Summary
Nous présentons ici un protocole pour l’ablation d’une sous-population génétiquement marquée de neurones par un laser à deux photons de larves de poisson zèbre.
Abstract
Pour identifier le rôle d’une sous-population de neurones dans le comportement, il est essentiel de tester les conséquences du blocage de son activité dans les animaux vivants. Ablation par laser de neurones est une méthode efficace à cet effet lorsque les neurones sont sélectivement marquées avec des sondes fluorescentes. Dans la présente étude, les protocoles pour laser ablation une sous-population de neurones à l’aide d’un microscope biphotonique et l’essai de ses conséquences fonctionnelles et comportementales sont décrits. Dans cette étude, le comportement de capture des proies chez les larves de poisson zèbre est utilisé comme un modèle d’étude. Le circuit pretecto-hypothalamique est connu pour sous-tendre cette proie pilotée par visuellement capture le comportement. Poisson zèbre prétectum étaient ablation au laser, et l’activité neuronale dans le lobe inférieur de l’hypothalamus (ILH ; la cible de la projection pretectal) a été examinée. Comportement de capture des proies après ablation pretectal a également été testé.
Introduction
Pour comprendre comment le comportement résulte de l’activité neuronale dans le cerveau, il est nécessaire d’identifier les circuits neurones qui sont impliqués dans la génération de ce comportement. Au stade larvaire, le poisson-zèbre fournit un modèle animal idéal pour étudier le fonctionnement du cerveau associées le comportement parce que leur cerveau petit, transparent permettre d’enquêter sur l’activité neuronale à une résolution cellulaire dans un vaste domaine de la cerveau tout en observant le comportement1. Imagerie de l’activité neuronale dans les neurones spécifiques est devenue possible grâce à l’invention des indicateurs génétiquement encodé calcium (Ca) (GECIs) comme GCaMP2. GCaMP zebrafish transgénique ont révélé utile permettant d’associer le circuit neuronal fonctionnel avec un comportement en procédant à l’imagerie Ca en se comportant des animaux3.
Alors que l’imagerie Ca peut démontrer les corrélations entre l’activité neuronale et comportement, pour montrer le lien de causalité, suppression de l’activité neuronale et les essais de ses conséquences sur le comportement sont des étapes importantes. Il existe différentes façons d’y parvenir : l’utilisation de la mutation génétique qui altère les circuits neuronaux spécifiques4, expression des neurotoxines de neurones spécifiques5,6, utilisation d’outils d’optogenetic comme halorhodopsin7, et laser ablation de neurones ciblés8,9. Ablation laser est particulièrement adaptée pour l’élimination de l’activité dans un relativement petit nombre de neurones spécifiques. Facilite l’élimination irréversible de l’activité neuronale en tuant les neurones évaluant les conséquences comportementales.
Un comportement intéressant que l'on peut observer au stade larvaire chez le poisson zèbre est la capture des proies (Figure 1A). Ce comportement guidé visuellement, ciblé fournit un système expérimental favorable pour l’étude de l’acuité visuelle10, visuomotor transformation11,12,13, perception visuelle et la reconnaissance des objets14,15,16,17,18et19de la prise de décision. Comment proies est reconnu par les prédateurs et comment la détection des proies mène à proie capture le comportement a été une question centrale dans la neuroéthologie20. Dans cet article, nous nous concentrons sur le rôle du circuit pretecto-hypothalamique formé par les saillies d’un noyau dans le prétectum (noyau pretectalis superficialis pars magnocellularis, ci-après, simplement remarqué que le prétectum) à la ILH. Ablation au laser de la prétectum a été montré pour réduire l’activité de capture des proies et d’abolir l’activité neuronale dans la ILH associé à la proie visual perception21. Ici, des protocoles pour l’exécution de laser ablation et tester son effet à l’aide de Ca2 + imagerie et enregistrement comportemental chez le poisson zèbre, les larves sont décrites.
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Protocol
1. l’ablation d’une sous-population de neurones à l’aide d’un Microscope biphotonique Laser
Remarque : Si utilisateurs comptez sur l’exécution d’ablation suivante d’imagerie Ca, utilisez la ligne de UAShspzGCaMP6s21. Si les utilisateurs plan sur l’exécution d’enregistrement comportemental après ablation, utilisez la ligne de UAS:EGFP, comme l’ablation des cellules positives EGFP est plus facile à réaliser que des cellules exprimant le GCaMP6s.
- Commencer par la mise en place de l’accouplement d’une ligne de Gal4 que les labels des neurones spécifiques à étudier et UAS:EGFP ou UAShspzGCaMP6s. N’oubliez pas d’utiliser le fond de nacre pour les deux parents afin que nacre homozygotes peuvent être obtenues.
Remarque : Homozygotes de nacre ne contenant aucun mélanophores sur la surface du corps (Figure 1B). Dans le présent étudier, une gSAIzGFFM119B de ligne de Gal4 (qui étiquète le prétectum) et un autre Gal4 line hspGFFDMC76A (qui marque la ILH) sont utilisés21. - Le lendemain de l’installation de l’accouplement, recueillir les oeufs de poisson-zèbre et élever au stade larvaire à quel point les neurones d’intérêt exprimera reporters fluorescents.
- Montez la larve de poisson-zèbre à point de fusion bas-agarose à 2 % (Figure 1B).
- Commencez par la préparation de solution-mère 2 % d’agarose : dissoudre 2 g de poudre faible point de fusion d’agarose dans 100 mL d’eau système (c.-à-d., l’eau utilisée pour maintenir le poisson-zèbre adulte dans un circuit d’eau) de22 ou E3 l’eau23, en apportant de l’eau au point d’ébullition dans un four à micro-ondes et mélanger vigoureusement.
- Le stock de bas point de fusion d’agarose 2 % au micro-ondes jusqu'à ébullition. Verser 3,5 à 4,0 mL de l’agarose sur le couvercle d’une boîte de Pétri 6 cm. Attendez que l’agarose refroidit afin qu’il soit chaud au toucher avant de continuer.
- Ensuite, placez une seule larve (non anesthésiée à cette étape) dans le gel d’agarose. Garder la position et l’orientation de la larve de réglage pour qu’il soit debout, à l’aide d’une aiguille dissection (Figure 1C), jusqu'à ce que l’agarose se solidifie pour assurer le bon positionnement de la larve.
Remarque : La larve va continuer à nager autour tandis que l’agarose se solidifie. - Une fois que la larve est positionnée, laisser 5 min pour l’agarose à solidifier complètement.
- Versez 5 mL de solution de tricaïne (0,4 % à 1 x concentration de travail) sur l’agarose.
Remarque : Pour éviter les mouvements des larves au cours de l’ablation laser, les larves doivent rester anesthésiés tout au long de la procédure d’ablation.
- L’ablation de la larve à l’aide de la fonction de blanchiment dans un système de microscopie biphotonique laser.
- Placez la larve d’agarose-encastré sous un microscope à balayage laser deux photons et démarrer le système de microscopie.
- Lancez le logiciel d’acquisition d’image et cliquez sur le bouton « On » sur l’onglet « Laser » pour allumer l’appareil (Figure 1D). Attendez que le « statut » du laser pour changer de « Occupé » à « Mode bloqué. »
- Sous l’onglet « Canaux », régler longueur d’onde du laser à 880 nm (puissance maximale : environ 2 300 mW) pour ablation EGFP ou à 800 nm (puissance maximale : environ 2 600 mW) pour ablation de GCaMP.
- Sélectionner l’objectif X 20 en déplaçant manuellement le revolver de lentille. Cliquez sur l’onglet « Rechercher », cliquez sur « GFP » de changer les voies optiques et de regarder directement la fluorescence par oeil.
- Localiser le cerveau de larves de poisson zèbre au centre de la vue ; puis cliquez sur l’onglet « Acquisition » pour revenir à la microscopie biphotonique.
- En tant qu’enregistrement de l’état « avant ablation », prendre une image de z-pile avec l’objectif de 20 X à vitesse de balayage rapide (pour éviter les dommages thermiques). Par la suite comparer les images prises avant et après les expériences d’ablation (Figure 2A). Pour obtenir un tapis z, cliquez sur « Z-Stack » pour sélectionner l’option z-pile et développez l’onglet définir la limite inférieure (cliquer sur la « valeur d’abord » bouton ») après la mise au point à l’extrémité ventrale du cerveau larvaire et réglez la limite supérieure (cliquez sur le bouton « Définir en dernier ») après en se concentrant sur la la plupart-surface dorsale du cerveau. Puis, cliquez sur le bouton « Commencer l’expérience » pour lancer l’acquisition d’images de z-pile.
- Sélectionner l’objectif X 63 en déplaçant manuellement le revolver de la lentille.
- Cliquez sur l’onglet « Rechercher » pour passer à la microscopie fluorescente epi, localiser les cellules pour être pratiqué l’ablation au centre de la vue par les yeux, puis cliquez sur l’onglet « Acquisition » pour revenir à la microscopie à balayage au laser.
- Sous l’onglet « Mode d’Acquisition », définir la taille du « cadre » à 256 x 256. Cliquez sur « Live » et observez les neurones d’intérêt.
- À partir de la face dorsale plus, trouver un plan focal dans lequel les cellules pour être pratiqué l’ablation sont en discussion.
- Marquer une petite zone circulaire taille environ un tiers de la cellule de diamètre sur chaque neurone comme une région d’intérêt (ROI) à l’aide de la fonction de « Régions ».
- Régler la vitesse de balayage à 13,93 s/256 x 256 pixels (134.42 µm x 134.42 µm), ce qui correspond à un temps de pause de laser d’environ 200 µs/pixels ou 200 µs/0,5 µm. En outre, la valeur 4 répétitions ("cycle d’itération : 4'). Vous pouvez également optimiser le nombre d’itérations et vitesse de numérisation afin que l’ablation suffisante est atteint.
- Remplir la fonction de « Blanchiment » pour l’ablation, en combinaison avec la série « Time (2 cycles) » pour l’image de l’échantillon (avant et après l’ablation) et des « Régions » (pour définir la ROIs) ou des fonctions équivalentes dans le logiciel utilisé (Figure 1D).
- En comparant la première image (avant l’ablation) et la deuxième image (après ablation) dans les séries chronologiques cycle, veiller à ce qu’après le blanchiment, la fluorescence, la diminution des cellules ciblées à celui observé à la concentration de fond (Figure 2B).
- Si la fluorescence est toujours présent après ablation, augmenter le nombre d’itérations.
- Ensuite, déplacer le plan focal légèrement plus profond (c'est-à-direvers la face ventrale) et choisir le prochain plan focal où apparaissent les cellules non ramollis.
- Remplir la fonction de blanchiment tel que décrit ci-dessus (étape 1.9). Répétez ces étapes jusqu'à ce que toutes les cellules de la structure neuronale d’intérêt ont été pratiqué l’ablation.
- Après avoir parcouru tous les plans focaux couvrant les structures neurales à être pratiqué l’ablation, vérifier les cellules pour fluorescence supprimé. Si certaines cellules se trouvent toujours être fluorescent en raison de l’ablation insuffisante, laser-irradient leur nouveau comme décrit ci-dessus.
- Si la larve doit être récupéré auprès d’agarose après irradiation laser, n’essayez pas de forcer sur l’agarose car cela risquerait d’endommager la larve. Au lieu de cela, faites en petites coupures dans l’agarose autour de la larve perpendiculairement à la surface de son corps. Ensuite, attendez que la larve de nager hors d’agarose sur ses propres lorsque l’anesthésie s’estompe.
- Passez à la prochaine larve pour ablation ou d’effectuer des expériences de contrôle à l’aide d’une autre population de neurones qui sont non impliqués dans le comportement incriminé.
Remarque : Ici, comme un contrôle, les neurones du bulbe olfactif dans UAS:EGFP ; gSAIzGFFM119B larves étaient laser-ablation en utilisant le même protocole décrit ci-dessus (Figure 2A, droite). - Laisser plusieurs heures ou 1 jour de rétablissement avant de procéder à l’imagerie Ca (Section 2) ou comportementaux enregistrement (Section 3). Pendant ce temps de récupération, vérifier la santé larvaire (p. ex., nage spontanée normale, aucune chaleur-dommages apparents autour de la zone type, etc.) et supprimer les larves montrant des signes de mauvaise santé.
2. calcium imagerie pour enregistrer l’activité neuronale induite sur les proies chez les larves de poisson zèbre prétectum-ablation
- Pour préparer une chambre d’enregistrement, mettre un joint de chambre de garantir-seal hybridation sur une lame de verre, avec la face adhésive sur la vitre et enlever le joint supérieur.
Remarque : Cela crée une chambre de petit enregistrement qui est de 9 mm de diamètre et de 0,8 mm d’épaisseur (Figure 3A). - Ensuite, placez une maille en nylon (taille de l’ouverture : 32 µm) sur un tube de 50 mL qui a le fond découpé. Utilisez le bouchon pour attacher la maille sur le tube (Figure 3B).
- Préparer la paramécie (qui est la proie à être utilisé comme le stimulus visuel pour larve).
Remarque : Préparer la culture de la paramécie (mesures 2.3.1 et 2.3.2) au préalable.- Obtenir des paramécies graines culture de sources commerciales ou bio-ressource académique Centres24 à l’avance.
- Culture la paramécie pendant plusieurs jours dans l’eau contenant la paille de riz stérilisés à l’autoclave et une pastille de levure de bière sèche22 (Figure 3C).
- Versez la culture de la paramécie par 2 tamis successivement (une avec une ouverture de 150 µm, suivie d’une autre avec une ouverture de 75 µm) pour enlever les débris de la culture.
- Recueillir des paramécies dans le cheminement de l’étape précédente sur une maille en nylon (ouverture 13 µm).
- Remettre en suspension les paramécies sur les mailles de nylon dans un bécher de verre à l’aide d’une pissette d’eau système (Figure 3D).
- Rincez le maillage (Figure 3B) dans l’eau-système 2 x (Figure 3E).
Remarque : L’objectif de cette étape est de supprimer tous les composés malodorants possible et aromatisants contenues dans le milieu de culture de paramécie , que l’objectif de cette étude est d’observer visuellement piloté par l’activité neuronale. - Placez une larve de poisson-zèbre dans la solution de tricaïne à anesthésier.
- Monter une seule larve dans 2 % faible point de fusion d’agarose.
- Tout d’abord, micro-ondes 2 % faible point de fusion d’agarose et ajouter 1/10 volume de 10 x tricaïne concentré à l’agarose.
- Placez une goutte de l’agarose de tricaïne contenant sur la chambre d’enregistrement (Figure 3A).
- Après avoir confirmé l’agarose n’est pas trop chaude, placez la larve anesthésiée (de l’étape 2.5) dans l’agarose, enlever immédiatement tout excès agarose afin que la surface de l’agarose ressemble légèrement convexe.
- Orienter rapidement la larve en position verticale avec une aiguille dissection (Figure 1C).
Remarque : Ces procédures doivent être effectuées dans plusieurs secondes avant que l’agarose se solidifie. - Une fois que la larve est correctement positionnée, laisser 5 min pour l’agarose à solidifier complètement. Puis, versez une goutte de solution de x tricaine 1 sur l’agarose.
- Retirez l’agarose autour de la tête de la larve de poisson-zèbre et faire place à la paramécie à nager à l’aide d’un bistouri. Pour ce faire, d’abord, faire quelques petites coupures dans l’agarose (Figure 3-F). Ensuite, retirez soigneusement l’agarose excès en versant doucement de l’eau système sur la chambre.
Remarque : À cette étape, le tricaïne va être rincé. - Ensuite, mettre une paramécie dans la chambre d’enregistrement pour servir un stimulus visuel.
Remarque : Lorsque la paramécie nage près de la tête de la larve de poisson-zèbre, il évoquera une réponse neuronale (Figure 3G). - Place la chambre d’enregistrement sous le microscope épifluorescente équipé d’une caméra CMOS de scientifiques (Figure 3H), puis sélectionnez un objectif X 2,5 (Figure 3j’ai).
- Recueillir des enregistrements Time-lapse des fluorescence des signaux GCaMP.
- Démarrez l’application d’acquisition d’image pour la caméra équipée.
- Cliquez sur « Séquence Pane » et sélectionnez « Disque dur Record » sur le volet. Dans la section paramètres de numérisation, définir le « nombre d’images » à 900 ou tout autre numéro d’image total désiré.
Remarque : Si possible, utilisez un logiciel d’enregistrement Time-lapse avec un module (ici, « disque dur Record ») qui permet une économie efficace des données sur un disque dur. - Dans le volet de « Capture », définir la durée d’exposition à 30-ms (c.-à-d., 33,3 fps) et Binning 2 x 2.
- Le microscope contrôle tactile, choisissez un filtre défini pour GFP, comme le GCaMP a les spectres d’excitation/émission similaire à GFP.
- Cliquez sur « Live » dans le volet de Capture pour localiser la larve dans la vue de la caméra et de se concentrer (Figure 4A), puis cliquez sur « Arrêter Live » et cliquez sur le bouton « Start ». Enregistrez le film en .cxd ou tout autre format qui contient des informations sur la condition de l’acquisition.
- Après les enregistrements, analyser les GCaMP6s fluorescent des signaux (Ca) en obtenant les valeurs moyennes de pixel pour le retour sur investissement sur une structure du cerveau dans le Time-lapse film en utilisant le logiciel gratuit Fidji25.
Remarque : Fidji est une version de ImageJ avec beaucoup utile du plug-in de préinstallé et peut lire des fichiers image au format .cxd avec les Bio-Formats plug-in. - Si la larve se déplacer légèrement lors de l’enregistrement, effectuez d’image en exécutant le plug-in TurboReg26 à Fidji. Dans le menu, sélectionnez « Plugins », « Enregistrement » et « TurboReg ».
- Étudier les moyens d’analyser les données selon l’objectif de l’étude. Ce qui suit est un exemple.
- Calculer la F/F0 (intensité de fluorescence à chaque fois, divisée par l’intensité de la fluorescence au repos ou avant toute transitoire Ca a eu lieu) comme suit :
- Définissez des ROIs sur le prétectum ou la ILH en utilisant le gestionnaire de ROI : dans le menu, sélectionnez « Analyser, » « Outils », « Gestionnaire de ROI » et « Ajouter » à la liste de la ROIs (Figure 4A).
- Calculer les valeurs moyennes de pixel pour la ROIs (i.e., les intensités de fluorescence de GCaMP6s) en sélectionnant dans le volet gestionnaire de ROI : « More » « Multi-mesures » et « OK ». Enregistrer les résultats dans un fichier de feuille de calcul.
- Comme les signaux sont bruyants, en moyenne les signaux pour 11-points dans le temps (moyenne mobile) à l’aide d’une application qui pourrait traiter les données de feuille de calcul.
- Diviser F (intensités de fluorescence au fil du temps) par F0 (intensité de la fluorescence au niveau basal) pour calculer l’intensité de la fluorescence normalisée. Comme un exemple de visualisation de données, modifie en intensité de la fluorescence GCaMP6s normalisée dans le prétectum et la ILH sont à codes de couleur et mappé sur les trajectoires de la paramécie (Figure 4B - D).
3. Evaluation des conséquences comportementales suite à Ablation Laser
- Mettre en place un système d’enregistrement comportementale qui se compose d’un stéréoscope équipé d’une caméra vidéo. Utiliser un appareil photo avec un image appropriée logiciel d’acquisition, commerce ou faits sur mesure (Figure 5A).
- Optimiser les conditions d’éclairage de sorte que la paramécie peut être détectées par traitement d’images. Par exemple, utiliser une anneau blanc LED lumière avec une entretoise (Figure 5B).
Remarque : La distance et l’angle, la LED affecte l’apparence de l’échantillon (c.-à-d., lumineux en fond noir ou foncé en fond clair) et sont donc critiques de traitement d’image réussie. Déterminer la meilleure hauteur de l’entretoise (Figure 5C). - Placez une larve de poisson-zèbre (extraite de l’expérience d’ablation laser décrite à la Section 1) dans une chambre d’enregistrement comportementale (qui était attachée à une lame de verre) avec le joint supérieur original retiré (Figure 5D).
- Collecter 50 paramécie , de la culture (étape 2.3.5) à l’aide d’une micropipette et placez-les dans la chambre d’enregistrement.
- Placez une lamelle couvre-objet sur le dessus de la chambre d’enregistrement. Mettre une petite goutte d’eau sur la lamelle couvre-objet avant de le placer sur la surface de l’eau de la chambre d’enregistrement pour éviter l’introduction d’air dans la chambre.
Remarque : Dans cette étape, un peu d’eau avec paramécies débordera de la chambre d’enregistrement. Le nombre restant de paramécies dans la chambre d’enregistrement sera d’environ 30-40. - Placez la chambre d’enregistrement (contenant une larve et la paramécie) dans le système d’éclairage (Figure 5D).
- Démarrer l’enregistrement Time-lapse à 10fps pendant 11 min (6 600 cadres).
- (Facultatif) Pour chaque larve qui a été testé pour le comportement, observer la fluorescence des domaines ablation laser par microscopie fluorescente pour confirmer l’efficacité de l’ablation laser (c.-à-d., absence ou sensiblement réduits nombre de cellules fluorescentes dans la zone irradiée laser).
Remarque : Même après l’irradiation, certaines cellules fluorescentes peuvent encore être observés en raison de l’apparition ultérieure de Gal4 l’expression des gènes dans les cellules différenciées après ablation27. - Après l’enregistrement d’un comportement de la larve, pour compenser le manque d’uniformité dans le fond, effectuez une division de pixel par pixel de chaque image en une image moyenne dans les îles Fidji : cliquez sur « Process », « Image Calculator », ' opération : diviser ', 32 bits (float) résultat ', et ' OK'. Pour rendre une image moyenne, cliquez sur « Image », « Empile », « Z-Project », « Intensité moyenne » et « OK » (Figure 5E, F).
- Compter le nombre des paramécies reste dans la chambre en cliquant sur « Analyser », « Analyser les particules », définissant une gamme de zone qui couvre tous les paramécies, cochant la case « Show : masques », puis en cliquant sur « OK ». L’option « Show : masques » fournira une image extraite paramécies (Figure 5G), avec une liste du nombre de particules (paramécie) dans chaque image.
- Tracer le nombre de paramécies laissés dans la chambre d’enregistrement au fil du temps. Parce que les estimations du nombre des paramécies sont bruyantes, nous vous recommandons d’effectuer une moyenne mobile sur chaque point dans une gamme de 600 cadres (1 min) sur la feuille de calcul.
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Representative Results
Neurones spécifiques ont été génétiquement marquées avec EGFP ou GCaMP6s, dont l’expression furent chassés dans les lignées Gal4. Un gSAIzGFFM119B de ligne de Gal4 a été utilisé pour étiqueter un noyau dans la zone pretectal (magnocellulaire superficiel pretectal noyau) et une sous-population de neurones du bulbe olfactif. Une autre ligne de Gal4, hspGFFDMC76A, a été utilisée pour marquer la ILH. Nous laser-ablation des neurones pretectal sur le plan bilatéral (panneau de gauche dela Figure 2A ) et aussi pratiqué l’ablation bilatérale neurones dans le bulbe olfactif comme contrôle (panneau de droite dela Figure 2A ) dans des larves de poisson zèbre d’une gSAIzGFFM119B de ligne de Gal4 qui ont été accouplés avec des poissons de journaliste UAS:EGFP. Les résultats montrent que deux photons laser peut l’ablation des cellules ciblées tout en laissant les cellules adjacentes ou neurites pas affectée (Figure 2B).
Les neurones pretectal projet leurs axones vers le ILH homolatéralement. Ici, nous avons étudié leur connectivité fonctionnelle imagerie Ca. L’activité neuronale dans cette région peut être observée sous forme de signaux Ca avec une sonde Ca GCaMP6s (Figure 4A), dont l’expression était pilotée par un gSAIzGFFM119B de ligne de Gal4 (Figure 4B) ou un autre Gal4 ligne hspGFFDMC76A (Figure 4 C). les flèches colorées (Figure 4) montrent natation directions et trajectoires de la paramécie, ainsi que Ca couleur signal-changements dans la région de cerveau spécifié, qui ont été évoqués par la vue de la piscine paramécie (Figure 4B-D). Le prétectum (Figure 4B) et l’activité neuronale ILH (Figure 4-C) a montré en présence proximale des proies, ce qui suggère que ces deux activités neuronales sont déterminées visuellement.
En utilisant les larves de Gal4 GCaMP6s doubles (gSAIzGFFM119B ; hspGFFDMC76A ; UAShspzGCaMP6s), nous avons pratiqué l’ablation la pretectal neurones unilatéralement et en outre effectués Ca imaging pour observer l’activité neuronale dans le prétectum et la ILH chez les larves roussis. Le prétectum gauche qui a été l’ablation au laser a montré résiduel pour aucune activité neuronale (Figure 4D, en haut à gauche), suggérant que laser-l’ablation a été un succès. La ILH ipsilatéral indiquent cependant considérablement réduit l’activité neuronale (Figure 4D angle inférieur gauche), ce qui suggère que la contribution majeure à la ILH provient le prétectum ipsilatéral. En revanche, la ILH sur l’autre côté de la prétectum ablation laser (Figure 4D en bas à droite) a démontré l’activité neuronale comparable à l’activité neuronale dans le prétectum ipsilatéral (Figure 4D, coin supérieur droit), qui suggère que la droite ILH reçoit entrées de la droite prétectum.
Le choix de quel test comportemental d’utiliser dans une expérience dépend le rôle possible des neurones incriminés. Ici, nous montrons un exemple d’un test de capture des proies après ablation d’un noyau de pretectal qui a été identifiée comme une proie détecteur21. En utilisant le système d’éclairage illustré à la Figure 5A-D, le nombre de paramécie dans la chambre d’enregistrement peut compter par (Figure 5E-G) de traitement d’image. Automatique d’extraction des yeux, et le calcul des positions des yeux (p. ex., changements dans les angles des yeux) peut également être possible parce que les yeux de la larve de poisson-zèbre apparaissent plus sombres que le fond dans cette condition d’éclairage (Figure 5H ).
L’expérience révèle que bilatéral-ablation de l’activité de capture des proies aboli pretectum (Fig. 5I, PT) tandis que l’ablation d’une sous-population de neurones dans le bulbe olfactif n’a pas (Figure 5I, OB). Ces résultats, ainsi qu’illustrés à la Figure 4, des expériences suggèrent que le circuit de pretecto-hypothalamique est essentiel dans le comportement de la capture des proies.
Figure 1 . Les larves de poisson zèbre. (A) cinq - vieux jours (5 jours après la fécondation (5-dpf)) poisson zèbre larve et sa proie, la paramécie. (B) 4-dpf nacre larve incorporé dans 2 % faible point de fusion d’agarose. Notez que la souche de nacre manque de pigments noirs sur le corps tandis que l’épithélium pigmentaire rétinien est intact. Barre d’échelle : 0,5 mm. (C) l’aiguille disséquant utilisé pour orienter les larves de poisson zèbre dans l’agarose. Echelle : 1 cm. (D) capture d’écran du logiciel utilisé dans la microscopie biphotonique, montrant les panneaux « Blanchiment », « Time Series » et « Régions » qui ont été utilisés dans l’ablation. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 . Ablation d’une sous-population de neurones à l’aide d’un microscope biphotonique laser. ()A) images fluorescentes EGFP des larves de poisson zèbre 4-dpf avant et après l’ablation des neurones. Vue de dessus et vue de côté d’images 3D reconstituées z-pile à l’aide de logiciels de traitement d’image. Les z-empiler les images ont été prises avec un objectif de 20 X. Les zones ramollis (prétectum ou bulbe olfactif) sont entourées en jaune. Echelle : 100 µm. ()B) exemple d’ablation laser dans un seul plan focal à l’aide de la fonction de « Blanchiment ». Les zones irradiées laser (défini comme ROIs) apparaissent en couleurs sur chaque cellule. Barre d’échelle : 10 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 . Préparation des larves de poisson zèbre et des paramécies pour l’imagerie de Ca. Chambre d’enregistrement (A). Un commercialement disponible de 9 mm de diamètre x joint d’hybridation de 0,8 mm de profondeur avec 8 chambres a été utilisé comme la chambre d’enregistrement. Le joint a été mis sur une lame de verre et respecté. Le joint sur le dessus de la garniture a été épluché au loin. ()B) les mailles de nylon (32 µm) pour rincer la paramécie. La maille a été placée sur un tube de 50 mL. (C) Paramecium paille de riz contenant de la culture et levure granulés à sec. (D) de Paramecium solution mère préparée de la culture sur la solution mère de C. (E) Paramecium a été rincés à l’eau système deux fois pour supprimer les signaux olfactifs et gustatifs possibles dans le milieu. (F) Paramecium incorporé dans la chambre d’enregistrement. Pour supprimer une partie d’agarose, plusieurs coupures ont été faites. (G) enregistrement de chambre avec une larve de poisson-zèbre et une paramécie. La majorité de l’agarose a été enlevée pour permettre la paramécie à nager. La tête de la larve de poisson-zèbre est exposée. (H) microscope droit fluorescent utilisé en imagerie de Ca. Le microscope est équipé d’une caméra CMOS scientifique. (j’ai) poisson zèbre larve dans la chambre d’enregistrement à la loupe avec l’excitation lumineuse sur. Avec un objectif X 2,5, la zone éclairée est légèrement supérieure à la taille de la chambre. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 . Ca représentant données d’imagerie. (A) Position de la prétectum et du lobe inférieur de l’hypothalamus (ILH), cerclé en jaune, dans un double hspGFFDMC76A de Gal4 ; gSAIzGFFM119B ; Larve de poisson-zèbre de UAShspzGCaMP6s. (B) des changements dans le pretectum Ca signal (en moyenne sur le plan bilatéral), mappé en couleur sur les trajectoires de la paramécie dans un gSAIzGFFM119B ; Larve de la UAShspzGCaMP6s. Echelle : 1 mm. (C) les changements dans le signal de ILH Ca (en moyenne sur le plan bilatéral), mappé en couleur sur les trajectoires de la paramécie dans un hspGFFDMC76A ; Larve de la UAShspzGCaMP6s. Echelle : 1 mm. (D) les changements dans le prétectum et les signaux de ILH Ca couleur mappé sur les trajectoires de la paramécie dans un hspGFFDMC76A ; gSAIzGFFM119B ; Larve de UAShspzGCaMP6s qui a été soumis à deux photons-ablation au laser de la gauche prétectum. Echelle : 1 mm. Cette image a été reproduite des mêmes données publiées précédemment21. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 . La proie de capture des données test et représentant chez les larves de poisson zèbre ablation laser. Système d’enregistrement comportemental (A). Le stéréomicroscope était équipé d’une caméra CMOS. Les images ont été acquises à l’aide d’un script sur mesure. (B) des composants du système d’éclairage. Un papier de couleur gris, un diffuseur en verre, anneau de LED blanc lumineux, diffuseur, une entretoise sur mesure (carton) et diffuseur avec un trou au centre. (C) le système d’éclairage assemblés à partir des pièces indiquées sur la chambre d’enregistrement B. (D) pour le dosage de capture des proies. Une chambre (diamètre : 20 mm ; profondeur : 2,5 mm) a été placé sur une lame de verre. Le sceau original et haut de la chambre a été épluché au loin. Un couvercle en verre-a été mis sur la chambre d’enregistrement. (E) image Raw d’une image du film enregistré. (F), une trame découpée (pixel par pixel) par une moyenne d’image dans un film. Notez que l’arrière-plan non uniforme dans l’éclairage peut être compensé par ce traitement de l’image. (G) paramécies extraite d’une image en utilisant la fonction « Particle Analysis » dans les îles Fidji. (H) exemple d’image à Fidji avec un seuil appliqué. Paramécie apparaissent lumineuses, alors que les yeux de la larve de poisson-zèbre apparaissent sombres, et le fond est gris. Changements de positions de l’oeil (c.-à-d., des angles par rapport à l’axe du corps) peuvent être calculés, si nécessaire. j’aides données expérimentales représentatifs de la consommation de la paramécie dans une larve de contrôle olfactif-ampoule-ablation (OB) et une larve prétectum-ablation (PT). Ablation pretectum réduit considérablement les capacités de chasse des proies tandis que l’ablation du bulbe olfactif n’a rien. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Bien que le deux photons laser a une excellente résolution spatiale pour spécifiquement l’ablation des neurones individuels, grande prudence convient pour éviter tout dommage non désiré sur le tissu cérébral en raison de la chaleur. L’étape la plus importante dans l’expérience d’ablation est de déterminer la quantité optimale d’irradiation laser. Irradiation insuffisante ne parvient pas à tuer les neurones. Trop d’irradiation sera endommagé par la chaleur le tissu environnant, ce qui donnera lieu à des effets indésirables. La gamme optimale d’irradiation laser (zones la ROIs, le nombre d’itérations et la vitesse de balayage) semble être étroit. Quelques facteurs affectent l’efficacité de l’ablation.
Tout d’abord, à l’aide de protéines différentes journaliste fluorescent, les conditions d’ablation doivent être optimisées pour chaque journaliste. Expression GCaMP est observée dans le cytoplasme dépourvues de noyaux. En revanche, la fluorescence EGFP apparaît tout au long de l’intérieur de la cellule, qui peut-être être avantageuse pour ablation efficace et spécifique des cellules ciblées, par rapport à GCaMP. L’utilisation de GCaMP est également désavantageuse, comme une cellule exprimant le GCaMP-ablation laser peut exposer l’intensité de la fluorescence accrue en raison de l’arrivée Ca massive immédiate, contrairement à l’intensité de la fluorescence une diminution lorsque EGFP a été utilisée pour l’ablation. Ainsi, le changement de fluorescence ne peut pas être un indicateur fiable de l’étendue de l’ablation avec GCaMP. Dans ce cas, il peut être nécessaire valider l’ablation en observant la perte de cellules fluorescentes après une période spécifique. Absence ou réduction significative des signaux dans la zone d’ablation Ca peut être un autre critère pour ablation réussie avec GCaMP.
En second lieu, le montant (c'est-à-direla vitesse de balayage, numéro de l’itération des scans) d’irradiation laser nécessaire pour l’ablation réussie peut varier selon la profondeur de l’emplacement des neurones de la surface du cerveau. Par rapport aux cellules situées près de la surface, ceux situés profondément à l’intérieur du cerveau exigent plus irradiation laser, ainsi, rend plus difficile leur ablation. Optimisation pour la quantité de rayonnement laser devrait être déterminée spécifiquement pour chaque sous-population ciblée des neurones.
En troisième lieu, il a été observé empiriquement que définissant un certain nombre de ROIs dans une petite zone en une seule analyse souvent endommagés par la chaleur le tissu autour des cellules ainsi (jugé par l’apparition de bulles dans la zone irradiée laser), tandis que ciblant une cellule seule, ou faiblement ROIs distribuées à un balayage dans les mêmes conditions n’avaient pas d’effets nocifs. Dans la présente étude, de blanchiment a été appliquée que sur une petite région (environ un tiers de la taille du corps cellulaire) pour éviter d’endommager les tissus à l’extérieur des cellules ciblées. En général, 5 à 10 cellules ont été ciblés sur chaque plan focal (4-8 avions pour couvrir toute la zone pretectal).
En plus de l’optimisation de la quantité d’irradiation laser, une validation de l’ablation laser en effectuant des expériences de contrôle est critique. Une des expériences de contrôle peut inclure l’ablation au laser d’un autre sous-population de cellules qui sont peu susceptibles d’être impliqués dans le comportement à l’étude. Bulbe olfactif neurones marqués dans la même ligne de Gal4 servi de témoin dans la présente étude (Figure 2A, droite et Figure 5j’ai). Toutefois, pour le motif indiqué ci-dessus, aucun groupe de neurones ne peut servir comme un contrôle idéal. Chacune des sous-populations de neurones se distingue des autres en ce qui concerne leur position dans le cerveau, densité cellulaire, niveau d’expression de journaliste fluorescent transgénique, le taux de prolifération et le moment de l’expression du transgène Rapporteur. Ces différences rendent impossible d’utiliser le même réglage exact pour l’ablation (la fonction de « Blanchiment ») dans des expériences de contrôle. Ainsi, différents types d’expériences de contrôle devraient également considérer, telles que les mesures de la réponse optocinétique, comportement visuel28et activité basale en locomotion21 pour assurer l’effet spécifique de l’ablation.
Dans notre expérience, ablation des dizaines des cellules pretectal a sur le plan bilatéral, prend environ 1 h (depuis l’incorporation dans l’agarose, ablation à l’aide d’un microscope biphotonique, à la récupération dans l’agarose après ablation). Jusqu'à 8 larves par jour (p. ex., 4 larves expérimentales et 4 pour le contrôle) peut être pratiqué l’ablation ; par conséquent, deux séries d’expériences peut-être devoir faire en sorte qu’il y a suffisamment de larves pour un groupe expérimental (par exemple, n = 12) et pour un groupe de contrôle (par exemple, n = 12). En outre, il est souhaitable de permettre la moitié d’une journée ou une journée pour les larves de récupérer d’ablation (p. ex., ablation laser à 4-dpf suivie d’un enregistrement comportemental au 5-dpf, ou ablation du matin suivie d’imagerie de Ca dans l’après-midi). Pendant ce temps de récupération, toutes les larves malades devraient être exclues de l’étude.
Le protocole utilisé pour analyser les données obtenues dépend complètement de l’objectif de l’étude. La présente étude axée sur les relations entre l’emplacement de la paramécie dans le champ visuel et l’activité neuronale dans le prétectum et la ILH. Compte tenu de la décroissance lente (~ secondes) de le GCaMP6s signaux29, seulement le calendrier de l’augmentation, mais pas la diminution, de le GCaMP6s des signaux est corrélée avec l’emplacement de la paramécie. Les signaux de Ca peuvent être élevés, même lorsque la paramécie s’éloigner. Par conséquent, nous avons inclus seulement intensité de fluorescence accrue de GCaMP6s dans la présentation des données. Ce type d’analyse nécessite souvent des scripts écrits avec certains langages de programmation ou de langages de macro. Les scripts utilisés dans ce document sont disponibles sur demande.
L’état sobre (c.-à-d., enrobées d’agarose) peut être stressant pour les larves de poisson zèbre dans une certaine mesure ; Cependant, nous ne pas observé l’activité neuronale induite par le stress apparente ou comportement dans cette condition, en comparaison avec les nageuses condition21,22. Les larves de poisson zèbre d’agarose-embedded peuvent survivre au moins 24h, (probablement plus) sans aucun problème apparent. Paramécie-Ca conduit les signaux dans le prétectum et la ILH dans l’état de contrainte était similaire à celle observée chez des larves nageuses21. Poisson zèbre comportement visuel peut être contrôlé par le rythme circadien. Par conséquent, nous avons mené des expériences comportementales du début à la fin de soirée. Type sauvage et des larves de contrôle consomment un nombre significatif de paramécies pendant cette période d’enregistrement.
Les épreuves fonctionnelles et comportementales décrites ici utilisent l’équipement plus couramment disponible qui peut être trouvés dans de nombreux laboratoires ou pourrait être facilement mis en place, et donc il devrait avoir des applications larges dans différents domaines de la science comportementale.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts au rapport.
Acknowledgments
Ces études ont été financées par des subventions provenance du MEXT, JSPS KAKENHI Grant numéros JP25290009, JP25650120, JP17K07494 et JP17H05984.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NuSieve GTG Agarose | Lonza | Cat.#50080 | low-melting temperature agarose |
| 6 cm petri dish | FALCON | Product#:351007 | |
| dissecting needle | AS ONE Corporation | Cat. No. 2-013-01 | https://keystone-lab.com/en/item/detail/404142 |
| LSM7MP | Carl Zeiss | two-photon laser scanning microscope | |
| W Plan-Apochromat 63x/1.0 | Carl Zeiss | 63X objective lens | |
| Imager.Z1 | Carl Zeiss | an epi-fluorescence microscope | |
| ZEN | Carl Zeiss | Image acquisition software for confocal microscopes | |
| Secure-Seal Hybridization Chamber Gasket, 8 chambers, 9 mm diameter x 0.8 mm depth | Molecular Probes | Catalogue # S-24732 | Used as a recording chamber in Ca imaging |
| Imageing Chambers | Grace Bio-Labs | CoverWell Imaging Chambers PCI-A-2.5 | Used as a behavioral recording chamber |
| surgical knife | MANI | Ophthalmic knife MST15 | |
| ORCA-Flash4.0 | Hamamatsu Photonics | model:C11440-22CU | a scientific CMOS camera |
| HCImage | Hamamatsu Photonics | image acuisition software | |
| Hard Disk Recording module | Hamamatsu Photonics | An software module that enables saving the movie files onto a hard disc drive in a short time | |
| SZX7 | Olympus | stereoscope | |
| DF PL 0.5X | Olympus | objective lens for SZX7 | |
| Point Grey Grasshopper3 4.1 MP Mono USB3 Visio | FLIR Systems, Inc. | Product No. GS3-U3-41C6NIR-C | CMOS camera |
| XIMEA xiQ camera | XIMEA | Product No. MQ042RG-CM | CMOS camera |
| a ring LED light | CCS | Model: LDR2-100SW2-LA | White LED |
| Nylon mesh 32µm | Tokyo Screen | N-No.380T | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/ |
| Nylon mesh 13µm | Tokyo Screen | N-No. 508T-K | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/ |
| Metal seive 150 micron aperture | Tokyo Screen | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami | |
| Metal seive 75 micron aperture | Tokyo Screen | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami | |
| EBIOS | Asahi Food & Healthcare, Co. Ltd. | dry beer yeast | |
| LabVIEW | National Instruments | an integrated development environment for programming | |
| Mai-Tai HP | Spectra Physics | two-photon laser |
References
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