Summary
Aquí, presentamos un protocolo para ablación de una subpoblación genéticamente marcada de neuronas por un láser de dos fotones de larvas de pez cebra.
Abstract
Para identificar el papel de una subpoblación de neuronas en el comportamiento, es esencial para poner a prueba las consecuencias de bloquear su actividad en animales vivos. Ablación láser de las neuronas es un método eficaz para este propósito cuando las neuronas son selectivamente marcadas con sondas fluorescentes. En el presente estudio, se describen los protocolos para láser ablación una subpoblación de neuronas utilizando un microscopio de dos fotones y la prueba de sus consecuencias funcionales y conductuales. En este estudio, el comportamiento de captura de presas en las larvas de pez cebra se utiliza como un modelo de estudio. El circuito hipotalámico pretecto se conoce para ser la base de esta presa visualmente impulsado por captura de comportamiento. Pez cebra pretectum fue quitado por ablación láser, y la actividad neuronal en el lóbulo inferior del hipotálamo (ILH; el objetivo de la proyección pretectal) fue examinada. Comportamiento de captura de presas después de la ablación pretectal también fue probado.
Introduction
Para entender cómo el comportamiento surge de la actividad neuronal en el cerebro, es necesario identificar los circuitos neuronales que intervienen en la generación de ese comportamiento. En la etapa larval, el pez cebra proporciona un modelo animal ideal para estudiar la función cerebral asociado con el comportamiento porque sus cerebros pequeños, transparentes permiten investigar la actividad neuronal en una resolución de celular en una zona amplia de la cerebro mientras observa el comportamiento1. Proyección de imagen de la actividad neuronal en las neuronas específicas ha sido posible a través de la invención de indicadores genético codificados calcio (Ca) (GECIs) como GCaMP2. Pez cebra transgénico GCaMP han demostrado para ser útiles para asociar el circuito neuronal funcional con un comportamiento mediante la realización de proyección de imagen de Ca en comportamiento de animales3.
Mientras que la proyección de imagen de Ca puede demostrar las correlaciones entre la actividad neuronal y el comportamiento, para demostrar causalidad, supresión de la actividad neuronal y su consequence(s) sobre el comportamiento de la prueba son pasos importantes. Hay varias maneras de lograrlo: uso de la mutación genética que altera circuitos neurales específicos4, expresión de neurotoxinas en neuronas específicas5,6, uso de herramientas optogenetic como halorodopsina7, y laser de ablación de las neuronas específicas8,9. Ablación láser es especialmente adecuada para la eliminación de la actividad en un número relativamente pequeño de neuronas específicas. Eliminación irreversible de la actividad neuronal matando neuronas facilita la evaluación de consecuencias conductuales.
Un comportamiento interesante que se puede observar en la etapa larval en el pez cebra es la captura de presas (figura 1A). Este comportamiento guiado visualmente, intencionadas ofrece un favorable sistema experimental para el estudio de la agudeza visual10, transformación visuomotor11,12,13, percepción visual y reconocimiento de objetos14,15,16,17,18y19de la toma de decisiones. Cómo presa es reconocida por depredadores y cómo detección de presa lleva a la presa catching comportamiento ha sido una cuestión central en Neuroetología20. En este artículo, nos centramos en el papel del circuito hipotalámico pretecto formado por proyecciones de un núcleo en el pretectum (núcleo pretectalis superficialis equipara magnocellularis, en adelante, simplemente observado como el pretectum) al ILH. Ablación del laser del pretectum fue demostrada para reducir la actividad de captura de presas y suprimen la actividad neuronal en el ILH asociado a la percepción visual de la presa del21. Aquí, los protocolos para la realización de láser ablación y probar su efecto en Ca2 + la proyección de imagen y grabación de comportamiento describen a las larvas de pez cebra.
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Protocol
1. ablación de una subpoblación de neuronas utilizando un microscopio de dos fotones láser
Nota: Si los usuarios plan realizar ablación siguiente imagen Ca, utilice la línea de UAShspzGCaMP6s21. Si los usuarios plan realizar grabación comportamiento después de la ablación, use la línea de UAS:EGFP, como la ablación de las células positivas de EGFP es más fácil de realizar que la de las células GCaMP6s expresan.
- Comenzar por establecer el apareamiento de una línea de Gal4 etiqueta a neuronas específicas para ser estudiada y UAS:EGFP o UAShspzGCaMP6s. Asegúrese de utilizar el fondo de nácar para ambos padres que nácar homozigotos pueden obtenerse.
Nota: Homozigotos de nácar no contienen melanóforos en la superficie del cuerpo (figura 1B). En el presente estudio, un gSAIzGFFM119B de línea de Gal4 (que etiquetas el pretectum) y otro de Gal4 línea hspGFFDMC76A (que etiquetas el ILH) son usados21. - Al día siguiente de la instalación de acoplamiento, recoger los huevos de pez cebra y elevarlas a la etapa larval, momento en el que las neuronas de interés expresará reporteros fluorescentes.
- Monte la larva del pez cebra en 2% bajo punto de fusión-agarosa (figura 1B).
- Comience por preparar agarosa 2% solución: disolver 2 g de agarosa de punto de fusión bajo en polvo en 100 mL de agua del sistema (es decir, el agua utilizada para mantener el pez cebra adulto en un sistema de agua circulante)22 o E3 agua23, trayendo el agua al punto en el microondas de ebullición y mezcla vigorosamente.
- El stock de bajo punto de fusión agarosa 2% en el microondas hasta que hierva. Verter 3.5-4.0 mL de agarosa en la tapa de un plato de Petri de 6 cm. Espere hasta que la agarosa se enfríe para que esté caliente al tacto antes de proceder.
- A continuación, coloque una sola larva (no anestesiada en este paso) en la agarosa. Mantener el ajuste de la posición y orientación de la larva para que sea vertical, usando una aguja de disección (figura 1C), hasta que la agarosa se solidifica para asegurar la colocación apropiada de la larva.
Nota: La larva continuará a nadar mientras que solidifique la agarosa. - Una vez que la larva está colocada, permite 5 minutos de la agarosa se solidifique completamente.
- Vierta 5 mL de solución de Metanosulfonato (0,4% en el 1 x trabajo concentración) sobre la agarosa.
Nota: Para evitar movimientos por las larvas durante la ablación del laser, las larvas deben estar anestesiadas durante todo el procedimiento de ablación.
- Ablación de la larva mediante la función de blanquear en un sistema de microscopía de dos fotones láser.
- Colocar la larva agarosa incrustada debajo de un láser de dos fotones microscopio y empezar el sistema de microscopía.
- Inicie el software de adquisición de imagen y haga clic en el botón "On" en la pestaña "Láser" para encender el láser (figura 1D). Espere a que el "Status" del láser para cambiar de "Ocupado" a "Modo-bloqueado."
- En la pestaña "Canales", seleccionar longitud de onda del láser en 880 nm (potencia máxima: aproximadamente 2.300 mW) para la ablación de EGFP, o al 800 nm (potencia máxima: aproximadamente 2.600 mW) para la ablación GCaMP.
- Seleccione la lente del objetivo X 20 moviendo manualmente el revólver de la lente. Haga clic en la pestaña de "Ubicación", haga clic en "GFP" cambiar las vías ópticas, y ver directamente la fluorescencia por el ojo.
- Ubicar el cerebro larvas de pez cebra en el centro de la vista; Haga clic en la pestaña de "Adquisición" para volver a la microscopía de dos fotones.
- Como un registro de la condición de 'antes de la ablación', tomar una imagen de z-stack con el objetivo de 20 X en escaneo-velocidad rápida (para evitar el daño por calor). Luego comparar las imágenes tomadas antes y después de experimentos de ablación (figura 2A). Para obtener una pila de z, haga clic en "Z-Stack" para seleccionar la opción z-stack y ampliar la ficha establece el límite inferior (clic en "Establecer primero" botón") después de enfocar en el extremo ventral del cerebro larvas y establece el límite superior (haga clic en el botón"Set pasado") después de enfocar en la más a la superficie dorsal del cerebro. Luego, haga clic en el botón de "Iniciar el experimento" para ejecutar la adquisición de la imagen de z-stack.
- Seleccione la lente del objetivo X 63 moviendo manualmente el revólver de la lente.
- Haga clic en la pestaña de "Localización" para cambiar al microscopio epi-fluorescente, localizar las células para ser quitado por ablación en el centro de visión por el ojo, luego haga clic en la pestaña de "Adquisición" para volver a la para microscopia de la exploración del laser.
- En la pestaña de "Modo de adquisición", establece el "marco de tamaño" en 256 x 256. Haga clic en "Live" y observar las neuronas de interés.
- A partir de la parte más dorsal, encontrar un plano focal en el cual las células para ser quitado por ablación están en foco.
- Marque un área pequeña y circular tamaño un tercio de la célula de diámetro en cada neurona como una región de interés (ROI) mediante la función de "Las provincias".
- Ajustar la velocidad de escaneo a s/256 13.93 x 256 pixeles (134.42 μm x 134.42 μm), que corresponde a un tiempo de permanencia de láser de aproximadamente 200 μS/pixel o 200 μS/0.5 μm. Asimismo, establece 4 repeticiones (' ciclo de iteración: 4'). Alternativamente, optimizar el número de iteraciones y velocidad de barrido que se logra la ablación suficiente.
- Realizan la función de 'Blanqueo' para la ablación, en combinación con la 'serie (2 ciclos) de tiempo' para la imagen de la muestra (antes y después de la ablación) y «Regiones» (para ajustar el ROIs) o funciones equivalentes en el software utilizado (figura 1D).
- Comparando la primera imagen (antes de la ablación) y la segunda imagen (después de la ablación) en la serie de tiempo del ciclo, asegúrese de después del blanqueamiento, la fluorescencia en la células apuntadas disminuye al observado en el nivel de fondo (figura 2B).
- Si la fluorescencia todavía está presente después de la ablación, aumentar el número de iteraciones.
- A continuación, mueva el plano focal ligeramente más profundo (es decir, hacia el lado ventral) y elegir el siguiente plano focal donde aparecen células no seccionadas.
- Realizar la función de blanqueaba como se describió anteriormente (paso 1.9). Repita estos pasos hasta que todas las células en la estructura neuronal de interés han sido quitado por ablación.
- Después de pasar por todos los planos focales que cubre las estructuras neuronales a ser quitado por ablación, compruebe las células para fluorescencia suprimida. Si algunas células se encuentran aún fluorescente debido a la ablación insuficiente, laser-irradiarles otra vez como se describe anteriormente.
- Si la larva necesita recuperarse de agarosa después de la irradiación láser, no intente forzarlo fuera de la agarosa ya que esto podría dañar la larva. En cambio, con cuidado hacer cortes diminutos en la agarosa alrededor de la larva perpendicular a la superficie de su cuerpo. Luego, espere la larva a nadar fuera de agarosa por cuenta propia cuando la anestesia.
- Proceder a la siguiente larva para la ablación o realizar experimentos de control de uso de otra población de neuronas que son uninvolved en la conducta objeto de investigación.
Nota: Aquí, como un control, las neuronas del bulbo olfatorio en UAS:EGFP; gSAIzGFFM119B las larvas fueron utilizando el mismo protocolo descrito anteriormente (figura 2A, derecha) por ablación láser. - Permite varias horas o 1 día para la recuperación antes de proceder a la proyección de imagen de Ca (sección 2) o registro conductual (sección 3). Durante este tiempo de recuperación, Compruebe la salud larvas (es decir, natación espontánea normal, sin daño de calor aparente alrededor de la zona seccionado, etc.) y eliminar las larvas que muestra signos de mala salud.
2. calcio la proyección de imagen para registrar la actividad Neuronal evocada de presa en las larvas de pez cebra por ablación Pretectum
- Para preparar una cámara de grabación, poner una Junta de la cámara de sello seguro hibridación en un portaobjetos de vidrio, con la cara adhesiva sobre el vidrio y retire el sello superior.
Nota: Esto crea una cámara de grabación pequeño que es de 9 mm de diámetro y 0,8 mm de profundidad (figura 3A). - A continuación, coloque una malla de nylon (tamaño de apertura: 32 μm) en un tubo de 50 mL que tiene la parte inferior cortar abierto. Utilice el tapón para fijar la malla en el tubo (figura 3B).
- Preparar el paramecio (que es la presa para ser utilizado como el estímulo visual de larva).
Nota: Preparar el cultivo de paramecio (pasos 2.3.1 y 2.3.2) previamente.- Obtener cultivo de paramecio semilla de fuentes comerciales o bio-recursos académicos centros24 por adelantado.
- Cultura el paramecium para varios días en agua con paja de arroz esterilizada y una pelotilla de la levadura de cerveza seca22 (figura 3C).
- Vierta el paramecio la cultura a través de 2 tamices sucesivamente (uno con una abertura de 150 μm, seguida de otra con una apertura de 75-μm) para eliminar restos de la cultura.
- Recoger el paramecio en el flujo a través del paso anterior en una malla de nylon (13 μm de abertura).
- Resuspenda el paramecio de la malla de nylon en un vaso de vidrio con una botella de apretón de agua del sistema (figura 3D).
- Enjuague la malla (figura 3B) en agua del sistema 2 x (figura 3E).
Nota: El propósito de este paso es eliminar cualquier posible odorantes y tastants contenida en el medio de cultivo de paramecio , ya que el objetivo del presente estudio es observar visualmente por la actividad neuronal. - Lugar una larva de pez cebra en la solución de Metanosulfonato para anestesiar.
- Montar una sola larva en agarosa de punto de fusión bajo de 2%.
- En primer lugar, microondas 2% agarosa de punto de fusión bajo y añadir volumen 1/10 de 10 x tricaine concentrado a la agarosa.
- Coloque una gota de la agarosa que contiene Metanosulfonato en la sala de grabación (figura 3A).
- Después de confirmar la agarosa no está demasiado caliente, coloque la larva anestesia (del paso 2.5) en la agarosa, quitar inmediatamente cualquier exceso agarosa para que la superficie de la agarosa se ve ligeramente convexa.
- Orientar rápidamente la larva en posición vertical con una aguja de disección (figura 1C).
Nota: Estos procedimientos deben ser completados dentro de varios segundos antes de que solidifique la agarosa. - Una vez que la larva está bien colocada, permite 5 minutos de la agarosa se solidifique completamente. A continuación, vierta una gota de solución de x tricaine 1 en la agarosa.
- Retire la agarosa alrededor de la cabeza de la larva de pez cebra y hacer espacio para el paramecium nadar con un cuchillo quirúrgico. Para ello, en primer lugar, hacer unos pequeños cortes en la agarosa (figura 3F). Entonces, retire cuidadosamente la agarosa sobrante vertiendo con cuidado sistema de agua en la cámara.
Nota: En este paso, el Metanosulfonato será eliminada. - A continuación, poner un paramecio en la cámara de grabación para servir como un estímulo visual.
Nota: Cuando el paramecio nade cerca de la cabeza de la larva de pez cebra, evocará una respuesta neuronal (figura 3G). - La cámara de grabación en un microscopio de epifluorescencia equipado con una cámara CMOS de científicos (figura 3H) y seleccionar un objetivo X 2,5 (figura 3).
- Recoge grabaciones time-lapse de las señales de fluorescencia GCaMP.
- Iniciar la solicitud de adquisición de imagen de la cámara equipada.
- Haga clic en "Panel de secuencia" y seleccione "Grabar disco" en el panel. En la sección de configuración del análisis, establecer el "Frame Count" a 900 o cualquier otro número de total de marco deseado.
Nota: Si está disponible, utilice software de grabación Time-lapse con un módulo (aquí, "disco duro graba") que permite el ahorro eficiente de los datos en un disco duro. - En el panel de "Captura", establece el tiempo de exposición 30-ms (es decir, 33,3 fps) y Binning 2 x 2.
- En el microscopio control touch panel, elija un filtro para GFP, como el GCaMP tiene similares espectros de excitación/emisión de GFP.
- Haga clic en "Live" en el panel captura para localizar a la larva en la vista de cámara y foco (figura 4A), haga clic en "Dejar de vivir" y haga clic en el botón "Inicio". Guardar la película en .cxd o cualquier otro formato que contiene información acerca de la condición de la adquisición.
- Después de las grabaciones, analizar las señales fluorescentes GCaMP6s (señales de Ca) obteniendo valores de pixel media para el retorno de la inversión en una estructura cerebral en la película Time-lapse con el software libre Fiji25.
Nota: Fiji es una versión de ImageJ con útiles muchos plug-ins de preinstalado y puede leer archivos de imagen de formato de .cxd con los formatos de Bio plug-in. - Si la larva se mueve ligeramente durante la grabación, realizar registro de la imagen al ejecutar el plug-in de TurboReg26 en Fiji. En el menú, seleccione 'Plugins', 'Registro' y 'TurboReg'.
- Considerar cómo analizar los datos según el objetivo del estudio. El siguiente es un ejemplo.
- Calcular la F/F0 (intensidad de fluorescencia en cada momento, dividido por la intensidad de fluorescencia en reposo o antes de cualquier transitorio de Ca) como sigue:
- Establecer ROIs en el pretectum o el ILH mediante el ROI Manager: en el menú, seleccionar "Analizar", "Herramientas", "ROI Manager" y "Añadir" a la lista de los ROIs (figura 4A).
- Calcular los valores de píxel de media para el ROIs (i.e., intensidades de fluorescencia de GCaMP6s) seleccionando en el panel de ROI Manager: "Más," "Multi-medida" y "Aceptar". Guardar los resultados como un archivo de hoja de cálculo.
- Como las señales son ruidosas, promedio de las señales para 11 puntos temporales (media móvil) usando una aplicación que puede procesar los datos de la hoja de cálculo.
- F (intensidades de fluorescencia con el tiempo) se dividen por F0 (intensidad de fluorescencia en el nivel basal) para calcular la intensidad de fluorescencia normalizado. Un ejemplo de visualización de datos, cambios en normalizado GCaMP6s intensidad de fluorescencia en el pretectum y el ILH son color-coded y asignado en las trayectorias de paramecium (figura 4B - D).
3. evaluación de las consecuencias conductuales después de la ablación láser
- Establecer un sistema de registro conductual que consiste en un estereoscopio equipado con una cámara de vídeo. Utilizar una cámara con un imagen apropiada adquisición software, comercial o a medida (figura 5A).
- Optimizar las condiciones de iluminación para que el paramecio puede detectarse por tratamiento de la imagen. Por ejemplo, usar una luz LED de anillo blanco con un espaciador (figura 5B).
Nota: La distancia y el ángulo, el LED afecta la apariencia de la muestra (es decir, brillante en el fondo oscuro u oscuro en fondo claro) y son, por lo tanto, crítica para el tratamiento de la imagen de éxito. Determinar la mejor altura del espaciador (figura 5C). - Lugar a una larva de pez cebra (recuperada del ablación láser experimento descrito en la sección 1) en una cámara de grabación de comportamiento (que se adjunta a un portaobjetos de vidrio) con el sello superior original eliminado(figura 5).
- Recoger 50 paramecio de la cultura (paso 2.3.5) utilizando una micropipeta y colocar en la cámara de grabación.
- Coloque un cubreobjetos sobre la cámara de grabación. Poner una pequeña gota de agua en la hoja de cubierta antes de colocar sobre la superficie del agua de la cámara de grabación para evitar la introducción de aire en la cámara.
Nota: En este paso, algunos con paramecio rebosará de la cámara de grabación. El número restante de paramecio en la cámara de grabación será aproximadamente 30-40. - Coloque la cámara de grabación (que contiene una larva y paramecio) en el sistema de iluminación(figura 5).
- Iniciar la grabación Time-lapse a 10 fps durante 11 minutos (6.600 Marcos).
- (Opcional) Por cada larva que fue probada por su comportamiento, observar la fluorescencia de las zonas de ablación de láser por microscopia fluorescente para confirmar la efectividad de la ablación del laser (es decir, ausencia o significativamente menores número de células fluorescentes en la zona irradiada por el láser.)
Nota: Incluso después de la irradiación, todavía se pueden observar algunas células fluorescentes debido al inicio posterior de Gal4 expresión génica en las células que distinguen después de ablación27. - Después de grabar el comportamiento de la larva, para compensar la falta de uniformidad en el fondo, realizar una división por píxeles de cada fotograma una imagen promedio en Fiji: haga clic en 'Procesar', 'Calculadora de imagen', ' operación: dividir ', 32 bits (float) resultado ', y ' OK'. Para una imagen promedio, haga clic en 'Imagen', 'Pilas', 'Proyecto Z', 'Intensidad media' y 'OK' (figura 5E, F).
- Cuenta el número de paramecio deja en la cámara haciendo clic en 'Analizar', 'Analizar partículas', establecer un rango de área que cubre todos los paramecia, comprobación de la casilla de verificación 'Mostrar: máscaras' y hacer clic en 'Aceptar'. La opción 'Mostrar: máscaras' proporcionará una imagen extraída de paramecio (figura 5G), con una lista del número de partículas (paramecio) en cada marco.
- Parcela número de paramecio que quedan en la sala de grabación con el tiempo. Debido a las estimaciones del número de paramecia son ruidosas, se recomienda realizar una media móvil de cada punto en un rango de 600 marcos (1 min) en la hoja de cálculo.
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Representative Results
Neuronas específicas fueron etiquetadas genéticamente con EGFP o GCaMP6s, cuya expresión fueron conducidos en líneas de Gal4. Un gSAIzGFFM119B de la línea de Gal4 fue utilizada para etiquetar un núcleo en el área pretectal (núcleo pretectal superficial magnocelulares) y una subpoblación de neuronas del bulbo olfatorio. Otra línea de Gal4, hspGFFDMC76A, fue utilizado para etiquetar el ILH. Laser-ablación las neuronas pretectal bilateral (panel de la izquierdafigura 2A ) y también la ablación de las neuronas en el bulbo olfativo bilateralmente como control (panel derecho de lafigura 2A ) en larvas de pez cebra de un gSAIzGFFM119B de la línea de Gal4 que fueron apoyadas con peces de reportero UAS:EGFP. Los resultados muestran que dos fotones láser puede extirpar células apuntadas dejando células adyacentes o neuritas afectada (figura 2B).
Las neuronas pretectal proyecto sus axones hacia el ILH ipsilaterally. Aquí, hemos investigado su conectividad funcional usando proyección de imagen de Ca. La actividad neuronal en esta región puede observarse como Ca señales con una punta de prueba de Ca GCaMP6s (figura 4A), cuya expresión fue impulsado por un gSAIzGFFM119B de la línea de Gal4 (figura 4B) u otro Gal4 línea hspGFFDMC76A (figura 4 C). las puntas de flecha de color (figura 4) muestran natación direcciones y trayectorias del paramecium, así como con códigos de color de los cambios de la señal de Ca en el área especifica del cerebro, que fueron evocados por la visión de la natación paramecium (Figura 4B-D). El pretectum (figura 4B) tanto el ILH (figura 4C) demostrada la actividad neuronal en la próxima presencia de presa, lo que sugiere que ambas actividades neuronales son visualmente conducidos.
Mediante el uso de las larvas de Gal4 GCaMP6s doble (gSAIzGFFM119B; hspGFFDMC76A; UAShspzGCaMP6s), hemos quitado por ablación la neuronas pretectal unilateralmente y además realizadas Ca la proyección de imagen para observar la actividad neuronal en el pretectum y el ILH en las larvas de seccionado. El pretectum izquierdo que fue quitado por ablación láser mostró residual a ninguna actividad neuronal (figura 4D, arriba a la izquierda), sugiriendo que laser-la ablación fue exitosa. Sin embargo, el ILH ipsilateral demostró dramáticamente reducida actividad neuronal (figura 4D parte inferior izquierda), lo que sugiere que la entrada principal al ILH proviene el pretectum ipsolateral. En contraste, el ILH al otro lado de la ablación láser pretectum (figura 4D abajo a la derecha) mostró actividad neuronal similar a la actividad neuronal en el pretectum ipsilateral (figura 4D, arriba a la derecha), que sugiere que el ILH derecha recibe entradas del pretectum derecha.
La elección de qué ensayo conductual para utilizar en un experimento depende de las posibles funciones de las neuronas bajo investigación. A continuación, os mostramos un ejemplo de un ensayo de captura de la presa después de la ablación de un núcleo pretectal que fue identificado como un detector de presa21. Usando el sistema de iluminación que se muestra en la figura 5A, D, el número de paramecium en la cámara de grabación puede contarse por tratamiento (figura 5E-G) de la imagen. Automatizado de extracción de los ojos, y cálculo de las posiciones del ojo (es decir, cambios en los ángulos de los ojos) también puede ser posible porque los ojos de la larva de pez cebra aparecen más oscuros que el fondo en este estado de iluminación (figura 5H ).
Resultados del experimento muestran que ablación bilateral de la actividad de captura de presa suprimido pretectum (Fig. 5I, PT) y la ablación de una subpoblación de neuronas en el bulbo olfatorio no (figura 5I, OB). Estos resultados, junto con los experimentos que se muestra en la figura 4, sugieren que el circuito hipotalámico pretecto es esencial en el comportamiento de la captura de presas.
Figura 1 . Larvas de pez cebra. Pez cebra (5 días después fertilización (5-PD)) cinco - viejo (A) larva y su presa, un paramecio. (B) larva de nácar de 4 dpf embebidas en agarosa de punto de fusión bajo de 2%. Tenga en cuenta que la cepa de nácar carece de pigmentos negros en el cuerpo mientras que el epitelio pigmentario de la retina está intacto. Barra de escala: 0,5 mm. (C) disecante de aguja utilizada para orientar las larvas de pez cebra en agarosa. Barra de escala: 1 cm. (D) captura de pantalla del software utilizado en la microscopia de dos fotones, que muestra paneles "Blanquear", "Series de tiempo" y "Regiones" que se utilizaron en la ablación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 . Ablación de una subpoblación de neuronas utilizando un microscopio de dos fotones láser. (A) imágenes fluorescentes EGFP de larvas de pez cebra dpf 4 antes y después de la ablación de las neuronas. Vista superior y vista lateral de imágenes 3D reconstruido z-stack utilizando software de procesamiento de imagen. El z-stack imágenes fueron tomadas con una lente de objetivo 20 X. Las áreas seccionadas (el pretectum o bulbo olfatorio) están un círculo amarillo. Barra de escala: 100 μm. ()B) ejemplo de ablación de láser en un solo plano focal utilizando la función de "Blanquear". Las zonas irradiadas por láser (establecer como ROIs) se muestran en colores en cada célula. Barra de escala: 10 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 . Preparación de las larvas de pez cebra y paramecio para proyección de imagen de Ca. Cámara de grabación (A). Un diámetro de 9 mm disponibles en el mercado x Junta de hibridación de 0,8 mm de profundidad con 8 cámaras fue utilizado como la sala de grabación. La junta fue puesta sobre un portaobjetos de vidrio y adherida. El sello en la parte superior de la junta fue pelado apagado. (B) la malla de nylon (32 μm) utilizada para aclarar el paramecio. La malla se colocó en un tubo de 50 mL. (C) Paramecium cultura con paja de arroz y pastillas de levadura de seca. (D) Paramecium solución madre se prepara de la cultura que se muestra en la solución de C. (E) Paramecium se enjuagó con agua de sistema dos veces para eliminar posibles señales olfativas y gustativas en el medio. (F) Paramecium incrustado en la sala de grabación. Para quitar una porción de agarosa, se hicieron varios cortes. (G) grabación de cámara con una larva de pez cebra y un paramecium. La mayoría de la agarosa fue quitada para permitir que el paramecium nadar. La cabeza de la larva del pez cebra se expone. (H) microscopio fluorescente vertical utilizado en proyección de imagen de Ca. El microscopio está equipado con una cámara CMOS de científico. () Pez cebra larva en la cámara de grabación en el microscopio con la luz de excitación. Con un objetivo de X 2.5, el área iluminada es ligeramente más grande que el tamaño de la cámara. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 . Representante Ca imagen datos. (A) posición del pretectum y el lóbulo inferior del hipotálamo (ILH), un círculo amarillo, en un doble hspGFFDMC76A de Gal4; gSAIzGFFM119B; Larva de pez cebra UAShspzGCaMP6s. (B) cambios en el pretectum Ca señal (promediadas bilateral), color-mapeado en las trayectorias de un paramecio en un gSAIzGFFM119B; Larva de UAShspzGCaMP6s. Barra de escala: 1 mm. (C) los cambios en la señal de Ca de ILH (promediadas bilateral), color-mapeado en las trayectorias de un paramecio en un hspGFFDMC76A; Larva de UAShspzGCaMP6s. Barra de escala: 1 mm (D) cambios en el pretectum y las señales de Ca de ILH color-mapped en las trayectorias de un paramecio en un hspGFFDMC76A; gSAIzGFFM119B; Larva de UAShspzGCaMP6s que fue sometida a dos fotones ablación del laser de la izquierda pretectum. Barra de escala: 1 mm. Esta imagen fue reproducida de los mismos datos anteriormente publicados21. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 . Presa de captura de datos análisis y representante en larvas de pez cebra por ablación láser. Sistema de grabación de comportamiento (A). El estereomicroscopio fue equipado con una cámara CMOS. Imágenes fueron adquiridas mediante un script a medida. (B) componentes del sistema de iluminación. Un papel de color gris, un difusor de cristal, anillo de LED blanco luz, difusor, un espaciador a medida (cartulina) y difusor con un agujero en el centro. (C) el sistema de iluminación montado de las piezas que se muestra en la cámara de grabación de B. (D) para el ensayo de captura de presas. Una cámara (diámetro: 20 mm, profundidad: 2,5 mm) se colocó en un portaobjetos de vidrio. El sello superior original de la cámara fue pelado apagado. Se puso una cubierta de cristal de la sala de grabación. (E) imagen de un fotograma de la película grabada. (F) A marco dividido (pixel por pixel) por una imagen media de una película. Tenga en cuenta que el fondo no uniforme en la iluminación puede ser compensado por este tratamiento de la imagen. (G) paramecio extraído de un marco usando la función "Análisis de la partícula" en Fiji. (H) ejemplo de imagen en Fiji con un umbral aplicado. Paramecio aparecen brillantes, mientras que los ojos de la larva de pez cebra aparecen oscuros, y el fondo es gris. Cambios en las posiciones del ojo (es decir, ángulos respecto al eje del cuerpo) pueden ser calculadas, si es necesario. () Datos experimentales representativos del consumo de paramecium en una larva control ablación de bulbo olfatorio (OB) y una larva de ablación pretectum (PT). Pretectum ablación redujo significativamente la capacidad de caza presas mientras ablación del bulbo olfatorio no lo afectó. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Aunque el régimen de dos fotones láser tiene una excelente resolución espacial a ablar específicamente las neuronas individuales, gran debe tener precaución para evitar daños no deseados en el tejido cerebral debido a la calor. El paso más importante en el experimento de ablación es determinar la cantidad óptima de la irradiación del laser. Insuficiente irradiación no mata a las neuronas. Demasiada irradiación será daño por calor el tejido circundante, que darán lugar a efectos no deseados. El rango óptimo de irradiación láser (áreas de ROIs, número de iteraciones y velocidad de exploración) parece ser estrecha. Algunos factores que afectan la eficacia de la ablación.
Primero, mediante el uso de proteínas de diferentes reportero fluorescente, las condiciones de la ablación deben optimizarse para cada reportero. Expresión de GCaMP se observa en el citoplasma desprovisto de los núcleos. En contraste, la fluorescencia EGFP aparece en todo el interior de la célula, que puede ser ventajoso para la ablación eficaz y específica de las células específicas, en comparación con GCaMP. El uso de GCaMP también es una desventaja como una célula de expresar GCaMP por ablación láser puede exhibir mayor fluorescencia intensidad debido a la afluencia masiva inmediata del Ca, en contraste con la intensidad de fluorescencia disminuida cuando EGFP fue utilizado para la ablación. Así, el cambio en la fluorescencia puede ser un indicador confiable de la magnitud de la ablación con GCaMP. En tales casos, puede ser necesario validar la ablación mediante la observación de la pérdida de células fluorescentes después de un período específico. Ausencia o reducción significativa de las señales de Ca en la zona separada por ablación puede ser otro criterio para la exitosa ablación con GCaMP.
En segundo lugar, la cantidad (es decir, velocidad de barrido, número de iteraciones de análisis) de la irradiación láser para ablación acertada puede variar dependiendo de la profundidad de la localización de las neuronas de la superficie del cerebro. Los situados profundamente dentro del cerebro en comparación con células situadas cerca de la superficie, requieren más la irradiación del laser, por lo tanto, lo que es más difícil de extirparlos. Optimización para la cantidad de irradiación de láser debe ser determinada específicamente para cada subpoblación específica de las neuronas.
En tercer lugar, se observó empíricamente que establecer un número de ROIs en un área pequeña en una exploración a menudo dañados por calor el tejido alrededor de las células así (juzgada por la aparición de burbujas en la zona irradiada por el láser), mientras que el dirigido a una celda solo, o escasamente ROIs distribuidos en una exploración bajo la misma condición no tenía efectos nocivos. En el presente estudio, se aplicó solamente en una pequeña región (aproximadamente un tercio del tamaño del cuerpo celular) blanqueo para evitar daño a los tejidos fuera de las células apuntadas. Por lo general, 5-10 células estuvieron dirigidas en cada plano focal (4-8 aviones para cubrir toda el área pretectal).
Además de optimizar la cantidad de irradiación láser, extensa validación de ablación con láser mediante la realización de experimentos de control es fundamental. Un experimento de control puede incluir ablación del laser de otra subpoblación de células que es poco probable en el comportamiento en estudio. Las neuronas del bulbo olfatorio en la misma línea de Gal4 sirvieron como control en el presente estudio (figura 2A, derecha y figura 5). Sin embargo, por la razón descrita anteriormente, no hay grupos de neuronas pueden servir como un control ideal. Cada subpoblación de neuronas difiere de los otros respecto a su posición en el cerebro, densidad celular, nivel de expresión de transgenes reportero fluorescente, la tasa de proliferación y el momento de la expresión del transgen de reportero. Estas diferencias hacen imposible utilizar la misma configuración exacta para la ablación (la función de 'Blanquear') en experimentos de control. Así, diferentes tipos de experimentos de control deben también considerarse, tales como medidas de la respuesta optokinetic comportamiento visual28y actividad basal en locomoción21 para asegurar el efecto específico de la ablación.
En nuestra experiencia, ablación de docenas de las células pretectal bilateralmente, toma aproximadamente 1 hora (de empotrar en agarosa, ablación usando un microscopio de dos fotones, para recuperar de la agarosa después de la ablación). Larvas de hasta 8 al día (por ejemplo, las 4 larvas experimentales y 4 para el control) puede ser quitado por ablación; por lo tanto, un par de sets de experimentos puede ser necesario para asegurarse de que existan suficientes larvas para un grupo experimental (p. ej., n = 12) y un grupo control (p. ej., n = 12). Además, es deseable permitir a medio día o un día para las larvas de ablación (p. ej., ablación con láser en seguida de un registro conductual en 5 PD, o la ablación en la mañana seguida por proyección de imagen de Ca en la tarde 4-PD). Durante este tiempo de recuperación, cualquier mal buscando larvas deben ser excluidas del estudio.
El protocolo utilizado para analizar los datos obtenidos depende totalmente del objetivo del estudio. El presente estudio se centró en las relaciones entre la ubicación de paramecio en el campo visual y la actividad neuronal en el pretectum y el ILH. Teniendo en cuenta el decaimiento lento (~ segundos) de la GCaMP6s señales29, sólo el momento en el aumento, pero no la disminución, de la GCaMP6s señales se correlaciona con la localización de la paramecio. Las señales de Ca pueden ser alta incluso cuando el paramecio alejarse. Por lo tanto, sólo se incluyeron intensidad de fluorescencia mayor de GCaMP6s en la presentación de los datos. Este tipo de análisis requiere a menudo por encargo scripts escritos con lenguajes específicos de programación o lenguajes de macro. Los scripts utilizados en este documento están disponibles bajo petición.
La condición restringida (es decir, incrustados de agarosa) puede ser estresante para las larvas de pez cebra hasta cierto punto; sin embargo, no observamos aparente actividad neuronal inducida por el estrés o el comportamiento en esta condición, en comparación con la condición de nado libre21,22. Larvas de pez cebra agarosa incrustada pueden sobrevivir al menos 24 h, (probablemente más) sin ningún problema aparente. Paramecium-Ca por las señales en el pretectum y el ILH en la condición restringida fueron similares a la observada en las larvas nadan libremente21. Comportamiento visual del pez cebra puede ser controlado por el ritmo circadiano. Por lo tanto, llevamos a cabo experimentos conductuales de tarde a tarde. Tipo salvaje y el control de larvas consumen un número significativo de paramecio durante este tiempo de grabación.
Los ensayos funcionales y conductuales descritos aquí utilizan el equipo más comúnmente disponible que se pueden encontrar en muchos laboratorios o puede configurar fácilmente, y así debe tener amplias aplicaciones en diferentes campos de la Ciencias del comportamiento.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de interés al informe.
Acknowledgments
Estos estudios fueron financiados por subvenciones recibidas del MEXT, JSP KAKENHI Grant números JP25290009, JP25650120, JP17K07494 y JP17H05984.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NuSieve GTG Agarose | Lonza | Cat.#50080 | low-melting temperature agarose |
| 6 cm petri dish | FALCON | Product#:351007 | |
| dissecting needle | AS ONE Corporation | Cat. No. 2-013-01 | https://keystone-lab.com/en/item/detail/404142 |
| LSM7MP | Carl Zeiss | two-photon laser scanning microscope | |
| W Plan-Apochromat 63x/1.0 | Carl Zeiss | 63X objective lens | |
| Imager.Z1 | Carl Zeiss | an epi-fluorescence microscope | |
| ZEN | Carl Zeiss | Image acquisition software for confocal microscopes | |
| Secure-Seal Hybridization Chamber Gasket, 8 chambers, 9 mm diameter x 0.8 mm depth | Molecular Probes | Catalogue # S-24732 | Used as a recording chamber in Ca imaging |
| Imageing Chambers | Grace Bio-Labs | CoverWell Imaging Chambers PCI-A-2.5 | Used as a behavioral recording chamber |
| surgical knife | MANI | Ophthalmic knife MST15 | |
| ORCA-Flash4.0 | Hamamatsu Photonics | model:C11440-22CU | a scientific CMOS camera |
| HCImage | Hamamatsu Photonics | image acuisition software | |
| Hard Disk Recording module | Hamamatsu Photonics | An software module that enables saving the movie files onto a hard disc drive in a short time | |
| SZX7 | Olympus | stereoscope | |
| DF PL 0.5X | Olympus | objective lens for SZX7 | |
| Point Grey Grasshopper3 4.1 MP Mono USB3 Visio | FLIR Systems, Inc. | Product No. GS3-U3-41C6NIR-C | CMOS camera |
| XIMEA xiQ camera | XIMEA | Product No. MQ042RG-CM | CMOS camera |
| a ring LED light | CCS | Model: LDR2-100SW2-LA | White LED |
| Nylon mesh 32µm | Tokyo Screen | N-No.380T | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/ |
| Nylon mesh 13µm | Tokyo Screen | N-No. 508T-K | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/ |
| Metal seive 150 micron aperture | Tokyo Screen | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami | |
| Metal seive 75 micron aperture | Tokyo Screen | http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami | |
| EBIOS | Asahi Food & Healthcare, Co. Ltd. | dry beer yeast | |
| LabVIEW | National Instruments | an integrated development environment for programming | |
| Mai-Tai HP | Spectra Physics | two-photon laser |
References
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