedreven Ca signalen in de pretectum en de ILH in de beperkte conditie waren vergelijkbaar met die bij vrijzwemmende larven21waargenomen. Zebravis visuele gedrag kan worden gecontroleerd door het circadiane ritme. Vandaar, experimenten we gedrags van vroeg tot laat in de avond. Wild type en controle larven verbruikt een groot aantal paramecia gedurende deze opnametijd.
De functionele en gedragsmatige testen hier beschreven gebruik maken van de meest algemeen beschikbare apparatuur die is te vinden in veel laboratoria of zou met gemak Troep opwaarts, en aldus het brede toepassingen moet hebben in de verschillende velden van de gedragswetenschappen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen conflicten van belang verslag.
Acknowledgments
Deze studies werden gefinancierd door subsidies ontvangen de MEXT JSPS KAKENHI Grant nummers JP25290009, JP25650120, JP17K07494 en JP17H05984.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NuSieve GTG Agarose | Lonza | Cat.#50080 | low-melting temperature agarose |
| 6 cm petri dish | FALCON | Product#:351007 | |
| dissecting needle | AS ONE Corporation | Cat. No. 2-013-01 | https://keystone-lab.com/en/item/detail/404142 |
| LSM7MP | Carl Zeiss | two-photon laser scanning microscope | |
| W Plan-Apochromat 63x/1.0 | Carl Zeiss | 63X objective lens | |
| Imager.Z1 | Carl Zeiss | an epi-fluorescence microscope | |
| ZEN | Carl Zeiss | Image acquisition software for confocal microscopes | |
| Secure-Seal Hybridization Chamber Gasket, 8 chambers, 9 mm diameter x 0.8 mm depth | Molecular Probes | Catalogue # S-24732 | Used as a recording chamber in Ca imaging |
| Imageing Chambers | Grace Bio-Labs | CoverWell Imaging Chambers PCI-A-2.5 | Used as a behavioral recording chamber |
| surgical knife | MANI | Ophthalmic knife MST15 | |
| ORCA-Flash4.0 | Hamamatsu Photonics | model:C11440-22CU | a scientific CMOS camera |
| HCImage | Hamamatsu Photonics | image acuisition software | |
| Hard Disk Recording module | Hamamatsu Photonics | An software module that enables saving the movie files onto a hard disc drive in a short time | |
| SZX7 | Olympus | stereoscope | |
| DF PL 0.5X | Olympus | objective lens for SZX7 | |
| Point Grey Grasshopper3 4.1 MP Mono USB3 Visio | FLIR Systems, Inc. | Product No. GS3-U3-41C6NIR-C | CMOS camera |
| XIMEA xiQ camera | XIMEA | Product No. MQ042RG-CM | CMOS camera |
| a ring LED light | CCS | Model: LDR2-100SW2-LA | White LED |
| Nylon mesh 32µm | Tokyo Screen | N-No.380T | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/ |
| Nylon mesh 13µm | Tokyo Screen | N-No. 508T-K | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/ |
| Metal seive 150 micron aperture | Tokyo Screen | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami | |
| Metal seive 75 micron aperture | Tokyo Screen | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami | |
| EBIOS | Asahi Food & Healthcare, Co. Ltd. | dry beer yeast | |
| LabVIEW | National Instruments | an integrated development environment for programming | |
| Mai-Tai HP | Spectra Physics | two-photon laser |
References
- Feierstein, C. E., Portugues, R., Orger, M. B. Seeing the whole picture: A comprehensive imaging approach to functional mapping of circuits in behaving zebrafish. Neuroscience. 296, 26-38 (2015).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).
- Muto, A., et al. Genetic visualization with an improved GCaMP calcium indicator reveals spatiotemporal activation of the spinal motor neurons in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (13), 5425-5430 (2011).
- Lorent, K., Liu, K. S., Fetcho, J. R., Granato, M. The zebrafish space cadet gene controls axonal pathfinding of neurons that modulate fast turning movements. Development. 128 (11), 2131-2142 (2001).
- Asakawa, K., et al. Genetic dissection of neural circuits by Tol2 transposon-mediated Gal4 gene and enhancer trapping in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (4), 1255-1260 (2008).
- Sternberg, J. R., et al. Optimization of a Neurotoxin to Investigate the Contribution of Excitatory Interneurons to Speed Modulation In Vivo. Curr Biol. , (2016).
- Arrenberg, A. B., Del Bene, F., Baier, H. Optical control of zebrafish behavior with halorhodopsin. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (42), 17968-17973 (2009).
- Orger, M. B., Kampff, A. R., Severi, K. E., Bollmann, J. H., Engert, F. Control of visually guided behavior by distinct populations of spinal projection neurons. Nat Neurosci. 11 (3), 327-333 (2008).
- Huang, K. H., Ahrens, M. B., Dunn, T. W., Engert, F. Spinal projection neurons control turning behaviors in zebrafish. Curr Biol. 23 (16), 1566-1573 (2013).
- Smear, M. C., et al. Vesicular glutamate transport at a central synapse limits the acuity of visual perception in zebrafish. Neuron. 53 (1), 65-77 (2007).
- Bianco, I. H., Engert, F. Visuomotor transformations underlying hunting behavior in zebrafish. Curr Biol. 25 (7), 831-846 (2015).
- Trivedi, C. A., Bollmann, J. H. Visually driven chaining of elementary swim patterns into a goal-directed motor sequence: a virtual reality study of zebrafish prey capture. Front Neural Circuits. 7, 86 (2013).
- Jouary, A., Haudrechy, M., Candelier, R., Sumbre, G. A 2D virtual reality system for visual goal-driven navigation in zebrafish larvae. Sci Rep. 6, 34015 (2016).
- Muto, A., Ohkura, M., Abe, G., Nakai, J., Kawakami, K. Real-time visualization of neuronal activity during perception. Curr Biol. 23 (4), 307-311 (2013).
- Del Bene, F., et al. Filtering of visual information in the tectum by an identified neural circuit. Science. 330 (6004), 669-673 (2010).
- Semmelhack, J. L., et al. A dedicated visual pathway for prey detection in larval zebrafish. Elife. 3, 04878 (2014).
- Preuss, S. J., Trivedi, C. A., vom Berg-Maurer, C. M., Ryu, S., Bollmann, J. H. Classification of object size in retinotectal microcircuits. Curr Biol. 24 (20), 2376-2385 (2014).
- Romano, S. A., et al. Spontaneous Neuronal Network Dynamics Reveal Circuit's Functional Adaptations for Behavior. Neuron. 85 (5), 1070-1085 (2015).
- Barker, A. J., Baier, H. Sensorimotor decision making in the zebrafish tectum. Curr Biol. 25 (21), 2804-2814 (2015).
- Ewert, J. -P. Neuroethology: an Introduction to the Neurophysiological Fundamentals of Behavior. , Springer Verlag. (1980).
- Muto, A., et al. Activation of the hypothalamic feeding centre upon visual prey detection. Nat Commun. 8, 15029 (2017).
- Muto, A., Kawakami, K. Calcium Imaging of Neuronal Activity in Free-Swimming Larval Zebrafish. Methods Mol Biol. 1451, 333-341 (2016).
- Westerfield, M. THE ZEBRAFISH BOOK, 5th Edition. , University of Oregon Press. (2007).
- National BioResource Project Paramecium. , Available from: http://nbrpcms.nig.ac.jp/paramecium/?lang=en (2017).
- Fiji. , Available from: https://fiji.sc (2017).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).
- Mueller, T., Wullimann, M. F. BrdU-, neuroD (nrd)- and Hu-studies reveal unusual non-ventricular neurogenesis in the postembryonic zebrafish forebrain. Mech Dev. 117 (1-2), 123-135 (2002).
- Muto, A., et al. Forward genetic analysis of visual behavior in zebrafish. PLoS Genet. 1 (5), 66 (2005).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
