Summary
모든 병원 성 Leishmania 종 있으며 그들의 척추 호스트의 세포 내부 복제. 여기, 선물이 Leishmania, 세포내 성장 속도의 정확한 정량화 다음으로 문화 murine 골 수 유래 세포를 감염 하는 프로토콜. 이 메서드는 호스트 병원 체 상호 작용 및 Leishmania 독성에 영향을 미치는 개별 요소를 공부 하는 데 유용.
Abstract
Leishmania, leishmaniasis의 원인이 되는 에이전트의 수명 주기는 promastigote의 amastigote 곤충 내부 단계와 척추 호스트 간에 각각 대체 항목입니다. 모든 Leishmania 종의 척 추가 있는 단계 호스트 세포 안에 있는 leishmaniasis의 병원 성 증상이 널리, infective 수 종에 따라 매우 치명적인 내장 질병 형태에 양성 피부 병 변에서 다를 수 있습니다. 그들의 수명 주기입니다. Leishmania infectivity은 따라서 직접 관련이 침공, 생존과 parasitophorous 그들 (PVs) 대 식 세포 내에서 복제 하는 기능. 따라서, 독성을 결정 하기 위한 신뢰할 수 있는 방법으로 제공 침 복제 하는 기생충의 능력을 평가 합니다. Leishmaniasis 개발 동물 모델을 사용 하 여 공부 하는 것은, 지루한 자주 하기가 어렵고, 특히 pathogenically 중요 한 내장 형태 와입니다. 여기 골 수 유래 세포 (BMMs)에 세포내 Leishmania 개발을 수행 하는 방법을 설명 합니다. 세포내 기생충 숫자 72 96 h 다음 감염에 대 한 24 시간 간격에 따라 결정 됩니다. 이 메서드는 Leishmania 독성에 다양 한 유전적 요인의 영향의 신뢰할 수 있는 결정에 대 한 수 있습니다. 예를 들어, 우리가 어떻게 Leishmania 미토 콘 드리 아 철 운송업 자 유전자 (LMIT1)의 단일 대립 유전자 삭제 손상 수 Leishmania amazonensis 돌연변이 스트레인 LMIT1/ΔLmit1 의 BMMs, 내부 성장 보여 야생-타입에 비해 독성에서의 급격 한 감소를 반영 합니다. 이 분석 결과 또한 호스트 병원 체 상호 작용에 다양 한 요인 (영양소, 반응성 산소 종 등)의 영향을 분석을 개별적으로 조작할 수 있습니다 실험 조건 정확 하 게 제어할 수 있습니다. 따라서, 적절 한 실행 및 BMM 감염 연구의 정량화 기존의 동물 모델 연구에 대 한 비-침략 적, 급속 한, 경제, 안전 하 고 안정적인 대안을 제공합니다.
Introduction
Leishmaniasis는 protozoan 기생충 종의 속 Leishmania로 인 한 인간의 질병의 광범위 한 스펙트럼을 말합니다. 약 12만 명이 현재 감염 된 Leishmania 전세계, 그리고 350만 이상의 위험이 있습니다. 질병 병리학 Leishmania 종에 고 호스트 요인에 따라 그리고 증상 무해 한 자기 치유 피부 병 변에서 치명적인 visceralizing 형태 다. 최악의 인간 질병으로 말라리아 후 순위 protozoan 기생충1감염에의 한 치료, 내장 leishmaniasis 치명적인 경우. 질병 병 리와 증상에 광범위 한 차이도 불구 하 고 모든 Leishmania 종 digenic 수명-주기 promastigote의 amastigote 곤충 내부 단계와 척추 호스트를 각각 교대로 있다. 내부 척추 동물, Leishmania 침공에 대 한 호스트 세포를 대상 하 고 parasitophorous 그들 (PVs), 높은 악성의 amastigote 형태의 복제 속성 phagolysosomes의 산 성 구획의 형성을 유발. Amastigotes 만성 감염 시 호스트 조직에서 유지 하 고 전달 될 수 있는 감염 되지 않은 앞으로 sandflies, 전송 주기를 완료. 따라서, 인간의 질병 개발의 맥락에서 amastigotes는 가장 중요 한 Leishmania 생명주 기 양식2. Amastigotes 대 식 세포 증후군 내부 복제 하는 방법을 조사 하는 것이 중요 이해 Leishmania 독성3,,45,,67 와 새로운 효능 요법의 개발입니다.
여기 정기적으로 Leishmania 감염 및 시간이 지남에 세포내 Leishmania 수의 양적 평가 포함 하는 골 수 유래 세포 (BMMs)에서 복제 연구를 우리의 실험실에 의해 사용 되는 방법을 설명 합니다. 과정 포함 Leishmania 그리고 부 량의 문화에서 대 식 세포, 생체 외에서 감염 감염 형태 (metacyclic promastigotes 또는 amastigotes)와 마우스 골 수에서 분화 monocytes의 수확은 세포내 기생충 감염 다음 72 96 h의 기간에 대 한 모든 24 시간 간격의 수입니다. 이 분석 결과 여러 환경 요인 및 기생충의 유전자, 노상 강도 의해 더 확인 되었다 L. amazonensis 독성을 홍보에 철의 중요 한 역할의 식별을 포함 하 여 영향을 확인 하기 위해 우리의 실험실에서 사용 되었습니다. 마우스6,,89,10,11,12,13,14,15 병 변 개발 연구 . 때문에 모든 병원 성 Leishmania 종 설정할 호스트 세포 안에 그들의 일차 틈새,이 분석 결과 모든 Leishmania 종에서 독성 결정에 대 한 보편적으로 사용할 수 있습니다.
BMM 감염 수행 단일 세포 수준에서 호스트-기생충 상호 작용의 분석 및 따라서 Leishmania 기생충 그들의 기본 설정된 호스트 microenvironment, 대 식 세포의 PVs 상호 작용 하는 방법에 대 한 더 광범위 한 이해를 수 있습니다. 대 식 세포 감염 분석 실험 성공적으로 사용 되었습니다 여러 그룹16,17,18,19,20,,2122 탐험 호스트 macrophage Leishmania 특정 유전자와 세포내 감염 특징 복잡 한 상호 작용에 있는 그들의 잠재적인 관련 기능. BMM 감염 microbicidal 산화 질소 생산, 반응성 산소 종의 생성 및 다른 조건 같은 세포내 생존에 영향을 주는 호스트 요인의 영향에의 한 읽기로 기생충 성장의 정량화를 허용 리소좀-같은 PVs23내부 발생 했습니다. 대 식 세포 감염 분석 치료 개발13,24에 대 한 잠재적인 안티 leishmanial 마약 단서를 식별 하도 이용 되어 있다.
BMM 감염의 생체 외에서 특성 Leishmania 독성을 평가 하기 위해 다른 방법에 비해 몇 가지 이점이 있습니다. 그러나, 시간이 지남에 세포내 기생충 생존의 메커니즘을 검토 하는 여러 이전의 연구 속도20,,2124로 감염을 계량 하지 않았다. 또한, 시간이 지남에 vivo에서 감염 다음에 초점을 맞춘 많은 연구 그렇게 피부 병 변의 크기와 직접 관련 없는 기생충 복제25,26 다른 생리 적인 증상을 측정 하 여 , 27. vivo에서 감염 기생충 독성 평가에 대 한 엄격한 접근 이지만 혼자 붓기 노상 강도에 따라 병 변 크기 측정은 종종 적절 한, 그들은 감염 된 조직에서 염증 반응을 반영 하지는 기생충의 절대 수입니다. 따라서, 노상 강도 병 변 개발 분석 뒤에 감염 된 조직, 기생충 부하의 정량화 해야 긴 제한 희석을 요구 하는 절차는28분석 실험. 또한, vivo에서 연구는 종종 포함 관심6,,89,10, 의 조직 추출 하는 시간에 서로 다른 지점에서 여러 동물을 희생 11 , 13. 대조적으로, BMMs의 다 수는 단지 하나의 동물에서 얻어질 수 있다 고이 세포는 다양 한 지점에서 시간에 감염의 평가 허용 하는 조건에서 도금 될 수 있다. 또한, vivo에서 연구에 비해, 실험 조건 제어가 있습니다 BMM 감염 체 외에서 수행. 스스로 기생충 함께 감염 되는 세포를 측정 복합성 감염 (MOI)의 문화 조건 정확 하 게 제어할 수 있습니다. 이러한 요소를 세밀 하 게 제어 키 이산 세포질 통로의 특성을 식별 하 고 감염의 과정에 미치는 영향을 이해 하실 수 있습니다.
이러한 이점을 감안할 때, 그것은 다소 놀라운 Leishmania 독성을 공부 하는 아주 몇몇 그룹 세포에서 세포내 복제의 양적 평가의 활용을 찍은 지금까지 있다. 이 문서에서는, 우리는이 분석 결과의 더 광범위 한 이용을 저해 하 고 적절 한 구현을 촉진 하기 위하여 단계별 프로토콜을 제공 수 있습니다 일반적인 함정 토론. 정밀도 및 다양성을 고려 하면 우리가 여기 설명 BMM 감염 분석 결과 하지만 이용 될 수 있다 탐험 Leishmania 독성에 영향을 미치는 호스트 병원 체 상호 작용 뿐만 아니라 내부 복제 하는 다른 미생물을 공부 하 대 식 세포29 중요 한 것은,이 분석 결과 또한 안티-leishmanial 약물 개발에 대 한 신속 하 고 경제적인 전 임상 스크리닝 방법으로 개발할 수 있습니다.
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Protocol
모든 실험 절차 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 가이드에 권장 사항에 따라 건강의 국가 학회에 의해 실시 했다 고 메릴랜드 대학 IACUC에 의해 승인 했다. 섹션 1-4에에서 설명 된 모든 단계 생물 층 류 캐비닛 안으로 밖으로 aseptically 실행 한다. 개인 보호를 사용 해야 합니다, 그리고 실험의 모든 단계에 걸쳐 라이브 Leishmania 기생충의 처리 하는 동안 주의 행사 한다.
1. 격리와 골 수 유래 세포 (BMMs)8,,3031 의 차별화
- 0: 4-6 주 된 여성 C57BL/6 또는 CO2 챔버에 BALB/c 마우스를 희생 하 고 자 궁 경부 전위를 통해 죽음을 확인 합니다. 70% 에탄올에 배어 그들을 유지 하 여가 위, 집게의 살 균을 확인 합니다. 골 수 세포 격리 프로세스를 통해 처리 살 균 수 있도록 70% 에탄올과 장갑 스프레이.
- 그 앞 발을 고정 하 여 희생된 마우스 해 부 보드를 장악 하 고 70% 에탄올 copiously 살포 하 여 소독.
- 엉덩이 관절 근처가 위로 작은 절 개 (약 1cm)을 확인 합니다. 신중 하 게가 위 기본 근육을 분리 하 여 고관절 주위의 모든 방법을 피부를 잘라 피부 아래 삽입 합니다.
주: 해 부 보드 엉덩이 관절에 대 한 향상 된 액세스를 허용 하도록 회전할 수 있습니다. - 신중 하 게 발목 쪽으로 당겨 다리에서 피부를 deglove 하 고 제거 합니다. 경골을 완전히 그대로 공동 또는 발목 아래를 잘라 아주 조심 발목에서 다리를 잘라.
참고:이 단계에서 비 골 및 느슨하게 연결 된는 집게와 쉽게 분리 될 수 있다. - 수동으로 회전 지점을 식별에 대 퇴 골을 조작 하 여 고관절을 찾습니다. 신중 하 게가 위를 사용 하 여 대 퇴 골의 근 위 머리를 그대로 두고 고관절 위의 다리를 끊을 수 있습니다.
- 많은 근육과 결합 조직으로 제거 가능한 다리에서가 위. 발목 및 고관절 위에 초과 뼈 자료에서 남아 있는 피부를 제거 합니다.
- 얼음에 페 트리 접시에 페니실린/스 (최종 농도 1%)으로 보충 하는 살 균 RPMI에 청소 다리 뼈를 배치 합니다.
- 1.4 1.6 다른 뒷 다리에서 대 퇴 골과 경골을 통해 단계를 반복 합니다.
- 모든 나머지 근육 및 결합 조직 RPMI 집게를 소독된 및 살 균 #10 블레이드를 사용 하 여에 몸을 담글 뼈에서 제거 합니다.
- Petri 접시 뚜껑에 뼈를 놓습니다. 바로 골 수 액세스할 수 발목 관절 위에 블레이드와 경골을 신중 하 게 잘라. 바로 아래는 무릎 관절을 절단 하 여 경골은 다리의 나머지 부분에서 제거 합니다.
- 10 mL 살 균 RPMI 10 mL 주사기로 페니실린/스 (최종 농도 1%)로 보충 하 고 25g 바늘을 연결을 그립니다.
- 잡고 경골 단단히 집게와 수직으로 얼음에 50 mL 원뿔 튜브에. 주사기를 사용 하 여 부드럽게 RPMI 약 5 mL 원뿔 관으로 다른 쪽으로 골 수를 뼈의 끝에 삽입. 뼈 흰색 변할 때까지 총 10 mL RPMI 골을 플러시.
참고: 후 철저 한 홍 조, 뼈 해야 차례 흰색. 그렇지 않은 경우에 골 수를 제거 하는 홍 조 계속. 경골의 선단부 너무 좁은 바늘을 삽입 하는 경우는 블레이드와 함께 다시 손질 해야 합니다. - 무릎 관절 위와 바로 아래 노출 액세스 골 수 뼈의 양쪽 끝을 고관절 바로 대 퇴 골을 잘라. 총 10 mL RPMI 동일한 방식으로 경골에 대 퇴 골에서 골을 플러시.
- 청소 및 단계 나머지 뼈 1.13 통해 1.6 홍 조를 반복 하 고 단일 50 mL 원뿔 튜브에 플러시 하는 골 수 세포 수집
참고: 경우 뼈 뼈 홍 조 전에 절 개 하는 동안 언제 든 지 휴식,이 뼈에서 골 수는 사용 하지 마십시오. - 원심 골 수 수집 하는 데 사용 하는 원뿔 튜브 x 300g에 4 ° C에서 10 분에 대 한 모든 4 개의 뼈에서 플러시됩니다.
- 장소 살 균 BMM 매체의 60 mL (마지막 20% 농도로 RPMI FBS, 1% 페니실린/스, 1.2 m m 나-pyruvate, 25 µ g/mL 인간의 M-CSF) 필터 캡 175 cm2 셀 문화 플라스 크로.
- 표면에 뜨는 다음 원심 분리를 삭제 하 고 셀 펠 릿 BMM 매체의 5 mL을 사용 하 여 플라스 크에서 pipetting 위아래로 부드러운 여 resuspend.
- 문화 플라스 크에 세포 현 탁 액을 전송 하 고 최대한 셀 복구 되도록 문화 플라스 크에서 두 번 BMM 매체와 원뿔 튜브를 헹 굴. 세포 현 탁 액은 매체에 혼합 철저 하 게 확인 하 고 두 번째 175 cm2 셀 문화 플라스 크 필터 캡을 초기 175 cm2 셀 문화 플라스 크에서 30 mL를 배포.
- 포함 30 mL 세포 현 탁 액에서 37 ° C, 5% CO2 어떤 오염 fibroblasts, 상주 대 식 세포와 다른 부착 세포 분리 수 있도록 각 숙박 모두 플라스 크를 품 어.
- 주 1: 100 m m x 15 m m TC 치료 비 폴리스 티 렌 접시에 약 10 mL를 플라스 크에서 undifferentiated 골 수 세포를 포함 하는 상쾌한 전송/요리 하 고 37 ° C, 5% CO2. 에서 품 어 플라스 크를 삭제 합니다.
- 3 또는 4: 각 페 트리 접시에는 추가 5 mL BMM 매체 (37 ° C에 미리 예 열)를 추가 하 고 37 ° c, 5% CO2배양을 계속.
2. 감염 (7 또는 8 주)에 대 한 Coverslips에 BMMs 도금
- 각 빈의 하단에 4 (4) 살 균 12 m m 유리 coverslips (압력가 마로 소독 하 고 닫힌된 유리 컨테이너에 저장)을 잘 배치 하 여 6 잘 조직 배양 접시를 준비 합니다.
참고: 데리 러 각 살 균 12 mm coverslip 진공 라인에 장착 하는 aspirating 팁. 중복, 진공을 방해 하는 튜브를 곤란 하 게 하 여 원하는 위치에 해제 없이 우물에 coverslips를 놓습니다. - Aspirate 미디어 (및 어떤 비 부착 한 세포) 부착 골으로 코팅 접시에서 파생 된 대 식 세포와 부드럽게 린스 점착 세포 칼슘 및 마그네슘 염화 물 (PBS-/-) 미리 예 열 없이 살 균 Dulbecco 인산 염 버퍼 식 염 수를 2 배 37 ° c
- 5 mL 살 균 1 각 페 트리 접시에 1 mM EDTA의 최종 농도 함께-/-PBS x dropwise, 추가 하 고 점착 BMMs. 확인 세포는 현미경을 사용 하 여 분리는 분리를 37 ° C에서 5 분 동안 품 어.
- 1 x PBS-/-50 mL 원뿔 튜브에 1 mM EDTA와 보완에 모든 분리 된 세포를 수집 합니다. 린스 각 접시 5 mL PBS-/-2 x 그리고 셀 서 스 펜 션 수영장에 추가.
참고: 추가 PBS-/-수집 프로세스 동안 EDTA 독성에서 세포를 보호 하기 위해 세포 현 탁 액 희석 될 수 있습니다. - 4 ° c.에서 10 분 동안 300 x g에서 원심 분리기 상쾌한 무시 하 고 pipetting으로 5-10 mL BMM 매체에서 대 식 세포를 resuspend. 장소는 첨부 파일 튜브 및 응집을 방지 하기 위해 얼음에 셀 resuspended.
- 실행 가능한 세포는 hemocytometer Trypan 블루 제외를 사용 하 여 계산 합니다.
참고: 5 mL 매체에 resuspended BMM 셀의 개수, 25 µ L 세포 현 탁 액-/-445 µ L PBS에 30 µ L 0.4 %Trypan 블루 솔루션의 희석 혼합 일반적으로 수 있습니다 쉽게 정량화를 hemocytometer (고려 최종 계산에 대 한 20 배 희석 요인에 ). Trypan 블루 (가능한 셀)로 얼룩진 얻을 하지 않았다 셀만을 계산 합니다. 이 혼합물은 너무 집중 또는 희석 하는 경우 셀 서 스 펜 션의 볼륨을 변경할 수 있습니다. 일반적으로, 준비 당 BMM의 수익률 2 x 107 , 5 x 107 셀 단일 마우스에서 사이 변화 한다. - 원하는 도금 농도 (5 x 105/mL)에서 BMM 매체에 세포 현 탁 액을 준비 하 고 각 잘 1 x 106 세포 받도록 잘 당 2 mL 매체에 6 잘 플레이트에 정지를 분산.
참고: 이것은 중요 한 단계는 모든 잘 되 면 대 식 세포는 coverslips를 균일 하 게 커버의 적절 한 번호입니다. 그 우물에 coverslips 하지 중복 또는 매체에 떠 있는 확인 하십시오. 그렇다면, 부드럽게 살 균 피 펫 팁으로 조정 합니다. - 37 ° C, 5% CO2에서 밤새 품 어.
3. 감염 형태의 L. amazonensis 의 정화
참고: 준비 Leishmania 감염-정화 고정 promastigote 문화8,13에서 metacyclic promastigotes 또는 promastigotes 문화에 표준 나 amazonensis를 사용 하 여 amastigote 형태로 차별화 axenic 차별화 프로토콜6,8.
-
Leishmania metacyclic promastigotes 사용 하 여 밀도 그라데이션 media(Materials) 33
- 살 균, 내 무료 물에서 밀도 그라데이션 미디어의 40% 재고 솔루션을 준비 합니다.
- M199 매체에 10% 농도 준비 하 밀도 (혈 청) 없이 10 x M199 매체에 그라데이션 솔루션을 희석.
- 모든 솔루션 0.22 μ m 필터를 통해 필터링.
참고: 재고 솔루션 4 oC 이상에 대 한 어둠 속에서 1 달에 저장할 수 없습니다. - 15 mL 원뿔 원심 분리기 튜브의 하단에 있는 40% 밀도 그라데이션 미디어 솔루션의 2 개 mL를 추가 합니다.
- 레이어 2 mL의 10% 밀도 그라데이션 미디어 솔루션 40% 밀도 그라데이션 미디어 레이어 위에 M199 신중 하 게, 2 개의 층 사이 어떤 혼합을 피하기 위해 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여.
- 10 분 동안 1900 x g에서 원심 분리 하 여 고정 위상 문화에서 1 x 109 기생충을 수집 합니다.
- 셀에 6 mL Dulbecco의 수정 필수 매체 (DMEM) resuspend
- 계층의 그라데이션 미디어 레이어, 부드럽게, 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 레이어 간 혼합을 피하려고 10% 밀도 위에 직접 세포 현 탁 액 2 mL.
- 상 온에서 1300 x g에서 10 분 동안 그라데이션 원심
참고: Leishmania 종 간의 물리적 특성 차이, 때문 각 원심 분리 조건 최대 수익률을 보장 하기 위해 약간 조정 해야 할 수도 있습니다. - 상위 10% 밀도 그라데이션 미디어 경계 (0%와 10% 밀도 그라데이션 미디어 계층 간의 인터페이스)에서 결성 된 밴드에서 기생충 (metacyclic promastigote 형태로 농축)를 수집 합니다.
- DMEM의 하나의 볼륨으로 기생충을 희석 하 고 원심 (실 온에서 10 분 동안 1900 x g)에 의해 수집 합니다.
- 500 µ L DMEM 매체에 resuspend과 hemocytometer 수익률을 계량 하기에.
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L. amazonensis amastigotes axenic 문화 조건 하에서 세대 (낮은 pH / 온도 상승)6,,813
- amastigote 매체 (pH 4.5), 동등한 양으로 로그 단계 promastigote 문화 (26 oC에서 pH 7.4)의 혼합 5 mL 25 c m2 플라스 크 (총 10 mL 매체)를 사용 하 고 밤새 26 ° C에서 품 어.
- 26 ° C에서 32 ° c.에 플라스 크를 이동
- 3 ~ 4 일 후에 32 ° c.에의 amastigote 미디어 문화 1:5 분하시오
- 기생충 감염에 사용 하기 위해 준비가 되어 있는지 확인 하기 위해 다음 3-4 일 (최대 7 일)에서 확인 합니다.
참고: 건강 한 axenic amastigotes는 타원형 모양, 보이는 flagella 없이 있어야 합니다. 부분적으로 차별화 된 amastigotes 짧은 flagella 큰 타원형 모양이 있다. 문화 없는 덩어리의 많은-많은 덩어리 비-성장, 죽어 기생충의 표시. Amastigote 문화 1: 5을 분할 하 고 3 주 최대 유지 수 있습니다.
4입니다. 감염 L. amazonensis
- (일반적으로 3-5 metacyclic promastigotes 대 식 세포 [나의 1:3 또는 1:5] 당)와 대 식 세포 [나 1:1] 당 1의 amastigote 원하는 나에 따라 기생충 정지 희석. 이미 2 mL 매체를 포함 하는 각 음에 Leishmania PBS-/-50-100 µ L의 볼륨에 추가 합니다.
- 1 h amastigotes와 3 h 34 oC 감염에서 metacyclic promastigotes와 BMMs를 품 어.
참고: 최적의 감염 온도 종에 의해 달라질 수 있습니다. - 다음 화, 철저 하 게 씻어-/-각 잘 3 x 2 mL PBS와 함께 무료 기생충 37 ° c에 미리 데워
참고: 분산 coverslips 서로 떠 있 하지 않습니다 수 있도록 부드럽게 PBS. 부드럽게 접시 소용돌이 그리고 액체 밖으로 발음. 기생충의 여러 종자를 사용 하 여 교차 오염을 피하기 위해 별도 발음 팁을 사용 합니다. - 1 h 또는 h 3을 각각 배양 하 여 시간-포인트 샘플 수정 2%의 1.5-2 mL와 잘 PFA PBS-/-10 분에 대 한 PBS-/-를 가진 3 배 세척. 마지막 세척을 발음 하지 고 얼룩까지 PBS에 coverslips를 포함 하는 접시를 냉장 보관.
- 추가 시간 포인트 접시에 각 음을 2 mL 신선한 BMM 매체를 추가 하 고 34 ° c.에 품 어
- 원하는 대로 수정 남은 시간-포인트에 설명 된 대로 단계 4.3과 얼룩까지 플레이트를 냉장 보관.
5. DAPI 얼룩 및 Coverslip 장착
- Coverslips를 포함 하는 우물에서 PBS를 발음 하 고 0.1% 비 이온 세제 1.5 mL PBS-/-를 추가 합니다. 2 mL PBS-/-3 배 세척 뒤 실 온에서 10 분 동안 품 어.
- Coverslips를 포함 하는 웰 스에 2 µ g/mL DAPI (물에서 5 mg/mL 재고 솔루션에서 희석)와 함께 1 mL PBS-/-을 추가 하 고 또 다른 1 시간 실 온에서 품 어.
참고: DAPI와 보육 시간은 세포내 Leishmania 기생충의 적절 한 시각화에 대 한 중요 합니다. 대 식 세포 핵 얼룩 급속 하 게, 그들의 큰 크기 및 DNA 콘텐츠 하지만 세포내 기생충의 핵의 얼룩 느립니다. 따라서, BMM 핵을 시각화 하는 데 필요한 무엇 넘어 보육 시간 연장 DAPI 통해 침투와 기생충 원형질 막 및 기생충 핵 막을 필요가 있다. 적절 한 DAPI 얼룩과 기생충의 flagellar 주머니 근처 미토 콘 드리 아 kinetoplast DNA 수 또한 구상 될, 핵 DNA 이외에. - 각 잘 coverslips 3를 포함 하는 워시 x 2 mL PBS-/-와 다음 리프트 및 셀 측면 내려 놓고 유리 현미경에 장착 하는 집게와 플립 coverslips 상용 antifade 장착 시 약으로 슬라이드.
참고: Coverslips는 충격에 약 하 고 신중한 처리가 필요. 특히 운동 할 때 우물의 측 벽에 대하여 그들에 압박 하지 마십시오. -/-PBS의 몇 방울을 추가 coverslip 잘 사이 표면 장력을 감소 시킨다 고 드는 프로세스. 정밀한 계기 바늘 캐 잘 아래쪽에서 coverslips을 지원 하기 위해 사용할 수 있습니다. 슬라이드에는 coverslip 후, 부드럽게 눌러 집게와 설치 미디어에서 모든 기포를 밖으로 밀어. 경우는 coverslip 고장 또는 드는 과정 성을 상실 가능성이 있다, 다시 탑재 하지 마십시오; 예비 4 coverslip을 사용 합니다. - 부 량까지 슬라이드를 냉동.
6. 감염 정량화
- 침수 기름으로 100 X 렌즈를 사용 하 여 대 식 세포에 초점을 맞춤 으로써 DAPI 스테인드 슬라이드 형광 현미경 검사 (358에서 여기 nm; 461에 최적의 방출 nm).
초점 유리 슬라이드와 coverslip 사이 세포의 층에 있는지 확인 합니다. - 대 식 세포 (큰 핵 DAPI 물)의 수 및 작은 amastigote 핵 각 대 식 세포 핵 주변 수 계량 ( 그림 2A, DAPI 참조) 각 분야의 비전에 대 한 수동 카운터를 사용 하 여.
참고: Amastigote 핵 모두 볼 수 있습니다 그들의 작은 크기로 인해 초점의 1 개의 비행기에. 그 때 대 식 세포 핵에 집중 되 고 정밀한 초점을 사용 하 여 평면 위에 그리고 대 식 세포 핵 아래에 기생충 핵에 대 한 확인. - 정량화를 반복 다른 시야를 이동 합니다. 별도 카운터의 키를 사용 하 여 계산 하는 필드 수를 추적 하. 방지 하기 위해 각 coverslip 걸쳐 병렬 행에서 시각 필드를 통해 이동 중복 계산.
- 계량 coverslip 당 200 대의 최소. 각 시간-포인트 3 (3 coverslips) 중에서 감염의 계량. 이전 중 coverslip 중복, 불 쌍 한 설치, 유리 파손, 등 계산에 적합 하지 않으면 4 coverslip 계산
참고: 200 대 식 세포는 어떤 하나의 coverslip에 계산 될 수 없습니다, 경우 계산 여분 4. - Amastigotes/100 amastigotes/대 식 세포 또는 대 식 세포로 감염 속도 계산 하 고 원시 정량화 데이터로 % 감염 된 세포를 결정 합니다.
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Representative Results
Leishmania 는 두 감염 양식-문화, 고정 단계에서 procyclic promastigotes에서 차별화 하는 metacyclic promastigotes 및 amastigotes, 세포내 단계 (그림 1). L. amazonensis같은 일부 Leishmania 종, amastigotes 또한 분화 될 수 있다 axenic 문화에 낮은 pH (4.5)과 온도 (32 ° C) 조건 BMM PVs 안에서 발견 된 것과 유사한 promastigote 셀을 이동 하 여 8 , 34. metacyclic promastigote 또는 amastigote 형태의 Leishmania PVs의 형성을 유발 하 고 호스트 세포35에 의해 잠겼습니다 되고있다 후 침 복제 수 있습니다만. Undifferentiated 로그 상 promastigotes 비 악성 고 PV 형성을 촉진 하는 (그림 2).
Metacyclic promastigotes와 감염의 경우 일반적으로 세포내 기생충 숫자에 증가 하기 전에 24 시간 지연이입니다. Metacyclic promastigotes 복제를 시작 하기 전에 amastigotes로 분화 하는 첫번째 때문에 발생 합니다. 이런 이유로, metacyclic promastigotes와 함께 시작 하는 감염 총 세포내 기생충 숫자, 그리고 이런이 이유로 증가 표시 하는 데 시간이 오래 걸릴 것입니다, 그리고 더 긴 시간 포인트 알을 품을 할 수 있습니다.
그림 2A 나타냅니다 axenically 사용 하 여 성공적인 감염 분화 초기 감염 (1 시간) 후 Leishmania (빨간색)으로 세포내 지역화를 보여주는 amastigotes와 phagosomes의 융합에 의해 PVs의 형성 이전 lysosomes입니다. 48 h에 고유 큰 PVs 여러 기생충을 은닉을 관찰할 수 있습니다. PVs 내부 기생충의 수에 있는 꾸준한 증가 악성 Leishmania 감염의 특징입니다. 비 악성 로그 상 promastigotes (그림 2B), 반면, 태양광 개발 (48 h 시간 포인트)을 시작할 수 없습니다, 그리고 실패 복제 하 고 호스트 세포 비교 숫자에 의해 촬영 하는 경우에 호스트 세포 내부 결국 사망 metacyclic promastigotes 또는 amastigotes입니다.
이 방법의 효능을 보여 우리 야생-타입 L. amazonensis 에 비해 LMIT1 의 단일 복사본을 포함 하는 LMIT1/ΔLmit1 기생충 (Leishmania Mitochondrial 나론 T ransporter 1) 유전자, 미토 콘 드 리아 철의 장애에 어떤 결과 가져올13. 한 LMIT1 대립 유전자의 손실 않았다 하지 LMIT1/ΔLmit1 promastigotes에서 미토 콘 드리 아 활동의 중요 한 변경 되거나 야생-타입 promastigotes13에 비해 순화 metacyclic 형태의 수확량 감소. 야생-타입 (WT)와 LMIT1/ΔLmit1 고정 문화에서 정화 metacyclic promastigotes가 했다 BMMs, 세포내 기생충 감염 ( 후 1 시간 정량의 유사한 수에 따라 침입에 동등 하 게 효과적인 그림 3A, 1 시간). 그건 amastigote 형태로 구분을 metacyclic promastigotes에 대 한 필요, 초기 24 시간 시간 지연에 따라 꾸준히 세포내 야생 형 기생충의 수 증가 (약 3 24 h 72 h 시간 점 사이)은 관찰. 대조적으로, 거의 없거나 전혀 없는 세포 성장 (1 h 및 72 h 시간 점 비교) LMIT1/ΔLmit1 기생충의 관찰 되었다, 단일 LMIT1 대립 유전자의 손실을 크게 안으로 성장 하는 것이 긴장의 능력에 영향을 제안 대 식 세포입니다. Episomal 식 보충된 스트레인 (LMIT1/ΔLmit1+LMIT1)에 LMIT1 단백질의 구조 LMIT1 은 세포내 amastigote 중요 확인 야생-타입 수준으로 세포내 기생충 성장을 복제 및 독성13.
대 식 세포 감염 promastigote 문화 변화에 의해 생성 된 axenic amastigotes 실시 (pH에서 7.4; 26 oC) amastigotes 성장 조건 (pH 4.5; 32 oC)34,36, 보였다 세포내 성장 패턴 (그림 3B) metacyclic promastigotes (그림 3A)와 관찰 비슷합니다. 초기 이해 (그림 3B, 1 시간) 야생-타입 (WT)의 대 등 한 수준에 따라 (LMIT1/ΔLmit1+LMIT1)를 보완 하는 LMIT1 및 amastigotes LMIT1/ΔLmit1 amastigotes 다시 동안 꾸준하게, 성장 했다 세포내 성장을 표시 하지 못했습니다. Axenic amastigotes 더 감염 (나 1:1 1:5 metacyclic promastigotes에 비해) 되었고 더 복제 PVs 안에 효율적으로.
세포내 기생충 번호 ( 그림 3A에서 24 시간 포인트와 3B사이 비교)에 증가 하기 전에 우리의 데이터 metacyclic promastigote 감염에 대 한 초기 24 시간 지연을 보여줍니다. 지연 내 면된 metacyclic promastigotes 복제를 시작 하기 전에 먼저 amastigotes로 차별화 하는 데에 필요한 시간을 나타냅니다. 한 일반적인 실수는 사람들이 만드는 metacyclic promastigotes를 사용 하 여 감염, 충분히 오래 기다리게 아니다. 독성 변화 없는 경우 과감 한, 실험 실시 이상 96 h 72 h 생산 훨씬 더 신뢰할 수 있는 결정 보다는.
그림 1 : 다양 한 L. amazonensis 생활 단계의 전자 현미경 사진 이미지 스캔. 로그 상 promastigote, 고정 위상 및 axenic의 amastigote에서 metacyclic promastigote 바 = 10 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 악성 axenic amastigotes (A) 및 (B) L. amazonensis의 비 악성 로그 상 promastigotes BMM 감염의 대표적인 그림. BALB/c 마우스, 1 시간 및 48 h 다음 감염에서 분리 된 세포의 면역 형광 이미지. 감염 된 대 식 세포는 면역 형광 검사에 대 한 프로토콜에 설명 된 대로 처리 했다. PV 막 쥐 반대로 마우스 Lamp1 단일 클론 항 체 (1:1, 000 희석)와 반대로 토끼 형광 IgG (희석 1: 500)와 부 화 1 시간 뒤 1 시간에 대 한 스테인드 했다. Coverslips axenic L. amazonensis 에 대 한 생성 된 마우스 polyclonal 항 체와 배양에 의해 수행 되었다 기생충 얼룩 amastigotes, 반대로 마우스 IgG 레드 다음 염색 (1: 500 희석) 6. 모든 coverslips는 핵 얼룩에 대 한 더 DAPI와 치료 했다. (48 h 시간 시점에서 여러 amastigotes를 은닉 별개 PVs의 형성 A) axenic amastigotes와 함께 성공적인 Leishmania 감염의 특징입니다. (B) 별개 PV 형성 및 48 h 시간 지점에서 amastigotes 복제의 부재 로그 상 문화에서 promastigotes에 독성의 부족 대표. 레드 안티-안티-Lamp1을 나타냅니다Leishmania 얼룩, 녹색, 파란색 나타냅니다 DAPI 스테인드 DNA와 노란색 안티 Lamp1의 병합을 나타냅니다 나타내고 DAPI 얼룩. 바, 5µm입니다. 이 그림은 Mittra, B. 그 외 여러분, 2013에서에서 수정 되었습니다. 제이 특급 클럽 메 드에서 출판. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 한 LMIT1 대립 유전자의 삭제는 심각 하 게 돌연변이 LMIT1/Δlmit1 기생충의 세포 성장 손상. BMM 감염 되었다 제시 된에 대 한 시간 L.amazonensis 및 즉시 고정 또는 추가 24 대 한 인 큐베이 팅, 48 또는 72 h 고정 했다 그들은 전에로 얼룩진 DAPI, 그리고 세포내 기생충의 수를 현미경으로 결정 되었다. (A) BMMs 순화 야생-타입 (WT), 단일 녹아웃 (LMIT1/Δlmit1)에 감염 되었다과 단일 녹아웃 (LMIT1/Δlmit1 + LMIT1) metacyclic promastigotes (나 1:5) 3 h 보완 및 즉시 고정 또는 incubated 추가 표시 시간 점, 그리고 세포내 기생충의 수에 대 한 결정 했다 현미경. 데이터 triplicate 결정의 평균 ± SD 나타내고 3 개의 독립적인 실험의 결과의 대표. 별표 표시 infectivity WT 및 LMIT1/Δlmit1 기생충 간의 중요 한 차이 (학생의 두 꼬리 t-테스트 48 h, p = 0.017; 72 h, p = 0.008). (B) Axenic amastigotes 야생-타입 (WT), 단일 녹아웃 (LMIT1/Δlmit1)와 보완된 단일 녹아웃 (LMIT1/Δlmit1 + LMIT1) 문화에서 감염 BMMs. 그들의 능력에 대 한 테스트 되었습니다 BMMs 1 감염 된 h (나 1:1) 고도 고정 즉시 (1 시간) 또는 후 추가 부 화 24, 48 또는 72 h, 그리고 세포내 기생충의 수 결정 했다 현미경. 데이터 triplicate 결정의 평균 ± SD 나타내고 3 개 이상의 독립적인 실험의 대표. P-값 (학생의 두 꼬리 t-검정) 각 그룹 사이 표시 됩니다. 이 그림은 Mittra, B. 그 외 여러분, 2016에서에서 수정 되었습니다. PloS Pathog에서 출판. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
위에서 설명한 BMM 감염 분석 결과 의해 생성 하는 양적 데이터 수 감염 속도 상대적으로 짧은 기간 (최대 2 주, 2에 비해 독성 속성에서 변경의 신뢰할 수 있는 결정을 조사 개월 vivo에서 실험에 필요한). 이 방법은 DNA 특정 염료 DAPI는 특히 대 식 세포 및 기생충 핵, 얼룩 및 신속한 식별 및 감염 된 세포의 정량화를 허용에 의존 합니다. 비교, Giemsa 같은 다른 얼룩 시각적 분석37복잡 다양 한 강도 가진 다른 세포질 분 대의 많은 수에 바인딩합니다. DAPI 사용 하 여 있습니다 세포내 기생충과 휴대에서 그들의 명확한 구별의 인식 구조 (호스트 세포의 핵도 묻은 게 있다, 그들의 크기는 몇 배나 기생충 핵 보다 더 큰만), 빠르고 쉽게 허용 감염 부 량이 고
어떤 실험 절차와 마찬가지로이 메서드는 몇 가지 제한 및 주의 실행을 요구 하는 몇 가지 중요 한 단계. Vivo에서 Leishmania 감염 복잡 한 타고 난 면역 반응을 이전에 먹어서 감염38의 최고의 코스를 결정 하는 포함 한다. 모델 마우스 긴장의 선택 따라서 연구 설계에 중요 한 중요성 이다. C57BL/6 와 BALB/c 마우스 스트레인이 프로토콜 베어 돌연변이 유전자 인코딩 자연 저항 관련 된 대 식 세포 단백질 (Nramp1), Fe2 + 와 미네소타2 + translocates 양성자 경과 펌프에 사용 대 식 세포는 cytosol로 리소좀/phagolysosomes에서 이온. 이 병원 균 세포8,,3031endocytic 구획 내부 복제 하는 걸릴 결과. 대 식 세포에 성공적인 식민지는 또한 살아남으려면 억제/대 식 세포 활성화39,40면역 반응 조작 infective Leishmania 기생충의 독특한 능력에 따라 달라 집니다. 약간 모방 Leishmania BMM 감염에 대 한 사용 차별화 된 대 식 세포 세포에서 vivo에서, 하지만 분석 결과의 비 활성화 상태에 독성에 영향을 주는 호스트 구성 요소의 훨씬 더 복잡 한 설정에 대 한 고려 하지 않습니다. 동물 모델입니다.
건강 한 infective Leishmania 형태의 절연 정확한 독성 결정에 대 한 다른 절대적으로 중요 한 요구 사항입니다. 모든 promastigotes 모든 Leishmania 긴장의 효율적으로 amastigotes 낮은 pH에 때로 분화 고온 조건41/. 따라서, 감염 수시로 실행 된다 metacyclic promastigotes 고정 promastigote 문화에서 정화와. Metacyclic promastigotes를 효과적으로 격리 하려면 일부 정화 전략의 활용 lipophosphoglycan (LPG)의 광범위 한 수정 내용을 포함 하 여 다른 생활 단계 기생충 표면 glycocalyx의 변화 구성 구조42,,4344. 예를 들어 땅콩 agglutinin (PNA), procyclic 하지 metacyclic LPG를 선택적으로 묶는 lectin 효과적으로 사용 되었습니다 부정적인 선택 프로토콜에 주요 L. metacyclic promastigotes45정화. L. amazonensis 에 대 한 metacyclic promastigote 정화 전략은 일반적으로 단일 클론 항 체 mAb3A.1 procyclic promastigotes metacyclic에 액세스할 수 있는 특정 표면 단백질 epitopes를 대상으로 agglutinate 수 있는 포함 때문에 표면 glycocalyx 수정8,,1332양식. 무대 전용 부 력 밀도 차이에 따라 promastigotes에서 metacyclic promastigotes를 분리 하는 밀도 그라데이션 미디어의 사용 기생충 표면 ligands에 종의 변이에 의존 하지 않습니다 때문에 매력적인 방법입니다. L. 주요 metacyclic promastigote 정화33, 처음 설명 하는이 방법은 성공적으로 동안 원심 분리 조건의 수정 통해 다른 여러 Leishmania 종 채택 되었습니다. 밀도-그라데이션 침전46,47,,4849.
그것은 또한 프로세스의 여러 단계에서 발생할 수 있는 분석 결과의 구현 복잡 하 게 만들 수 있는 문제를 알고 있어야 하는 것이 중요. 이러한 문제는 BMM 추출, 추출, 일관성이 macrophage 도금, 감염 기생충 형태의 불완전 한 정화, 가난한 또는 일치 하지 않는 감염, BMMs의 실패 차별화 중 오염 포함 될 수 있습니다 및 현미경 슬라이드 유리 coverslips를 장착 하는 어려움 이러한 가능성은 프로토콜에서 해결 되었습니다 그리고 신중 하 게 문제를 식별 감염 절차의 각 단계를 평가 하 여 해결할 수 있습니다. 예를 들어 차별화 과정 BMM 문화의 오염 추출 하는 동안 향상 된 메 마른 기술에 대 한 필요성을 나타낼 수 있습니다. 순도 정화 시 약의 신선도 및 정화 프로토콜의 정확한 구현에 주의 깊은 관심 원하는 기생충 형태의 실패 하거나 불완전 한 정화를 해결할 수 있습니다. 불 쌍 한 또는 일치 하지 않는 감염 기생충 또는 너무 높거나 너무 낮은 특정 실험 조건에 대 한 나의 부정확 한 정량화에 의해 발생할 수 있습니다. 다음 추출 하 고, 조작 하 고 유리 coverslips 장착은 틀림 없이이 기술;에서 가장 기술적으로 도전적인 과정 개인은 그들이 선호 하는 coverslips의 처리를 촉진 하기 위해 다른 도구를 사용 하 여 찾을 수 있습니다. DAPI 핵 스테인드의 명확한 시각화 현미경 계산 정확한 기생충에 대 한 중요 하다. 희미 한 얼룩 및 부적당 한 초점 일관성 정량화 뒤에 두 가지 주요 범인 있습니다. 이 품질 관리 DAPI 단계 얼룩, 빛의 노출 시간을 줄이기 위해 사진-표백, 제한 및 신속 하 게 모든 기생충 핵 분야에 대 한 계정에 객관적인 초점을 변경 하 여 보장 수 있습니다. 세제, 샘플의 적절 한 permeabilization 함으로써 고 얼룩 동안 DAPI의 농도 증가 시켜 DAPI 형광 밝기도 개선할 수 있습니다. 정량화 과정을 촉진 수 있는 대체 방법을 현미경 검사 동안 샘플의 디지털 이미지를 얻을 것입니다. 이미지는 정량화는 나중에 사용할 수 있습니다 그리고 독립적인 조사자에 의해 확인/측정할 수 있습니다. 그러나, 신중한 고려를 필요로 하는이 프로세스와 관련 된 기술적인 문제가 있다. PV의 구형 특성상 기생충 않습니다 항상 같은 초점 비행기에. 이 여러 이미지 필요로 미세한 각 필드에 대 한 서로 다른 초점 비행기를 사용 하 여 인수 하 고 이후 모든 기생충에 대 한 계정에 함께 조립. 그렇지 않으면, 사진에서 정량화 매우 오해의 소지가 있을 수 있습니다. 대 식 세포/필드 및 amastigotes/필드의 계산은 일관 된 macrophage 도금 및 기생충의 확산 감염 시 달성을 보장 하기 위해 중요 합니다. BMMs 완전히 차별화 된 세포 이기 때문에, 그들의 숫자가 시간이 지남에 하지 늘어나야 합니다. 호스트 대 식 세포의 수는 시간이 지남에 따라 증가, 대 식 세포는 아직 성숙 되지 않은 의미 합니다. 이 경우, 소스 및 M-CSF의 농도 확인 한다. % 감염 된 대 식 세포의 제공 하는 호스트에 대 한 포괄적인 보기 세포-병원 체 상호 작용, % 감염 및 기생충 부하 유사한 동향20,21 따르지 않는 경우에 특히 유용할 수 있습니다. .
BMM 감염 체 외에서 여기서 설명 하는 방법은 특정 실험적인 요구에 맞게 수정할 수 있습니다. 수정은 BMM 추출 및 분화, 감염 기생충 형태의 정화에 시험관 대 식 세포 감염, 다른 구현 감염의 정량화는 프로세스의 기본 단계를 만들 수 있습니다. 개월과 감염 및 시간 기간 조정 분석. 문화 미디어 구성 요소 또한 쉽게 수정할 수 있습니다 통해 보완 또는 특정 영양분의 고갈 그리고 여러 다른 긴장 또는 기생충의 형태는 동시에 평가 될 수 있다. 이러한 수정 기술 절차;의 추가 조정이 필요할 수 있습니다. 예를 들어 amastigote 준비 및 metacyclic promastigote 정화에 대 한 절차는 다양 한 Leishmania 종 사이 변화를 예상 된다. DAPI, 외 추가 형광 염료 또는 붙일 태그가 세포질 구성 요소 호스트-기생충 상호 작용 프로세스6,24의 포괄적인 범위를 시각화 하기 위해 활용 될 수 있습니다. 또한,이 분석 결과 leishmaniasis24치료에 대 한 새로운 효능 의약품 단서를 식별 하기 위해 화합물 라이브러리의 신속한 심사에 대 한 허용 하는 높은 처리량 시스템 (HTS) 형식에 적용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언
Acknowledgments
이 작품은 노스 웨스트를 건강 그랜트 RO1 AI067979의 국가 학회에 의해 지원 되었다.
YK 학부 친목에서 하 워드 휴즈 의학 연구소/대학 메릴랜드 칼리지 파크의 받는 사람입니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 well cell culture plate | Cellstar | 657160 | |
| Adenine | Acros Organics | AC147440250 | |
| Aerosol Barrier Pipet Tips (100-1000 μL) | Fisherbrand | 02-707-404 | |
| Aerosol Barrier Pipet Tips (20-200 μL) | Fisherbrand | 02-707-430 | |
| Aerosol Barrier Pipet Tips (2-20 μL) | Fisherbrand | 02-707-432 | |
| Bard-Parker Rib-Back Carbon Steel Surgical Blade #10 | Aspen Surgical | 371110 | |
| BD Luer-Lok Tip 10 mL Syringe | Becton Dickinson (BD) | 309604 | |
| BD Precisionglide Needle, 25G | Becton Dickinson (BD) | 305124 | |
| Cell Culture Dish 35 mm x 10 mm | Cellstar | 627 160 | |
| Cell Culture Flask | Cellstar | 660175 | |
| Cover Glasses: 12 mm circles | Fisherbrand | 12-545-80 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| D-Biotin | J.T. Baker | C272-00 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS | |
| Ethyl alcohol 200 proof | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Falcon 100 mm x 15 mm non-TC-treated polystyrene Petri dish | Corning | 351029 | |
| Fetal Bovine Serum | Seradigm | 1500-500 | |
| Ficoll400 | Sigma Aldrich | F8016 | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | E200 | |
| Goat anti-mouse IgG Texas red | Invitrogen | T-862 | |
| Goat anti-rabbit IgG AlexaFluor488 | Invitrogen | A-11034 | |
| Hemin | Tokyo Chemical Industry Co. LTD | H0008 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Isoton II Diluent | Beckman Coulter | 8546719 | |
| L-Glutamine | Gemini | 400-106 | |
| Medium 199 (10X) | Gibco | 11825-015 | |
| Na pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360-070 | |
| Paraformaldehyde | Alfa Aesar | 43368 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gemini | 400-109 | |
| Phosphate Buffered Saline (-/-) | ThermoFisher | 14200166 | |
| Polypropyline conical Centrifuge Tubes 15 mL | Cellstar | 188 271 | |
| Polypropyline conical Centrifuge Tubes 50 mL | Cellstar | 227 261 | |
| ProLong Gold antifade reagent | ThermoFisher | P36930 | |
| Rat anti-mouse Lamp-1 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 1D4B | |
| Recombinant Human M-CSF | PeproTech | 300-25 | |
| Reichert Bright-Line Hemocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| RPMI Medium 1640 (1X) | Gibco | 11875-093 | |
| Triton X-100 Surfactant | Millipore Sigma | TX1568-1 | |
| Trypan Blue | Sigma Aldrich | T8154 | |
| Delicate Scissors, 4 1/2" | VWR | 82027-582 | |
| Dissecting Forceps, Fine Tip | VWR | 82027-386 | |
| Microscope Slides | VWR | 16004-368 | |
| Z1 Coulter Particle Counter, Dual Threshold | Beckman Coulter | 6605699 |
References
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