Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Kvantificering af intracellulære vækst inde makrofager er en holdbar og pålidelig metode til vurdering af virulens i Leishmania parasitter

Published: March 16, 2018 doi: 10.3791/57486

Summary

Alle patogene Leishmania arter opholde sig og replikere indeni makrofager i deres hvirveldyr værter. Vi præsenterer her, en protokol for at inficere murine knoglemarv-afledte makrofager i kultur med Leishmania, efterfulgt af præcis kvantificering af intracellulære vækst kinetik. Denne metode er nyttig til at studere individuelle faktorer, der påvirker vært-patogen interaktion og Leishmania virulens.

Abstract

Livscyklus af Leishmania, det agens af leishmaniasis, veksler mellem promastigote og amastigote stadier i insekt og hvirveldyr værter, henholdsvis. Mens patogene symptomer med leishmaniasis kan variere meget, fra benigne kutane læsioner meget dødelig visceral sygdom former dyrearten infektiøst alle Leishmania arter opholder sig inde i værten makrofager i hvirveldyr fase af deres livscyklus. Leishmania smitteevne er derfor direkte relateret til dens evne til at invadere, overleve og replikere inden for parasitophorous vacuoles (PVs) inde i makrofager. Således fungerer vurderingen af parasittens evne til at replikere intracellulært som en pålidelig metode til bestemmelse af virulens. At studere leishmaniasis udvikling ved hjælp af dyremodeller er tidskrævende, besværligt og ofte vanskelige, især med de pathogenically vigtigt visceral former. Vi beskriver her en metode til at følge den intracellulære udvikling af Leishmania i knoglemarv-afledte makrofager (BMMs). Intracellulære parasit numre bestemmes med 24 timers mellemrum i 72-96 timer efter infektion. Denne metode giver mulighed for en pålidelig bestemmelse af virkningerne af forskellige genetiske faktorer på Leishmania virulens. Som et eksempel viser vi, hvordan et enkelt allel sletning af Leishmania mitokondrie jern Transporter-genet (LMIT1) forringer Leishmania amazonensis mutant stamme LMIT1/ΔLmit1 evne til at vokse inde i BMMs, afspejler en drastisk reduktion i virulens i forhold til wild-type. Denne analyse giver også mulighed for præcis styring af forsøgsbetingelser, der individuelt kan manipuleres til at analysere forskellige faktorer (næringsstoffer, reaktive ilt arter, osv.) indflydelse på vært-patogen interaktion. Derfor, passende udførelse og kvantificering af BMM infektion undersøgelser giver en non-invasiv, hurtig, økonomisk, sikker og pålidelig alternativ til konventionel dyr model undersøgelser.

Introduction

Leishmaniasis refererer til et bredt spektrum af sygdomme hos mennesker forårsaget af protozoer parasit arter af slægten Leishmania. Ca. 12 millioner mennesker smittes i øjeblikket med Leishmania på verdensplan, og mere end 350 millioner er truet. Sygdom patologi afhænger af arternes Leishmania og vært faktorer og symptomer varierer fra uskadelige selvhelende hudlæsioner dødbringende visceralizing former. Hvis ubehandlet, visceral leishmaniasis er dødelig, ranking kun efter malaria som de dødeligste sygdom hos mennesker forårsaget af infektion med protozoer parasitten1. På trods af de vidtrækkende forskelle i sygdom patologi og symptomer har alle Leishmania arter en digenic liv-cyklus vekslende mellem promastigote og amastigote stadier i insekt og hvirveldyr værter, henholdsvis. Indersiden hvirveldyr, Leishmania target host makrofager for invasion og inducere dannelse af parasitophorous vacuoles (PVs), sure segmenter med egenskaberne for phagolysosomes hvor de stærkt virulente amastigote former replikere. Amastigotes vedvarer i værten væv under kroniske infektioner og kan være bestået frem til ikke-inficerede sandfluer, fuldfører transmission cyklus. Derfor, i forbindelse med udvikling af human sygdom, amastigotes er den vigtigste Leishmania lifecycle form2. Undersøge hvordan amastigotes replikere indeni makrofag PVs er afgørende for forståelse Leishmania virulens3,4,5,6,7 og for den udvikling af nye effektive behandlinger.

Vi beskriver her en metode, der bruges regelmæssigt af vores laboratorium til at studere Leishmania infektion og replikering i knoglemarv-afledte makrofager (BMMs), der involverer kvantitative vurdering af antallet af intracellulære Leishmania over tid. Processen indebærer høst af monocytter fra mus knoglemarven og differentiering til makrofager i kultur, in vitro- smitte med infektiøs former (metacyclic promastigotes eller amastigotes) Leishmania og kvantificering af den antallet af intracellulære parasitter på hver 24 h interval for en periode på 72-96 h efter infektion. Denne analyse har været brugt i vores laboratorium til at bestemme virkningen af flere miljømæssige faktorer og parasit gener, herunder identifikation af jern kritiske rolle i at fremme L. amazonensis virulens, der yderligere blev valideret af footpad læsion udviklingsstudier mus6,8,9,10,11,12,13,14,15 . Da alle patogene Leishmania arter fastsætte deres replicative niche inde i værten makrofager, kan dette assay anvendes universelt til virulens bestemmelser i alle Leishmania arter.

Udfører BMM infektioner giver mulighed for analyse af vært-parasit interaktioner på enkelt celle-niveau, og dermed en mere omfattende forståelse af hvordan Leishmania parasitter interagerer med deres foretrukne vært mikromiljø, PVs af makrofager. Makrofag infektion assays er blevet med held brugt af flere grupper16,17,18,19,20,21,22 at udforske funktioner af både vært makrofager og Leishmania specifikke gener og deres potentielle inddragelse i det komplekse samspil, der kendetegner intracellulære infektion. BMM infektioner giver mulighed for kvantificering af parasitten vækst som en udlæsning af virkningen af vært faktorer, der påvirker intracellulære overlevelse, som microbicidal nitrogenoxid produktion, generation af reaktive ilt arter og andre ugunstige forhold stødt inde i lysosomet-lignende PVs23. Makrofag infektion assays har også været udnyttet til at identificere potentielle anti-leishmanial medicin kundeemner for terapeutisk udvikling13,24.

In vitro- arten af BMM infektioner giver flere fordele sammenlignet med andre metoder til at vurdere Leishmania virulens. Flere tidligere studier undersøger mekanismer af intracellulære parasit overlevelse over tid dog ikke kvantificere infektion som en sats20,21,24. Desuden, mange undersøgelser fokuseret på efter i vivo infektioner over tid gjorde det ved at måle kutan læsion størrelse og andre fysiologiske symptomer, der er kun indirekte relateret til parasit replikering25,26 , 27. in vivo infektion er en stringent tilgang til at vurdere parasit virulens, men læsion størrelse målinger baseret på footpad hævelse alene er ofte utilstrækkelige, da de afspejler det inflammatoriske respons i inficeret væv og ikke den absolutte antal af parasitter. Af denne grund, footpad læsion udvikling assays skal følges ved kvantificeringen af parasitten belastning inficeret væv, en procedure, der kræver lange begrænsende fortynding-undersøgelser,28. Desuden, indebærer i vivo undersøgelser ofte, at ofre flere dyr på forskellige punkter i tid til at udtrække væv af interesse6,8,9,10, 11 , 13. derimod stort antal BMMs kan fås fra bare ét dyr, og disse celler kan være forgyldt betingelser, som tillader vurdering af infektion på forskellige punkter i tid. Derudover giver sammenlignes i vivo undersøgelser, udfører in vitro- BMM infektioner større kontrol over forsøgsbetingelser. Kvantificere makrofager at blive smittet med parasitter, selv giver præcis kontrol over mangfoldigheden af infektion (MOI) og dyrkningsbetingelserne. Fin kontrol over disse faktorer kan være nøglen til at identificere karakteristika af diskrete cellulære veje og forstå deres indflydelse på forløbet af infektionen.

Disse fordele er det noget overraskende, at meget få grupper at studere Leishmania virulens hidtil har taget fuld fordel af kvantitativ evaluering af intracellulær replikation i makrofager. I denne artikel vil diskutere vi fælles faldgruber, der kan være hæmmer de mere omfattende udnyttelse af denne analyse, og give en trinvis protokol for at lette dets korrekte gennemførelse. I betragtning af dens præcision og alsidighed, BMM infektion analysen vi beskrive her kan ikke kun udnyttes til at udforske vært-patogen interaktioner påvirke Leishmania virulens, men også at studere andre mikroorganismer, der replikerer inde makrofager29. Vigtigere, kan dette assay også udvikles som en hurtig og økonomisk præklinisk screeningsmetode for anti-leishmanial medicin udvikling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eksperimentelle procedurer blev udført i overensstemmelse med henstillingerne i vejledningen for pleje og anvendelse af forsøgsdyr af National Institutes of Health og blev godkendt af University of Maryland's IACUC. Alle trin beskrevet i afsnit 1-4 foretages under aseptiske forhold inde biologiske laminar flow kabinetter. Personlig beskyttelse bør anvendes, og skal der udvises forsigtighed under håndteringen af levende Leishmania parasitter i alle faser af eksperimenter.

1. isolering og differentiering af knoglemarv-afledte makrofager (BMMs)8,30,31

  1. Dag 0: Ofre 4 - 6 uger gamle kvindelige C57BL/6 eller BALB/c mus i en CO2 sal og bekræfte død via cervikal dislokation. Sikre sterilisering af saks og pincet ved at holde dem i blød i 70% ethanol. Spray handsker med 70% ethanol tillade steril håndtering overalt i knoglemarven celle isoleret proces.
  2. Sikre ofrede mus til dissektion bord ved pinning sin forbens og desinficere ved sprøjtning rigeligt med 70% ethanol.
  3. Gør et lille snit (ca. 1 cm) med en saks i nærheden af hofteleddet. Omhyggeligt indsætte saks under huden til at adskille den underliggende muskel og skære huden hele vejen omkring hofteleddet.
    Bemærk: Dissektion bestyrelsen kan drejes for at give bedre adgang til hofteleddet.
  4. Omhyggeligt deglove huden fra benet ved at trække mod anklen og fjerne. Afbrød foden på anklen, være meget omhyggelig med at skære ned på eller under anklen fælles at forlade tibia fuldt intakt.
    Bemærk: Fibula i denne fase lægges løst og let kan adskilles med pincet.
  5. Manuelt finde hofteleddet ved at manipulere lårbenet for at identificere punktet af rotation. Omhyggeligt bruge saks til at bryde ben over hofteleddet at forlade den proksimale leder i femur intakt.
  6. Fjern så meget muskel og bindevæv som muligt fra benet med en saks. Fjerne enhver resterende hud fra anklen og overskydende knoglemateriale over hofteleddet.
  7. Placer renset ben knogler i sterile RPMI suppleret med penicillin/streptomycin (1% slutkoncentration) i en petriskål på is.
  8. Gentag trin 1.4 gennem 1,6 at isolere skinnebenet og lårbenet fra de andre bagben.
  9. Fjern eventuelle resterende muskler og bindevæv fra knoglerne iblødsætning i RPMI ved hjælp af steriliseret pincet og sterile #10 blade.
  10. Placer knogler på petriskål låget. Skære tibia omhyggeligt med klinge umiddelbart ovenfor fodleddet adgang til marven. Fjerne tibia fra resten af benet ved at skære lige under knæleddet.
  11. Trække 10 mL sterilt RPMI suppleret med penicillin/streptomycin (1% slutkoncentration) i et 10 mL sprøjte og vedhæfte en 25G kanyle.
  12. Hold tibia fast med pincet, lodret over en 50 mL konisk slange på is. Brug sprøjten til forsigtigt injicere ca. 5 mL RPMI i slutningen af knogle til at skylle knoglemarv ud af anden enden ind i den koniske rør. Skyl knoglemarven med ialt 10 mL RPMI, indtil knoglen bliver hvidt.
    Bemærk: Efter grundig skylning, bør knoglen bliver hvide. Hvis ikke, Fortsæt skylning for at fjerne marv. Den distale ende af skinnebenet kan være nødvendigt at blive trimmet tilbage med kniven, hvis det er for snæver til at indsætte nålen.
  13. Skære lårbenet umiddelbart over knæleddet og straks nedenfor hofteleddet at afsløre begge ender af knoglen adgang til marven. Skylle knoglemarv fra lårbenet med ialt 10 mL RPMI på samme måde som tibia.
  14. Gentag rengøring og rødmen trin 1,6 gennem 1.13 med de resterende knogler og indsamle knoglemarv skyllet celler i en enkelt 50 mL konisk slange
    Bemærk: Hvis en knogle pauser på noget tidspunkt under dissektion før knoglen rødmen, brug ikke marv fra denne knogle.
  15. Centrifuge konisk røret bruges til at indsamle knoglemarv skyllet fra alle fire ben til 10 min. ved 4 ° C på 300 x g.
  16. 60 ml af sterile BMM medium (RPMI med en endelig koncentration på 20% FBS, 1% penicillin/streptomycin, 1,2 mM Na-pyruvat, 25 µg/mL mennesker Mikkelsen-CSF) ind i en 175 cm2 celle kultur kolbe med filter cap.
  17. Kassér den supernatanten følgende centrifugering og resuspenderes celle af blid op og ned ad pipettering med 5 mL af BMM medium fra kolben.
  18. Overføre cellesuspension kultur kolben og skyl den koniske rør to gange med BMM medium fra kultur kolben til at sikre maksimal celle opsving. Sikre cellesuspension er grundigt blandet ind i medium og distribuere 30 mL fra indledende 175 cm2 celle kultur kolben til en anden 175 cm2 celle kultur kolbe med filter cap.
  19. Inkuber begge målekolber indeholdende 30 mL cellesuspension hver natten over ved 37 ° C, 5% CO2 til adskillelse af alle forurenende fibroblaster, bosiddende makrofager og andre vedhængende celler.
  20. Dag 1: Overføre supernatanten udifferentierede knoglemarv celler fra kolber til 100 mm x 15 mm ikke-TC-behandlede polystyren petriskåle på ca. 10 mL/parabol og inkuberes ved 37 ° C, 5% CO2. Kassér kolberne.
  21. Dag 3 eller 4: Tilføje en ekstra 5 mL BMM medium (pre-hjertelig til 37 ° C) til hver petriskål og fortsætte inkubation ved 37 ° C, 5% CO2.

2. plating BMMs på Coverslips for infektion (dag 7 eller 8)

  1. Forbered 6-godt vævskultur plader ved at placere fire (4) sterile 12 mm glas coverslips (autoklaveres og opbevares i et lukket glasbeholder) i bunden af hver Tom godt.
    Bemærk: Afhente hver sterile 12 mm coverslip med en aspirating spids monteret et vakuum linje. Læg coverslips i brønde uden overlapning, frigive på den ønskede position ved at klemme i røret for at afbryde vakuum.
  2. Aspirat medier (og eventuelle ikke-tilhænger celler) fra petriskåle belagt med vedhængende knoglemarv afledt makrofager og forsigtigt skyl tilhænger celler 2 x med steril Dulbecco fosfatbufferet saltopløsning uden calcium og magnesium chlorid (PBS- / -) pre varmet til 37 ° C.
  3. Tilsættes dråbevis, 5 mL sterilt 1 x PBS- / - med en endelig koncentration på 1 mM EDTA til hver petriskål og Inkuber i 5 minutter ved 37 ° C at løsrive tilhænger BMMs. Bekræft at cellerne er adskilt ved hjælp af et mikroskop.
  4. Indsamle alle fritliggende celler suspenderet i 1 x PBS- / - suppleret med 1 mM EDTA i en 50 mL konisk slange. Skyl hvert fad 2 x med 5 mL PBS- / - og tilføje til celle suspension pool.
    Bemærk: Cellesuspension kan fortyndes med yderligere PBS- / - at beskytte makrofager fra EDTA toksicitet i forbindelse med indsamlingen proces.
  5. Der centrifugeres ved 300 x g i 10 min. ved 4 ° C. Kassér supernatanten og resuspend makrofager i 5-10 mL BMM medium af pipettering. Sted genopslemmes celler på isen for at forhindre tilknytning til rør og sammenklumpning.
  6. Grev levedygtige celler benytter Trypan blå udstødelse i hemocytometer.
    Bemærk: Hvis du vil tælle BMM celler genopslemmes i 5 mL medium, en fortynding-mix af 25 µL cellesuspension i 445 µL PBS- /- og 30 µL 0,4% Trypan blå løsning typisk tillader nem kvantificering i en hemocytometer (under hensyntagen til en 20 x fortyndingsfaktoren for den endelige beregning ). Tæl kun celler, der ikke blive plettet med Trypan blå (levedygtige celler). Mængden af cellesuspension kan ændres, hvis denne blanding er også koncentreret eller fortyndet. I almindelighed, varierer udbyttet af BMM pr. forberedelse mellem 2 x 107 og 5 x 107 celler fra et enkelt museklik.
  7. Forberede cellesuspension i BMM medium på ønskede plating koncentration (5 x 105/mL) og sprede suspension til 6 godt plader i 2 mL medium pr. brønd, så hver kan godt modtage 1 x 106 makrofager.
    Bemærk: Dette er et afgørende skridt, der sikrer hver godt får det tilstrækkelige antal makrofager at dække coverslips ensartet. Kontroller, at coverslips i brønde ikke overlappende eller flydende på mediet. Hvis ja, justere forsigtigt med en steril pipette spids.
  8. Der inkuberes natten over ved 37 ° C, 5% CO2.

3. rensning af inficeret former af L. amazonensis

Bemærk: Forberede Leishmania infektioner - rense metacyclic promastigotes fra stationære promastigote kulturer8,13, eller differentiere promastigotes i kultur i amastigote form ved hjælp af standard L. amazonensis axenic differentiering protokol6,8.

  1. Rensning af Leishmania metacyclic promastigotes ved hjælp af tæthed gradient media(Materials) 33
    1. Forberede 40% stamopløsning af tæthed gradient medier i sterile, endotoxin-gratis vand.
    2. Fortynd tæthed gradient løsning i 10 x M199 medium (uden serum) for at forberede 10% koncentration i M199 medium.
    3. Filtrere alle løsninger gennem 0,22 µm filter.
      Bemærk: Lager løsninger kan opbevares ved 4 oC i mørke i længere end 1 måned.
    4. Tilsættes 2 mL 40% tæthed gradient medier i bunden af en 15 mL konisk centrifugeglas.
    5. Layer 2 mL 10% tæthed gradient media løsning i M199 oven på 40% tæthed gradient media lag omhyggeligt, ved hjælp af Pasteurs pipette til at undgå enhver blanding mellem de to lag.
    6. Indsamle 1 x 109 parasitter fra stationære fase kultur ved centrifugering ved 1.900 x g i 10 min.
    7. Resuspend celler i 6 mL Dulbecco ændret afgørende Medium (DMEM).
    8. Lag 2 mL cellesuspension direkte oven på de 10% tæthed gradient media lag forsigtigt, ved hjælp af Pasteurs pipette til at undgå at blande mellem lagene.
    9. Der centrifugeres hældning over 10 min på 1.300 x g ved stuetemperatur.
      Bemærk: På grund af forskelle i fysiske egenskaber mellem Leishmania arter, centrifugeringsbetingelserne for hver muligvis justeres lidt for at sikre maksimalt udbytte.
    10. Indsamle parasitter (beriget med metacyclic promastigote form) fra bandet dannet på øverste 10% tæthed gradient media grænse (interface mellem 0% og 10% tæthed gradient media lag).
    11. Fortynd parasitter med en volumen på DMEM og indsamle ved centrifugering (1.900 x g i 10 min. ved stuetemperatur).
    12. Resuspend i 500 µL DMEM medium og regne i en hemocytometer at kvantificere udbytte.
  2. Generation af L. amazonensis amastigotes axenic kultur betingelser (lav pH / forhøjet temperatur)6,8,13
    1. Mix 5 mL af log-fase promastigote kultur (pH 7,4 på 26 oC) med et lige saa stort volumen af amastigote medium (pH 4.5), ved hjælp af 25 cm2 flasker (samlede 10 mL medium) og inkuberes ved 26 ° C natten over.
    2. Skift kolben fra 26 ° C til 32 ° C.
    3. Efter 3 eller 4 dage, opdele kultur 1:5 i amastigote medier ved 32 ° C.
    4. Kontrollere parasitter i de næste 3-4 dage (maksimalt 7 dage) at se, om de er klar til brug i infektioner.
      Bemærk: Sund axenic amastigotes bør have en oval form, uden synlige flageller. Delvist opdelte amastigotes har en stor oval form med korte flageller. Kultur bør ikke have en masse klumper - mange klumper er en indikation af ikke-vokser, dør parasitter. Amastigote kulturen kan split 1:5 og opretholdes i en periode på højst 3 uger.

4. infektion med L. amazonensis

  1. Fortynd parasit suspensioner ifølge ønskede MOI (normalt 3-5 metacyclic promastigotes per makrofag [MOI 1:3 eller 1:5]) og 1 amastigote pr. makrofag [MOI 1:1]. Tilføje Leishmania i PBS- / - i et volumen på 50-100 µL til hver brønd allerede indeholdende 2 mL medium.
  2. Inkubér BMMs 1 h med amastigotes og 3 h med metacyclic promastigotes på 34 oC for infektion.
    Bemærk: Optimale infektion temperatur kan variere efter art.
  3. Efter inkubationen grundigt vaske væk gratis parasitter i hver godt 3 x med 2 mL PBS- / - pre opvarmet til 37 ° C.
    Bemærk: Sprede PBS forsigtigt for at sikre, at coverslips ikke flyde over hinanden. Forsigtigt swirl pladen og derefter suges ud af væsken. Bruge separate sugning tip, hvis du bruger flere stammer af parasitter for at undgå krydskontaminering.
  4. Fix 1 h eller 3 h tidspunkt prøver af inkubere hver godt med 1,5-2 mL 2% PFA i PBS- / - for 10 min. vask 3 x med PBS- / -. Ikke Aspirér sidste vask og køleskab plader der indeholder coverslips i PBS indtil farvning.
  5. Tilsæt 2 mL frisk BMM medium til hver brønd på plader for yderligere tid-point og inkuberes ved 34 ° C.
  6. Fix resterende tid-punkter som ønsket som beskrevet i trin 4.3, og opbevares i køleskab plader indtil farvning.

5. DAPI farvning og Coverslip montering

  1. Opsug PBS fra brønde indeholdende coverslips og tilføje 1,5 mL PBS- / - med 0,1% nonionisk detergent. Der inkuberes i 10 min. ved stuetemperatur, efterfulgt af 3 x vask med 2 mL PBS- / -.
  2. Der tilsættes 1 mL PBS- / - med 2 µg/mL DAPI (fortyndet fra 5 mg/mL stamopløsning i vand) til brønde med coverslips og inkuberes i en anden 1 time ved stuetemperatur.
    Bemærk: Inkubationstiden med DAPI er afgørende for korrekt visualisering af intracellulære Leishmania parasitter. Makrofag kerner pletten hurtigt, på grund af deres større størrelse og DNA indhold men farvningen af kerner af de intracellulære parasitter er langsommere. Således er udvide inkubationstiden ud over hvad der kræves for at visualisere BMM kerner nødvendigt at tillade DAPI at gennemsyre gennem og parasit plasmamembran og Kernemembranen parasit. Med ordentlig DAPI pletten, kan den mitokondrielle kinetoplast DNA i nærheden af flagellaternes lommen af parasitten også visualiseres, ud over den nukleare DNA.
  3. Vask hver godt indeholdende coverslips 3 x med 2 mL PBS- / - og derefter lift og vend coverslips med pincet til at placere cellen side ned og montere på glas mikroskop slides med en kommercielt tilgængelig antifade montering reagens.
    Bemærk: Coverslips er meget skrøbelige og bør forsigtig håndtering. Undgå at lægge pres på dem, især mod dæksiden af brøndene ved løft. Tilføje et par dråber af PBS- / - nedsætter overfladespænding mellem coverslip og godt og letter løft processen. En fin gauge kanyle kan bruges til at hjælpe med nysgerrige coverslips fra bunden af brønden. Efter at placere en coverslip på diaset, tryk forsigtigt ned med pincet til at skubbe ud eventuelle luftbobler i montering medier. Hvis en coverslip er brudt eller har måske vendt under løft processen, ikke remount; Du skal blot bruge den ekstra fjerde coverslip.
  4. Opbevares i køleskab dias indtil kvantificering.

6. infektion kvantificering

  1. Undersøge DAPI-farvede dias under et fluorescens mikroskop ved at fokusere på makrofager ved hjælp af 100 X mål linse med immersionsolie (excitation på 358 nm; optimal emission på 461 nm).
    Sikre, at fokus er på lag af makrofager mellem glas dias og coverslip.
  2. Kvantificere antallet af makrofager (store cellekerner farves med DAPI) og antallet af mindre amastigote kerner grupperet omkring enkelte makrofag kerne (Se figur 2A, DAPI) for hver synsfelt ved hjælp af en manuel counter.
    Bemærk: Amastigote kerner kan ikke alle være synlige i et plan med fokus på grund af deres lille størrelse. Tælle dem, der er synlig, når fokuseret på makrofag kerner, og derefter bruge fine fokus til at kontrollere for parasitten kerner i fly over og under makrofag kerner.
  3. Flytte til et andet synsfelt gentage kvantificering. Brug en separat counter nøgle til at spore antallet felter tælles. Flytte gennem visuelle felter i parallelle rækker på tværs af hver coverslip, at forhindre tælle overlapning.
  4. Kvantificere et minimum af 200 makrofager pr. coverslip. Kvantificere hvert tidspunkt af infektion i tre eksemplarer (3 coverslips). Regne den fjerde coverslip, hvis en af de tidligere ikke er egnet til optælling af coverslip overlapning, dårlig montering, glas brud, osv.
    Bemærk: Hvis 200 makrofager ikke kan tælles på enhver én coverslip, tælle reservedele fjerde.
  5. Beregne smittespredningen som amastigotes/makrofag eller amastigotes/100 makrofager og bestemme procent inficerede makrofager fra rå kvantificering data.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Leishmania har to infektiøst former - metacyclic promastigotes, der adskiller fra procyklisk promastigotes på den stationære fase af kultur og amastigotes, som er de intracellulære faser (figur 1). I nogle Leishmania arter såsom L. amazonensis, kan amastigotes også være differentieret i axenic kultur ved at flytte promastigote cellerne til at sænke pH (4,5) og forhøjet temperatur (32 ° C), betingelser svarende til dem fundet inde BMM PVs 8 , 34. kun metacyclic promastigote eller amastigote former for Leishmania er i stand til at inducere dannelse af PVs og replikere intracellulært efter at blive opslugt af vært makrofager35. Udifferentierede log-fase promastigotes er ikke-virulente og ude af stand til at fremme PV dannelsen (figur 2).

For infektioner med metacyclic promastigotes er der normalt en 24-timers forsinkelse før en stigning i antallet af intracellulære parasit. Dette sker fordi de metacyclic promastigotes har første til at differentiere i amastigotes, før de begynder at gentage. Derfor infektioner indledt med metacyclic promastigotes vil tage længere tid at vise stigninger i samlede intracellulære parasit numre, og af denne grund, muligvis inkuberes i længere tid point.

Figur 2A repræsenterer en vellykket infektion ved hjælp af axenically differentieret amastigotes, viser intracellulære lokalisering af Leishmania (i rødt) efter den første infektion (1 h), før dannelsen af PVs ved fusion af phagosomes med lysosomer. På 48 h, kan forskellige store PVs husly flere parasitter observeres. En støt stigning i antallet af parasitter inde PVs er karakteristisk for virulente Leishmania -infektioner. Non-virulente log-fase promastigotes (figur 2B), derimod er ikke i stand til at indlede PV udvikling (48 h tidspunkt), undlader at replikere og til sidst dør inde i værten makrofager, selv når det tages af vært makrofager på sammenlignelige tal til metacyclic promastigotes eller amastigotes.

For at demonstrere effektiviteten af denne metode, vi sammenlignede vildtype L. amazonensis med LMIT1/ΔLmit1 parasitter der indeholder en enkelt kopi af LMIT1 (Leishmania Mitochondrial jegron T ransporter 1)-genet, som resulterer i svækkelse af mitokondrie jern importere13. Tab af en LMIT1 allel ikke resulterer i væsentlige ændringer af mitokondrie-aktivitet i LMIT1/ΔLmit1 promastigotes eller reducere udbyttet af renset metacyclic former i forhold til vildtype promastigotes13. Renset metacyclic promastigotes fra både wild-type (WT) og LMIT1/ΔLmit1 stationære kulturer var lige så effektiv i invaderende BMMs, baseret på det tilsvarende antal intracellulære parasitter kvantificeret 1 h efter infektion ( Figur 3A, 1 h). Efter en indledende 24 h tidsforskydning, der er nødvendig for metacyclic promastigotes til at tilpasse sig og differentiere i amastigote former, en støt stigning i antallet af intracellulære vildtype parasitter (ca 3-fold mellem 24 og 72 h tid point) blev observeret. Derimod blev lidt eller ingen intracellulære vækst af LMIT1/ΔLmit1 parasitter (Sammenlign 1 og 72 h tidspunkter) observeret, tyder på at tab af enkelt LMIT1 allel væsentligt påvirker denne stamme evne til at vokse inde makrofager. Episomal udtryk af LMIT1 proteinet i suppleret stammen (LMIT1/ΔLmit1+LMIT1) reddet intracellulære parasit vækst til wild-type niveauer, bekræfter, at LMIT1 er afgørende for amastigote intracellulære replikering og virulens13.

Makrofag infektioner, der er udført med axenic amastigotes, genereret af skiftende promastigote kulturer (pH-værdi på 7,4; 26 oC) til amastigotes vækstbetingelser (pH 4,5; 32 oC)34,36, viste en intracellulær vækst mønster (figur 3B) svarende til den konstaterede med metacyclic promastigotes (figur 3A). Efter sammenlignelige niveauer af oprindelige optagelse (figur 3B, 1 h) wild-type (WT) og LMIT1 suppleres (LMIT1/ΔLmit1+LMIT1) amastigotes voksede støt, mens LMIT1/ΔLmit1 amastigotes igen ikke kunnet udvise intracellulære vækst. Axenic amastigotes var mere smitsom (MOI 1:1 i forhold til 1:5 for metacyclic promastigotes) og replikeret mere effektivt inde PVs.

Vores data viser en indledende 24 h forsinkelse for metacyclic promastigote infektioner, før der er en stigning i intracellulære parasit nummer (Sammenlign mellem 24 h tidspunkter i figur 3A og 3B). LAG'en repræsenterer den nødvendige tid til internaliseret metacyclic promastigotes først skelne i amastigotes før du begynder at kopiere. En fælles fejl folk gør, når du bruger metacyclic promastigotes til at inficere, er ikke vente længe nok. I tilfælde, hvor ændringen i virulens ikke er drastiske, udført eksperimenter over 96 h snarere end 72 h producere langt mere pålidelige målinger.

Figure 1
Figur 1 : Scanning elektron Mikrograf billeder af forskellige L. amazonensis livsstadier. Log-fase promastigote, metacyclic promastigote fra stationære fase og axenic amastigote. Bar = 10 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : En repræsentativ illustration af BMM infektion med virulente axenic amastigotes (A) og ikke-virulente log-fase promastigotes (B) af L. amazonensis. Immunfluorescens billeder af makrofager isoleret fra BALB/c mus, 1 og 48 timer efter infektion. Inficerede makrofager blev behandlet for immunofluorescens som beskrevet i protokollen. PV membraner var farvet med rotte anti-Lamp1 monoklonalt muse-antistof (1:1, 000 fortynding) for 1 h, efterfulgt af 1 h inkubation med anti-kanin fluorescerende IgG (1: 500 fortynding). Parasit farvning blev udført ved at inkubere coverslips med musen polyklonale antistoffer dannet mod axenic L. amazonensis amastigotes, efterfulgt af anti-mus IgG røde farvestof (1: 500 fortynding) 6. Alle coverslips blev yderligere behandlet med DAPI for farvning kerner. (A) dannelsen af særskilte PVs husly flere amastigotes for 48 h tidspunkt er karakteristisk for en vellykket Leishmania infektion med axenic amastigotes. (B) manglende særskilte PV dannelse og kopiere amastigotes for 48 h tidspunkt er typisk manglende virulens i promastigotes fra log-fase kultur. Rød angiver -Leishmania farvning, grøn angiver anti-Lamp1, blå angiver DAPI-farvede DNA og gul indikerer sammenfletning af anti-Lamp1 og DAPI pletter. Barer, 5µm. Dette tal er blevet ændret fra Mittra, B. et al., 2013. Oprindeligt udgivet i J. Exp. Med. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Sletning af en LMIT1 allel alvorligt svækker den intracellulære vækst af mutant LMIT1/Δlmit1 parasitter. BMM blev smittet for den angivne tidspunkter med L.amazonensis og enten fast straks eller yderligere inkuberes i 24, 48 eller 72 timer før de blev fastsat, farves med DAPI, og antallet af intracellulære parasitter blev fastsat mikroskopisk. (A) BMMs var smittet med renset wild-type (WT), enkelt knockout (LMIT1/Δlmit1) og suppleret enkelt knockout (LMIT1/Δlmit1 + LMIT1) metacyclic promastigotes (MOI 1:5) for 3 h og fast straks eller rugede yderligere blev for de angivne tidspunkter, og antallet af intracellulære parasitter fastsat mikroskopisk. Data repræsenterer den gennemsnit ± SD af tredobbelt bestemmelser og er repræsentative for resultaterne af tre uafhængige forsøg. Stjernerne angiver betydelige forskelle i smitteevne mellem WT og LMIT1/Δlmit1 parasitter (Students to-sidede t -test 48 h, p = 0,017; 72 h, p = 0,008). (B) Axenic amastigotes fra wild-type (WT), enkelt knockout (LMIT1/Δlmit1) og suppleret enkelt knockout (LMIT1/Δlmit1 + LMIT1) kulturer blev testet for deres evne til at inficere BMMs. BMMs blev smittet for 1 h (MOI 1:1) og enten fast straks (1 h) eller efter yderligere inkubation i 24, 48 eller 72 h, og antallet af intracellulære parasitter blev fastsat mikroskopisk. Data repræsenterer den gennemsnit ± SD af tredobbelt bestemmelser og er repræsentative for mere end tre uafhængige forsøg. P-værdierne (Students to-sidede t-test) mellem de respektive grupper er anført. Dette tal er blevet ændret fra Mittra, B. et al., 2016. Oprindeligt udgivet i PloS Pathog. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De kvantitative data produceret af BMM infektion assay beskrevet ovenfor, giver mulighed for efterforskerne at indhente priser af infektion og en pålidelig bestemmelse af ændringer i virulens egenskaber i en relativt kortere tidsperiode (maksimalt 2 uger, i forhold til 2 måneder kræves for i vivo forsøg). Denne metode bygger på DNA specifikke farvestoffet DAPI, som specifikt pletter makrofag og parasit kerner, og giver mulighed for hurtig identifikation og kvantificering af inficerede celler. I sammenligning, andre pletter såsom Giemsa binder sig til et stort antal forskellige cellulære komponenter med varierende intensitet, komplicerende visuel analyse37. Brugen af DAPI giver anerkendelse af intracellulære parasitter og deres klare sondring fra cellulære strukturer (kun kerner i værtsceller også farves, og deres størrelse er flere størrelsesordener større end parasit kerner), giver mulighed for lettere og hurtigere kvantificering af infektioner.

Som ved alle eksperimentelle procedurer, har denne metode nogle begrænsninger og flere kritiske trin, der kræver omhyggelig udførelse. In vivo Leishmania infektion indebærer komplekse medfødte immunologisk respons inden fagocytose, som bestemmer det ultimative kursus for infektion38. Valg af model mus stamme, er derfor af afgørende betydning i undersøgelsen design. Både C57BL/6 og BALB/c mus stamme bruges i denne protokol bærer mutationer i genet kodning naturlig resistens-associerede makrofag protein (Nramp1), en proton efflux pumpe, der translocates Fe2 + og Mn2 + ioner fra makrofag lysosomer/phagolysosomes ind i cytosol. Dette resulterer i øget modtagelighed over for patogener, der replikerer inde i endocytic rum af makrofager8,30,31. Vellykket kolonisering i makrofager afhænger også af infektioest Leishmania parasitter unikke evne til at manipulere immunrespons for at undertrykke/overleve makrofag aktivering39,40. De differentierede makrofager bruges til Leishmania BMM infektioner noget efterligne den ingen-aktiveret tilstand af makrofager i vivo, men analysen tager ikke højde for de meget mere komplekst sæt af vært komponenter, der påvirker virulens i dyremodeller.

Isolering af sunde infektiøst Leishmania former er det andre helt afgørende krav for nøjagtig virulens bestemmelse. Ikke alle promastigotes af alle Leishmania stammer effektivt differentiere i amastigotes når de udsættes for lav pH / høj temperatur betingelser41. Derfor er infektioner ofte udført med metacyclic promastigotes renset fra stationære promastigote kulturer. Du kan effektivt isolere metacyclic promastigotes, drage nogle rensning strategier fordel af den skiftende sammensætning af parasitten overflade glycocalyx under forskellige livsstadier, herunder omfattende ændringer af lipophosphoglycan (LPG) struktur42,43,44. For eksempel, har peanut agglutinin (PNA), en lektin, som binder sig selektivt til procykliske, men ikke metacyclic LPG været effektivt bruges i negative valg protokoller til at rense L. store metacyclic promastigotes45. Metacyclic promastigote rensning strategi for L. amazonensis omfatter normalt et monoklonalt antistof-mAb3A.1, som kan agglutinere procyklisk promastigotes ved at målrette specifikke overflade protein epitoper, der er utilgængelige i metacyclic formularer på grund af overflade glycocalyx ændringer8,13,32. Brugen af en tæthed gradient medier til at adskille metacyclic promastigotes fra promastigotes baseret på scenen-specifikke forskelle i livlig tæthed er en attraktiv metode, fordi det ikke afhænger af artsspecifik varianter i parasit overflade ligander. Denne metode, oprindeligt beskrevet for L. store metacyclic promastigote rensning33, er med held vedtaget for flere andre Leishmania arter hovedsagelig gennem ændringer af centrifugeringsbetingelserne under densitet-gradient sedimentering46,47,48,49.

Det er også vigtigt at være opmærksom på problemer, der kan vanskeliggøre gennemførelsen af den analyse, som kan forekomme i flere trin i processen. Disse problemer kan omfatte forurening under BMM udvinding, mislykket differentiering af BMMs efter ekstraktion, inkonsekvent makrofag plating, ufuldstændige rensning af inficeret parasit former, fattige eller inkonsekvente infektion, og vanskeligheder montering glas coverslips på objektglas. Disse muligheder er blevet behandlet i protokollen, og kan løses ved at omhyggeligt vurdere hvert trin af proceduren infektion at identificere problemet. For eksempel, kan forurening af BMM kulturer under differentiering proces indikere behov for forbedret steril teknik under udvinding. Omhyggelig opmærksomhed på renhed og friskhed af rensning reagenser og præcis gennemførelse af rensning-protokollen kan berigtige mislykket eller ufuldstændig rensning af de ønskede parasit former. Dårlig eller inkonsekvente infektioner kan være forårsaget af unøjagtige kvantificering af parasitter eller en MOI, der er for høj eller for lav for de specifikke forsøgsbetingelser. Efter ekstraktion, manipulere og montering af glas coverslips er velsagtens den mest teknisk udfordrende proces i denne teknik; enkeltpersoner kan finde, de foretrækker at bruge forskellige værktøjer til at lette håndtering af coverslips. Klart visualisering af DAPI farves kerner er kritisk for nøjagtig parasit tælle under mikroskop. Svag farvning og forkert fokus er to største syndere bag inkonsekvent kvantificering. Dette kan sikres ved kvalitetskontrol af DAPI farvning skridt, begrænser lys eksponeringstid til at reducere foto-blegning, og hurtigt skiftende den objektive fokus for at tage hensyn til alle parasit kerner i feltet. DAPI fluorescens lysstyrke kan også forbedres ved at sikre korrekt permeabilization af prøverne med rengøringsmiddel, og ved at øge koncentrationen af DAPI i farvning. En alternativ tilgang, der kan lette kvantificering processen er at få digitale billeder af prøverne under mikroskopisk undersøgelse. Billederne kan bruges til kvantificering på et senere tidspunkt og kan være kontrolleret/kvantificeres ved uafhængige undersøgere. Men der er tekniske problemer forbundet med denne proces, der kræver nøje overvejelse. På grund af den sfæriske karakter af PV er parasitter ikke altid på den samme fokalplan. Dette kræver at flere billeder skal anskaffes ved hjælp af forskellige fokale planer for hver mikroskopiske felt, og efterfølgende samlet at tage højde for alle parasitterne. Ellers, kvantificering fra fotografier kan være meget vildledende. Beregninger af makrofager/felt og amastigotes/felt er afgørende for at sikre konsekvent makrofag plating og spredning af parasitter blev opnået under infektion. Da BMMs er fuldt differentierede celler, må deres antal ikke stige over tid. Hvis antallet af vært makrofager øges over tid, betyder det, at makrofager var stadig umodent. I så fald bør kilde og koncentrationen af M-CSF kontrolleres. Bestemmelse af procent inficerede makrofager kan også være nyttige i at yde en omfattende visning af værten celle-patogen interaktion, især i tilfælde hvor procent infektion og parasit belastning ikke følger lignende tendenser20,21 .

Metode til in vitro- BMM infektion detaljeret her kan ændres til specifikke eksperimentelle behov. Ændringer kan foretages til en af de grundlæggende trin i processen - BMM udvinding og differentiering, rensning af inficeret parasit former og kvantificering af in vitro makrofag infektioner samt gennemførelsesbestemmelserne infektioner med forskellige MOIs og justere perioden infektion og tid-point analyseret. Kultur medier komponenter kan også let ændres via tilskud eller udtynding af bestemte næringsstoffer, og flere forskellige stammer eller former for parasitter kan vurderes samtidigt. Disse ændringer kan kræve yderligere tilpasning af tekniske procedurer; for eksempel, forventes procedurer for amastigote forberedelse og metacyclic promastigote rensning at variere mellem forskellige Leishmania arter. Yderligere fluorescerende farvestoffer udover DAPI, eller fluorescently tagged cellulære komponenter kan udnyttes til at visualisere en omfattende vifte af vært-parasit interaktion processer6,24. Desuden kan dette assay tilpasses til en høj overførselshastighed systemer (HTS) format, som giver mulighed for hurtig screening af sammensatte biblioteker til at identificere nye og virkningsfuldt narkotika fører til behandling af leishmaniasis24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer de har ingen konkurrerende finansielle interesser,

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af nationale kontorer i sundhed grant RO1 AI067979 til NWA.
Gitte er modtager af bachelorstuderende stipendium fra Howard Hughes Medical Institute/universitetet af Maryland College Park.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6 well cell culture plate Cellstar 657160
Adenine Acros Organics AC147440250
Aerosol Barrier Pipet Tips (100-1000 μL) Fisherbrand 02-707-404
Aerosol Barrier Pipet Tips (20-200 μL) Fisherbrand 02-707-430
Aerosol Barrier Pipet Tips (2-20 μL) Fisherbrand 02-707-432
Bard-Parker Rib-Back Carbon Steel Surgical Blade #10 Aspen Surgical 371110
BD Luer-Lok Tip 10 mL Syringe Becton Dickinson (BD) 309604
BD Precisionglide Needle, 25G  Becton Dickinson (BD) 305124
Cell Culture Dish 35 mm x 10 mm Cellstar 627 160
Cell Culture Flask Cellstar 660175
Cover Glasses: 12 mm circles Fisherbrand 12-545-80
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Invitrogen D1306
D-Biotin J.T. Baker C272-00
EDTA Sigma Aldrich EDS
Ethyl alcohol 200 proof Pharmco-AAPER 111000200
Falcon 100 mm x 15 mm non-TC-treated polystyrene Petri dish Corning 351029
Fetal Bovine Serum Seradigm 1500-500
Ficoll400 Sigma Aldrich F8016
Fluorescence Microscope Nikon E200
Goat anti-mouse IgG Texas red Invitrogen T-862
Goat anti-rabbit IgG AlexaFluor488 Invitrogen A-11034
Hemin Tokyo Chemical Industry Co. LTD H0008
HEPES (1M) Gibco 15630-080
Isoton II Diluent Beckman Coulter 8546719
L-Glutamine Gemini 400-106
Medium 199 (10X) Gibco 11825-015
Na pyruvate (100 mM) Gibco 11360-070
Paraformaldehyde Alfa Aesar 43368
Penicillin/Streptomycin Gemini 400-109
Phosphate Buffered Saline (-/-) ThermoFisher 14200166
Polypropyline conical Centrifuge Tubes 15 mL Cellstar 188 271
Polypropyline conical Centrifuge Tubes 50 mL Cellstar 227 261
ProLong Gold antifade reagent ThermoFisher P36930
Rat anti-mouse Lamp-1 antibody Developmental Studies Hybridoma Bank 1D4B
Recombinant Human M-CSF PeproTech 300-25
Reichert Bright-Line  Hemocytometer  Hausser Scientific 1492
RPMI Medium 1640 (1X) Gibco 11875-093
Triton X-100 Surfactant Millipore Sigma TX1568-1
Trypan Blue Sigma Aldrich T8154
Delicate Scissors, 4 1/2" VWR 82027-582
Dissecting Forceps, Fine Tip VWR 82027-386
Microscope Slides VWR 16004-368
Z1 Coulter Particle Counter, Dual Threshold Beckman Coulter 6605699

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. WHO. Control of the leishmaniases. World Health Organ Tech Rep Ser. (949), (2010).
  2. Naderer, T., McConville, M. J. Intracellular growth and pathogenesis of Leishmania parasites. Essays Biochem. 51, 81-95 (2011).
  3. Rosenzweig, D., et al. Retooling Leishmania metabolism: from sand fly gut to human macrophage. FASEB J. 22 (2), 590-602 (2008).
  4. Lahav, T., et al. Multiple levels of gene regulation mediate differentiation of the intracellular pathogen Leishmania. The FASEB Journal. 25 (2), 515-525 (2011).
  5. Saunders, E. C., et al. Induction of a stringent metabolic response in intracellular stages of Leishmania mexicana leads to increased dependence on mitochondrial metabolism. PLoS Pathog. 10 (1), e1003888 (2014).
  6. Mittra, B., et al. Iron uptake controls the generation of Leishmania infective forms through regulation of ROS levels. J Exp Med. 210 (2), 401-416 (2013).
  7. Kloehn, J., et al. Using metabolomics to dissect host-parasite interactions. Curr Opin Microbiol. 32, 59-65 (2016).
  8. Huynh, C., Sacks, D. L., Andrews, N. W. A Leishmania amazonensis ZIP family iron transporter is essential for parasite replication within macrophage phagolysosomes. J Exp Med. 203 (10), 2363-2375 (2006).
  9. Flannery, A. R., Huynh, C., Mittra, B., Mortara, R. A., Andrews, N. W. LFR1 Ferric Iron Reductase of Leishmania amazonensis Is Essential for the Generation of Infective Parasite Forms. J Biol Chem. 286 (26), 23266-23279 (2011).
  10. Miguel, D. C., Flannery, A. R., Mittra, B., Andrews, N. W. Heme uptake mediated by LHR1 is essential for Leishmania amazonensis virulence. Infect Immun. 81 (10), 3620-3626 (2013).
  11. Cortez, M., et al. Leishmania Promotes Its Own Virulence by Inducing Expression of the Host Immune Inhibitory Ligand CD200. Cell Host Microbe. 9 (6), 463-471 (2011).
  12. Mittra, B., Andrews, N. W. IRONy OF FATE: role of iron-mediated ROS in Leishmania differentiation. Trends Parasitol. 29 (10), 489-496 (2013).
  13. Mittra, B., et al. A Trypanosomatid Iron Transporter that Regulates Mitochondrial Function Is Required for Leishmania amazonensis Virulence. PLoS Pathog. 12 (1), e1005340 (2016).
  14. Ben-Othman, R., et al. Leishmania-mediated inhibition of iron export promotes parasite replication in macrophages. PLoS Pathog. 10 (1), e1003901 (2014).
  15. Renberg, R. L., et al. The Heme Transport Capacity of LHR1 Determines the Extent of Virulence in Leishmania amazonensis. PLoS Negl Trop Dis. 9 (5), e0003804 (2015).
  16. McConville, M. J. Metabolic Crosstalk between Leishmania and the Macrophage Host. Trends Parasitol. 32 (9), 666-668 (2016).
  17. Carrera, L., et al. Leishmania promastigotes selectively inhibit interleukin 12 induction in bone marrow-derived macrophages from susceptible and resistant mice. J Exp Med. 183 (2), 515-526 (1996).
  18. Hsiao, C. H., et al. The effects of macrophage source on the mechanism of phagocytosis and intracellular survival of Leishmania. Microbes Infect. 13 (12-13), 1033-1044 (2011).
  19. Murray, A. S., Lynn, M. A., McMaster, W. R. The Leishmania mexicana A600 genes are functionally required for amastigote replication. Mol Biochem Parasitol. 172 (2), 80-89 (2010).
  20. Farias Luz, N., et al. RIPK1 and PGAM5 Control Leishmania Replication through Distinct Mechanisms. J Immunol. 196 (12), 5056-5063 (2016).
  21. Franco, L. H., et al. Autophagy downstream of endosomal Toll-like receptor signaling in macrophages is a key mechanism for resistance to Leishmania major infection. J Biol Chem. 292 (32), 13087-13096 (2017).
  22. da Silva, M. F., Zampieri, R. A., Muxel, S. M., Beverley, S. M., Floeter-Winter, L. M. Leishmania amazonensis arginase compartmentalization in the glycosome is important for parasite infectivity. PLoS One. 7 (3), e34022 (2012).
  23. Carneiro, P. P., et al. The Role of Nitric Oxide and Reactive Oxygen Species in the Killing of Leishmania braziliensis by Monocytes from Patients with Cutaneous Leishmaniasis. PLoS One. 11 (2), e0148084 (2016).
  24. Siqueira-Neto, J. L., et al. An image-based high-content screening assay for compounds targeting intracellular Leishmania donovani amastigotes in human macrophages. PLoS Negl Trop Dis. 6 (6), e1671 (2012).
  25. Pastor, J., et al. Combinations of ascaridole, carvacrol, and caryophyllene oxide against Leishmania. Acta Trop. 145, 31-38 (2015).
  26. Giarola, N. L., et al. Leishmania amazonensis: Increase in ecto-ATPase activity and parasite burden of vinblastine-resistant protozoa. Exp Parasitol. 146, 25-33 (2014).
  27. Sacks, D. L., Melby, P. C. Animal models for the analysis of immune responses to leishmaniasis. Curr Protoc Immunol. , Chapter 19 Unit 19 12 (2001).
  28. Tabbara, K. S., et al. Conditions influencing the efficacy of vaccination with live organisms against Leishmania major infection. Infect Immun. 73 (8), 4714-4722 (2005).
  29. Price, J. V., Vance, R. E. The macrophage paradox. Immunity. 41 (5), 685-693 (2014).
  30. Huynh, C., Andrews, N. W. Iron acquisition within host cells and the pathogenicity of Leishmania. Cell Microbiol. 10 (2), 293-300 (2008).
  31. Blackwell, J. M., et al. SLC11A1 (formerly NRAMP1) and disease resistance. Cell Microbiol. 3 (12), 773-784 (2001).
  32. Pinto-da-Silva, L. H., et al. The 3A1-La monoclonal antibody reveals key features of Leishmania (L) amazonensis metacyclic promastigotes and inhibits procyclics attachment to the sand fly midgut. Int J Parasitol. 35 (7), 757-764 (2005).
  33. Spath, G. F., Beverley, S. M. A lipophosphoglycan-independent method for isolation of infective Leishmania metacyclic promastigotes by density gradient centrifugation. Exp Parasitol. 99 (2), 97-103 (2001).
  34. Zilberstein, D., Shapira, M. The role of pH and temperature in the development of Leishmania parasites. Annu Rev Microbiol. 48, 449-470 (1994).
  35. Bates, P. A. Transmission of Leishmania metacyclic promastigotes by phlebotomine sand flies. Int J Parasitol. 37 (10), 1097-1106 (2007).
  36. Bates, P. A., Robertson, C. D., Tetley, L., Coombs, G. H. Axenic cultivation and characterization of Leishmania mexicana amastigote-like forms. Parasitology. 105 (Pt 2), 193-202 (1992).
  37. Frickmann, H., et al. Rapid identification of Leishmania spp. in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue samples by fluorescence in situ hybridization. Trop Med Int Health. 17 (9), 1117-1126 (2012).
  38. Seguin, O., Descoteaux, A. Leishmania, the phagosome, and host responses: The journey of a parasite. Cell Immunol. 309, 1-6 (2016).
  39. Wanderley, J. L., Thorpe, P. E., Barcinski, M. A., Soong, L. Phosphatidylserine exposure on the surface of Leishmania amazonensis amastigotes modulates in vivo infection and dendritic cell function. Parasite Immunol. 35 (3-4), 109-119 (2013).
  40. Crauwels, P., et al. Apoptotic-like Leishmania exploit the host's autophagy machinery to reduce T-cell-mediated parasite elimination. Autophagy. 11 (2), 285-297 (2015).
  41. Bringmann, G., et al. A novel Leishmania major amastigote assay in 96-well format for rapid drug screening and its use for discovery and evaluation of a new class of leishmanicidal quinolinium salts. Antimicrob Agents Chemother. 57 (7), 3003-3011 (2013).
  42. Sacks, D. L., Brodin, T. N., Turco, S. J. Developmental modification of the lipophosphoglycan from Leishmania major promastigotes during metacyclogenesis. Mol Biochem Parasitol. 42 (2), 225-233 (1990).
  43. Sacks, D. L. Leishmania-sand fly interactions controlling species-specific vector competence. Cell Microbiol. 3 (4), 189-196 (2001).
  44. McConville, M. J., Turco, S. J., Ferguson, M. A., Sacks, D. L. Developmental modification of lipophosphoglycan during the differentiation of Leishmania major promastigotes to an infectious stage. EMBO J. 11 (10), 3593-3600 (1992).
  45. Sacks, D. L., Hieny, S., Sher, A. Identification of cell surface carbohydrate and antigenic changes between noninfective and infective developmental stages of Leishmania major promastigotes. J Immunol. 135 (1), 564-569 (1985).
  46. Yao, C., Chen, Y., Sudan, B., Donelson, J. E., Wilson, M. E. Leishmania chagasi: homogenous metacyclic promastigotes isolated by buoyant density are highly virulent in a mouse model. Exp Parasitol. 118 (1), 129-133 (2008).
  47. Almeida Marques-da-Silva, E., et al. Extracellular nucleotide metabolism in Leishmania: influence of adenosine in the establishment of infection. Microbes Infect. 10 (8), 850-857 (2008).
  48. Moreira, D., et al. Impact of continuous axenic cultivation in Leishmania infantum virulence. PLoS Negl Trop Dis. 6 (1), e1469 (2012).
  49. Svensjo, E., et al. Interplay between parasite cysteine proteases and the host kinin system modulates microvascular leakage and macrophage infection by promastigotes of the Leishmania donovani complex. Microbes Infect. 8 (1), 206-220 (2006).

Tags

Immunologi og infektion sag 133 Leishmania virulens makrofag intracellulære replikering parasitophorous vakuole
Kvantificering af intracellulære vækst inde makrofager er en holdbar og pålidelig metode til vurdering af virulens i <em>Leishmania</em> parasitter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sarkar, A., Khan, Y. A.,More

Sarkar, A., Khan, Y. A., Laranjeira-Silva, M. F., Andrews, N. W., Mittra, B. Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites. J. Vis. Exp. (133), e57486, doi:10.3791/57486 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter