Summary
Здесь мы представляем протокол к удалять генетически помечены субпопуляция нейронов лазером двух фотонов от данио рерио личинки.
Abstract
Чтобы определить роль субпопуляции нейронов в поведении, важно проверить последствия блокирования свою деятельность на живых животных. Лазерная абляция нейронов является эффективным методом для этой цели, когда нейроны выборочно помечены флуоресцентных зондов. В настоящем исследовании протоколы для лазерной абляции субпопуляции нейронов под микроскопом двух фотонов и тестирования его функциональные и поведенческие последствия описаны. В этом исследовании поведение захвата добычи в zebrafish личинки используется как модель исследования. Pretecto гипоталамический цепи известно, лежат в основе этой визуально инициативе добычу поведение ловля. Данио рерио метаталамус были удаленной лазера, и активность нейронов в нижней доле гипоталамуса (ILH; целевой pretectal проекции) был рассмотрен. Также был испытан поведение захвата добычу после pretectal абляции.
Introduction
Чтобы понять, как поведение возникает от активности нейронов в головном мозге, необходимо определить нейронных цепей, которые участвуют в генерации этого поведения. В личиночной стадии, данио рерио обеспечивает идеальная модель животных для изучения функции мозга связанные с поведением, потому что их небольшой, прозрачной мозги позволяют исследовать нейронной активности в клеточном резолюции в широкой области мозг при соблюдении поведения1. Визуализация активности нейронов в конкретных нейронах стало возможным благодаря изобретение показателей (GECIs) генетически закодированный кальция (Ca), например GCaMP2. GCaMP трансгенных данио рерио оказались полезными для сопоставления функциональных нейронные цепи с поведением путем проведения Ca изображений в себя животных3.
В то время как Ca изображений можно продемонстрировать корреляции между нейронной активности и поведение, чтобы показать причинности, подавление активности нейронов и тестирования его consequence(s) на поведение являются важными шагами. Существуют различные способы для достижения этой цели: использование генетической мутации, которая изменяет конкретные нейронных цепей4, выражение нейротоксинов в конкретных нейронах5,6, использования optogenetic инструментов, таких как галородопсин7, и Лазерная абляция целевых нейронов8,9. Лазерная абляция особенно подходит для ликвидации деятельность в сравнительно небольшое число конкретных нейронов. Необратимой ликвидации нейронной активности, убивая нейронов облегчает оценки поведенческих последствий.
Один из интересных поведение, которое можно наблюдать в личиночной стадии в данио рерио — добычу захвата (рис. 1A). Это визуально гидом, целенаправленное поведение обеспечивает благоприятный экспериментальная система для изучения остроты10, зрительномоторной преобразование11,12,13, визуальное восприятие и признание объекты14,,1516,17,18и принятия решений19. Как хищные признается хищников и как добычу обнаружения ведет добычу ловить поведение был центральным вопросом в Нейроэтология20. В этой статье, мы сосредоточить внимание на роли pretecto гипоталамический контура, образованного прогнозы ядра в метаталамус (ядро pretectalis superficialis Парс magnocellularis, далее, просто к сведению как метаталамус) в ILH. Лазерная абляция метаталамус было показано сократить добычу захвата активности и упразднить нейронной активности в ILH, который связан с добычей визуального восприятия21. Здесь протоколы для выполнения лазерной абляции и тестирования его эффект с помощью Ca2 + изображений и поведенческих запись в данио рерио, личинки описаны.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. абляции субпопуляции нейронов, с помощью двух Фотон лазерный микроскоп
Примечание: Если пользователи план на выполнении Ca изображений следующих абляции, используйте линии UAShspzGCaMP6s21. Если пользователи план на выполнение поведенческих записи после аблации, используйте линии UAS:EGFP, как абляции EGFP-положительных клеток легче выполнить, чем GCaMP6s-выражая клеток.
- Начните с создания спаривания Gal4 линии, что этикетки конкретных нейронах изучаться и UAS:EGFP или UAShspzGCaMP6s. Не забудьте использовать фон перламутра для обоих родителей, так что могут быть получены перламутра рецессивной.
Примечание: Рецессивной перламутра содержат не меланофоров на поверхности тела (рис. 1Б). В настоящее время исследование, gSAIzGFFM119B линии Gal4, (который этикетки метаталамус) и другой Gal4 линии hspGFFDMC76A (который обозначает ILH) используются21. - На следующий день спаривания установки собирать яйца данио рерио и поднять их на личиночной стадии в какой-то момент нейронов интерес выразят флуоресцентные журналистам.
- Смонтируйте данио рерио личинка в 2% низкая температура плавления агарозы (рис. 1Б).
- Начните с подготовки 2% агарозном Стоковый раствор: Растворите 2 g низкой агарозы плавления порошка в 100 мл воды системы (т.е., вода, используемая для поддержания взрослых рыбок данио циркулирующей воды системы)22 или E3 воды23, путем привлечения воды кипения в микроволновой и смешивая энергично.
- Микроволновая фондовой низких плавления агарозы 2% до тех пор, пока она кипит. Налейте 3,5-4,0 мл агарозы на крышке Петри 6-см. Подождите, пока агарозы охлаждает, так что это теплая на ощупь, прежде чем продолжить.
- Далее Поместите один личинка (не под наркозом на этом шаге) в агарозы. Держите регулировки положения и ориентации личинка, так что это вертикально, с использованием рассечения иглы (рис. 1C), до тех пор, пока агарозы застывает для обеспечения надлежащего позиционирования личинка.
Примечание: Личинка будет по-прежнему плавать вокруг в то время как агарозы затвердевает. - Когда личинки позиционируется, позволяют 5 мин для агарозы полностью затвердеть.
- 5 мл tricaine раствора (0,4% на 1 x рабочей концентрации) Залейте агарозы.
Примечание: Чтобы избежать движений, личинки во время лазерной абляции, личинки должны храниться наркотизированных на протяжении всей процедуры аблации.
- Удалять личинка, используя функцию отбеливания в системе двух Фотон лазерная микроскопия.
- Место агарозы встроенный личинка под двух Фотон лазерный сканирующий микроскоп и начать системы микроскопии.
- Запустите программное обеспечение приобретения изображений и нажмите кнопку «On» на вкладке «Лазер» Включите лазер (рис. 1D). Ждать для «Статус» лазера изменить с «Занят» на «Locked режиме.»
- На вкладке «Каналы», задайте длина волны лазера на 880 Нм (максимальная мощность: около 2300 МВт) абляции EGFP, или на 800 Нм (максимальная мощность: около 2600 МВт) для GCaMP абляции.
- Выберите 20 X объектив, вручную перемещая объектив револьвер. Перейдите на вкладку «Поиск», нажмите «ГФП» чтобы изменить оптического пути и непосредственно просмотреть флуоресцирования на глаз.
- Найдите данио рерио личиночной мозга в центре зрения; затем нажмите на вкладку «Приобретение», чтобы вернуться к двух Фотон микроскопии.
- Как запись состояния «до абляции» принять образ z стек с 20 X объектив на быстро-скорость сканирования (чтобы избежать теплового повреждения). Позже Сравните снимки, сделанные до и после аблации экспериментов (рисA). Для получения z стека, нажмите «Z-стека» выберите параметр z стек и разверните вкладку установить нижний предел (нажмите «задать первый «кнопка») после сосредоточения на вентральной концу личиночной мозга и установить верхний предел (нажмите кнопку «Установить последний») после сосредоточения на Дорсальная большинство поверхности головного мозга. Затем нажмите кнопку «Начать эксперимент» для запуска загрузки изображений z стека.
- Выберите 63 X объектив, вручную перемещая объектив револьвер.
- Нажмите на вкладку «Поиск», чтобы переключиться epi Люминесцентная микроскопия, найдите клетки, чтобы быть удаленной в центре зрения глаз, а затем нажмите вкладку «Приобретение», чтобы вернуться к лазерная сканирующая микроскопия.
- На вкладке «Приобретение режим» установите «Размер кадра» в 256 x 256. Нажмите «Live» и просмотрите нейронов интерес.
- Начиная со стороны спины большинство, найти фокальной плоскости, в котором клетки, чтобы быть удаленной находятся в центре внимания.
- Марк небольшой, круговой области около одной трети размер ячейки в диаметре на каждый нейрон как региона интерес (ROI) с помощью функции «Регионы».
- Установите скорость сканирования 13.93 s/256 x 256 пикселей (134,42 мкм x 134,42 мкм), что соответствует время задержки лазера приблизительно 200 мкс/пиксель или 200 мкс/0,5 мкм. Кроме того, набор 4 повторений (' итерации цикла: 4'). Кроме того Оптимизируйте количество итераций и скорость сканирования, таким образом, чтобы достичь достаточного абляции.
- Выполните функцию «Отбеливание» для уноса, в сочетании с временных рядов (2 цикла) изображения образца (до и после аблации) и «Регионы» (чтобы задать ROIs) или эквивалентные функции в программное обеспечение, используемое (рис. 1D).
- Сравнивая первое изображение (до абляция) и второе изображение (после аблации) в серии время цикла, убедитесь, что после отбеливания, флуоресценции в целевых клеток уменьшается, наблюдается на уровне фона (рис. 2B).
- Если флуоресценции присутствует все еще после аблации, увеличьте количество итераций.
- Далее переместите фокальной плоскости немного глубже (т.е., к вентральной стороне) и выбрать следующий фокальной плоскости, где ООН ablated клетки появляются.
- Выполните функцию отбеливания, как описано выше (шаг 1.9). Повторите эти шаги, пока не удаленной всех ячеек в структуре нейронной интереса.
- После идти через все плоскости фокуса охватывающих нейронных структур, чтобы быть удаленной, проверьте ячейки для отменено флуоресценции. Если некоторые клетки будут найдены все еще быть флуоресцентные из-за недостаточной абляции, лазер облучить их снова как описано выше.
- Если личинка должна быть восстановлены от агарозы после лазерного облучения, не пытайтесь заставить его покинуть агарозы, потому что это может повредить личинка. Вместо этого тщательно сделайте крошечные сокращений в агарозном вокруг личинка перпендикулярно к поверхности ее тела. Затем подождите, личинка плавать из агарозы на своих собственных, когда анестезии прекратит.
- Перейти к следующей личинка для абляции или управления эксперименты с использованием другого населения нейронов, которые являются посторонним в поведении под следствием.
Примечание: Здесь, как элемент управления, обонятельные луковицы нейронов в UAS:EGFP; Личинки gSAIzGFFM119B были, лазер удаленной используя тот же протокол, описанные выше (Рисунок 2A, право). - Разрешайте несколько часов или 1 день для восстановления перед Ca изображений (раздел 2) или поведенческих запись (раздел 3). В это время восстановления проверьте личиночной здравоохранения (то есть, нормальный спонтанное плавание, без очевидной теплового повреждения вокруг удаленной области и т.д.) и удалить личинки, любые признаки плохого состояния здоровья.
2. кальция изображений для записи вызывали добычу нейронной активности в удаленной метаталамус данио рерио личинки
- Подготовить запись камеры, надел на стеклянное скольжение, прокладка камеры безопасного печать гибридизации клейкой стороной на стекле с, и удалить верхней печатью.
Примечание: Это создает небольшой запись камеры, 9 мм в диаметре и 0,8 мм в глубину (рис. 3А). - Далее, поместите нейлоновая сетка (размер открытия: 32 мкм) на 50 мл, имеющий разрезать дно. Используйте крышку прикрепить сетку на трубе (рис. 3B).
- Подготовьте paramecia (который является добычей для использования в качестве визуального стимула для личинок).
Примечание: Парамеции культуры (шаги 2.3.1 и 2.3.2) подготовить заранее.- Получить paramecia семян культуры из коммерческих источников или академических био ресурсных центров24 заранее.
- Культура Парамеции на несколько дней в воде, содержащей газобетона рисовой соломы и Пелле сухие дрожжи пивные22 (рис. 3C).
- Налить Парамеции культуры через 2 сита последовательно (один с отверстием 150 мкм, последовал еще один с отверстием 75 мкм) для удаления мусора из культуры.
- Соберите paramecia потока через из предыдущего шага на нейлоновая сетка (13-мкм диафрагмы).
- Вновь приостановите paramecia на нейлоновая сетка в стеклянный стакан с помощью бутыль воды системы (рис. 3D).
- Промойте сетку (Рисунок 3B) в системе воды 2 x (Eрис. 3).
Примечание: Этот шаг предназначен для удаления любых возможных отдушки и tastants, содержащихся в среде культуры Парамеции , как цель настоящего исследования заключается в наблюдать визуально инициативе активности нейронов. - Место данио рерио личинка в tricaine растворе, чтобы анестезировать.
- Смонтируйте один личинка в 2% низких плавления агарозы.
- Во-первых Микроволновая печь, 2% низких плавления агарозы и добавить 1/10 объема 10 x концентрации tricaine агарозы.
- Поместите одну каплю tricaine содержащих агарозы на запись камеры (рис. 3А).
- После подтверждения агарозы не слишком жарко, уложите агарозы, сразу же удаление любой избыток агарозы, так что выглядит слегка выпуклой поверхности агарозы наркотизированных личинка (с шагом 2.5).
- Быстро сориентироваться личинка в вертикальном положении с иглой рассечения (рис. 1C).
Примечание: Эти процедуры необходимо выполнить в течение нескольких секунд, прежде чем агарозы затвердевает. - После того, как правильно позиционируется личинка, позволяют 5 мин для агарозы полностью затвердеть. Затем влить капля раствора 1 x tricaine на агарозе.
- Удаление агарозы вокруг головы данио рерио личинка и сделать пространство для Парамеции плавать с помощью хирургического ножа. Для этого, во-первых, сделать несколько малых разрезов в агарозном (рис. 3F). Затем осторожно удалите избыток агарозы, слегка поливая системы воды в камере.
Примечание: На этом шаге будет промыть tricaine. - Затем положите один Парамеции в зале записи в качестве визуального стимула.
Примечание: Когда Парамеции плавает рядом с головой личинка данио рерио, он будет отклик нейронов (рис. 3G). - Место записи камеры под epi флуоресцентным микроскопом с научной CMOS камера (рис. 3H) и выберите 2,5 X объектив (рис. 3я).
- Собирайте покадровой записи сигналов флуоресценции GCaMP.
- Запустите приложение приобретения изображений для оборудованные камеры.
- Нажмите кнопку «последовательность» и выберите «Запись диска» на панели. В разделе Параметры сканирования установите «количество кадров» для 900 или любой другой номер всего кадра желаемого.
Примечание: Если возможно, используйте покадровой записи программного обеспечения с модулем (здесь, «жёсткий диск записывать») которые позволяет эффективное сохранение данных на жесткий диск. - В панели «Захват» установите время экспозиции на 30-мс (то есть, 33.3 fps) и биннинга 2 x 2.
- На микроскопе Управление сенсорной панели выберите фильтр для GFP, как GCaMP имеет аналогичные спектры возбуждения/выбросов GFP.
- Нажмите «Live» на панели захвата для поиска личинка в камеры и фокус (рис. 4A) и затем нажмите кнопку «Остановить жить» и нажмите кнопку «Пуск». Сохраните фильм в .cxd или любой другой формат, который содержит сведения о состоянии приобретения.
- После записи анализировать сигналы флуоресцентный GCaMP6s (Ca сигналы) путем получения значения средней пикселей для ROI на структуры мозга в промежуток времени с использованием свободного программного обеспечения Фиджи25кино.
Примечание: Фиджи является версия ImageJ с много полезных plug в в предустановленные и может читать .cxd формате файлов изображений с био-форматов плагина. - Если личинка слегка двигаться во время записи, выполните регистрацию изображения, запустив TurboReg плагин26 в Фиджи. Из меню выберите «Плагины», «Регистрация» и «TurboReg».
- Рассмотрим способы анализа данных согласно цели исследования. Ниже приведен пример.
- Вычислите F/F0 (флуоресценции интенсивности на каждый раз, разделена по интенсивности флуоресценции в состоянии покоя или перед любой Ca переходных произошла) следующим образом:
- Установить ROIs метаталамус или ILH, с помощью диспетчера ROI: в меню, выберите «Анализировать,» «Инструменты», «Менеджер ROI» и «Добавить» в список трансформирования (рис. 4A).
- Вычислить среднее пикселей для трансформирования (т.е., интенсивности флуоресценции GCaMP6s), выбрав на панели менеджера ROI: «Больше,» «Мульти мера» и «ОК». Сохраните результаты в файл электронной таблицы.
- Как сигналы шумной, средняя сигналы для 11-моменты времени (скользящее среднее) с помощью приложения, которое может обрабатывать данные таблицы.
- Разделите F (интенсивностью флюоресценции со временем) F0 (интенсивность флуоресценции на базальный уровень) для вычисления нормализованных флуоресценции интенсивности. Как пример визуализации данных, изменения в нормализованной GCaMP6s интенсивности флуоресценции в метаталамус и ILH цветом и сопоставлены на Парамеции траектории (Рисунок 4B - D).
3. Оценка поведенческих последствий после лазерной абляции
- Настроить систему поведенческих записи, которая состоит из стереоскоп, оборудован с камерой видео. Используйте камеру с помощью соответствующего изображения приобретения программного обеспечения, коммерческого или по индивидуальному заказу (рис. 5A).
- Оптимизируйте условия освещения, чтобы Парамеции могут быть обнаружены путем обработки изображений. Например используйте белый кольцо светодиодные с распоркой (рис. 5B).
Примечание: Расстояние от и угол, светодиод влияет на внешний вид образца (т.е., яркие в темном фоне или темного в светлый фон) и, таким образом, решающее значение для успешной обработки. Определите лучший высоту распорку (рис. 5C). - Место larva данио рерио (оправился от лазерной абляции эксперимент, описанных в разделе 1) в камере поведенческих записи (который был прикреплен к слайду стекла) с оригинальной верхней печатью удалены (рис. 5D).
- Соберите 50 paramecia от культуры (шаг 2.3.5) с использованием микропипеткой и поместите их в записи камеры.
- Поместите крышку выскальзования верхней записи камеры. Положите небольшую каплю воды на крышку выскальзования до размещения на поверхности воды записи камеры во избежание введения воздуха в камере.
Примечание: На этом этапе некоторые воды с paramecia будет переполнения из камеры для записи. Количество оставшихся paramecia в зале запись будет примерно 30-40. - Место записи камеры (содержащие личинки и paramecia) в системе освещения (рис. 5D).
- Начните запись отснятого на 10 fps для 11 мин (6600 кадров).
- (Необязательно) Для каждого личинка, которая была испытана для поведения соблюдайте флуоресценции лазер удаленной районов, флуоресцентной микроскопии для подтверждения эффективности лазерной абляции (например, отсутствие или значительно снизить количество, люминесцентные клеток в лазер облученных область).
Примечание: Даже после облучения некоторые люминесцентные клеток может наблюдаться еще из-за позднее начало Gal4 экспрессии генов в клетках, которые различаются после аблации27. - После записи личинка поведение, чтобы компенсировать отсутствие единообразия в фоновом режиме, выполнить разделение пиксель в пиксель каждого кадра, среднее изображение в Фиджи: нажмите «Процесс», «Изображение калькулятор», ' операция: разделить ', ' 32-бит (float) результат ', и ' OK'. Чтобы сделать среднее изображение, нажмите кнопку «Образ», «Стеки», «Z-проект», «Средняя интенсивность» и «OK» (Рисунок 5E, F).
- Количество количество paramecia оставили в камере, нажав «Анализа», «Анализ частиц», установка диапазона области, которая охватывает все paramecia, установив флажок «Шоу: маски» и нажмите «OK». Параметр «Шоу: маски» обеспечит извлеченного paramecia изображения (рис. 5G), с перечень количество частиц (paramecia) в каждом кадре.
- Участок количество paramecia оставили в камере записи со временем. Потому что оценкам количество paramecia шумные, мы рекомендуем скользящее среднее на каждой точке в диапазоне 600 кадров (1 мин) на листе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Конкретные нейроны генетически были помечены с EGFP или GCaMP6s, выражением которого были изгнаны в Gal4 линиях. GSAIzGFFM119B линии Gal4 был использован для обозначения ядро в районе pretectal (Магноцеллюлярные поверхностный pretectal ядро) и субпопуляции обонятельные луковицы нейронов. Еще одна линия Gal4, hspGFFDMC76A, был использован для обозначения ILH. Мы лазер удаленной pretectal нейронов на двусторонней основе (рис. 2A левой панели) и также удаленной нейронов в обонятельные луковицы на двусторонней основе как элемент управления (рис. 2A правая панель) в zebrafish личинки gSAIzGFFM119B линии Gal4, были вязка с UAS:EGFP репортер рыбы. Результаты показывают, что два фотона лазерного можно удалять целевые клетки оставляя смежных ячеек или невритов неизменным (рис. 2B).
Pretectal нейроны проекта ипсилатерально их аксоны к ILH. Здесь мы исследовали их функциональной подключения с использованием изображений Ca. Активность нейронов в этом регионе можно наблюдать как Ca сигналы с зондом Ca GCaMP6s (рис. 4A), выражением которого был обусловлен gSAIzGFFM119B линии Gal4 (рис. 4B) или другой Gal4 линии hspGFFDMC76A (рис. 4 C). цветные стрелки (рис. 4) показывают направления плавательный и траекторий Парамеции, а также цветную Ca сигнал изменения в области указанного мозга, которые были вызваны взгляд плавательный Парамеции (Рисунок 4B-D). Метаталамус (Рисунок 4B) и ILH (рис. 4C) показал активность нейронов в проксимальном присутствии добычу, предлагая визуально приводом обоих нейронов деятельности.
С помощью двойной личинки Gal4 GCaMP6s (gSAIzGFFM119B; hspGFFDMC76A; UAShspzGCaMP6s), мы удаленной изображений Ca pretectal нейронов в одностороннем порядке и далее соблюдать нейронной активности в метаталамус и ILH в ablated личинки. Левый метаталамус, что лазер удаленной показал остаточных не нейронной активности (рис. 4D, слева сверху), предполагая, что лазерное удаление было успешным. Однако ипсилатеральные ILH показали значительно снижение активности нейронов (рис. 4D внизу слева), предполагая, что важный вклад ILH приходит от ипсилатеральные метаталамус. Напротив, ILH на другой стороне лазер удаленной метаталамус (рис. 4D внизу справа) показан нейронной активности уступает активности нейронов в ипсилатеральные метаталамус (рис. 4D, сверху справа), который предполагает, что право ILH получает входы от правой метаталамус.
Выбор которых поведенческого анализа для использования в эксперименте зависит от возможной роли нейронов под следствием. Здесь мы покажем пример добычу захват пробирного после аблации pretectal ядра, которая была определена в качестве детектора добычу21. С помощью системы освещения, показано на рисунке 5A-D, количество Парамеции в зале звукозаписи может учитываться путем обработки (рис. 5E-G) изображений. Автоматизированное извлечение глаза, и расчет глаз позиции (то есть, изменения в углах глаз) также может быть возможным, потому что глаза данио рерио личинки появляются темнее фона в этом состоянии освещения (рис. 5H ).
Результаты эксперимента показывают, что двусторонние абляция pretectum отменено добычу захвата активности (рис. 5I, PT) а абляции субпопуляции нейронов в обонятельные луковицы не (Рисунок 5я, OB). Эти результаты, а также эксперименты, показанный на рисунке 4, показывают, что pretecto гипоталамический цепи важно поведение добычу захвата.
Рисунок 1 . Данио рерио личинок. (A), пять - старый день (5 дней после оплодотворения (5-dpf)) у рыбок данио личинка и его добычу, Парамеции. (B) 4-dpf перламутра личинки внедряются в 2% низких плавления агарозы. Обратите внимание, что штамм перламутра не хватает черные пигменты на теле, в то время как пигментный эпителий сетчатки интактен. Линейки: 0.5 мм. (C) Dissecting иглой для ориентируясь данио рерио личинок в агарозы. Линейки: 1 см. скриншот (D) программного обеспечения используется в двух Фотон микроскопии, показывая «Отбеливание», «Ряды» и «Регионы» панелей, которые были использованы в абляции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 . Аблация субпопуляции нейронов, с помощью двух Фотон лазерный микроскоп. (A) EGFP флуоресцентного изображения 4-dpf данио рерио личинок до и после аблации нейронов. Вид сверху и сбоку 3D реконструированный z стек изображений с помощью программного обеспечения для обработки изображений. Z стек изображения были взяты с 20 X объектив. Ablated области (метаталамус или обонятельные луковицы) кружил в желтый. Линейки: 100 µm. ()B) пример лазерной абляции в одной фокальной плоскости, используя функцию «Отбеливание». Облученных лазерный областей (как ROIs) показаны цвета на каждой ячейки. Линейки: 10 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 . Подготовка данио рерио личинок и paramecia Ca изображений. (A) запись камеры. Коммерчески доступных 9 мм диаметр x 0,8 мм глубина прокладки гибридизации с 8 камер, была использована как запись камеры. Прокладки на стеклянное скольжение и соблюдаться. Печать верхней прокладки был снимают. ()B) нейлоновая сетка (32 мкм) используется для полоскания paramecia. Mesh был сделан на 50 мл. (C) Парамеции культура содержащий рисовой соломы и сухие дрожжи окатышей. (D) Парамеции Стоковый раствор, приготовленный из культуры, показано в C. (E) Парамеции Стоковый раствор был промыть водой системы дважды, чтобы удалить возможные обонятельные и вкусовые сигналы в среде. (F) Парамеции встроенных в записи камеры. Чтобы удалить часть агарозы, несколько сокращений были сделаны. (G) запись камеры с larva данио рерио и Парамеции. Большинство агарозы был удален, чтобы позволить Парамеции плавать. Глава данио рерио личинка подвергается. (H) вертикально флуоресцентный Микроскоп, используемых в Ca изображений. Микроскоп оснащен научных CMOS камеры. (я) данио рерио личинка в записи камеры под микроскопом с возбуждением, свет. С 2,5 X объектив освещенной области немного больше, чем размер камеры. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 . Представитель Ca визуализации данных. (A) позиция метаталамус и нижней доли гипоталамуса (ILH), обведена желтой, в двойной Gal4 hspGFFDMC76A; gSAIzGFFM119B; UAShspzGCaMP6s личинки у рыбок данио. (Б) изменения в pretectum Ca сигнала (в среднем на двусторонней основе), цвет сопоставленные на траектории Парамеции в gSAIzGFFM119B; Личинка UAShspzGCaMP6s. Линейки: 1 mm. (C) изменения в ILH Ca сигнала (в среднем на двусторонней основе), цвет сопоставленные на траектории Парамеции в hspGFFDMC76A; Личинка UAShspzGCaMP6s. Линейки: 1 mm. (D) изменения в метаталамус и сигналы ILH Ca, цвет сопоставленные на траектории Парамеции в hspGFFDMC76A; gSAIzGFFM119B; Личинка UAShspzGCaMP6s, который был подвергнут два фотона лазерного уноса левой метаталамус. Линейки: 1 мм. Этот образ был воспроизведен из того же данных ранее опубликована21. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 . Добычей захвата пробирного и представитель данных в удаленной лазерной данио рерио личинок. (A) поведенческих запись системы. Стереомикроскопом был оборудован с камерой CMOS. Изображения были приобретены с использованием сценария по индивидуальному заказу. (B) компонентов системы освещения. Серого цвета бумаги, стекла диффузор, белый кольцо LED свет, диффузор, заказные распорку (картон) и диффузор с отверстием в центре. (C) система освещения собран из частей, показано в камере б. (D) записи для assay захвата добычу. Палата (диаметр: 20 мм; Глубина: 2,5 мм) был помещен на стеклянное скольжение. Оригинальной печатью верхней палаты был снимают. Стекло Обложка был поставлен на запись камеры. (E) изображений в формате Raw из кадра записанного фильма. (F) A кадра (пиксель в пиксель) разделены среднее изображение в кино. Обратите внимание, что фон неравномерного освещения могут быть компенсированы этой обработки изображений. (G) Paramecia извлеченные из кадра, используя функцию «Анализ частиц» в Фиджи. (H) пример изображения в Фиджи с прикладной порог. Paramecia появляются яркие, тогда как глаза данио рерио личинки появляются темные, и серый фон. Изменения в глаз позиции (то есть, угол относительно оси тела) может быть рассчитана, в случае необходимости. (я) репрезентативных экспериментальных данных потребления Парамеции в удаленной от обонятельной луковицы управления личинка (OB) и удаленной метаталамус личинка (PT). Pretectum абляции значительно снижается способность охоты добычу а обонятельные луковицы аблации не влияет на его. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Хотя два фотона лазерного имеет отличное пространственное разрешение для специально удалять отдельных нейронов, большой осторожностью следует во избежание нежелательных повреждений на ткани мозга из-за тепла. Наиболее важным шагом в эксперименте уноса необходимо определить оптимальное количество лазерного облучения. Недостаточное облучение не убить нейронов. Слишком много облучения будет тепло повреждения окружающих тканей, который приведет к нежелательным последствиям. Оптимальный спектр лазерного облучения (районы Руа, количество итераций и скорость сканирования), как представляется, быть узким. Несколько факторов влияют на эффективность абляции.
Во-первых с помощью различных флуоресцентные репортер белков, абляция условия должны быть оптимизированы для каждого репортера. Выражение GCaMP наблюдается в цитоплазме лишенные ядер. В отличие от EGFP флуоресценции появляется по всему внутри ячейки, который может быть выгодным для эффективных и конкретных абляции целевых клеток, по сравнению с GCaMP. Использование GCaMP невыгодно также как лазер удаленной GCaMP выражая клетки могут exhibit флуоресценции увеличение интенсивности ввиду непосредственной массовый приток Ca, в отличие от интенсивности снижение флуоресценции когда EGFP использовался для абляции. Таким образом изменения в флуоресцировании не может быть надежным показателем степени абляции с GCaMP. В таких случаях может быть необходимо для проверки абляции, наблюдая за потери люминесцентные клеток после определенного периода времени. Отсутствия или существенного сокращения Ca сигналов в ablated области может быть еще одним критерием для успешной аблации с GCaMP.
Во-вторых (то есть, скорость сканирования, итерации количество сканов) количество лазерного облучения, необходимых для успешной аблации могут варьироваться в зависимости от глубины расположения нейронов от поверхности головного мозга. По сравнению с клетками, расположенных вблизи поверхности, находящиеся глубоко внутри мозг требуют больше лазерного облучения, таким образом, что делает его более трудным для их удалять. Оптимизация на сумму лазерного облучения должны определяться специально для каждой целевой субпопуляция нейронов.
В-третьих, эмпирически было отмечено, что установка ряда ROIs в небольшой области в одно сканирование часто тепло поврежденные ткани вокруг клетки также (судить появление пузырей в районе облученных лазерный), тогда как ориентация одной ячейки самостоятельно, или редко распределенные ROIs в сканирования при том же условии не имеют вредные последствия. В настоящем исследовании отбеливание применяется только на небольшой территории (примерно одна треть размера клетки тела) чтобы избежать повреждения ткани за пределами целевых ячеек. Как правило 5-10 клеток были ориентированы на каждом фокальной плоскости (4-8 самолетов для покрытия всей pretectal области).
В дополнение к оптимизации количество лазерного облучения, обширные проверки лазерной абляции, выполняя экспериментов управления имеет решающее значение. Один элемент управления эксперимент может включать лазерной абляции другой субпопуляции клеток, которые вряд ли будут участвовать в поведение изучается. Обонятельные луковицы нейронов, помечены в одной и той же линии Gal4 служил в качестве управления в настоящем исследовании (рис. 2А, справа и Рисунок 5я). Однако по причине, описанной выше, нет групп нейронов может служить идеальным управления. Каждый субпопуляция нейронов отличается от других в отношении их положения в мозг, плотность ячеек, флуоресцентный репортер трансген выражение уровня, уровень распространения и сроков репортер трансген выражения. Эти различия делают невозможным использовать точное же настройки для абляции (функция «Отбеливание») в экспериментах управления. Таким образом различные виды экспериментов управления также следует, например измерения оптокинетический ответ, визуальное поведение28и базальной активности в двигательный аппарат21 обеспечить конкретный эффект уноса.
По нашему опыту абляция десятки pretectal клеток на двусторонней основе, занимает примерно 1 час (от встраивания в агарозы, абляции с помощью микроскопа двух фотонов, для извлечения из агарозы после аблации). До 8 личинок в день (например, 4 Личинки для экспериментальных и 4 для элемента управления) может быть удаленной; Следовательно, пару множеств экспериментов может потребоваться обеспечить, что есть достаточно личинок для экспериментальной группы (например, n = 12) и для группы управления (например, n = 12). Кроме того желательно, чтобы половину день или один день для личинок, чтобы оправиться от абляции (например, лазерной абляции на 4-dpf следуют поведенческих запись 5-dpf, или абляции утром следуют Ca изображений в послеобеденное время). В это время восстановления любой плохо выглядящие личинки должны быть исключены из исследования.
Протокол, используемый для анализа полученных данных полностью зависит от цели исследования. Настоящее исследование сосредоточено на отношения между расположение Парамеции в поле зрения и активность нейронов в метаталамус и ILH. Учитывая медленный упадок (~ секунд) GCaMP6s сигналы29, только время увеличение, но не сокращение, из GCaMP6s сигналы коррелирует с расположением Парамеции. Ca сигналов может быть высокой, даже когда Парамеции отойти. Таким образом мы только включали рост флуоресценции интенсивности GCaMP6s в представлении данных. Этот тип анализа часто требует заказные сценарии, написанные с определенных языков программирования или макроязыков. Сценарии, используемые в данном документе предоставляются по запросу.
Сдержанные состояние (т.е., встроенный агарозы) может быть напряженный для личинки данио рерио в некоторой степени; Однако мы не наблюдали явное стресс индуцированного нейронной активности или поведение в этом состоянии, когда по сравнению с свободноплавающих условие21,22. Встраиваемый агарозы данио рерио личинки могут выжить по крайней мере 24 ч, (вероятно, больше) без какой-либо очевидной проблемы. Парамеции-ведомый Ca сигналов в метаталамус и ILH в условиях ограниченного были схожи с наблюдаемой в свободноплавающих личинки21. Данио рерио визуальное поведение может управляться суточный ритм. Следовательно мы провели поведенческие экспериментов от раннего до позднего вечера. Дикого типа и управления личинки потребляется значительное количество paramecia в это время записи.
Функциональные и поведенческие тесты, описанные здесь используют чаще всего имеющегося оборудования, которые могут быть найдены во многих лабораториях или может быть легко настроить, и таким образом он должен иметь широкое применение в различных областях поведенческих наук.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы имеют без коллизии интересов в отчет.
Acknowledgments
Эти исследования финансировались грантов, полученных от МПКСНТ, JSP-страницы KAKENHI Грант номера JP25290009, JP25650120, JP17K07494 и JP17H05984.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NuSieve GTG Agarose | Lonza | Cat.#50080 | low-melting temperature agarose |
| 6 cm petri dish | FALCON | Product#:351007 | |
| dissecting needle | AS ONE Corporation | Cat. No. 2-013-01 | https://keystone-lab.com/en/item/detail/404142 |
| LSM7MP | Carl Zeiss | two-photon laser scanning microscope | |
| W Plan-Apochromat 63x/1.0 | Carl Zeiss | 63X objective lens | |
| Imager.Z1 | Carl Zeiss | an epi-fluorescence microscope | |
| ZEN | Carl Zeiss | Image acquisition software for confocal microscopes | |
| Secure-Seal Hybridization Chamber Gasket, 8 chambers, 9 mm diameter x 0.8 mm depth | Molecular Probes | Catalogue # S-24732 | Used as a recording chamber in Ca imaging |
| Imageing Chambers | Grace Bio-Labs | CoverWell Imaging Chambers PCI-A-2.5 | Used as a behavioral recording chamber |
| surgical knife | MANI | Ophthalmic knife MST15 | |
| ORCA-Flash4.0 | Hamamatsu Photonics | model:C11440-22CU | a scientific CMOS camera |
| HCImage | Hamamatsu Photonics | image acuisition software | |
| Hard Disk Recording module | Hamamatsu Photonics | An software module that enables saving the movie files onto a hard disc drive in a short time | |
| SZX7 | Olympus | stereoscope | |
| DF PL 0.5X | Olympus | objective lens for SZX7 | |
| Point Grey Grasshopper3 4.1 MP Mono USB3 Visio | FLIR Systems, Inc. | Product No. GS3-U3-41C6NIR-C | CMOS camera |
| XIMEA xiQ camera | XIMEA | Product No. MQ042RG-CM | CMOS camera |
| a ring LED light | CCS | Model: LDR2-100SW2-LA | White LED |
| Nylon mesh 32µm | Tokyo Screen | N-No.380T | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/ |
| Nylon mesh 13µm | Tokyo Screen | N-No. 508T-K | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/ |
| Metal seive 150 micron aperture | Tokyo Screen | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami | |
| Metal seive 75 micron aperture | Tokyo Screen | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami | |
| EBIOS | Asahi Food & Healthcare, Co. Ltd. | dry beer yeast | |
| LabVIEW | National Instruments | an integrated development environment for programming | |
| Mai-Tai HP | Spectra Physics | two-photon laser |
References
- Feierstein, C. E., Portugues, R., Orger, M. B. Seeing the whole picture: A comprehensive imaging approach to functional mapping of circuits in behaving zebrafish. Neuroscience. 296, 26-38 (2015).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).
- Muto, A., et al. Genetic visualization with an improved GCaMP calcium indicator reveals spatiotemporal activation of the spinal motor neurons in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (13), 5425-5430 (2011).
- Lorent, K., Liu, K. S., Fetcho, J. R., Granato, M. The zebrafish space cadet gene controls axonal pathfinding of neurons that modulate fast turning movements. Development. 128 (11), 2131-2142 (2001).
- Asakawa, K., et al. Genetic dissection of neural circuits by Tol2 transposon-mediated Gal4 gene and enhancer trapping in zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (4), 1255-1260 (2008).
- Sternberg, J. R., et al. Optimization of a Neurotoxin to Investigate the Contribution of Excitatory Interneurons to Speed Modulation In Vivo. Curr Biol. , (2016).
- Arrenberg, A. B., Del Bene, F., Baier, H. Optical control of zebrafish behavior with halorhodopsin. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (42), 17968-17973 (2009).
- Orger, M. B., Kampff, A. R., Severi, K. E., Bollmann, J. H., Engert, F. Control of visually guided behavior by distinct populations of spinal projection neurons. Nat Neurosci. 11 (3), 327-333 (2008).
- Huang, K. H., Ahrens, M. B., Dunn, T. W., Engert, F. Spinal projection neurons control turning behaviors in zebrafish. Curr Biol. 23 (16), 1566-1573 (2013).
- Smear, M. C., et al. Vesicular glutamate transport at a central synapse limits the acuity of visual perception in zebrafish. Neuron. 53 (1), 65-77 (2007).
- Bianco, I. H., Engert, F. Visuomotor transformations underlying hunting behavior in zebrafish. Curr Biol. 25 (7), 831-846 (2015).
- Trivedi, C. A., Bollmann, J. H. Visually driven chaining of elementary swim patterns into a goal-directed motor sequence: a virtual reality study of zebrafish prey capture. Front Neural Circuits. 7, 86 (2013).
- Jouary, A., Haudrechy, M., Candelier, R., Sumbre, G. A 2D virtual reality system for visual goal-driven navigation in zebrafish larvae. Sci Rep. 6, 34015 (2016).
- Muto, A., Ohkura, M., Abe, G., Nakai, J., Kawakami, K. Real-time visualization of neuronal activity during perception. Curr Biol. 23 (4), 307-311 (2013).
- Del Bene, F., et al. Filtering of visual information in the tectum by an identified neural circuit. Science. 330 (6004), 669-673 (2010).
- Semmelhack, J. L., et al. A dedicated visual pathway for prey detection in larval zebrafish. Elife. 3, 04878 (2014).
- Preuss, S. J., Trivedi, C. A., vom Berg-Maurer, C. M., Ryu, S., Bollmann, J. H. Classification of object size in retinotectal microcircuits. Curr Biol. 24 (20), 2376-2385 (2014).
- Romano, S. A., et al. Spontaneous Neuronal Network Dynamics Reveal Circuit's Functional Adaptations for Behavior. Neuron. 85 (5), 1070-1085 (2015).
- Barker, A. J., Baier, H. Sensorimotor decision making in the zebrafish tectum. Curr Biol. 25 (21), 2804-2814 (2015).
- Ewert, J. -P. Neuroethology: an Introduction to the Neurophysiological Fundamentals of Behavior. , Springer Verlag. (1980).
- Muto, A., et al. Activation of the hypothalamic feeding centre upon visual prey detection. Nat Commun. 8, 15029 (2017).
- Muto, A., Kawakami, K. Calcium Imaging of Neuronal Activity in Free-Swimming Larval Zebrafish. Methods Mol Biol. 1451, 333-341 (2016).
- Westerfield, M. THE ZEBRAFISH BOOK, 5th Edition. , University of Oregon Press. (2007).
- National BioResource Project Paramecium. , Available from: http://nbrpcms.nig.ac.jp/paramecium/?lang=en (2017).
- Fiji. , Available from: https://fiji.sc (2017).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).
- Mueller, T., Wullimann, M. F. BrdU-, neuroD (nrd)- and Hu-studies reveal unusual non-ventricular neurogenesis in the postembryonic zebrafish forebrain. Mech Dev. 117 (1-2), 123-135 (2002).
- Muto, A., et al. Forward genetic analysis of visual behavior in zebrafish. PLoS Genet. 1 (5), 66 (2005).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
