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Immunology and Infection

मैक्रोफेज के अंदर Intracellular विकास के ठहराव के डाह के आकलन के लिए एक तेज और विश्वसनीय विधि है Leishmania परजीवी

Published: March 16, 2018 doi: 10.3791/57486
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Cell Biology and Molecular Genetics, University of Maryland

Summary

सभी रोगजनक Leishmania प्रजातियों में रहते है और उनके हड्डीवाला मेजबान के मैक्रोफेज अंदर दोहराने । यहां, हम Leishmaniaके साथ संस्कृति में murine अस्थि मज्जा-व्युत्पंन मैक्रोफेज को संक्रमित करने के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद, intracellular वृद्धि कैनेटीक्स के सटीक ठहराव द्वारा पीछा किया । यह विधि होस्ट-रोगज़नक़ संपर्क और Leishmania डाह को प्रभावित करने वाले व्यक्तिगत कारकों का अध्ययन करने के लिए उपयोगी है ।

Abstract

Leishmaniaका जीवनचक्र, लीशमनियासिस का प्रेरणा का एजेंट, क्रमशः कीट और हड्डीवाला होस्ट्स के अंदर promastigote और amastigote चरणों के बीच वैकल्पिक । लीशमनियासिस के रोगजनक लक्षण व्यापक रूप से भिन्न हो सकते हैं, सौम्य त्वचा के घावों से अत्यधिक घातक आंत रोग रूपों के लिए संक्रमित प्रजातियों के आधार पर, सभी Leishmania प्रजातियों के हड्डीवाला चरण के दौरान मेजबान मैक्रोफेज अंदर रहते हैं उनका जीवनचक्र । Leishmania infectivity इसलिए सीधे अपने आक्रमण, जीवित और PVs अंदर parasitophorous रिक्तिकाएं (मैक्रोफेज) के भीतर दोहराने की क्षमता से संबंधित है । इस प्रकार, को दोहराने intracellularly है परजीवी की क्षमता का आकलन डाह निर्धारित करने के लिए एक भरोसेमंद विधि के रूप में कार्य करता है । पशु मॉडलों का उपयोग कर लीशमनियासिस विकास का अध्ययन समय लेने वाली है, थकाऊ और अक्सर मुश्किल है, विशेष रूप से pathogenically महत्वपूर्ण आंत रूपों के साथ. हम यहां एक पद्धति का वर्णन करने के लिए अस्थि मज्जा-व्युत्पंन मैक्रोफेज (BMMs) में Leishmania के intracellular विकास का पालन करें । Intracellular परजीवी संख्या 72 के लिए 24 एच अंतराल पर निर्धारित कर रहे है-96 एच निंनलिखित संक्रमण । इस विधि में Leishmania डाह पर विभिंन आनुवंशिक कारकों के प्रभाव का एक विश्वसनीय दृढ़ संकल्प के लिए अनुमति देता है । एक उदाहरण के रूप में, हम बताते है कि कैसे Leishmania Mitochondrial आयरन ट्रांसपोर्टर जीन (LMIT1) के एक एकल एलील विलोपन Leishmania amazonensis उत्परिवर्ती तनाव LMIT1/ΔLmit1 की क्षमता बिगड़ती BMMs अंदर बढ़ने के लिए, जंगली प्रकार की तुलना में डाह में भारी कमी को दर्शाती है । यह परख भी प्रयोगात्मक शर्तों के सटीक नियंत्रण की अनुमति देता है, जो व्यक्तिगत रूप से विभिंन कारकों के प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए हेरफेर किया जा सकता है (पोषक तत्वों, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों, आदि) मेजबान रोगज़नक़ बातचीत पर । इसलिए, उचित निष्पादन और ठहराव बीएमएम संक्रमण के अध्ययन के एक गैर इनवेसिव, तेजी से, किफायती, सुरक्षित और विश्वसनीय पारंपरिक पशु मॉडल अध्ययन के लिए विकल्प प्रदान करते हैं ।

Introduction

लीशमनियासिस जीनस Leishmaniaके प्रोटोजोआ परजीवी प्रजातियों की वजह से मानव रोगों की एक व्यापक स्पेक्ट्रम को संदर्भित करता है । लगभग १२,०००,००० लोग वर्तमान में दुनिया भर में Leishmania से संक्रमित हैं, और ३५०,०००,००० से अधिक खतरे में हैं । रोग विकृति Leishmania प्रजातियों पर और मेजबान कारकों पर निर्भर करता है, और लक्षण अहानिकर आत्म चिकित्सा त्वचा घावों से घातक visceralizing रूपों के लिए बदलती हैं । अगर अनुपचारित, आंत लीशमनियासिस घातक है, केवल एक प्रोटोजोआ परजीवी के साथ संक्रमण की वजह से घातक मानव रोग के रूप में मलेरिया के बाद रैंकिंग1. रोग विकृति और लक्षणों में व्यापक मतभेद के बावजूद, सभी Leishmania प्रजातियों में एक digenic जीवन चक्र promastigote और amastigote के बीच बारी-साइकिल है कीट और हड्डीवाला मेजबान के अंदर चरणों, क्रमशः । रीढ़ के अंदर, Leishmania लक्ष्य मेजबान मैक्रोफेज आक्रमण के लिए और parasitophorous रिक्तिकाएं (PVs) के गठन के लिए प्रेरित, phagolysosomes के गुणों के साथ अंलीय डिब्बों जहां उच्च विषमय amastigote रूपों दोहराने । Amastigotes पुराने संक्रमण के दौरान मेजबान ऊतकों में जारी रहती है और संक्रमित sandflies को आगे पारित किया जा सकता है, संचरण चक्र को पूरा करने. इसलिए, मानव रोग विकास के संदर्भ में, amastigotes सबसे महत्वपूर्ण Leishmania जीवनचक्र प्रपत्र2हैं । जांच कैसे amastigotes मैक्रोफेज PVs अंदर दोहराने के लिए महत्वपूर्ण है Leishmania डाह समझ3,4,5,6,7 और के लिए उपन्यास प्रभावोत्पादक उपचारों का विकास ।

हम यहां एक नियमित रूप से हमारी प्रयोगशाला द्वारा उपयोग के लिए अस्थि मज्जा में Leishmania संक्रमण और प्रतिकृति अध्ययन-व्युत्पंन मैक्रोफेज (BMMs) है, जो समय के साथ intracellular Leishmania की संख्या का मात्रात्मक आकलन शामिल है एक विधि का वर्णन । प्रक्रिया माउस अस्थि मज्जा और मैक्रोफेज को संस्कृति में भेदभाव से monocytes की कटाई शामिल है, इन विट्रो में संक्रमण के साथ संक्रमित रूपों (metacyclic promastigotes या amastigotes) के Leishmania और ठहराव के 72-96 एच निम्नलिखित संक्रमण की अवधि के लिए हर 24 एच अंतराल पर intracellular परजीवी की संख्या । यह परख हमारी प्रयोगशाला में इस्तेमाल किया गया है कई पर्यावरणीय कारकों और परजीवी जीन के प्रभाव को निर्धारित करने में आयरन की महत्वपूर्ण भूमिका की पहचान सहित एल amazonensis डाह कि आगे footpad द्वारा मांय किया गया था चूहों में घाव विकास अध्ययन6,8,9,10,11,12,13,14,15 . के बाद से सभी रोगजनक Leishmania प्रजातियों मेजबान मैक्रोफेज के अंदर अपने प्रतिकृति आला स्थापित, इस परख सार्वभौमिक सभी Leishmania प्रजातियों में डाह निर्धारण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

बीएमएम संक्रमण प्रदर्शन एक सेल स्तर पर मेजबान-परजीवी बातचीत के विश्लेषण की अनुमति देता है, और इस प्रकार कैसे Leishmania परजीवी अपने पसंदीदा मेजबान microenvironment, मैक्रोफेज के PVs के साथ बातचीत की एक और अधिक व्यापक समझ । मैक्रोफेज संक्रमण परख सफलतापूर्वक कई समूहों द्वारा इस्तेमाल किया गया है16,17,18,19,20,21,22 का पता लगाने के लिए दोनों मेजबान मैक्रोफेज और Leishmania विशिष्ट जीन के कार्य, और उनके जटिल खेल है कि intracellular संक्रमण की विशेषता में संभावित भागीदारी । बीएमएम संक्रमण intracellular अस्तित्व, microbicidal नाइट्रिक ऑक्साइड उत्पादन, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों और अन्य प्रतिकूल परिस्थितियों की पीढ़ी के रूप में प्रभावित है कि मेजबान कारकों के प्रभाव के एक पढ़ें-बाहर के रूप में परजीवी विकास की अनुमति ठहराव lysosome के अंदर पडा-जैसे PVs23। मैक्रोफेज संक्रमण परख भी क्षमता विरोधी leishmanial दवा की पहचान करने के लिए उपयोग किया गया है चिकित्सीय विकास13,24के लिए सुराग ।

बीएमएम संक्रमण के इन विट्रो प्रकृति Leishmania डाह का आकलन करने के लिए अन्य तरीकों पर कई लाभ प्रदान करता है । हालांकि, कई पिछले समय के साथ intracellular परजीवी अस्तित्व के तंत्र की जांच अध्ययन एक दर20,21,24के रूप में संक्रमण नहीं है । इसके अलावा, कई समय के साथ vivo संक्रमण में निंनलिखित पर ध्यान केंद्रित अध्ययन त्वचा के घावों का आकार और अंय शारीरिक लक्षण है कि केवल परोक्ष रूप से परजीवी प्रतिकृति25,26 से संबंधित है मापने के द्वारा किया था , 27. vivo में संक्रमण परजीवी डाह का आकलन करने के लिए एक कड़े दृष्टिकोण है, लेकिन footpad सूजन के आधार पर घाव का आकार माप अक्सर अपर्याप्त हैं, के रूप में वे संक्रमित ऊतकों में भड़काऊ प्रतिक्रिया को प्रतिबिंबित नहीं है और परजीवी की निरपेक्ष संख्या । इस कारण से, footpad घावों के विकास के लिए परख संक्रमित ऊतकों, एक प्रक्रिया है कि लंबे कमजोर पड़ने परख28सीमित की आवश्यकता होती है में परजीवी लोड के ठहराव द्वारा पीछा किया जाना है । इसके अतिरिक्त, vivo में अध्ययन अक्सर विभिंन बिंदुओं पर कई जानवरों का त्याग शामिल करने के लिए ब्याज की ऊतकों को निकालने के लिए समय में6,8,9,10, 11 , 13. इसके विपरीत, BMMs की बड़ी संख्या सिर्फ एक जानवर से प्राप्त की जा सकती है, और इन कोशिकाओं को शर्तों के तहत चढ़ाया जा सकता है जो समय में विभिन्न बिंदुओं पर संक्रमण के आकलन की अनुमति देते हैं । इसके अलावा, vivo अध्ययनों में की तुलना में, इन विट्रो बीएमएम संक्रमण में प्रदर्शन प्रयोगात्मक शर्तों पर अधिक से अधिक नियंत्रण की अनुमति देता है । मैक्रोफेज को बढ़ाता है परजीवी के साथ साथ संक्रमित होने के लिए खुद को संक्रमण की बहुलता (MOI) और संस्कृति की स्थिति का सटीक नियंत्रण की अनुमति देता है । इन कारकों पर ठीक नियंत्रण असतत सेलुलर रास्ते की विशेषताओं की पहचान करने में और संक्रमण के पाठ्यक्रम पर उनके प्रभाव को समझने में महत्वपूर्ण हो सकता है ।

इन फायदों को देखते हुए यह कुछ हद तक आश्चर्य की बात है कि Leishmania डाह का अध्ययन बहुत कुछ समूहों अब तक मैक्रोफेज में intracellular प्रतिकृति के मात्रात्मक मूल्यांकन का पूरा लाभ लिया है । इस अनुच्छेद में, हम आम नुकसान है कि इस परख के अधिक व्यापक उपयोग में बाधा हो सकती है चर्चा, और एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल प्रदान करने के लिए इसके समुचित कार्यांवयन की सुविधा । अपनी सटीक और बहुमुखी प्रतिभा को ध्यान में रखते हुए, बीएमएम संक्रमण परख हम यहां का वर्णन केवल मेजबान-रोगज़नक़ Leishmania डाह को प्रभावित करने वाली बातचीत का पता लगाने का उपयोग नहीं किया जा सकता है, लेकिन यह भी अंय सूक्ष्मजीवों कि अंदर दोहराने अध्ययन के लिए मैक्रोफेज29. महत्वपूर्ण बात यह है कि इस परख को एंटी leishmanial ड्रग डेवलपमेंट के लिए तीव्र और किफायती पूर्व नैदानिक जांच पद्धति के रूप में भी विकसित किया जा सकता है ।

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Protocol

सभी प्रायोगिक प्रक्रियाओं के अनुसार स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा देखभाल और प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग के लिए गाइड में सिफारिशों के साथ आयोजित की गई और मैरीलैंड के IACUC विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया । सभी कदम 1 से 4 वर्गों में वर्णित जैविक लामिना प्रवाह अलमारियां अंदर aseptically बाहर किया जाना चाहिए । व्यक्तिगत सुरक्षा इस्तेमाल किया जाना चाहिए, और सावधानी प्रयोग के सभी चरणों में रहते हैं Leishmania परजीवी की हैंडलिंग के दौरान व्यायाम किया जाना चाहिए.

1. अलगाव और अस्थि मज्जा के भेदभाव-व्युत्पंन मैक्रोफेज (BMMs)8,30,31

  1. दिन 0: एक सह2 चैंबर में बलिदान 4-6 सप्ताह पुरानी महिला C57BL/ या बालब माउस और ग्रीवा अव्यवस्था के माध्यम से मौत की पुष्टि करें । उन्हें ७०% इथेनॉल में भिगोकर रखने से कैंची और संदंश की नसबंदी सुनिश्चित हो जाती है. 70% इथेनॉल के साथ स्प्रे दस्ताने अस्थि मज्जा सेल अलगाव की प्रक्रिया में बाँझ हैंडलिंग की अनुमति दें ।
  2. सुरक्षित अपनी forelimbs पिन और 70% इथेनॉल के साथ copiously छिड़काव द्वारा विच्छेदन बोर्ड के लिए बलिदान माउस ।
  3. संयुक्त कूल्हे के पास कैंची के साथ एक छोटा सा चीरा (के बारे में 1 सेमी) बनाओ । ध्यान से अंतर्निहित मांसपेशियों को अलग करने के लिए त्वचा के नीचे कैंची डालें और कूल्हे के चारों ओर त्वचा काट सभी तरह से संयुक्त ।
    नोट: विच्छेदन बोर्ड संयुक्त कूल्हे के लिए सुधार की पहुंच की अनुमति के लिए घुमाया जा सकता है ।
  4. ध्यान से टखने की ओर खींच और हटाने के द्वारा पैर से त्वचा के दस्ताने । टखने में बंद पैर कट, बहुत से कम या टिबिया पूरी तरह से बरकरार छोड़ने के लिए संयुक्त टखने के नीचे कटौती सावधान किया जा रहा है ।
    नोट: इस स्तर पर बहिर्जंघिका शिथिल संलग्न है और आसानी से संदंश के साथ अलग किया जा सकता है ।
  5. मैन्युअल रूप से फीमर रोटेशन के बिंदु की पहचान करने के लिए जोड़ तोड़ से कूल्हे का पता लगाएं । ध्यान से फीमर बरकरार के समीपस्थ सिर छोड़ने के लिए संयुक्त कूल्हे के ऊपर पैर विच्छेद करने के लिए कैंची का उपयोग करें ।
  6. कैंची के साथ पैर से संभव के रूप में ज्यादा मांसपेशियों और संयोजी ऊतक के रूप में निकालें । टखने से किसी भी शेष त्वचा निकालें और संयुक्त कूल्हे के ऊपर किसी भी अतिरिक्त हड्डी सामग्री ।
  7. एक पेट्री डिश में बर्फ पर streptomycin (1% अंतिम एकाग्रता) के साथ पूरक बाँझ RPMI में साफ पैर हड्डियों रखें ।
  8. टिबिया और फीमर को दूसरे हिंद पैर से अलग करने के लिए 1.6 से 1.4 चरणों को दोहराएं ।
  9. निष्फल संदंश और बाँझ #10 ब्लेड का उपयोग RPMI में भिगोने हड्डियों से किसी भी शेष मांसपेशी और संयोजी ऊतक निकालें ।
  10. पेट्री डिश के ढक्कन पर हड्डियां लगाएं । मज्जा का उपयोग करने के लिए संयुक्त टखने के ऊपर तुरंत ब्लेड के साथ टिबिया ध्यान से काटें । टिबिया को तुरंत घुटने के जोड़ से काट कर टांग के बाकी हिस्सों से निकाल लें ।
  11. ड्रा 10 मिलीलीटर बाँझ RPMI एक 10 मिलीलीटर सिरिंज में पेनिसिलिन/streptomycin (1% अंतिम एकाग्रता) के साथ पूरक और एक 25G सुई देते हैं ।
  12. बर्फ पर एक 50 मिलीलीटर शंकु ट्यूब पर खड़ी संदंश के साथ मजबूती से टिबिया पकड़ो । सिरिंज का उपयोग करने के लिए धीरे अस्थि मज्जा फ्लश शंकु ट्यूब में दूसरे छोर से बाहर करने के लिए हड्डी के अंत में लगभग 5 मिलीलीटर RPMI इंजेक्षन करने के लिए । 10 मिलीलीटर RPMI की कुल के साथ अस्थि मज्जा फ्लश जब तक हड्डी सफेद हो जाता है ।
    नोट: पूरी तरह से निस्तब्धता के बाद, हड्डी सफेद बारी चाहिए । यदि नहीं, तो मज्जा निकालने के लिए निस्तब्धता जारी रखें । टिबिया के बाहर का अंत ब्लेड के साथ वापस छंटनी की आवश्यकता हो सकती है अगर यह भी सुई डालने के लिए संकीर्ण है ।
  13. फीमर तुरंत घुटने संयुक्त और तुरंत कूल्हे के नीचे हड्डी के दोनों सिरों को उजागर करने के लिए मज्जा का उपयोग नीचे कट । टिबिया के रूप में एक ही फैशन में 10 मिलीलीटर RPMI की कुल के साथ फीमर से फ्लश अस्थि मज्जा ।
  14. दोहराएं सफाई और फ्लश कदम 1.6 के माध्यम से 1.13 शेष हड्डियों के साथ और एक एकल 50 एमएल शंकु ट्यूब में अस्थि मज्जा फ्लश कोशिकाओं को इकट्ठा
    नोट: हड्डी निस्तब्धता से पहले विच्छेदन के दौरान किसी भी बिंदु पर एक हड्डी टूट जाता है, इस हड्डी से मज्जा का उपयोग नहीं करते.
  15. शंकु ट्यूब 4 डिग्री सेल्सियस पर 300 x जी में 10 मिनट के लिए सभी चार हड्डियों से निकाली अस्थि मज्जा एकत्र करने के लिए इस्तेमाल किया केंद्रापसारक
  16. बाँझ बीएमएम मध्यम के 60 मिलीलीटर प्लेस (20% FBS, 1% पेनिसिलिन/streptomycin, 1.2 mM Na-पाइरूवेट, 25 µ g/एमएल मानव एम-सीएसएफ के अंतिम एकाग्रता के साथ RPMI) एक 175 सेमी2 सेल संस्कृति कुप्पी में फ़िल्टर कैप के साथ ।
  17. supernatant निंनलिखित केंद्रापसारक त्यागें और ऊपर कोमल और नीचे pipetting कुप्पी से बीएमएम मध्यम के 5 मिलीलीटर का उपयोग करके सेल गोली reसस्पेंड ।
  18. संस्कृति कुप्पी के लिए स्थानांतरण सेल निलंबन और बीएमएम माध्यम के साथ दो बार शंकु ट्यूब संस्कृति कुप्पी से कुल्ला करने के लिए अधिक से अधिक सेल वसूली सुनिश्चित करते हैं । सुनिश्चित करें कि सेल निलंबन अच्छी तरह से मध्यम में मिलाया है और प्रारंभिक 175 सेमी2 सेल संस्कृति कुप्पी से 30 मिलीलीटर एक दूसरे 175 सेमी2 फिल्टर कैप के साथ सेल संस्कृति कुप्पी के लिए वितरित ।
  19. प्रत्येक रात को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% CO2 में से 30 मिलीलीटर सेल सस्पेंशन युक्त दोनों कुप्पी को किसी भी दूषित fibroblasts, निवासी मैक्रोफेज, और अंय अनुयाई कोशिकाओं के पृथक्करण की अनुमति दें ।
  20. दिन 1: के लिए 100 मिमी x 15 मिमी गैर-टीसी-polystyrene पेट्री व्यंजन लगभग 10 मिलीलीटर/डिश और मशीन पर 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सह में इलाज के लिए बोतल से supernatant विभेदक अस्थि मज्जा कोशिकाओं से युक्त स्थानांतरण2। कुप्पी को त्यागें ।
  21. दिन 3 या 4: एक अतिरिक्त 5 मिलीलीटर बीएमएम मध्यम जोड़ें (37 डिग्री सेल्सियस से पूर्व) प्रत्येक पेट्री डिश के लिए और 37 ° c, 5% CO2पर मशीन जारी रखें ।

2. संक्रमण के लिए Coverslips पर चढ़ाना BMMs (दिन 7 या 8)

  1. चार (4) बाँझ 12 मिमी ग्लास coverslips (autoclaved और एक बंद गिलास कंटेनर में संग्रहीत) प्रत्येक खाली अच्छी तरह से नीचे रखने के द्वारा 6-well टिशू कल्चर प्लेटें तैयार करें ।
    नोट: प्रत्येक बाँझ 12 मिमी उठाओ एक aspirating टिप एक वैक्यूम लाइन के लिए फिट के साथ coverslip । ओवरलैप के बिना कुओं में coverslips प्लेस, वैक्यूम बाधित करने के लिए ट्यूब चुटकी द्वारा वांछित स्थान पर रिहा.
  2. महाप्राण मीडिया (और किसी भी गैर अनुयाई कोशिकाओं) पेट्री व्यंजन से अनुयाई अस्थि मज्जा व्युत्पंन मैक्रोफेज और धीरे से कुल्ला अनुयाई कोशिकाओं के साथ लेपित बाँझ Dulbecco की फास्फेट के बिना खारा बफर नमकीन कैल्शियम और मैग्नीशियम क्लोराइड (पंजाब-/ से 37 डिग्री सेल्सियस ।
  3. dropwise जोड़ें, 5 मिलीलीटर बाँझ 1x पंजाब-/1 मिमी EDTA के एक अंतिम एकाग्रता के साथ प्रत्येक पेट्री पकवान और 5 मिनट के लिए मशीन 37 डिग्री सेल्सियस पर अनुयाई BMMs को अलग करने के लिए । सत्यापित करें कि कक्षों को एक माइक्रोस्कोप का उपयोग कर अलग कर रहे हैं ।
  4. एक 50 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में 1 मिमी EDTA के साथ एक पूरक-/1x पंजाब में निलंबित सभी रेग्युलेटर कोशिकाओं लीजिए । प्रत्येक 5 मिलीलीटर पंजाबियों के साथ 2x डिश कुल्ला-/-और सेल निलंबन पूल में जोड़ें ।
    नोट: संग्रहण प्रक्रिया के दौरान मैक्रोफेज को EDTA विषाक्तता से बचाने के लिए सेल सस्पेंशन को अतिरिक्त पंजाबियों के साथ पतला किया जा सकता है ।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 300 x g पर केंद्रापसारक । supernatant त्यागें और 5-10 मिलीलीटर बीएमएम माध्यम में मैक्रोफेज को पुनर्स्थगित pipetting । बर्फ पर reसस्पैंड कोशिकाओं प्लेस ट्यूबों और झुरमुट के लिए लगाव को रोकने के लिए ।
  6. गणना व्यवहार्य hemocytometer में Trypan नीले अपवर्जन का उपयोग कर कोशिकाओं ।
    नोट: 5 मिलीलीटर मध्यम में reसस्पैंड बीएमएम कोशिकाओं की गणना करने के लिए, एक कमजोर पड़ने-के मिश्रण 25 µ एल सेल निलंबन में 445 µ l पंजाब-/-और 30 µ l 0.4% Trypan ब्लू समाधान आम तौर पर एक ठहराव में आसान hemocytometer की अनुमति देता है (खाते में अंतिम गणना के लिए एक 20x कमजोर पड़ने कारक लेने ). गिनती केवल कोशिकाओं है कि Trypan नीले (व्यवहार्य कोशिकाओं) के साथ दाग नहीं मिला । इस मिश्रण बहुत ध्यान केंद्रित या पतला है, तो सेल निलंबन की मात्रा बदल सकता है । सामांय में, तैयारी के अनुसार बीएमएम की उपज 2 x 107 और 5 x 107 कोशिकाओं के बीच एक ही माउस से भिंन होती है ।
  7. वांछित चढ़ाना एकाग्रता पर बीएमएम माध्यम में सेल निलंबन तैयार (5 x 105/mL) और अच्छी तरह से 2 मिलीलीटर माध्यम में 6 अच्छी तरह से प्लेटों को फैलाने के निलंबन इतना है कि प्रत्येक अच्छी तरह से 1 एक्स 106 मैक्रोफेज प्राप्त करता है ।
    नोट: यह एक महत्वपूर्ण कदम है कि हर अच्छी तरह से मैक्रोफेज की पर्याप्त संख्या में coverslips समान रूप से कवर हो जाता है सुनिश्चित करता है । जाँच करें कि कुओं में coverslips के माध्यम से अतिव्यापी या तैरते नहीं हैं. यदि हां, तो धीरे से एक बाँझ पिपेट टिप के साथ समायोजित करें ।
  8. 37 ° c, 5% सह2पर रात भर की मशीन ।

3. L amazonensis के संक्रामक रूपों का शुद्धिकरण

नोट: संक्रमण के लिए Leishmania तैयार-स्थिर promastigote संस्कृतियों8,13, या promastigotes मानक एल amastigote का उपयोग कर के रूप में संस्कृति में अंतर amazonensis से शुद्ध metacyclic promastigotes axenic भिंनता प्रोटोकॉल6,8।

  1. Leishmania metacyclic promastigotes का शुद्धिकरण घनत्व ग्रैडिएंट मीडिया (सामग्री) का उपयोग करना 33
    1. बाँझ, endotoxin-मुक्त पानी में घनत्व ढाल मीडिया के 40% शेयर समाधान तैयार करें ।
    2. M199 माध्यम में 10% एकाग्रता तैयार करने के लिए 10x M199 मध्यम (सीरम के बिना) में घनत्व ढाल समाधान पतला ।
    3. 0.22 µm फ़िल्टर के माध्यम से सभी समाधानों को फ़िल्टर करें ।
      नोट: स्टॉक समाधान 4 से अधिक नहीं 1 महीने के लिए अंधेरे में ओसी पर संग्रहित किया जा सकता है ।
    4. एक 15 मिलीलीटर शंकु केंद्रापसारक ट्यूब के तल में 40% घनत्व ढाल मीडिया समाधान के 2 मिलीलीटर जोड़ें ।
    5. परत M199 में 10% घनत्व ढाल मीडिया समाधान के 2 मिलीलीटर 40% घनत्व ढाल मीडिया परत के शीर्ष पर ध्यान से, एक पाश्चर पिपेट का उपयोग करने के लिए दो परतों के बीच किसी भी मिश्रण से बचें ।
    6. 10 मिनट के लिए १,९०० x g पर केंद्रापसारक द्वारा स्थिर चरण संस्कृति से 1 x 109 परजीवी लीजिए ।
    7. 6 मिलीलीटर Dulbecco के संशोधित आवश्यक माध्यम (DMEM) में कोशिकाओं को पुनर्निलंबित ।
    8. परत 10% घनत्व ढाल मीडिया परत के ऊपर सीधे सेल निलंबन के 2 मिलीलीटर, धीरे, एक पाश्चर पिपेट का उपयोग करने के लिए परतों के बीच मिश्रण से बचें ।
    9. कमरे के तापमान पर 1,300 x जी में 10 मिनट के लिए ढाल केंद्रापसारक ।
      नोट: Leishmania प्रजातियों के बीच भौतिक गुणों में अंतर के कारण, प्रत्येक के लिए केंद्रापसारक शर्तों को थोड़ा अधिकतम उपज सुनिश्चित करने के लिए समायोजित किया जा सकता है ।
    10. एकत्र परजीवी (metacyclic promastigote रूप में समृद्ध) ऊपरी 10% घनत्व ढाल मीडिया सीमा पर गठित बैंड से (0% और 10% घनत्व ढाल मीडिया परतों के बीच इंटरफेस) ।
    11. DMEM की एक मात्रा के साथ परजीवी पतला और (कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए १,९०० x g) द्वारा इकट्ठा ।
    12. 500 µ l DMEM मध्यम और एक hemocytometer में गणना करने के लिए उपज यों तो reसस्पेंड ।
  2. axenic संस्कृति की स्थिति के तहत एल. amazonensis amastigotes की जनरेशन (कम पीएच/6,8,13
    1. amastigote मध्यम (पीएच 4.5) की एक बराबर मात्रा के साथ लॉग-चरण promastigote संस्कृति (पीएच 7.4 26 ओसी) के 5 मिलीलीटर मिक्स, 25 सेमी2 कुप्पी (कुल 10 मिलीलीटर मध्यम) का उपयोग कर और 26 डिग्री सेल्सियस रात भर में गर्मी ।
    2. कुप्पी को 26 ° से 32 डिग्री सेल्सियस तक खिसकाएं ।
    3. 3 या 4 दिनों के बाद, amastigote मीडिया में 32 डिग्री सेल्सियस पर विभाजित संस्कृति 1:5 ।
    4. अगले 3-4 दिनों (अधिकतम 7 दिन) में परजीवी की जांच करें यदि वे संक्रमण में उपयोग के लिए तैयार है देखने के लिए ।
      नोट: स्वस्थ axenic amastigotes एक अंडाकार आकार होना चाहिए, दृश्यमान कशाभिका के बिना. आंशिक रूप से विभेदित amastigotes कम कशाभिका के साथ एक बड़ा अंडाकार आकार है । संस्कृति का बहुत से झुरमुट नहीं होना चाहिए-कई झुरमुट न बढ़ते हुए, मरते हुए परजीवी के संकेत हैं । amastigote संस्कृति 1:5 विभाजित किया जा सकता है और 3 सप्ताह की एक अधिकतम के लिए बनाए रखा ।

4. एल amazonensis के साथ संक्रमण

  1. वांछित MOI (आमतौर पर 3-5 metacyclic promastigotes प्रति मैक्रोफेज [MOI के 1:3 या 1:5] और 1 amastigote प्रति मैक्रोफेज [MOI 1:1]) के अनुसार परजीवी निलंबन पतला । पंजाब में Leishmania जोड़ें-/-50-100 µ एल की मात्रा में प्रत्येक अच्छी तरह से पहले से ही 2 मिलीलीटर मध्यम से युक्त ।
  2. amastigotes के साथ 1 एच के लिए BMMs और संक्रमण के लिए 34 ओसी पर metacyclic promastigotes के साथ 3 एच के लिए मशीन ।
    नोट: इष्टतम संक्रमण तापमान प्रजातियों के आधार पर भिन्न हो सकते हैं ।
  3. निंनलिखित मशीन, अच्छी तरह से एक अच्छी तरह से 2 मिलीलीटर पंजाबियों के साथ 3x में मुक्त परजीवी धो-/
    नोट: coverslips एक दूसरे पर नाव नहीं है कि यह सुनिश्चित करने के लिए धीरे पंजाबियों फैलाने । धीरे से प्लेट घूमता है और फिर बाहर तरल महाप्राण । क्रॉस-प्रदूषित होने से बचने के लिए परजीवी के कई उपभेदों का उपयोग करते हुए अलग aspirating टिप का उपयोग करें ।
  4. पंजाबियों में 2% पीएफए की 1.5-2 मिलीलीटर के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से मशीन द्वारा 1 h या 3 घंटे के नमूनों को ठीक करें-/-/ महाप्राण पिछले धोने और प्रशीतन जब तक पंजाब में coverslips युक्त प्लेटें मत करो ।
  5. आगे के समय के लिए प्लेटों पर एक अच्छी तरह से 2 मिलीलीटर ताजा बीएमएम माध्यम जोड़ें-अंक और मशीन 34 डिग्री सेल्सियस पर ।
  6. शेष समय फिक्स-के रूप में वांछित के रूप में चरण 4.3 में वर्णित अंक, और धुंधला तक प्लेटें प्रशीतित ।

5. DAPI धुंधला और Coverslip बढ़ते

  1. coverslips युक्त कुओं से महाप्राण पंजाबियों और 1.5 एमएल पंजाबियों-/0.1% गैर ईओण डिटर्जेंट के साथ जोड़ें । कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए मशीन, 3x धोने के बाद 2 मिलीलीटर पंजाबियों के साथ-/
  2. 1 मिलीलीटर पंजाबियों जोड़ें-/-2 µ g/ml DAPI के साथ (पतला 5 मिलीग्राम/एमएल से पानी में स्टॉक समाधान) coverslips युक्त कुओं के लिए और एक और 1 के लिए कमरे के तापमान पर एच मशीन ।
    नोट: DAPI के साथ मशीन समय intracellular Leishmania परजीवी के उचित दृश्य के लिए महत्वपूर्ण है । मैक्रोफेज नाभिक तेजी से दाग, उनके बड़े आकार और डीएनए सामग्री के कारण लेकिन intracellular परजीवी के नाभिक के दाग धीमी है । इस प्रकार, क्या बीएमएम नाभिक कल्पना करने के लिए आवश्यक है से परे मशीन समय का विस्तार DAPI के माध्यम से रिस और परजीवी प्लाज्मा झिल्ली के लिए अनुमति देने के लिए आवश्यक है, और परजीवी परमाणु झिल्ली । उचित DAPI दाग के साथ, परमाणु डीएनए के अलावा, परजीवी की flagellar जेब के पास mitochondrial kinetoplast डीएनए भी visualized किया जा सकता है ।
  3. धो प्रत्येक अच्छी तरह से coverslips 3x युक्त 2 मिलीलीटर पंजाबियों के साथ-/-और फिर लिफ्ट और फ्लिप coverslips संदंश के साथ सेल की ओर नीचे जगह और एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध antifade बढ़ते एजेंट के साथ कांच माइक्रोस्कोप स्लाइड पर माउंट ।
    नोट: Coverslips बेहद नाजुक है और सतर्क हैंडलिंग की जरूरत है । उन पर दबाव डालने से बचें, खासकर कुओं के sidewall के खिलाफ जब लिफ्टिंग की जाए. पंजाबियों की कुछ बूँदें जोड़ना-/-coverslip के बीच सतह तनाव कम कर देता है और अच्छी तरह से और उठाने की प्रक्रिया की सुविधा । एक ठीक गेज सुई को coverslips के नीचे से अच्छी तरह से खोदकर में सहायता करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । स्लाइड पर एक coverslip रखने के बाद, धीरे से संदंश के साथ नीचे प्रेस के लिए बढ़ते मीडिया में किसी भी हवा में बुलबुले धक्का । यदि एक coverslip टूट गया है या संभवतः उठाने की प्रक्रिया के दौरान फ़्लिप किया है, फिर से माउंट नहीं है; बस स्पेयर चौथे coverslip का उपयोग करें ।
  4. ठहराव तक स्लाइड प्रशीतित ।

6. संक्रमण ठहराव

  1. एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत विसर्जन तेल के साथ 100X उद्देश्य लेंस का उपयोग मैक्रोफेज पर ध्यान केंद्रित करके DAPI-सना हुआ स्लाइड की जांच करें (358 एनएम पर उत्तेजना इष्टतम उत्सर्जन) ।
    सुनिश्चित करें कि ध्यान ग्लास स्लाइड और coverslip के बीच मैक्रोफेज की परत पर है ।
  2. मैक्रोफेज की संख्या (बड़े नाभिक DAPI के साथ दाग) और छोटे amastigote नाभिक प्रत्येक मैक्रोफेज नाभिक के आसपास संकुल की संख्या (देखें चित्रा 2a, दृष्टि के प्रत्येक क्षेत्र के लिए DAPI), एक मैनुअल काउंटर का उपयोग कर ।
    नोट: Amastigote नाभिक अपने छोटे आकार के कारण ध्यान के एक विमान में सभी दिखाई नहीं हो सकता है । गिनती उन है कि जब मैक्रोफेज नाभिक पर ध्यान केंद्रित दिखाई दे रहे हैं, और फिर ऊपर और मैक्रोफेज नाभिक नीचे विमानों में परजीवी नाभिक के लिए जांच करने के लिए ठीक ध्यान का उपयोग करें ।
  3. ठहराव दोहराने के लिए दृष्टि के किसी अंय क्षेत्र में जाएं । गिना फ़ील्ड्स की संख्या को ट्रैक करने के लिए एक अलग काउंटर कुंजी का उपयोग करें । प्रत्येक coverslip में समानांतर पंक्तियों में दृश्य फ़ील्ड के माध्यम से ले जाएं, तो गिनती ओवरलैप को रोकने के लिए ।
  4. coverslip प्रति 200 मैक्रोफेज की एक ंयूनतम मात्रा बढ़ाता है । तपसिल (3 coverslips) में संक्रमण के हर बार-पॉइंट को बढ़ाता है । चौथे coverslip गिनती अगर पिछले में से एक coverslip ओवरलैप के कारण गिनती के लिए उपयुक्त नहीं है, गरीब बढ़ते, कांच टूटना, आदि ।
    नोट: अगर 200 मैक्रोफेज किसी एक coverslip पर गिनी नहीं जा सकतीं, तो स्पेयर फोर्थ काउंट करें ।
  5. amastigotes/मैक्रोफेज या amastigotes/100 मैक्रोफेज के रूप में संक्रमण दर की गणना करें और कच्चे मैक्रोफेज डेटा से प्रतिशत संक्रमित ठहराव निर्धारित करते हैं ।

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Representative Results

Leishmania दो संक्रामक रूपों-metacyclic promastigotes कि संस्कृति के स्थिर चरण में चक्रीय promastigotes से अंतर है, और amastigotes, जो intracellular चरणों (चित्रा 1) हैं । कुछ Leishmania प्रजातियों जैसे एल amazonensisमें, amastigotes भी axenic संस्कृति में कम पीएच (4.5) और ऊंचा तापमान (32 डिग्री सेल्सियस) के लिए promastigote कोशिकाओं को स्थानांतरित करके विभेदित किया जा सकता है, शर्तों बीएमएम PVs अंदर पाया उन लोगों के लिए समान 8 , 34. केवल metacyclic promastigote या Leishmania के amastigote रूपों PVs के गठन के लिए प्रेरित करने में सक्षम है और intracellularly दोहराने के बाद मेजबान मैक्रोफेज35से घिरा जा रहा है । विभेदित लॉग-चरण promastigotes PV गठन ( चित्र 2) को बढ़ावा देने के लिए गैर-विषमय और असमर्थ हैं ।

metacyclic promastigotes के साथ संक्रमण के मामले में, वहाँ आमतौर पर intracellular परजीवी संख्या में वृद्धि से पहले एक 24 ज देरी है । यह इसलिए होता है क्योंकि metacyclic promastigotes पहले amastigotes में अंतर करने के लिए पहले वे प्रतिकृति शुरू करते हैं । इस कारण से, metacyclic promastigotes के साथ शुरू संक्रमण के लिए कुल intracellular परजीवी संख्या में वृद्धि दिखाने के लिए अब ले जाएगा, और इस कारण के लिए, लंबे समय अंक के लिए मशीन हो सकता है ।

चित्रा 2a axenically विभेदित amastigotes का उपयोग कर एक सफल संक्रमण का प्रतिनिधित्व करता है, Leishmania के intracellular स्थानीयकरण दिखा (लाल में) प्रारंभिक संक्रमण के बाद (1 ज), PVs के फ्यूजन द्वारा phagosomes के गठन से पहले lysosomes । 48 घंटे में, अलग बड़े PVs कई परजीवी बंदरगाह देखा जा सकता है । PVs के अंदर परजीवी की संख्या में लगातार वृद्धि विषमय Leishmania संक्रमण की विशेषता है । गैर-विषमय लॉग-चरण promastigotes (चित्र बी b), इसके विपरीत, PV विकास (48 h समय बिंदु) आरंभ करने में असमर्थ हैं, दोहराने के लिए असफल और अंततः मेजबान मैक्रोफेज के अंदर मारे जाते हैं, यहां तक कि जब मेजबान मैक्रोफेज ने तुलनीय संख्या में ले लिया ते metacyclic promastigotes वा amastigotes ।

इस विधि की प्रभावकारिता प्रदर्शित करने के लिए, हम की तुलना में जंगली-प्रकार L. amazonensis LMIT1/ΔLmit1 परजीवी के साथ LMIT1 की एक प्रतिलिपि (Leishmania Mitochondrial मैंरॉन टी ransporter 1) जीन है, जो mitochondrial आयरन की हानि में परिणाम13आयात । एक LMIT1 एलील के नुकसान LMIT1/ΔLmit1 promastigotes में mitochondrial गतिविधि के महत्वपूर्ण परिवर्तन में परिणाम नहीं था या जब जंगली प्रकार metacyclic13की तुलना में शुद्ध promastigotes रूपों की उपज को कम । दोनों जंगली से शुद्ध metacyclic promastigotes-प्रकार (WT) और LMIT1/ΔLmit1 स्थिर संस्कृतियों BMMs पर हमला करने में समान रूप से प्रभावी थे, intracellular परजीवी की तुलनीय संख्या के आधार पर quantified 1 ज संक्रमण के बाद ( चित्र 3ए, 1 एच) । एक प्रारंभिक 24 घंटे के अंतराल के बाद, कि metacyclic promastigotes अनुकूलन और amastigote रूपों में अंतर करने के लिए आवश्यक है, intracellular जंगली प्रकार परजीवी की संख्या में एक स्थिर वृद्धि (लगभग 3-गुना के बीच 24 एच और 72 एच समय अंक) था मनाया. इसके विपरीत, कम या LMIT1/ΔLmit1 परजीवी की कोई intracellular वृद्धि (तुलना 1 एच और 72 एच समय अंक) मनाया गया था, सुझाव है कि एकल LMIT1 एलील के नुकसान काफी इस तनाव की क्षमता के अंदर बढ़ने को प्रभावित करता है मैक्रोफेज. पूरित तनाव में LMIT1 प्रोटीन की Episomal अभिव्यक्ति (LMIT1/ΔLmit1+LMIT1) जंगली प्रकार के स्तर को intracellular परजीवी विकास बचाया, पुष्टि की है कि LMIT1 amastigote intracellular के लिए महत्वपूर्ण है प्रतिकृति और डाह13।

मैक्रोफेज संक्रमण axenic amastigotes के साथ बाहर किया, promastigote संस्कृतियों स्थानांतरण द्वारा उत्पंन (पीएच 7.4; 26 oc) को amastigotes विकास की स्थिति (पीएच 4.5; 32 ओसी)34,36, एक intracellular विकास दिखाया पैटर्न (चित्र 3 बी) के समान है कि metacyclic promastigotes के साथ मनाया (चित्राएक) । प्रारंभिक रूप से आगे की तुलनीय स्तरों (चित्र3, 1 ज) जंगली-प्रकार (WT) और LMIT1 पूरित (LMIT1/ΔLmit1+LMIT1) amastigotes तेजी से वृद्धि हुई है, जबकि LMIT1/ ΔLmit1 amastigotes फिर से intracellular ग्रोथ दिखाने में नाकाम रहे । Axenic amastigotes अधिक संक्रामक थे (MOI 1:1 metacyclic promastigotes के लिए 1:5 की तुलना में) और अधिक कुशलता से PVs अंदर दोहराया ।

हमारे डेटा metacyclic promastigote संक्रमण के लिए एक प्रारंभिक 24 एच देरी प्रदर्शित करता है, इससे पहले कि वहां intracellular परजीवी संख्या में वृद्धि हुई है ( चित्रा 3 ए में 24 एच समय अंक के बीच तुलना करें और बी) । अंतराल को दोहराने के लिए शुरू करने से पहले amastigotes में अंतर करने के लिए पहले आंतरिक metacyclic promastigotes के लिए आवश्यक समय का प्रतिनिधित्व करता है । एक आम गलती लोगों को जब संक्रमित करने के लिए metacyclic promastigotes का उपयोग कर, लंबे समय पर्याप्त इंतजार नहीं है । मामलों में जहां डाह में परिवर्तन कठोर नहीं है, प्रयोगों 96 से अधिक एच के बजाय 72 एच अधिक विश्वसनीय दृढ़ संकल्प का उत्पादन ।

Figure 1
चित्र 1 : विभिंन एल amazonensis जीवन-चरणों की स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन Micrograph छवियां । लाग-चरण promastigote, metacyclic promastigote से स्थिर-चरण और axenic amastigote । बार = 10 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2 : बीएमएम संक्रमण का एक प्रतिनिधि चित्रण विषमय axenic amastigotes (ए) और गैर-विषमय लॉग-चरण promastigotes के (बी) के साथ L. amazonensis इम्यूनोफ्लोरेसेंस से अलग मैक्रोफेज की छवियां बालब/c चूहों, 1 ज और 48 एच निंनलिखित संक्रमण । प्रोटोकॉल में बताए गए अनुसार संक्रमित मैक्रोफेज को इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए संसाधित किया गया । पीवी झिल्ली चूहे विरोधी माउस Lamp1 मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के साथ दाग (1:1000 कमजोर पड़ने) 1 एच के लिए, विरोधी खरगोश फ्लोरोसेंट आईजीजी (1:500 कमजोर पड़ने) के साथ 1 एच मशीन द्वारा पीछा किया गया । परजीवी धुंधला माउस polyclonal axenic एल amazonensis amastigotes, विरोधी माउस आईजीजी लाल डाई (1:500 कमजोर पड़ने) 6के बाद के खिलाफ उत्पंन एंटीबॉडी के साथ coverslips की मशीन द्वारा प्रदर्शन किया गया । सभी coverslips दाग नाभिक के लिए DAPI के साथ आगे इलाज किया गया । (क) 48 ज समय बिंदु पर अलग PVs बंदरगाह एकाधिक amastigotes के गठन axenic amastigotes के साथ एक सफल Leishmania संक्रमण की विशेषता है । (ख) की अनुपस्थिति में विशिष्ट PV गठन और नकल amastigotes 48 ज समय बिंदु typifies लॉग-चरण संस्कृति से promastigotes में डाह की कमी है । लाल विरोधी-Leishmania धुंधला, हरा इंगित करता है विरोधी Lamp1, नीला इंगित करता है DAPI-सना हुआ डीएनए और पीला विरोधी Lamp1 और DAPI दाग के विलय को इंगित करता है । सलाखों, 5 µm । यह आंकड़ा Mittra, बी एट अल., 2013 से संशोधित किया गया है । मूल रूप से जे Exp. मेडमें प्रकाशित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 : एक LMIT1 एलील के विलोपन गंभीर रूप से उत्परिवर्ती LMIT1/Δlmit1 परजीवी के intracellular वृद्धि को बाधित । बीएमएम एल amazonensis के साथ संकेत बार के लिए संक्रमित थे और या तो तुरंत तय या आगे 24, 48 या 72 एच के लिए मशीन से पहले वे तय हो गए थे, DAPI के साथ दाग, और intracellular परजीवी की संख्या microscopically निर्धारित किया गया था । (क) BMMs शुद्ध जंगली प्रकार से संक्रमित थे (WT), एक पीटा (LMIT1/Δlmit1) और पूरक एकल पीटा (LMIT1/Δlmit1 + LMIT1) metacyclic promastigotes (MOI 1:5) के लिए 3 ज और फिक्स्ड तुरंत या मशीन इसके अलावा संकेत समय अंक के लिए, और intracellular परजीवी की संख्या microscopically निर्धारित किया गया था । डेटा तपसिल निर्धारण के अर्थ ± एसडी प्रतिनिधित्व करते है और तीन स्वतंत्र प्रयोगों के परिणामों के प्रतिनिधि हैं । तारक WT और LMIT1/Δlmit1 परजीवी (छात्र के दो पूंछ t-test 48 h, p = ०.०१७; 72 h, p = ०.००८) के बीच infectivity में महत्वपूर्ण अंतर दर्शाते हैं । (ख) Axenic amastigotes से जंगली-प्रकार (WT), एकल नॉकआउट (LMIT1/Δlmit1) और पूरित एकल नॉकआउट (LMIT1/Δlmit1 + LMIT1) संस्कृतियों को संक्रमित BMMs के लिए उनकी क्षमता के लिए परीक्षण किया गया । BMMs 1 के लिए संक्रमित थे एच (MOI 1:1) और या तो तुरंत तय (1 ज) या 24, 48 या 72 एच के लिए आगे की मशीन के बाद, और intracellular परजीवी की संख्या microscopically निर्धारित किया गया था । डेटा तपसिल निर्धारण के अर्थ ± एसडी प्रतिनिधित्व करते है और तीन से अधिक स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं । संबंधित समूहों के बीच P-मान (छात्र का दो-पुच्छ t-परीक्षण) दर्शाया गया है । यह आंकड़ा Mittra, बी एट अल., 2016 से संशोधित किया गया है । मूल रूप से PloS Pathogमें प्रकाशित । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

मात्रात्मक बीएमएम संक्रमण परख द्वारा उत्पादित डेटा ऊपर वर्णित है, जांचकर्ताओं संक्रमण की दर और एक अपेक्षाकृत कम समय अवधि में डाह गुण में परिवर्तन का एक विश्वसनीय दृढ़ संकल्प प्राप्त करने की अनुमति देता है (अधिकतम 2 सप्ताह, 2 की तुलना में vivo प्रयोगों में के लिए आवश्यक महीने) । इस विधि डीएनए विशिष्ट डाई DAPI, जो विशेष रूप से दाग मैक्रोफेज और परजीवी नाभिक पर निर्भर करता है, और तेजी से पहचान और संक्रमित कोशिकाओं के ठहराव की अनुमति देता है । इसकी तुलना में, अंय दाग जैसे Giemsa के रूप में विभिंन सेलुलर घटकों की एक बड़ी संख्या के लिए बांध की तीव्रता बदलती, दृश्य विश्लेषण37उलझी । DAPI के उपयोग की अनुमति देता है intracellular परजीवी की मांयता और सेलुलर संरचनाओं से उनके स्पष्ट भेद (केवल मेजबान कोशिकाओं के नाभिक भी दाग रहे हैं, और उनके आकार के परिमाण के कई आदेश है परजीवी नाभिक से बड़ा), की अनुमति आसान और तेजी से संक्रमण के ठहराव ।

किसी भी प्रयोगात्मक प्रक्रिया के साथ के रूप में, इस विधि कुछ सीमाएं और कई महत्वपूर्ण कदम है कि सावधान निष्पादन की आवश्यकता है । vivo Leishmania में संक्रमण जटिल जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया से पहले phagocytosis, जो38संक्रमण के अंतिम पाठ्यक्रम निर्धारित करता है शामिल है । मॉडल माउस तनाव का विकल्प है, इसलिए, अध्ययन डिजाइन में महत्वपूर्ण महत्व का है । दोनों C57BL/ बालब/सी चूहे इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया तनाव प्राकृतिक प्रतिरोध एंकोडिंग जीन में भालू उत्परिवर्तनों मैक्रोफेज प्रोटीन (Nramp1), एक प्रोटॉन समाप्ति पंप कि translocates Fe2 + और Mn2 + cytosol में मैक्रोफेज lysosomes/phagolysosomes से आयनों । रोगजनकों कि मैक्रोफेज8,30,31के endocytic डिब्बे के अंदर दोहराने के लिए वृद्धि की संवेदनशीलता में यह परिणाम है । मैक्रोफेज में सफल औपनिवेशीकरण भी संक्रामक Leishmania परजीवी की अद्वितीय क्षमता पर निर्भर करता है दमन करने के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में हेरफेर करने के लिए/जीवित मैक्रोफेज सक्रियण39,40। विभेदित मैक्रोफेज Leishmania बीएमएम संक्रमण के लिए इस्तेमाल कुछ हद तक vivo मेंमैक्रोफेज के गैर सक्रिय राज्य की नकल, लेकिन परख मेजबान घटकों के अधिक जटिल सेट के लिए खाते में नहीं है कि प्रभाव डाह में पशु मॉडल ।

स्वस्थ संक्रामक Leishmania रूपों का अलगाव सटीक डाह निर्धारण के लिए अन्य बिल्कुल महत्वपूर्ण आवश्यकता है । नहीं सभी promastigotes के सभी Leishmania उपभेदों कुशलता से amastigotes में अंतर जब कम पीएच के अधीन/ इसलिए, संक्रमण अक्सर metacyclic promastigotes स्टेशनरी promastigote संस्कृतियों से शुद्ध के साथ किया जाता है । metacyclic promastigotes को प्रभावी रूप से अलग करने के लिए, कुछ शुद्धि रणनीतियों lipophosphoglycan (एलपीजी) के व्यापक संशोधनों सहित विभिन्न जीवन चरणों के दौरान परजीवी सतह glycocalyx की बदलती रचना का लाभ उठाते हैं स्ट्रक्चर42,43,44. उदाहरण के लिए, मूंगफली agglutinin (ॄणा), एक लेक्टिन कि चुनिंदा चक्रीय करने के लिए बांधता है लेकिन नहीं metacyclic एलपीजी प्रभावी रूप से नकारात्मक चयन प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया गया है शुद्ध एल मेजर metacyclic promastigotes45। Metacyclic promastigote शुद्धिकरण कार्यनीति के लिए L. amazonensis आमतौर पर एक मोनोक्लोनल एंटीबॉडी mAb3A .1 शामिल है जो agglutinate में दुर्गम हैं विशिष्ट सतह प्रोटीन promastigotes को लक्षित करके चक्रीय epitopes Metacyclic कर सकते हैं सतह glycocalyx संशोधनों के कारण प्रपत्र8,13,32। एक घनत्व ढाल मीडिया का उपयोग promastigotes से अलग metacyclic promastigotes मंच के आधार पर बोया घनत्व में विशिष्ट अंतर एक आकर्षक तरीका है क्योंकि यह प्रजातियों पर निर्भर नहीं करता है-परजीवी सतह लाइगैंडों में विशिष्ट रूपों । इस विधि, शुरू में एल मेजर metacyclic promastigote शुद्धि33के लिए वर्णित है, सफलतापूर्वक कई अंय Leishmania प्रजातियों के लिए मुख्य रूप से केंद्रापसारक शर्तों के संशोधनों के दौरान अपनाया गया है के दौरान घनत्व-ढाल अवसादन46,47,48,49.

यह भी मुद्दों के बारे में पता होना महत्वपूर्ण है कि परख के कार्यांवयन जटिल हो सकता है, जो इस प्रक्रिया में कई चरणों में हो सकता है । इन समस्याओं बीएमएम निष्कर्षण के दौरान संदूषण शामिल हो सकते हैं, निष्कर्षण के बाद BMMs के असफल भेदभाव, असंगत मैक्रोफेज चढ़ाना, संक्रामक परजीवी रूपों की अपूर्ण शुद्धि, गरीब या असंगत संक्रमण, और कठिनाइयों बढ़ते माइक्रोस्कोप स्लाइड पर ग्लास coverslips. इन संभावनाओं प्रोटोकॉल में संबोधित किया गया है, और ध्यान से समस्या की पहचान करने के लिए संक्रमण प्रक्रिया के प्रत्येक चरण का आकलन करके हल किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, भेदभाव की प्रक्रिया के दौरान बीएमएम संस्कृतियों के संदूषण निष्कर्षण के दौरान सुधार बाँझ तकनीक के लिए एक की जरूरत का संकेत हो सकता है । शुद्धता और शुद्धि एजेंट और शुद्धि प्रोटोकॉल के सटीक कार्यांवयन की ताजगी के लिए सावधान ध्यान वांछित परजीवी रूपों की असफल या अधूरी शुद्धि को सुधारने हो सकता है । गरीब या असंगत संक्रमण परजीवी या एक MOI है कि बहुत अधिक है या विशिष्ट प्रयोगात्मक स्थितियों के लिए बहुत कम है की गलत ठहराव के कारण हो सकता है । निष्कर्षण के बाद, जोड़ तोड़ और कांच coverslips बढ़ते यकीनन इस तकनीक में सबसे अधिक तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण प्रक्रिया है; व्यक्तियों को मिल सकता है वे विभिंन उपकरणों का उपयोग करने coverslips की हैंडलिंग की सुविधा पसंद करते हैं । DAPI दाग नाभिक के स्पष्ट दृश्य माइक्रोस्कोप के तहत सटीक परजीवी गिनती के लिए महत्वपूर्ण है । बेहोश धुंधला और अनुचित केंद्रित कर रहे है असंगत ठहराव के पीछे दो मुख्य अपराधी हैं । यह DAPI धुंधला कदम के गुणवत्ता नियंत्रण द्वारा सुनिश्चित किया जा सकता है, प्रकाश जोखिम समय सीमित करने के लिए फोटो ब्लीचिंग कम है, और जल्दी से क्षेत्र में सभी परजीवी नाभिक के लिए खाते में उद्देश्य ध्यान बदल रहा है । DAPI प्रतिदीप्ति चमक भी डिटर्जेंट के साथ नमूनों की उचित permeabilization सुनिश्चित करने के द्वारा सुधार किया जा सकता है, और धुंधला के दौरान DAPI की एकाग्रता में वृद्धि से. एक वैकल्पिक तरीका है कि ठहराव प्रक्रिया की सुविधा के लिए सूक्ष्म परीक्षा के दौरान नमूनों की डिजिटल छवियों को प्राप्त कर सकते हैं । छवियों को बाद के समय में ठहराव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और स्वतंत्र जांचकर्ताओं द्वारा सत्यापित/quantified किया जा सकता है । हालांकि, इस प्रक्रिया के साथ जुड़े तकनीकी कठिनाइयों है कि सावधान विचार की आवश्यकता है । पीवी के गोलाकार स्वभाव के कारण परजीवी हमेशा एक ही फोकल विमान पर नहीं होते हैं । यह आवश्यक है कि एकाधिक छवियों प्रत्येक सूक्ष्म क्षेत्र के लिए अलग फोकल विमानों का उपयोग कर प्राप्त किया है, और बाद में एक साथ इकट्ठे सभी परजीवी के लिए खाते हैं । अंयथा, तस्वीरों से ठहराव बहुत भ्रामक हो सकता है । मैक्रोफेज/क्षेत्र की गणना, और amastigotes/क्षेत्र सुसंगत मैक्रोफेज चढ़ाना सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है और परजीवी के प्रसार के संक्रमण के दौरान प्राप्त किया गया था । चूंकि BMMs पूरी तरह से विभेदित कोशिकाएं हैं, उनकी संख्या समय के साथ नहीं बढ़ाना चाहिए । यदि समय के साथ मेजबान मैक्रोफेज की संख्या बढ़ जाती है, इसका मतलब है कि मैक्रोफेज अभी भी अपरिपक्व थे । उस स्थिति में, स्रोत और एम सीएसएफ की एकाग्रता की जांच की जानी चाहिए । प्रतिशत संक्रमित मैक्रोफेज का निर्धारण भी मेजबान सेल के एक व्यापक दृश्य रोगज़नक़ संपर्क, विशेष रूप से मामलों में जहां प्रतिशत संक्रमण और परजीवी लोड समान रुझान का पालन नहीं करते प्रदान करने में उपयोगी हो सकते हैं20,21 .

इन विट्रो बीएमएम संक्रमण की विधि यहां विस्तृत विशिष्ट प्रयोगात्मक जरूरतों के अनुरूप संशोधित किया जा सकता है । संशोधन प्रक्रिया के बुनियादी कदमों में से किसी के लिए किया जा सकता है-बीएमएम निष्कर्षण और भेदभाव, संक्रामक परजीवी रूपों की शुद्धि, और के ठहराव के इन विट्रो मैक्रोफेज संक्रमण, साथ ही साथ संक्रमण को लागू करने के लिए अलग MOIs और संक्रमण और समय की अवधि का समायोजन-अंक का विश्लेषण किया । संस्कृति मीडिया घटकों को भी आसानी से या तो पूरकता या विशिष्ट पोषक तत्वों की कमी के माध्यम से संशोधित किया जा सकता है, और कई अलग उपभेदों या परजीवी के रूपों एक साथ मूल्यांकन किया जा सकता है । इन संशोधनों के लिए तकनीकी कार्यविधियों के अतिरिक्त समायोजन की आवश्यकता हो सकती है; उदाहरण के लिए, amastigote तैयारी और metacyclic promastigote शुद्धि के लिए प्रक्रियाओं विभिन्न Leishmania प्रजातियों के बीच भिन्न होने की उम्मीद है । DAPI, या फ्लोरोसेंट टैग सेलुलर घटकों के अलावा अतिरिक्त फ्लोरोसेंट रंजक मेजबान-परजीवी बातचीत की एक व्यापक रेंज की कल्पना करने के लिए उपयोग किया जा सकता है6,24प्रक्रियाओं । इसके अलावा, इस परख एक उच्च प्रवाह प्रणालियों (HTS) प्रारूप है, जो यौगिक पुस्तकालयों की तेजी से स्क्रीनिंग के लिए नए और प्रभावोत्पादक दवा की पहचान करने के लिए लीशमनियासिस24के इलाज के लिए सुराग की अनुमति होगी के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है,

Acknowledgments

इस कार्य को राष्ट्रीय स्वास्थ्य अनुदान संस्थान RO1 AI067979 द्वारा NWA को समर्थन दिया गया.
यूसुफ हावर्ड ह्यूजेस चिकित्सा संस्थान से स्नातक फैलोशिप के प्राप्तकर्ता है/मैरीलैंड कॉलेज पार्क के विश्वविद्यालय ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6 well cell culture plate Cellstar 657160
Adenine Acros Organics AC147440250
Aerosol Barrier Pipet Tips (100-1000 μL) Fisherbrand 02-707-404
Aerosol Barrier Pipet Tips (20-200 μL) Fisherbrand 02-707-430
Aerosol Barrier Pipet Tips (2-20 μL) Fisherbrand 02-707-432
Bard-Parker Rib-Back Carbon Steel Surgical Blade #10 Aspen Surgical 371110
BD Luer-Lok Tip 10 mL Syringe Becton Dickinson (BD) 309604
BD Precisionglide Needle, 25G  Becton Dickinson (BD) 305124
Cell Culture Dish 35 mm x 10 mm Cellstar 627 160
Cell Culture Flask Cellstar 660175
Cover Glasses: 12 mm circles Fisherbrand 12-545-80
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Invitrogen D1306
D-Biotin J.T. Baker C272-00
EDTA Sigma Aldrich EDS
Ethyl alcohol 200 proof Pharmco-AAPER 111000200
Falcon 100 mm x 15 mm non-TC-treated polystyrene Petri dish Corning 351029
Fetal Bovine Serum Seradigm 1500-500
Ficoll400 Sigma Aldrich F8016
Fluorescence Microscope Nikon E200
Goat anti-mouse IgG Texas red Invitrogen T-862
Goat anti-rabbit IgG AlexaFluor488 Invitrogen A-11034
Hemin Tokyo Chemical Industry Co. LTD H0008
HEPES (1M) Gibco 15630-080
Isoton II Diluent Beckman Coulter 8546719
L-Glutamine Gemini 400-106
Medium 199 (10X) Gibco 11825-015
Na pyruvate (100 mM) Gibco 11360-070
Paraformaldehyde Alfa Aesar 43368
Penicillin/Streptomycin Gemini 400-109
Phosphate Buffered Saline (-/-) ThermoFisher 14200166
Polypropyline conical Centrifuge Tubes 15 mL Cellstar 188 271
Polypropyline conical Centrifuge Tubes 50 mL Cellstar 227 261
ProLong Gold antifade reagent ThermoFisher P36930
Rat anti-mouse Lamp-1 antibody Developmental Studies Hybridoma Bank 1D4B
Recombinant Human M-CSF PeproTech 300-25
Reichert Bright-Line  Hemocytometer  Hausser Scientific 1492
RPMI Medium 1640 (1X) Gibco 11875-093
Triton X-100 Surfactant Millipore Sigma TX1568-1
Trypan Blue Sigma Aldrich T8154
Delicate Scissors, 4 1/2" VWR 82027-582
Dissecting Forceps, Fine Tip VWR 82027-386
Microscope Slides VWR 16004-368
Z1 Coulter Particle Counter, Dual Threshold Beckman Coulter 6605699

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 133 Leishmania डाह मैक्रोफेज intracellular प्रतिकृतिकरण parasitophorous vacuole
मैक्रोफेज के अंदर Intracellular विकास के ठहराव के डाह के आकलन के लिए एक तेज और विश्वसनीय विधि है <em>Leishmania</em> परजीवी
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Sarkar, A., Khan, Y. A.,… More

Sarkar, A., Khan, Y. A., Laranjeira-Silva, M. F., Andrews, N. W., Mittra, B. Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites. J. Vis. Exp. (133), e57486, doi:10.3791/57486 (2018).

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