Summary
すべての病原性リーシュ マニア原虫種に存在し、脊椎動物のホストのマクロファージ内で複製。ここでは、リーシュ マニア、続いて細胞増殖動態の正確な定量培養マウス骨髄由来マクロファージに感染するプロトコルを提案する.このメソッドは、リーシュ マニアの病原性と宿主-病原体相互作用に影響を与える個々 の要因を調べる場合に役立ちます。
Abstract
リーシュ マニア、リーシュ マニア症の原因となるエージェントのライフ サイクルそれぞれ昆虫内の promastigote と amastigote の段階と脊椎動物のホスト間で交互に行います。脊椎動物の段階で感染種によって非常に致命的な内臓疾患形態に良性の皮膚病変から広く、リーシュ マニア症の病原性の症状があります、すべてのリーシュ マニア原虫種ホスト マクロファージの内部に存在します。そのライフ サイクル。リーシュ マニア感染が侵入し生き残るため、マクロファージ内 parasitophorous 液胞 (PVs) 内のレプリケート機能に直結したがってします。したがって、細胞内で複製する寄生虫の能力評価は、病原性を決定するための信頼性の高い方法として機能します。モデル動物を用いたリーシュ マニア症開発の勉強は時間がかかり、退屈で、多くの場合困難である特に pathogenically 重要な内臓フォームです。骨髄由来マクロファージ (BMMs)リーシュ マニア原虫の細胞内の発展を追跡する方法をご紹介します。細胞内の寄生虫数は 72 96 h の感染のための 24 時間間隔で決定されます。このメソッドは、リーシュ マニア病原性に及ぼすさまざまな遺伝的要因の信頼性の高い定量できます。リーシュ マニア原虫ミトコンドリア鉄トランスポーター遺伝子 (LMIT1) の単一の対立遺伝子の削除がリーシュ マニア amazonensis変異株LMIT1/ΔLmit1の BMMs、内部成長能力を損なう方法を示す例については、野生型と比較して毒性の大幅な削減を反映しています。この試金は、宿主-病原体相互作用に及ぼす諸要因(栄養素、活性酸素種など)の分析を個別に操作できる実験条件を正確に制御できます。したがって、適切な実行と BMM 感染症研究の定量化は、従来の動物モデル研究の非侵襲的、急速な経済的な安全で信頼性の高い代替を提供します。
Introduction
リーシュ マニア症は、原虫リーシュ マニア属の種によって引き起こされる人間の病気の広いスペクトルを指します。約 1200 万人現在リーシュ マニア、世界中に感染しているし、以上 3 億 5000 万が危険にさらされます。病の病理は、リーシュ マニア原虫種と宿主因子によって決まるし、症状が無害な自己治癒皮膚病変から致命的な visceralizing フォームに変わる。最悪の人間の病気としてマラリア後だけランキングが1原虫感染によって引き起こされる未処理、内臓リーシュ マニア症は致命的な場合。病の病理や症状に多岐にわたる違いがあるにもかかわらずすべてのリーシュ マニア原虫種昆虫内の promastigote と amastigote の段階と脊椎動物のホストをそれぞれ交互 digenic ライフ サイクルがあります。内部脊椎動物、リーシュ マニアホスト マクロファージ浸潤、parasitophorous 液胞 (Pv)、高度病原性 amastigote フォームが複製ファゴライソゾームの特性と酸性コンパートメントの形成を誘導します。Amastigotes 慢性感染の間に宿主組織の永続化および伝送サイクルを完了するに感染していないサシチョウバエを渡されることができます。したがって、人間の病気の開発の中で、amastigotes は、最も重要なリーシュ マニアライフ サイクル フォーム2です。理解リーシュ マニア病原性3,4,5,6、7のための重要なマクロファージ Pv 内での amastigotes の複製方法の調査は、新規の効果的な治療法の開発。
リーシュ マニア感染や骨髄由来マクロファージ (BMMs)、時間の経過とともに細胞内リーシュ マニア原虫の数の定量的評価を含むレプリケーションを研究する研究室による定期的な利用法をご紹介します。リーシュ マニアの定量化の文化におけるマクロファージに感染フォーム (metacyclic promastigotes または amastigotes)の in vitro感染マウス骨髄と分化から球の収穫には、細胞内寄生虫感染 72 96 h の期間の 24 時間間隔での数です。この試金は、いくつかの環境要因および足蹠でさらに検証されたL. amazonensis病原性の促進に鉄の役割の重要性の識別を含む寄生虫の遺伝子の影響を判断する私たちの研究室で使用されていますマウス6,8,9,10、11,12,13,14,15 病変の開発研究.以来、すべての病原性リーシュ マニア原虫種ホスト マクロファージ内の複製のニッチを確立、この試金はすべてリーシュ マニア原虫種の病原性決定の普遍的に使用できます。
BMM 感染症を実行する単一セルのレベルでホスト寄生虫相互作用の解析とこうしてリーシュ マニア原虫が彼らのホストの優先の微小環境、マクロファージの PVs と対話する方法のより広範な理解ことができます。探索する正常にマクロファージ感染アッセイ複数グループ16,17,18,19,20,21,22で使用されています。ホスト マクロファージや細胞内感染症を特徴付ける複雑な相互作用の彼らの潜在的関与やリーシュ マニア原虫遺伝子の機能。BMM の感染症は、寄生虫としての成長、読み出し殺菌一酸化窒素産生、活性酸素種の生成および他の不利な条件など、細胞の生存に影響を与えるホストの要因の影響の定量化を許可します。ライソソーム様 Pv23中が発生しました。マクロファージ感染アッセイは、治療開発13,24の潜在的な抗 leishmanial 薬リードを識別するために利用されています。
BMM 感染症の体外性質は、リーシュ マニア病原性を評価するために他の方法に比べていくつかの利点を提供します。ただし、時間の経過とともに細胞内寄生虫生存のメカニズムを調べるいくつかの以前の研究では、感染率20,21,24は定量化しなかった。さらに、次の時間をかけて生体内で感染症に焦点を当てた多くの研究によってそう寄生虫レプリケーション25,26に間接的にのみ関連が他の生理学的な症状や皮膚病変の長さを測る,27.体内感染寄生生物の毒性を評価するために厳格なアプローチが単独で腫れ足蹠に基づく病変サイズ測定はしばしば不十分で彼らは感染した組織の炎症反応を反映してではなく、寄生虫の絶対数。このため、足蹠ヒメシバの試金が感染した体内寄生虫の負荷の定量化が続いて長い制限希釈を必要とする手順28の試金します。さらに、研究生体内では度々 関心6,8,9,10,の組織を抽出する時に別のポイントで複数の動物を犠牲にします。11,13。 対照的に、ちょうど 1 つの動物から得られる BMMs の数が多いと、これらの細胞は、時間の様々 なポイントで感染症の評価を許可する条件の下でめっきすることが。さらに、生体内での研究と比較すると実験条件をより細かく制御 BMM 感染体外を実行できます。寄生虫自身と一緒に感染するマクロファージの定量化は、感染 (MOI) と培養条件の多様性の正確に制御できます。これらの要因を細かく制御は、離散細胞経路の特性を識別する内感染に与える影響を理解する上でのキーをすることができます。
これらの利点を考えると、それはリーシュ マニア病原性を研究する非常に少数グループがマクロファージの細胞内複製の定量的評価をフルに活用を撮影ところやや意外。この資料では、このアッセイのより広範な利用を妨げる、その適切な実施を促進するステップバイ ステップのプロトコルを提供可能性があります一般的な落とし穴について述べる.精度、汎用性を考慮してここで述べる BMM 感染試験ないのみ利用できるリーシュ マニア病原性に影響を及ぼす宿主-病原体相互作用を探索する内で複製その他の微生物の研究にもマクロファージ29。重要なは、この試金は反 leishmanial 医薬品開発の迅速かつ経済的な前臨床スクリーニング法としても開発できます。
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Protocol
すべての実験手順はケアと実験動物の使用のためのガイドの推奨事項に従って健康の国民の協会によって実施され、メリーランド大学 IACUC によって承認されました。1 4 からのセクションで説明するすべての手順は、生物層流キャビネット内無菌実施されなければなりません。個人用保護具を使用する必要がありますと実験のすべての段階を通してライブリーシュマニア原虫の処理中に注意が必要があります。
1. 分離と骨髄由来マクロファージ (BMMs)8,30,31の分化
- 0:4 - 6 週齢女性C57BL/6または CO2チャンバーのBALB/cマウスを犠牲にし、頚部転位による死を確認します。70% エタノールに浸して保存すると、ハサミ、鉗子の滅菌を確認します。滅菌骨髄細胞分離プロセス全体の処理を許可する 70% のエタノールと手袋をスプレーします。
- 解剖に犠牲にされたマウスのセキュリティで保護されたその前肢を固定することによってボードおびただしく 70% エタノールを噴霧して消毒してください。
- 股関節に近いハサミ小切開 (約 1 cm) を確認します。皮膚の下に別の基になる筋と股関節周りのすべての方法皮膚をカットはさみを慎重に挿入します。
注: 郭清ボードは、股関節への改善されたアクセスを許可するように回転可能性があります。 - 慎重に足首に向かって引いて足から皮膚を deglove し、削除します。足関節は、脛骨は完全にそのまま接合部や足首から下をカットする非常に慎重にされてで足を切断します。
注: この段階で腓骨が緩く接続されているし、鉗子で簡単に分けることができます。 - 手動で回転のポイントを識別するために大腿骨を操作することによって股関節を見つけます。慎重に近位大腿骨頭をそのまま使用するのに股関節上に足を切断するのにハサミを使用します。
- ハサミでできるだけ脚から同様に多くの筋肉や結合組織を削除します。足首と股関節の構造上、余分な骨素材から任意の残りの皮を削除します。
- ペニシリン/ストレプトマイシン (最終濃度 1%) 氷の上にペトリ皿を添加した滅菌に RPMI で掃除の脚の骨を配置します。
- 脛骨と大腿骨他の後ろ足を分離する 1.6 から 1.4 の手順を繰り返します。
- RPMI 鉗子を滅菌と滅菌 #10 ブレードを使用して浸漬骨から残りのすべての筋肉と結合組織を削除します。
- シャーレの蓋に骨を配置します。脛骨を骨髄にアクセスする足関節のすぐ上の刃で慎重にカットします。ひざの関節のすぐ下の切断することによって脚の残りの部分から脛骨を削除します。
- 10 mL 滅菌 RPMI 10 mL 注射器にペニシリン/ストレプトマイシン (最終濃度 1%) を添加した、25 G 針を接続を描画します。
- しっかり脛骨鉗子、垂直方向に氷の上 50 mL コニカル チューブの上。軽く円錐管にもう一方の端から骨髄をフラッシュするのに骨の端に RPMI 約 5 mL を注入するのに注射器を使用します。骨が白くなるまで合計 10 mL RPMI で骨髄をフラッシュします。
注: 徹底洗浄後骨が白きます。されていない場合は、骨髄を削除するフラッシュを続行します。脛骨の遠位端は、小さすぎて針を挿入する場合、刃にトリミングする必要があります。 - 膝関節上とすぐ下の骨髄にアクセスする骨の両端を公開する股関節、大腿骨をすぐにカットします。10 mL RPMI 脛骨と同じ方法での合計で大腿骨の骨髄をフラッシュします。
- クリーニングと残りの骨と 1.13 で 1.6 の手順をフラッシュを繰り返し、単一の 50 mL の円錐管にフラッシュされる骨髄細胞を収集
注: 場合、骨は骨をフラッシュする前に解剖中の任意の時点で中断、この骨から骨髄を使用しないでください。 - 骨髄 300 x g で 4 ° C で 10 分間のすべての 4 つのボーンからフラッシュを収集するために使用される円錐チューブを遠心します。
- BMM の生殖不能媒体の 60 ml (20% の最終的な集中に RPMI FBS、1% ペニシリン/ストレプトマイシン、1.2 mM Na-ピルビン酸、25 μ g/mL 人間 M CSF) 175 cm2細胞培養用フラスコ フィルター キャップ付けに。
- 清次遠心分離を破棄し、フラスコから BMM 培地 5 mL を使用して分注上下による細胞ペレットを再懸濁します。
- 細胞懸濁液を培養用フラスコに転送、最大セル復旧できるように培養用フラスコから BMM 培地で 2 回の円錐管をすすいでください。細胞懸濁液が完全に混合媒体にことを確認し、フィルター キャップ付け第 2 175 cm2細胞培養フラスコに初期 175 cm2細胞培養用フラスコから 30 mL を配布します。
- 37 ° c、5% CO2任意の汚染線維芽細胞、マクロファージと他の付着性のセルの分離を許可する各一晩 30 mL 細胞懸濁液を含む両方のフラスコを孵化させなさい。
- 1 日目:100 x 15 mm 無処理 TC ポリスチレン シャーレ約 10 mL でフラスコから未分化骨髄細胞を含む上清を転送/皿し、, 37 ° C、5% CO2.でフラスコを破棄します。
- 3 または 4 日:各ペトリ皿に (37 ° C に加温) 追加 5 mL BMM 媒体を追加し、37 ° C、5% CO2で潜伏を続けます。
2. めっき Coverslips に BMMs 感染 (7 または 8 日)
- 6 ウェル培養プレートを準備するには、それぞれの空の下にも 4 4 滅菌 12 mm ガラス coverslips (オートクレーブ、密閉ガラス容器に格納される) を配置します。
注: 真空ラインに装着吸引チップで各滅菌 12 mm coverslip をピックアップします。井戸掃除を中断するチューブをつまんでリリース希望の位置に重複なしに coverslips を配置します。 - 吸引メディア (と任意の非付着性のセル) 付着性骨髄でコーティングされたシャーレから派生したマクロファージと優しくすすぎ付着細胞カルシウムとマグネシウム塩化 (PBS-/-) を予め加温なしダルベッコ滅菌リン酸緩衝生理食塩水で 2 倍37 ° c
- 滴下し、5 mL 滅菌 1 最終濃度 1 mM EDTA 各シャーレの-/- x の PBS を追加し、付着 BMMs。 顕微鏡を用いた細胞が切り離されることを確認をデタッチする 37 ° C で 5 分間インキュベートします。
- 50 mL の円錐管に 1 mM EDTA を添加した 1 × PBS-/- で中断すべて剥離細胞を収集します。リンスは各皿 5 ml の PBS-/- 2 x、細胞懸濁液プールに追加します。
注: コレクション プロセス中に EDTA 毒性から大食細胞を保護するために追加の PBS-/- 細胞懸濁液を希釈することがあります。 - 300 x g で 4 ° C で 10 分間遠心上澄みを廃棄し、ピペッティングによるマクロファージを 5-10 mL BMM 媒体で再懸濁します。場所は、細胞への愛着チューブと凝集を防ぐために氷の上を再停止されます。
- 検定でトリパン ブルー色素排除を使用して実行可能なセルを数える。
注: 5 mL の培地で再停止される BMM セルをカウントするには、-/- 445 の μ L の PBS で 30 μ L 0.4% トリパン ブルー溶液 25 μ L の細胞懸濁液の希釈ミックス普通ことを簡単な定量化 (考慮して最終的な計算の 20 倍希釈係数検定).トリパン ブルー (生菌) で染色するでしたされませんセルのみをカウントします。この混合物があまりにも濃縮または希釈、細胞懸濁液の量を変更可能性があります。一般に、BMM の準備当たりの収量は 2 x 107とマウスのシングルから 5 x 10 の7セル間異なります。 - 目的のめっき濃度 (5 x 105/mL) BMM 培地で細胞懸濁液を準備し、それぞれはよく 1 × 106マクロファージを受信するようにウェルあたり 2 mL 中 6 ウェル プレートに懸濁液を分散します。
注: これはすべてのよく取得、coverslips を均一にカバーするマクロファージの十分な数を保証する重要なステップです。井戸 coverslips の重複または媒体でフローティングされていないを確認します。もしそうなら、そっと滅菌ピペット チップで調整します。 - 37 ° C、5% CO2で一晩インキュベートします。
3. L. amazonensisの感染形態の浄化
注: 準備リーシュ マニア感染症 - 定常 promastigote 文化8,13から metacyclic promastigotes の浄化や標準L. amazonensis を使用して amastigote フォームに文化の promastigotes を区別します。無菌分化プロトコル6,8。
-
リーシュ マニア原虫metacyclic promastigotes の精製を用いた密度勾配 media(Materials)33
- 40% 原液滅菌、エンドトキシン フリーの水の密度勾配メディアを準備します。
- M199 培地で 10% 濃度を準備する (血清) なし 10 x M199 中密度勾配ソリューションを希釈します。
- 0.22 μ m のフィルターを通してすべてのソリューションをフィルターします。
注: 4 oC は、もはや闇の中で 1 ヶ月以上の在庫ソリューションを格納できます。 - 15 mL コニカル遠心管の底に 40% 密度勾配メディア溶液 2 mL を追加します。
- 層の 40% の密度勾配メディア層の上に M199 で 10% の密度勾配メディア溶液 2 mL、慎重にパスツール ピペットを使用して 2 つのレイヤー間の任意の混合を回避します。
- 10 分間 1,900 × g で遠心分離によって停滞期文化から 1 x 10 の9の寄生虫を収集します。
- セルで 6 mL ダルベッコ変更重要な媒体 (DMEM) 再懸濁します。
- レイヤー グラデーション メディア層、優しく、レイヤー間の混合を避けるためにパスツール ピペットを使用して 10% の密度の上に直接細胞懸濁液 2 mL。
- 室温で 1,300 x g で 10 分間のグラデーションを遠心します。
注:リーシュ マニア原虫種の物性の違い、それぞれ遠心条件は最大収量を確保するため若干調整する必要があります。 - 上位 10% の密度勾配メディア境界 (0%、10% の密度勾配媒体層間のインターフェイス) で結成から寄生虫 (metacyclic promastigote フォームの濃縮) を収集します。
- DMEM の 1 つのボリュームで寄生虫を希釈し、遠心分離 (室温で 10 分間 1,900 g x) によって収集します。
- 500 μ L DMEM 培地で再懸濁します、収量を定量化する検定でカウントします。
-
L. amazonensis amastigotes 培養条件下での生成 (低 pH/温度を高架)6,8,13
- Amastigote 培地 (pH 4.5) の等量とログ相 promastigote 文化 (pH 7.4 26 oC) のミックス 5 mL は 25 cm2フラスコ (合計 10 mL 中) を使用して、26 の ° C で一晩インキュベートします。
- 26 ° C から 32 ° c. にフラスコをシフトします。
- 3 〜 4 日後の 32 ° C で amastigote メディア文化 1:5 分割します。
- 寄生虫を感染症で使用する準備ができているかどうかを確認する次の 3-4 日 (最大 7 日) にチェックインします。
注: 正常な無菌 amastigotes 表示鞭毛なしの楕円形が必要です。部分的に差別化された amastigotes がある短い鞭毛と大きな楕円形。文化が塊の多くを持っていない - 非成長で、寄生虫を死の徴候が多く群生しています。Amastigote 文化を 1:5 の分割、最大 3 週間維持することができます。
4. l. amazonensisと感染症
- 目的モイ (通常 3-5 metacyclic promastigotes マクロファージ [MOI 1:3、1:5] あたり) とマクロファージ [MOI 1:1] につき 1 amastigote によると寄生虫の懸濁液を希釈します。-/- 50-100 μ L のボリュームで PBS で 2 mL の培地を既に含む各ウェルにリーシュを追加します。
- BMMs amastigotes と metacyclic promastigotes 34 oC 感染症で 3 h 1 h 間インキュベートします。
メモ: 最適な感染温度は種によって異なります。 - 次の孵化、徹底的に洗い流す-/- 無料の寄生虫も 3 x 2 ml の PBS で 37 ° c に予め温めておいた
注: 分散 coverslips がお互いにフロートしないように優しく PBS。プレートを軽く旋回し、液体を吸引します。クロス汚染を避けるために寄生虫の複数の系統を使用している場合は、独立した吸引チップを使用します。 - それぞれの孵化によって 1 h または 3 h の時間ポイント サンプルを修正 2% の 1.5-2 mL でも PFA-/- 10 分のため PBS で洗浄 PBS-/- の 3 倍。最後の洗浄を吸引しないし、染色まで PBS で coverslips を含んでいる版冷蔵庫で冷やします。
- さらにタイム ポイントのプレートの各ウェルに 2 ミリリットル新鮮な BMM 媒体を追加し、34 ° c. で孵化させなさい
- 修正残り時間に応じてポイントで説明 4.3、ステップ、板染色まで冷蔵庫で冷やします。
5. DAPI 染色と Coverslip 取付
- Coverslips を含む井戸から PBS を吸引し、0.1% 非イオン性洗剤で 1.5 mL PBS-/- を追加します。-/- 2 mL の PBS で 3 回洗浄後、室温で 10 分間インキュベートします。
- 2 μ g/ml (水に 5 mg/mL 原液から希釈) DAPI coverslips を含む井戸に 1 mL の PBS-/- を追加し、さらに 1 時間室温で孵化させなさい。
注: DAPI のインキュベーション時間はリーシュ マニア原虫の細胞内の適切な可視化にとって重要です。急速に大食細胞核を染色、その大きいサイズと DNA のためコンテンツが細胞内の寄生虫の核の染色は遅くなります。したがって、BMM 核を視覚化する必要なインキュベーション時間を延長は寄生虫の核膜と寄生虫細胞膜透過に DAPI を許可するため。適切な DAPI 染色、寄生虫のべん毛のポケット近くミトコンドリア キネトプ ラスト DNA も視覚化できます、核の DNA に加え。 - それぞれよく coverslips 3 を含む洗浄 2 mL PBS-/- とそれから、持ち上げて x と下細胞側に置くし、ガラス顕微鏡をマウントする鉗子でフリップ coverslips 市販 antifade 取付試薬とスライドします。
注: Coverslips は非常に壊れやすい、慎重な取り扱いを必要です。特に井戸を持ち上げるときの側壁に対して、それらの圧力を置かないようにします。PBS-/- の数滴を追加する coverslip と井戸の間の表面張力を減らすし、リフティングのプロセスが容易になります。極細針は、井戸の底から coverslips を詮索好きな支援するために使用可能性があります。観察をスライドに配置した後軽く下に押して鉗子でメディアをマウントで気泡を押し出す。観察が壊れているがおそらく持ち上がるプロセス中に反転がマウントされません。予備第 4 coverslip を使用します。 - スライド定量化まで冷蔵庫で冷やします。
6. 感染症の定量化
- イマージョン オイル 100 X 対物レンズを用いたマクロファージに焦点を当て、蛍光顕微鏡下で DAPI 染色スライドを調べる (358 で励起 nm; 461 で最適な発光 nm)。
スライド ガラスと coverslip の大食細胞の層にフォーカスがあることを確認します。 - マクロファージ (大核を DAPI 染色) の数と小さい amastigote 核マクロファージ原子核の周りに群がった数を数値化 (図 2 aDAPI を参照) 各視野を使用して手動のカウンター。
注: Amastigote 核すべて表示ことがあります彼らの小さいサイズのために集中の 1 つの平面に。大食細胞核に焦点を当てたときに表示されるそれらをカウントして寄生虫核マクロファージの核の上下の平面を確認するファインフォーカスを使用します。 - 定量化を繰り返すもう一つのビジョンのフィールドに移動します。別のカウンター キーを使用して、カウント フィールドの数を追跡します。防ぐために各 coverslip で並列で visual フィールドに移動する重複をカウントします。
- Coverslip あたり 200 マクロファージの最小値を定量化します。3 通 (3 coverslips) 感染症のそれぞれの時点を定量化します。前の 1 つがcoverslip の重複、悪い土台、ガラス破損等によるカウントのため適していない場合 4 coverslip をカウントします。
注: 任意の 1 つの coverslip 200 マクロファージにカウントできません、第四にスペアをカウントします。 - Amastigotes/マクロファージまたは amastigotes/100 大食細胞として感染率を計算し、生定量化データから感染させた大食細胞割合を決定します。
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Representative Results
リーシュ マニアは 2 つの感染形 - metacyclic promastigotes procyclic promastigotes から文化の固定相で区別する amastigotes、細胞内ステージ (図 1) であります。L. amazonensisなどのいくつかのリーシュ マニア原虫種の amastigotes 区別できます無菌培養で pH (4.5) および高温 (32 ° C)、BMM PVs の中見つけられるそれらに類似した条件を下げる promastigote セルをシフトすることによって8,34. だけでリーシュ マニア原虫の metacyclic promastigote または amastigote フォームが PVs の形成を誘導してホスト マクロファージ35によって飲み込まれるした後、細胞内で複製することができます。未分化ログ相 promastigotes、非病原性と太陽光発電の形成を促進することはできません(図 2)。
Metacyclic promastigotes 感染、細胞内の寄生虫の数の増加の前に 24 時間遅延は通常です。これは、metacyclic promastigotes がある最初のレプリケーションを開始する前に amastigotes に区別するために発生します。このため、metacyclic promastigotes を使用して開始の感染症は総細胞内寄生虫の数字で、この理由の増加を表示する時間がかかる、長い時間ポイントを培養する必要があります。
図 2 aを表す axenically を使用して成功した感染ファゴゾームとの融合による PVs の形成前に初期感染 (1 h) 後、(赤) はリーシュ マニア原虫の細胞内局在性を示す amastigotes を区別リソソーム。48 時間で複数の寄生虫をかくまっている個別の大規模な PVs を観察できます。PVs の中の寄生虫の数の着実な増加は、毒性の強いリーシュ マニア感染の特徴です。非病原性の強いログ相 promastigotes (図 2 b)、対照的に、太陽光発電開発 (48 h 時間ポイント) を開始できない、レプリケートに失敗、最終的に殺されているホスト マクロファージ内でも対等な数でホストの大食細胞によってとらmetacyclic promastigotes または amastigotes。
このメソッドの有効性を示すためには、我々 に比べて野生型L. amazonensis LMIT1の単一のコピーを含むLMIT1/ΔLmit1寄生虫 (Leishmania Mitochondrial私ロン T ransporter 1) 遺伝子、ミトコンドリア鉄の障害の結果がインポート13。1 つのLMIT1の対立遺伝子の損失ないLMIT1/ΔLmit1 promastigotes におけるミトコンドリアの活動の重要な変更については、か浄化された metacyclic フォーム野生型 promastigotes13と比較した場合の収量を減らします。野生型 (WT) とLMIT1/ΔLmit1固定文化の両方から浄化された metacyclic promastigotes した細胞内寄生虫感染 (後 1 h を定量化に匹敵する数に基づく BMMs の侵入に効果的図 3 a、1 h)。野生型の細胞内の寄生虫の数が着実に増加次の amastigote フォームに分化していく metacyclic promastigotes に対して要求される初期 24 時間の時間のずれ (約 3 倍 72 h 時間ポイントと 24 h の間) だった観察。対照的に、 LMIT1/ΔLmit1寄生虫 (1 h と 72 h 時間ポイント比較) のほとんど、あるいは全くの細胞内増殖を認めた単一LMIT1の対立遺伝子の損失が大きく内側に成長するこの緊張の能力を影響マクロファージ。補完のひずみ (LMIT1/ΔLmit1+LMIT1) LMIT1 蛋白発現の episomal 救出野生型レベル、 LMIT1が amastigote 細胞内の重要なことを確認する細胞内の寄生虫の成長レプリケーションおよび病原性13。
マクロファージ感染症無菌 amastigotes、promastigote 文化をシフトすることによって生成された実施 (ph 7.4; 26 oC) amastigotes 成長条件 (pH 4.5; 32 oC)34,36, 細胞内増殖を示したパターン (図 3 b) 類似 metacyclic promastigotes (図 3 a) で観察します。初期の取り込み (図 3 b、1 h) 野生型 (WT) の同等のレベル、次 LMIT1 補完 (LMIT1/ΔLmit1+LMIT1) amastigotes LMIT1/ΔLmit1 amastigotes 再び着実に増していった細胞内増殖を表示できませんでした。無菌 amastigotes より感染 (MOI 1:1 1:5 metacyclic promastigotes のと比較して)、複製より効率的に PVs の中。
細胞内寄生虫数 (図 3 aで 24 h タイム ポイントと3 bの間比較) の増加がある前に、我々 のデータは metacyclic promastigote 感染症の初期の 24 h 遅延を示します。ラグは、まず複製を開始する前に amastigotes に区別するために内面の metacyclic promastigotes に必要な時間を表します。1 つの共通の間違いの人々 metacyclic promastigotes を使用して、感染するときは、十分に長く待つではありません。病原性の変化を抜本的なしない場合は、72 時間を作り出すはるかに信頼できる決定ではなく、96 h 以上を実験しました。
図 1: 様々 なl. amazonensisライフ ステージの電子顕微鏡写真の画像をスキャンします。ログ相 promastigote、停滞期と無菌 amastigote から metacyclic の promastigote。バー = 10 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: BMM 感染病原性無菌 amastigotes (A) と (B) l. amazonensisの非病原性ログ相 promastigotes の代表図。感染 48 h、1 h BALB/cマウスから分離したマクロファージの蛍光画像。プロトコルで説明するよう、感染させた大食細胞は蛍光抗体法の処理されました。PV 膜染色によるラット抗マウス Lamp1 モノクローナル抗体 (1:1, 000 の希釈) 1 h、蛍光抗うさぎ IgG (1: 500 希釈) で 1 時間培養。無菌L. amazonensisに対して生成されたマウス抗体と coverslips の孵化によって寄生虫染色を行った amastigotes、続いて抗マウス IgG 赤染料 (1: 500 希釈) 6。すべて coverslips は核を染色 DAPI でさらに処理しました。(A) 48 h 時点で複数の amastigotes をかくまっている個別の PVs の形成は、無菌 amastigotes 成功したリーシュ マニア感染の特徴です。(B) 異なる PV 形成と 48 時間の時点で amastigotes を複製するの不在は、promastigotes ログ相培養から病原性の欠如を象徴します。赤字はアンチ - アンチ Lamp1 を示しますリーシュ マニア原虫の染色、緑、青は DAPI 染色 DNA を示しますと黄色を示します抗 Lamp1 のマージ、DAPI の汚れ。バー、5 μ m。この図は、B. et al., 2013 Mittra から変更されています。J. Exp. Medに掲載されたもの。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: LMIT1/Δlmit1寄生虫の突然変異体の細胞内の増殖にインパクトを与える 1 つのLMIT1の対立遺伝子の削除します。BMM 感染していた示されたのL.amazonensisとすぐに修正または 24 のために更に孵化、48 または 72 h が修正され、前に染色 DAPI と細胞内の寄生虫の数は顕微鏡的に定められました。(A) BMMs 精製野生型 (WT) 単一ノックアウト (LMIT1/Δlmit1) に感染していたと 3 h の単一ノックアウト (LMIT1/Δlmit1 + LMIT1) metacyclic promastigotes (MOI 1:5) を補完して即座に修正されたり培養さらに示された時間のポイント、および細胞内の寄生虫の数の決定した顕微鏡。データは帳票の決定の平均 ± SD を表し、3 つの独立実験の結果の代表です。印はWT ・ LMIT1/Δlmit1寄生虫間感染に有意差 (スチューデントの両側t -テスト 48 h、 p = 0.017; 72 h、 p = 0.008)。(B)補完単一ノックアウト (LMIT1/Δlmit1 + LMIT1) 文化、単一ノックアウト (LMIT1/Δlmit1) 野生型 (WT) から無菌 amastigotes BMMs. に感染する能力を調べた 1 BMMs が感染しました。h (MOI 1:1) とどちらかが即座に修正 (1 h) 後さらに 24 のインキュベーション、48 または 72 h、および細胞内の寄生虫の数は決定された顕微鏡または。データは帳票の決定の平均 ± SD を表し、以上の 3 つの独立実験の代表です。P 値 (スチューデントの両側 t 検定) をそれぞれのグループの間に表示されます。この図は、B. et al., 2016 Mittra から変更されています。PloS Pathogに掲載されたもの。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
上記、BMM 感染試験によって生成された定量的データにより、感染率と比較的短い期間 (最長 2 週間、2 に比べて病原性の変化の信頼性の決定を取得します。ヶ月生体内で実験に必要な)。このメソッドは、DNA 特定色素 DAPI、特にマクロファージと寄生虫の核を汚れと感染細胞の迅速な同定及び定量化に依存します。比較では、ギムザなどの他の汚れは強さを変化させて、複雑な視覚分析37多数の異なる細胞コンポーネントにバインドします。DAPI を使用細胞内寄生虫・携帯から明確な区別の認識構造 (唯一の宿主細胞の核が染色もとのサイズが桁違い寄生虫核より大きい)、簡単かつ迅速にできるように感染症の定量化。
任意の実験プロシージャと同様、このメソッドはいくつかの制限といくつかの重要な手順を慎重に実行を必要とします。生体内でリーシュ マニア感染症には、貪食能、感染症38の究極のコースを決定する前に複雑な生得の免疫反応が含まれます。モデル マウス株の選択は、したがっての研究デザインは非常に重要です。自然耐性関連マクロファージ蛋白質 (Nramp1)、Fe2 + Mn2 +を移行陽子排出ポンプの遺伝子のこのプロトコルのクマの突然変異のC57BL/6およびBALB/cマウス株大食細胞リソソーム/細胞質へのファゴライソゾームからのイオン。これは、結果、マクロファージ8,30,31のエンドサイトーシスのコンパートメント内で複製病原体に対する感受性の増加。マクロファージの成功植民地化は、マクロファージ活性化39,40の抑制/生き残るために免疫応答を操作する感染性リーシュマニア原虫のユニークな能力によっても異なります。リーシュ マニアBMM 感染症幾分模倣に使用分化マクロファージ体内のマクロファージ、しかし、アッセイの非活性化状態における病原性に影響を与えるホスト コンポーネントのはるかに複雑なセットについては考慮しません動物モデル。
健康的な感染性リーシュ マニア原虫フォームの分離は、正確な病原性を決定するための他の絶対に重要な要件です。すべてリーシュ マニア原虫株のすべての promastigotes は amastigotes 低 pH に服従させたときに効率的に区別/高温条件41。したがって、感染症、固定 promastigote 文化から精製した metacyclic promastigotes としばしば行われて。Metacyclic promastigotes を効果的に特定するには、いくつかの浄化戦略を lipophosphoglycan (LPG) の大幅な変更を含む異なった生命段階で、寄生虫の表面の糖衣の変化する組成の活用構造42,43,44。たとえば、ピーナッツ凝集素 (PNA)、procyclic がない metacyclic LPG に選択的に結合するレクチン使用されています効果的に否定的な選択のプロトコルの主要な L. metacyclic promastigotes45を浄化します。L. amazonensis metacyclic promastigote 浄化戦略は通常、metacyclic でアクセス可能な特定の表面蛋白質エピトープをターゲットに procyclic promastigotes を凝集することがでくモノクローナル抗体 mAb3A.1 を含む表面の糖衣の変更8,13,32原因で形成されます。寄生虫表面配位子の種特異的な変動に依存しないために、浮揚性の密度のステージ固有の相違に基づく promastigotes から metacyclic promastigotes を分離する密度勾配メディアの使用は魅力的な方法です。主要な L. metacyclic promastigote 浄化33、当初説明されている、このメソッドは、正常に中に遠心分離の状態の変更を中心にその他のいくつかのリーシュ マニア原虫種に採用されています密度勾配沈降46,47,48,は49。
また、プロセスのいくつかの手順が発生するアッセイの実装が複雑になる点に注意することが重要です。これらの問題は、BMM 抽出、次の抽出、矛盾したマクロファージめっき、寄生虫感染形態の不完全な浄化、貧しいまたは一貫性のない感染症 BMMs の失敗の分化時に汚染を含めることができ、顕微鏡のスライド ガラス coverslips を取り付けの難しさ。これらの可能性はプロトコルでは、対処されているし、問題を識別するために感染症の手順の各ステップを慎重に評価することによって解決することがあります。たとえば、BMM 文化の分化過程の汚染抽出中に改良された生殖不能の技術の必要性を示します。純度、精製試薬の新鮮さおよび浄化のプロトコルの正確な実装に注意可能性があります失敗したまたは不完全な浄化目的の寄生虫の形態の是正するため。貧しい人々 や一貫性のない感染症寄生虫または高すぎるか低すぎて特定の実験条件は、MOI の不正確な定量化による可能性があります。次の抽出、操作およびガラス coverslips をマウントは間違いなくこのテクニックで最も技術的に挑戦的なプロセス個人は、彼らは、coverslips の取り扱いを容易にするさまざまなツールを使用することを好むかもしれません。核を染色 DAPI の明確に可視化は、顕微鏡下でカウント正確な寄生虫にとって重要です。かすかな染色と不適切な焦点は、一貫性のない数量の背後にある 2 つの主な原因です。これは、品質コントロール、DAPI 染色手順、写真漂白、減らすために露光時間を制限する、すぐにフィールドにすべての寄生虫核を考慮する客観的のフォーカスを変更するが確保できます。洗剤、サンプルの適切な透過を確保することによって、DAPI 染色工程の濃度を増やすことによって、DAPI の蛍光明るさを改善もできます。定量化プロセスを容易にすることができます別の方法は、顕微鏡検査の中にサンプルのデジタル画像を取得します。画像は後で定量化のため使用することができます、検証/独立した調査官によって定量化することができます。ただし、注意が必要ですこのプロセスに関連付けられている技術的な問題があります。PV の球面の性質のため、寄生虫が必ずしも同じ焦点面に。これは、複数の画像を必要と顕微鏡フィールドごとに異なる焦点面を使用してを取得し、その後すべての寄生虫のアカウントに組み立てた。それ以外の場合、写真から定量化は非常に誤解を招くことができます。マクロファージ/フィールド、および amastigotes/フィールドの計算は、めっきと寄生虫の広がりの一貫したマクロファージが感染時に達成されたことを確認する重要です。BMMs は完全に分化した細胞であるので、時間をかけて自分の番号必要も増えません。ホスト マクロファージの数は時間の経過と共に増加する場合は、マクロファージがまだ成熟されていないことを意味します。その場合は、ソースと M 脳脊髄液の濃度をチェックしなければなりません。パーセント感染させた大食細胞の定量は細胞病原体の相互作用、特にパーセント感染症と寄生虫の負荷が同様の傾向20,21 に従っていない場合に、ホストの包括的なビューを提供する便利なことができます。.
ここで詳細な BMMの in vitro感染症法実験の特定のニーズに合わせて変更できます。BMM 抽出と分化、寄生虫感染形態の精製と体外マクロファージ感染症として別の実装する感染症の定量化 - プロセスの基本的な手順のいずれかに変更があります。モアと感染との時間ポイントの期間を調整することを分析しました。文化メディア コンポーネントは、補充または特定の栄養素の枯渇のいずれかを介して簡単に変更こともでき、複数の異なる系統または寄生虫の形態を同時に評価することができます。これらの変更は技術的なプロシージャの追加調整を必要があります。たとえば、amastigote 準備と metacyclic promastigote の精製の手順は様々 なリーシュ マニア原虫種の間で変わる予定としています。DAPI、ほか追加蛍光染料または寄主-寄生者相互作用プロセス6,24の包括的な範囲を可視化する蛍光タグ細胞成分に利用されるかもしれない。また、このアッセイは、化合物ライブラリーのスクリーニングのリーシュ マニア症24を治療するための新しい、効果的な薬物リードを識別するためにできるようになる高スループット システム (HTS) 形式に合わせることができます。
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Disclosures
著者は、彼らは競合の金銭的な利益がある宣言します。
Acknowledgments
この作品は、国立衛生研究所健康付与 RO1 AI067979 NWA によって支えられました。
有限会社は、学部の交わりからハワード ヒューズ医学研究所/大学のメリーランド州カレッジパークの受信者です。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
6 well cell culture plate | Cellstar | 657160 | |
Adenine | Acros Organics | AC147440250 | |
Aerosol Barrier Pipet Tips (100-1000 μL) | Fisherbrand | 02-707-404 | |
Aerosol Barrier Pipet Tips (20-200 μL) | Fisherbrand | 02-707-430 | |
Aerosol Barrier Pipet Tips (2-20 μL) | Fisherbrand | 02-707-432 | |
Bard-Parker Rib-Back Carbon Steel Surgical Blade #10 | Aspen Surgical | 371110 | |
BD Luer-Lok Tip 10 mL Syringe | Becton Dickinson (BD) | 309604 | |
BD Precisionglide Needle, 25G | Becton Dickinson (BD) | 305124 | |
Cell Culture Dish 35 mm x 10 mm | Cellstar | 627 160 | |
Cell Culture Flask | Cellstar | 660175 | |
Cover Glasses: 12 mm circles | Fisherbrand | 12-545-80 | |
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
D-Biotin | J.T. Baker | C272-00 | |
EDTA | Sigma Aldrich | EDS | |
Ethyl alcohol 200 proof | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
Falcon 100 mm x 15 mm non-TC-treated polystyrene Petri dish | Corning | 351029 | |
Fetal Bovine Serum | Seradigm | 1500-500 | |
Ficoll400 | Sigma Aldrich | F8016 | |
Fluorescence Microscope | Nikon | E200 | |
Goat anti-mouse IgG Texas red | Invitrogen | T-862 | |
Goat anti-rabbit IgG AlexaFluor488 | Invitrogen | A-11034 | |
Hemin | Tokyo Chemical Industry Co. LTD | H0008 | |
HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
Isoton II Diluent | Beckman Coulter | 8546719 | |
L-Glutamine | Gemini | 400-106 | |
Medium 199 (10X) | Gibco | 11825-015 | |
Na pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360-070 | |
Paraformaldehyde | Alfa Aesar | 43368 | |
Penicillin/Streptomycin | Gemini | 400-109 | |
Phosphate Buffered Saline (-/-) | ThermoFisher | 14200166 | |
Polypropyline conical Centrifuge Tubes 15 mL | Cellstar | 188 271 | |
Polypropyline conical Centrifuge Tubes 50 mL | Cellstar | 227 261 | |
ProLong Gold antifade reagent | ThermoFisher | P36930 | |
Rat anti-mouse Lamp-1 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 1D4B | |
Recombinant Human M-CSF | PeproTech | 300-25 | |
Reichert Bright-Line Hemocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
RPMI Medium 1640 (1X) | Gibco | 11875-093 | |
Triton X-100 Surfactant | Millipore Sigma | TX1568-1 | |
Trypan Blue | Sigma Aldrich | T8154 | |
Delicate Scissors, 4 1/2" | VWR | 82027-582 | |
Dissecting Forceps, Fine Tip | VWR | 82027-386 | |
Microscope Slides | VWR | 16004-368 | |
Z1 Coulter Particle Counter, Dual Threshold | Beckman Coulter | 6605699 |
References
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