Summary
Todas as espécies de Leishmania patogênicas residem e replicam no interior de macrófagos de seus hospedeiros vertebrados. Aqui, apresentamos um protocolo para infectar murino macrófagos derivados da medula óssea em cultura com Leishmania, seguido por quantificação exacta da cinética de crescimento intracelular. Esse método é útil para estudar os fatores individuais que influenciam a interação patógeno-hospedeiro e virulência de Leishmania .
Abstract
O ciclo de vida de Leishmania, o agente causador da leishmaniose, alterna-se entre as fases amazonensis e amastigotas no interior do inseto e hospedeiros vertebrados, respectivamente. Enquanto patogénicos sintomas da leishmaniose podem variar amplamente, de lesões cutâneas benignas para formas altamente fatal doença visceral, dependendo da espécie infecciosa, todas as espécies de Leishmania residem no interior de macrófagos do hospedeiro durante a fase de vertebrados de seu ciclo de vida. Infectividade de Leishmania , portanto, está diretamente relacionada à sua capacidade de invadir, sobreviver e replicar dentro parasitophorous vacúolos (PVs) dentro de macrófagos. Assim, avaliar a capacidade do parasita para replicar intracelular serve como um método confiável para determinar a virulência. Estudar o desenvolvimento de leishmaniose usando modelos animais é demorado, fastidioso e muitas vezes difícil, especialmente com as formas viscerais pathogenically importantes. Aqui descrevemos uma metodologia para acompanhar o desenvolvimento intracelular de Leishmania na medula óssea-derivada de macrófagos (BMMs). Parasita intracelular números são determinados em intervalos de 24 h para 72-96 h após a infecção. Este método permite uma determinação confiável dos efeitos de diferentes fatores genéticos na virulência de Leishmania . Como exemplo, mostramos como uma exclusão de único alelo do gene transportador de ferro mitocondrial Leishmania (LMIT1) prejudica a capacidade da estirpe mutante de Leishmania têm LMIT1/ΔLmit1 para crescer dentro BMMs, refletindo uma redução drástica na virulência em relação ao tipo selvagem. Este ensaio também permite um controle preciso das condições experimentais, que podem ser manipulados individualmente para analisar a influência de vários fatores (nutrientes, espécies reativas de oxigênio, etc.) sobre a interação patógeno-hospedeiro. Portanto, a execução adequada e quantificação dos estudos de infecção BMM fornecem uma alternativa não-invasiva, rápida, econômica, segura e confiável para estudos de modelo animal convencional.
Introduction
Leishmaniose refere-se a um amplo espectro de doenças humanas causadas por espécies de parasitas protozoários do gênero Leishmania. Atualmente, cerca de 12 milhões de pessoas estão infectados com Leishmania em todo o mundo, e mais de 350 milhões estão em risco. A patologia da doença depende da espécie de Leishmania e fatores do hospedeiro, e sintomas variam de lesões de pele de auto-recuperação inócuo para formas visceralizing letais. Se leishmaniose visceral, não tratada é fatal, classificação somente depois da malária, como a doença mais mortal humana causada pela infecção por um protozoário parasita1. Apesar das diferenças amplas na patologia da doença e sintomas, todas as espécies de Leishmania têm um digenic-ciclo de vida alternando entre fases amazonensis e amastigotas no interior do inseto e hospedeiros vertebrados, respectivamente. Dentro vertebrados, Leishmania alvo macrófagos do hospedeiro para invasão e induzem a formação de vacúolos parasitophorous (PVs), compartimentos ácidos com propriedades de fagolisossomas onde replicam as formas amastigotas altamente virulento. Amastigotes persistir nos tecidos do hospedeiro durante infecções crônicas e podem ser passados para a frente não infectados flebotomíneos, completando o ciclo de transmissão. Portanto, no contexto do desenvolvimento de doenças humanas, amastigotes são o mais importante de formulário do ciclo de vida Leishmania 2. Investigar como amastigotes replicar dentro macrófago PVs é fundamental para a compreensão de Leishmania virulência3,4,5,6,7 e para o desenvolvimento de novas terapias eficazes.
Descrevemos aqui um método usado regularmente por nosso laboratório para estudar a infecção de Leishmania e replicação em macrófagos derivados da medula óssea (BMMs), que envolve a avaliação quantitativa do número de intracelular Leishmania ao longo do tempo. O processo envolve a colheita de monócitos da medula óssea de rato e diferenciação de macrófagos na cultura, na vitro infecção com formas infectantes (promastigotas metacyclic ou amastigotes) de Leishmania e quantificação do número de parasitas intracelulares em cada intervalo de 24 h, por um período de 72-96 h após a infecção. Este ensaio tem sido usado em nosso laboratório, para determinar o impacto de diversos fatores ambientais e os genes do parasita, incluindo a identificação do papel crítico de ferro na promoção têm L. virulência que mais foi validada por Whitney estudos de desenvolvimento de lesão em ratos6,8,9,10,11,12,13,14,15 . Desde que todas as espécies de Leishmania patogênicas estabelecer seu nicho replicative dentro de macrófagos do hospedeiro, este ensaio pode ser usado universalmente para determinações de virulência em todas as espécies de Leishmania .
Realizar infecções BMM permite a análise das interações hospedeiro-parasita no nível da célula única e, portanto, uma compreensão mais ampla de como parasitas Leishmania interagem com seu microambiente hospedeiro preferencial, os PVs dos macrófagos. Ensaios de infecção de macrófagos têm sido utilizados com sucesso por vários grupos de16,17,18,19,20,21,22 para explorar funções dos macrófagos do hospedeiro e Leishmania genes específicos e sua potencial participação em complexa interação que caracteriza a infecção intracelular. Infecções de BMM permitem a quantificação do crescimento do parasita como uma leitura do impacto dos fatores do hospedeiro que influenciam a sobrevivência intracelular, tais como a produção de óxido nítrico de microbicidas, geração de espécies reativas de oxigênio e outras condições adversas encontrado no interior do lisossomo, como PVs23. Ensaios de infecção de macrófagos também têm sido utilizados para identificar pistas de drogas antileishmaniótica potencial para o desenvolvimento de terapêuticas13,24.
A natureza em vitro de infecções BMM fornece várias vantagens sobre outros métodos para avaliar a virulência de Leishmania . No entanto, vários estudos anteriores examinar mecanismos de sobrevivência do parasita intracelular ao longo do tempo não quantificar a infecção como uma taxa20,21,24. Além disso, muitos estudos focados nos seguintes infecções na vivo ao longo do tempo fizeram medindo o tamanho da lesão cutânea e outras sintomas fisiológicos apenas indiretamente relacionados ao parasita replicação25,26 , 27. infecção in vivo é uma abordagem rigorosa para avaliar a virulência do parasita, mas medições de tamanho de lesão baseadas no Whitney inchaço sozinho são muitas vezes inadequadas, como eles refletem a resposta inflamatória nos tecidos infectados e não o número absoluto de parasitas. Por esta razão, o desenvolvimento de lesão de Whitney ensaios têm de ser seguidos pela quantificação da carga parasita em tecidos infectados, um procedimento que requer diluição limitante longa ensaios28. Além disso, estudos em vivo muitas vezes envolvem sacrificar vários animais em pontos diferentes na hora de extrair os tecidos de interesse6,8,9,10, 11 , 13. em contraste, um grande número de BMMs pode ser obtido de um animal, e estas células podem ser revestidas em condições que permitam a avaliação de infecção em vários pontos no tempo. Além disso, comparado com estudos em vivo , realizando em vitro infecções BMM permite maior controle sobre as condições experimentais. Quantificar os macrófagos para ser contagiado como os parasitas se permite um controle preciso da multiplicidade de infecção (MOI) e das condições de cultura. Bom controle sobre esses fatores pode ser chave na identificação de características de vias celulares discretas e na compreensão do seu impacto sobre o curso da infecção.
Dadas essas vantagens, é um pouco surpreendente que muito poucos grupos estudando a virulência de Leishmania até agora tomaram vantagem cheia de avaliação quantitativa de replicação intracelular em macrófagos. Neste artigo, discutimos as armadilhas comuns que podem estar prejudicando a utilização mais ampla deste teste e fornecer um protocolo passo a passo para facilitar a sua correcta aplicação. Considerando sua precisão e versatilidade, o ensaio de infecção BMM que descrevemos aqui pode não apenas ser utilizado para explorar interações patógeno-hospedeiro, influenciando a virulência de Leishmania , mas também para estudar outros microorganismos que replicam dentro os macrófagos29. Importante, este ensaio também pode ser desenvolvido como um método de triagem pré-clínica rápida e econômica para o desenvolvimento de drogas antileishmaniótica.
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Protocol
Todos os procedimentos experimentais foram conduzidos em conformidade com as recomendações do guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório por institutos nacionais de saúde e foram aprovados pela Universidade de Maryland IACUC. Todos os passos descritos nas seções 1 a 4 devem ser efectuados em condições assépticas dentro dos armários biológica de fluxo laminar. Proteção pessoal deve ser usada, e o cuidado deve ser exercitado durante a manipulação de parasitas de Leishmania ao vivo durante todas as fases de experimentação.
1. isolamento e diferenciação de macrófagos derivados da medula óssea (BMMs)8,30,31
- Dia 0: Sacrificar a 4 - 6 semanas de idade fêmea C57BL/6 ou rato BALB/c em uma câmara de2 CO e confirmar a morte por deslocamento cervical. Assegure a esterilização de tesouras e pinças, mantendo-os embebido em etanol 70%. Pulverizar as luvas com etanol a 70% para permitir estéril de manipulação durante todo o processo de isolamento de células de medula óssea.
- Secure mouse sacrificado para tabuleiro de dissecação fixando seus membros dianteiros e desinfectar por pulverização copiosamente com etanol a 70%.
- Faça uma pequena incisão (cerca de 1 cm) com uma tesoura, perto da articulação do quadril. Insira cuidadosamente a tesoura sob a pele para separar o músculo subjacente e cortar a pele ao redor da articulação do quadril.
Nota: O tabuleiro de dissecação pode ser girado para permitir melhor acesso à articulação do quadril. - Cortar a pele da perna puxando para o tornozelo e Retire cuidadosamente. Corte o pé na altura da tornozelo, sendo muito cuidadoso para cortar ou abaixo do tornozelo conjunta para deixar o tibia totalmente intacta.
Nota: A fíbula nesta fase é frouxamente ligada e pode ser facilmente separada com a pinça. - Localize manualmente a articulação do quadril, manipulando o fêmur para identificar o ponto de rotação. Cuidadosamente use a tesoura para cortar a perna acima da articulação do quadril para deixar intacta a cabeça do fêmur proximal.
- Remova tanto músculo e tecido conjuntivo quanto possível da perna com uma tesoura. Retire qualquer pele restante do tornozelo e qualquer material de excesso de osso acima da articulação do quadril.
- Coloque os ossos da perna limpa em estéril RPMI suplementado com penicilina/estreptomicina (concentração final de 1%) em uma placa de Petri no gelo.
- Repita as etapas de 1.4 através de 1.6 para isolar a tíbia e fêmur da outra pata traseira.
- Remova qualquer restantes músculo e tecido conjuntivo dos ossos imersão em RPMI usando Pinças esterilizadas e estéril lâmina #10.
- Coloque os ossos na tampa da caixa de Petri. Corte a tíbia cuidadosamente com a lâmina imediatamente acima da articulação do tornozelo para acessar a medula. Remova a tíbia do resto da perna, cortando-se imediatamente abaixo da articulação do joelho.
- Desenhe 10 mL estéril RPMI suplementado com penicilina/estreptomicina (concentração final de 1%) em uma seringa de 10 mL e anexar uma agulha 25g.
- Segure bem a tíbia com fórceps, verticalmente ao longo de um tubo cónico de 50 mL no gelo. Use a seringa para injetar aproximadamente 5 mL RPMI suavemente a extremidade do osso para lavar a medula óssea fora a outra extremidade no tubo cónico. Irrigue a medula óssea, com um total de 10 mL RPMI até o osso torna-se branco.
Nota: Após a lavagem completa, o osso deveria virar branco. Se não, continue a irrigar para remover a medula. A extremidade distal da tíbia pode precisar de ser aparado com a lâmina se é estreito demais para inserir a agulha. - Corte o fêmur imediatamente acima da articulação do joelho e imediatamente abaixo da articulação do quadril para expor a ambas as extremidades do osso para acessar a medula. Irrigue a medula óssea do fémur com um total de 10 mL RPMI da mesma forma como a tíbia.
- Repita a limpeza e lavagem passos 1.6 através de 1.13 com os ossos restantes e recolher as células de medula óssea liberada em um tubo cônico único 50 mL
Nota: Se um osso se quebra em algum ponto durante a dissecção antes da lavagem do osso, não use a medula deste osso. - Centrifugar o tubo cônico usado para coletar a medula óssea liberada do todos os quatro ossos durante 10 minutos a 4 ° C a 300 x g.
- Coloque 60 mL de meio BMM estéril (RPMI com uma concentração final de 20% FBS, 1% penicilina/estreptomicina, 1,2 mM nd-piruvato, 25 µ g/mL M-CSF humano) para um balão de cultura celular de2 175 cm com tampa de filtro.
- Descartar a centrifugação seguir sobrenadante e ressuspender as células de gentil e descer de pipetagem usando 5 mL de meio BMM do recipiente.
- Suspensão de células de transferência para o frasco de cultura e enxaguar o tubo cônico duas vezes com meio BMM do frasco de cultura para garantir a recuperação máxima de célula. Certifique-se de suspensão de células é bem misturada em meio e distribuir 30ml do frasco de cultura inicial 175cm2 célula para um segundo balão cultura 175cm célula2 com tampa de filtro.
- Incube os dois frascos contendo a suspensão de células de 30 mL cada uma noite a 37 ° C, 5% de CO2 para permitir a separação de qualquer contaminantes fibroblastos, macrófagos residentes e outras células aderentes.
- Dia 1: Transfira o sobrenadante contendo células indiferenciadas da medula óssea de frascos de 100 x 15 mm TC não-tratados poliestireno placas de Petri em cerca de 10 mL/prato e incubar a 37 ° C, 5% CO2. Descarte os frascos.
- Dia 3 ou 4: Adicionar um meio BMM adicionais 5ml (pré aquecido a 37 ° C) para cada placa de Petri e continuar a incubação a 37 ° C, 5% de CO2.
2. chapeamento BMMs em lamelas para infecção (dia 7 ou 8)
- Prepare as placas de cultura de tecidos de 6-poços, colocando quatro 4 12mm estéreis as lamelas de vidro (esterilizadas e armazenadas em um recipiente de vidro fechado) na parte inferior de cada vazia bem.
Nota: Pegar cada lamela estéril 12 mm com uma ponta de aspiração montada em uma linha de vácuo. Coloque as lamelas em poços sem sobreposição, liberando na posição desejada por beliscar o tubo para interromper a vácuo. - Aspirado de mídia (e todas as células não-aderentes) de pratos de Petri revestida com aderentes da medula óssea derivada de macrófagos e suavemente aderente de enxaguamento células 2x com soro fisiológico de estéril Dulbecco tampão fosfato sem cloreto de cálcio e magnésio (PBS- / -) pré aquecido 37 ° c.
- Adicionar gota a gota, 5ml estéril 1 x PBS- / - com uma concentração final de 1 mM de EDTA para cada placa de Petri e incubar durante 5 min a 37 ° C para desanexar aderente BMMs. verificar que as células são desanexadas usando um microscópio.
- Recolha todos desanexadas células suspendidas em 1X PBS- / - suplementado com 1 mM de EDTA em um tubo cónico de 50 mL. Enxaguar cada prato 2x com 5 mL de PBS- / - e adicionar ao pool de suspensão celular.
Nota: Suspensão de células pode ser diluído com PBS adicionais- / - para proteger os macrófagos da toxicidade de EDTA durante o processo de coleta. - Centrifugação a 300 x g durante 10 minutos a 4 ° C. Descartar o sobrenadante e ressuspender macrófagos em 5-10 mL de meio de BMM pipetando. Lugar resuspended células no gelo para evitar a fixação de tubos e aglutinação.
- Contagem de células viáveis usando Trypan azul exclusão no hemocytometer.
Nota: Para contar células BMM resuspended em 5 mL de meio, uma mistura de diluição da suspensão de célula 25 µ l em 445 µ l PBS- / - e solução de azul de Tripan 0,4% 30 µ l normalmente permite fácil quantificação em um hemocytometer (tendo em conta um factor de diluição 20 x para o cálculo final ). Conte somente as células que não ficar manchadas com Trypan azul (células viáveis). O volume da suspensão de células pode ser alterado se esta mistura é muito concentrada ou diluída. Em geral, o rendimento de BMM por preparação varia entre 2 x 107 e 5 x 107 células de um único rato. - Preparar a suspensão de células em meio BMM a concentração desejada de chapeamento (5 x 105/mL) e dispersar a suspensão para 6 placas bem no meio de 2 mL por bem, para que cada um recebe bem os macrófagos 1 x 106 .
Nota: Este é um passo crítico que garante que cada fica bem o número adequado de macrófagos para abranger as lamelas uniformemente. Verifique as lamelas em poços não são sobrepostas ou flutuando no meio. Em caso afirmativo, ajuste suavemente com a ponta da pipeta estéril. - Incube durante uma noite a 37 ° C, 5% de CO2.
3. a purificação das formas infectantes de têm L.
Nota: Preparar Leishmania para infecções - purificar metacyclic promastigotas de estacionária amazonensis culturas8,13, ou diferenciar promastigotas de cultura em amastigotas formulário usando padrão têm de L. protocolo de diferenciação axénica6,8.
-
Purificação de metacyclic promastigotas de Leishmania usando media(Materials) gradiente de densidade 33
- Prepare a solução a 40% das ações da mídia gradiente de densidade em água estéril, livre de endotoxinas.
- Dilua a solução gradiente de densidade no meio de 10 x M199 (sem o soro) para preparar a concentração de 10% no meio M199.
- Filtre todas as soluções através de filtro de 0,22 µm.
Nota: Soluções de estoque podem ser armazenadas no 4 oC na escuridão por não mais de 1 mês. - Adicione 2 mL de solução de mídia gradiente de densidade de 40% no fundo de um tubo de centrifuga conico de 15 mL.
- Camada 2 mL de solução de mídia gradiente de densidade de 10% em M199 no topo da camada de mídia gradiente de densidade de 40% com cuidado, usando uma pipeta Pasteur para evitar qualquer mistura entre as duas camadas.
- Colete 1 x 109 parasitas de cultura estacionária-fase por centrifugação a 1.900 x g durante 10 minutos.
- Ressuspender as células em de 6 mL Dulbecco modificado essencial médio (DMEM).
- Camada 2 mL de suspensão de célula diretamente na parte superior a 10% densidade gradiente mídia de camada, delicadamente, usando uma pipeta Pasteur para evitar a mistura entre as camadas.
- Centrifugue o gradiente para 10 min a 1.300 x g, à temperatura ambiente.
Nota: Devido às diferenças nas propriedades físicas entre as espécies de Leishmania , condições de centrifugação para cada um terá que ser ligeiramente ajustado para garantir o rendimento máximo. - Recolhamos parasitas (enriquecidas em forma metacyclic amazonensis) a banda foi formada no limite do gradiente de mídia de alta densidade de 10% (interface entre as camadas de mídia gradiente de densidade 0% e 10%).
- Diluir os parasitas com um volume de DMEM e recolher por centrifugação (1.900 x g durante 10 minutos à temperatura ambiente).
- Resuspenda médio e 500 µ l DMEM e contar em um hemocytometer para quantificar o rendimento.
-
Geração de amastigotes L. têm condições de cultura axénica (baixo pH / elevada temperatura)6,8,13
- Mix 5 mL de cultura de registro-fase amazonensis (pH 7,4 em 26 oC) com um volume igual de amastigotas médio (pH 4.5), usando frascos de 25 cm2 (médio total 10 mL) e incubar a 26 ° C durante a noite.
- Deslocar o balão do 26 ° C a 32 ° C.
- Depois de 3 ou 4 dias, dividir cultura 1:5 em amastigotas mídia a 32 ° C.
- Verifique os parasitas nos próximos 3-4 dias (máximos 7 dias) para ver se eles estão prontos para o uso em infecções.
Nota: Amastigotes axénica saudável deve ter forma oval, sem flagelos visíveis. Amastigotes parcialmente diferenciadas têm uma forma oval grande com flagelos de curtos. A cultura não deve ter um monte de grupos - muitos aglomerados são uma indicação do não-crescimento, morrendo de parasitas. A cultura de amastigotas pode ser dividida de 1:5 e mantida por um período máximo de 3 semanas.
4. infecção com têm L.
- Dilua suspensões parasita de acordo com o desejado MOI (geralmente 3-5 metacyclic promastigotas por macrófagos [MOI de 1:3 ou 1:5]) e 1 amastigotas por macrófagos [MOI 1:1]. Adicione Leishmania em PBS- / - num volume de 50 a 100 µ l de cada poço já contendo 2 mL de meio.
- Incube BMMs durante 1 h com amastigotes e 3 h com metacyclic promastigotas em 34 oC para a infecção.
Nota: A temperatura ideal de infecção pode variar por espécie. - Após a incubação, Lave cuidadosamente afastado livre parasitas em cada bem 3x com 2 mL de PBS- / - previamente aquecido a 37 ° C.
Nota: Disperse PBS com cuidado para assegurar que as lamelas não flutuar por cima do outro. Agite suavemente a placa e em seguida Aspire para fora o líquido. Use a ponta de aspiração separada se usando várias cepas de parasitas para evitar a contaminação cruzada. - Fix 1 h ou h 3 amostras de tempo-ponto incubando-cada um com 1,5-2 mL de 2% PFA em PBS- / - 10 min. lavar 3x com PBS- / -. Não aspire a última lavagem e refrigerar placas contendo lamelas em PBS até coloração.
- Adicionar 2 mL de meio de BMM fresco a cada poço placas por mais tempo-pontos e incubar a 34 ° C.
- Tempo restante Fix-pontos conforme desejado conforme descrito no passo 4.3 e refrigerar placas até coloração.
5. DAPI coloração e montagem de lamela
- Aspire PBS de poços contendo lamelas e adicione 1,5 mL de PBS- / - com detergente não-iônico de 0,1%. Incube durante 10 minutos à temperatura ambiente, seguido de lavagem 3 x com 2 mL de PBS- / -.
- Adicione 1 mL de PBS- / - com 2 µ g/mL DAPI (diluído de 5 mg/mL de solução em água) para poços contendo lamelas e incube por outro 1h à temperatura ambiente.
Nota: O tempo de incubação com DAPI é essencial para a correta visualização dos parasitas intracelulares de Leishmania . Núcleos do macrófago mancham rapidamente, devido ao seu tamanho maior e DNA conteúdo mas coloração dos núcleos dos parasitas intracelulares é mais lento. Assim, estender o tempo de incubação, além do que é necessário para visualizar os núcleos BMM é necessário para permitir a DAPI de permear através de e a membrana plasmática do parasita e a membrana nuclear do parasita. Com mancha DAPI adequada, o cinetoplasto mitochondrial DNA perto o bolso flagelar do parasita também pode ser visualizado, além do DNA nuclear. - Lavagem a cada poço contendo lamelas 3 x 2 mL de PBS- / - e depois levanta e aleta lamelas com pinças para colocar do lado do celular para baixo e montar em microscópio de vidro corrediças com um reagente de montagem antidesgaste comercialmente disponível.
Nota: As lamelas são extremamente frágeis e precisam de manipulação cautelosa. Evite exercer pressão sobre eles, especialmente contra o flanco dos poços ao levantar. Adicionando algumas gotas de PBS- / - reduz a tensão superficial entre a lamela e bem e facilita o processo de levantamento. Uma agulha de calibre fino pode ser usada para ajudar a erguer as lamelas do fundo do poço. Depois de colocar uma lamela no slide, pressione suavemente para baixo com fórceps para eliminar quaisquer bolhas de ar nos meios de comunicação de montagem. Se uma lamela está quebrada ou tem possivelmente invertida durante o processo de levantamento, não remontar; Basta use a lamela quarta sobressalente. - Leve à geladeira de slides até quantificação.
6. infecção quantificação
- Examinar as corrediças manchadas de DAPI sob um microscópio de fluorescência, centrando-se em macrófagos usando 100 X da lente objetiva com óleo de imersão (excitação em 358 nm; emissão ideal em 461 nm).
Certifique-se de que o foco é sobre a camada de macrófagos entre a lâmina de vidro e lamela. - Quantificar o número de macrófagos (grandes núcleos corados com DAPI) e o número de núcleos de amastigotas menores agrupadas ao redor de cada núcleo de macrófagos (ver Figura 2A, DAPI) para cada campo de visão, usando um contador manual.
Nota: Amastigotas núcleos podem não só ser visíveis em um plano de foco devido ao seu pequeno tamanho. Contar aqueles que são visíveis quando focada em núcleos de macrófagos e então usar foco fino para verificar se há núcleos do parasita em aviões acima e abaixo dos núcleos de macrófagos. - Mudar para outro campo de visão para quantificação de repetir. Use uma chave de contador separado para controlar o número de campos contados. Percorrer campos visuais em linhas paralelas em cada lamela, para evitar a sobreposição de contagem.
- Quantificar um mínimo de 200 macrófagos por lamela. Quantificar a cada ponto do tempo de infecção em triplicado (3 lamelas). Conta a lamela quarta se dentre o anterior não é adequado para contagem devido à sobreposição de lamela, pobre montagem, quebra de vidro, etc.
Nota: Se 200 macrófagos não podem ser contados sobre qualquer uma lamela, conte o estepe em quarto lugar. - Calcular as taxas de infecção como macrófagos amastigotes/macrófago ou amastigotes/100 e determinar a porcentagem macrófagos infectados a partir dos dados brutos de quantificação.
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Representative Results
Leishmania tem duas formas infectantes - metacyclic promastigotas que diferenciam de promastigotas procyclic na fase estacionária da cultura e amastigotes, quais são os estágios intracelulares (Figura 1). Em algumas espécies de Leishmania , tais como L. têm, amastigotes também podem ser diferenciados na cultura axénica deslocando as células amazonensis para abaixar o pH (4.5) e temperatura elevada (32 ° C), condições similares àquelas encontradas dentro BMM PVs 8 , 34. apenas metacyclic formas amazonensis ou amastigotas de Leishmania são capazes de induzir a formação de PVs e replicar intracelular após ser tragado pelo anfitrião macrófagos35. Log-fase indiferenciada promastigotas são não-virulenta e incapaz de promover a formação de PV (Figura 2).
No caso de infecções com promastigotas metacyclic, normalmente há um atraso de 24 h antes de um aumento do número de parasita intracelular. Isso ocorre porque as metacyclic promastigotas têm primeiro de se diferenciarem em amastigotes antes que eles comecem a replicar. Por esta razão, infecções iniciadas com promastigotas metacyclic levará mais tempo para mostrar aumentos nos números totais parasita intracelular e por este motivo, pode ter que ser incubadas durante mais tempo pontos.
Figura 2A representa uma infecção bem sucedida usando axenically diferenciadas amastigotes, mostrando a localização intracelular de Leishmania (em vermelho) após a infecção inicial (1h), antes da formação do PVs pela fusão da phagosomes com lisossomos. A 48 h, podem ser observados distintos PVs grandes abrigando vários parasitas. Um aumento constante no número de parasitas dentro PVs é característica de infecções virulentas de Leishmania . Log-fase não-virulenta promastigotas (Figura 2B), em contraste, são incapazes de iniciar o desenvolvimento de PV (ponto de tempo de 48 h), não conseguir replicar e são eventualmente mortas no interior de macrófagos do hospedeiro, mesmo quando ocupados pelos macrófagos do hospedeiro em números comparáveis promastigotas metacyclic ou amastigotes.
Para demonstrar a eficácia deste método, comparamos o selvagem-tipo L. têm com parasitas LMIT1/ΔLmit1 , contendo uma única cópia do LMIT1 (Leishmania Mitochondrial euron T ransporter 1) gene, que resulta em deficiência de ferro mitocondrial importa13. Perda de um alelo LMIT1 não resultar em alterações significativas da atividade mitocondrial em promastigotas de LMIT1/ΔLmit1 ou reduzir o rendimento das formas metacyclic purificados quando comparado ao tipo selvagem promastigotas13. Promastigotas metacyclic purificadas do selvagem-tipo (WT) e LMIT1/ΔLmit1 estacionárias culturas foram igualmente eficazes em invadir BMMs, baseados no número comparável de parasitas intracelulares quantificado 1 h após a infecção ( Figura 3A, 1 h). Após um intervalo de tempo inicial de 24 h, que é necessário para metacyclic promastigotas adaptar-se e diferenciar-se em formas amastigotas, um constante aumento no número de parasitas intracelulares do tipo selvagem (aproximadamente 3 vezes entre 24 h e 72 h tempo pontos) foi observada. Em contraste, pouco ou nenhum crescimento intracelular de parasitas LMIT1/ΔLmit1 (compare 1 h e 72 h-pontos de tempo) foi observado, sugerindo que a perda do único alelo LMIT1 significativamente afeta a capacidade desta estirpe de crescer dentro macrófagos. Epissomal expressão da proteína LMIT1 na estirpe complementada (LMIT1/ΔLmit1+LMIT1) resgatou o crescimento do parasita intracelular para níveis de tipo selvagem, confirmando que o LMIT1 é essencial para amastigotas intracelular replicação e virulência13.
Infecções do macrófago realizado com axénica amastigotes, gerado pelo deslocamento amazonensis culturas (em pH 7,4; 26 oC) às condições de crescimento amastigotes (pH 4,5; 32 oC)34,36, mostrou um crescimento intracelular padrão (Figura 3B) semelhante às observadas com metacyclic promastigotas (Figura 3A). Seguindo a níveis comparáveis de absorção inicial (Figura 3B, 1 h) selvagem-tipo (WT) e LMIT1 complementada (LMIT1/ΔLmit1+LMIT1) amastigotes cresceu firmemente, enquanto amastigotes LMIT1/ΔLmit1 novo Falha ao mostrar crescimento intracelular. Axénica amastigotes foram mais infecciosa (MOI 1:1 em comparação com 1:5 para metacyclic promastigotas) e replicados mais eficientemente dentro PVs.
Nossos dados demonstram um atraso inicial 24h para infecções metacyclic amazonensis, antes que haja um aumento no número de parasita intracelular (comparação entre pontos de tempo de 24 h na Figura 3A e 3B). O lag representa o tempo necessário para interiorizado promastigotas metacyclic primeiro diferenciar em amastigotes antes de começar a se replicar. Um comum erro de pessoas fazem quando usando metacyclic promastigotas para infectar, não é esperar o suficiente. Em casos onde a mudança na virulência não é drástica, experimentos realizados mais de 96 h, em vez de 72 h produzir determinações muito mais confiáveis.
Figura 1 : Micrografia eletrônica de imagens dos vários L. têm vida-estágios. Log-fase amazonensis, metacyclic amazonensis de amastigotas de fase estacionária e axénica. Bar = 10 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Uma ilustração representativa de infecção virulenta amastigotes axénica (A) e registro-fase não-virulenta promastigotas (B) de L. têmBMM. Imagens de imunofluorescência de macrófagos isolados de camundongos BALB/c , 1 h e 48 h após a infecção. Macrófagos infectados foram processados por imunofluorescência, conforme descrito no protocolo. Membranas de PV foram coradas com rato anti-rato Lamp1 anticorpo monoclonal (1:1, 000 diluição) de 1 h, seguida de incubação de 1 h com IgG de antifluorescente coelho (diluição 1: 500). Coloração do parasita foi realizada incubando lamelas com Anticorpos policlonais de rato gerados contra axénica L. têm amastigotes, seguidos pelo vermelho de IgG anti-rato tintura (diluição 1: 500) 6. Todas as lamelas mais foram tratadas com DAPI para coloração de núcleos. (A) formação de distintas PVs abrigando vários amastigotes no ponto de tempo de 48 h é característica de uma infecção de Leishmania bem sucedida com axénica amastigotes. (B) a ausência de formação do PV distintas e replicando amastigotes no ponto de tempo de 48 h tipifica falta de virulência em promastigotas de cultura de registro-fase. Vermelho indica -Leishmania coloração, verde indica anti-Lamp1, azul indica DNA DAPI-manchado e amarelo indica a mesclagem de anti-Lamp1 e manchas de DAPI. Bares, 5µm. Esta figura foi modificada de Mittra, b. et al, 2013. Originalmente publicado em J. exp. Med. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Exclusão de um alelo LMIT1 prejudica severamente o crescimento intracelular do mutantes parasitas LMIT1/Δlmit1 . BMM foram infectados para o indicado vezes com L.amazonensis e corrigido imediatamente ou mais incubadas durante 24, 48 ou 72 h antes eles eram fixas, manchado com DAPI, e determinou-se microscopicamente o número de parasitas intracelulares. (A) BMMs foram infectados com purificada selvagem-tipo (WT), nocaute único (LMIT1/Δlmit1) e complementado nocaute único (LMIT1/Δlmit1 + LMIT1) metacyclic promastigotas (MOI 1:5) para 3h e fixa imediatamente ou incubadas ainda mais para os pontos de tempo indicado e o número de parasitas intracelulares foi determinada microscopicamente. Os dados representam a média ± DP de três vias determinações e representativos dos resultados dos três experimentos independentes. Os asteriscos indicam diferenças significativas de infecciosidade entre parasitas WT e LMIT1/Δlmit1 (Student bicaudal t -teste 48 h, p = 0,017; 72 h, p = 0.008). (B) axénica amastigotes de tipo selvagem (WT), nocaute único (LMIT1/Δlmit1) e complementado nocaute único (LMIT1/Δlmit1 + LMIT1) culturas foram testados por sua capacidade de infectar BMMs. BMMs foram infectados por 1 h (MOI 1:1) e também corrigido imediatamente (1h) ou depois de mais de incubação por 24, 48 ou 72 h e o número de parasitas intracelulares foi determinado microscopicamente. Os dados representam a média ± DP de três vias determinações e sejam representativas de mais de três experimentos independentes. P-valores (teste de Student bicaudal t) entre os respectivos grupos são indicados. Esta figura foi modificada de Mittra, b. et al, 2016. Originalmente publicado na PloS Pathog. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Os dados quantitativos produzidos por BMM infecção ensaio descrito acima, permite que os investigadores obter taxas de infecção e uma determinação confiável das mudanças nas propriedades de virulência em um período de tempo relativamente curto (máximos 2 semanas, em comparação com os 2 meses exigidos para experimentos em vivo ). Esse método depende o corante específico DNA DAPI, que especificamente manchas núcleos macrófago e parasita e permite a rápida identificação e quantificação de células infectadas. Em comparação, outras manchas como Giemsa vincular-se a um grande número de diferentes componentes celulares com intensidade variável, complicando a análise visual37. O uso de DAPI permite reconhecimento de parasitas intracelulares e sua distinção clara de celular estruturas (apenas os núcleos das células do hospedeiro também estão manchados, e seu tamanho é várias ordens de magnitude maiores do que os núcleos do parasita), permitindo que mais fácil e rápido quantificação de infecções.
Como com qualquer procedimento experimental, este método tem algumas limitações e vários passos críticos que requerem cuidadosa execução. Infecção de Leishmania em vivo envolve complexa resposta imunológica inata antes da fagocitose, que determina o curso final da infecção38. Escolha da estirpe de rato do modelo, portanto, é de fundamental importância no projeto de estudo. Cepa de ratos tanto C57BL/6 e BALB/c usada em mutações de urso este protocolo no gene que codifica a proteína Natural associada a resistência macrófago (Nramp1), uma bomba de efluxo de prótons que translocates Fe2 + e Mn2 + íons de macrófago lisossomos/fagolisossomas no citosol. Isso resulta em aumento da susceptibilidade a patógenos que replicam no interior do compartimento endocítica dos macrófagos8,30,31. Colonização bem-sucedida em macrófagos também depende a capacidade única de parasitas infecciosas de Leishmania para manipular a resposta imune para suprimir/sobreviver a ativação de macrófagos39,40. Os macrófagos diferenciados usados para Leishmania BMM infecções imitar um pouco o estado não está ativado de macrófagos na vivo, mas o ensaio não conta para o conjunto muito mais complexo de componentes do hospedeiro que influenciam a virulência em modelos animais.
Isolamento de formas saudáveis de Leishmania infecciosas é o outro requisito absolutamente crítico para a determinação exata de virulência. Nem todos os promastigotas de todas as cepas de Leishmania diferenciarem eficientemente em amastigotes quando submetido ao baixo pH / alta temperatura conditions41. Portanto, infecções são frequentemente realizadas com promastigotas metacyclic purificadas de culturas amazonensis estacionária. Para efetivamente isolar metacyclic promastigotas, algumas estratégias de purificação tirar proveito da mudança composição de glicocálix de superfície do parasita durante as fases de vida diferentes, incluindo extensas modificações da lipophosphoglycan (LPG) estrutura42,,43,44. Por exemplo, amendoim aglutininas (PNA), uma lectina que se liga seletivamente a procyclic mas não metacyclic LPG tem efetivamente utilizou protocolos de seleção negativa para purificar metacyclic promastigotas de L. major 45. Estratégia de purificação metacyclic amazonensis L. têm geralmente envolve um anticorpo monoclonal mAb3A.1 que pode aglutinar procyclic promastigotas alvejando epítopos específicos da proteína de superfície que são inacessíveis em metacyclic formas devido a modificações de superfície glicocálix8,13,32. O uso de uma mídia de gradiente de densidade para separar metacyclic promastigotas de promastigotas baseadas em diferenças de fase específica na densidade flutuante é um método atraente porque isso não depende de variações específicas na superfície ligantes parasita. Este método, inicialmente descrito por L. major metacyclic amazonensis purificação33, foi adotado com sucesso por várias outras espécies de Leishmania , principalmente através de modificações das condições de centrifugação durante sedimentação de gradiente de densidade46,47,,48,49.
Também é importante estar ciente dos problemas que podem complicar a execução do ensaio, que pode ocorrer em várias etapas do processo. Esses problemas podem incluir a contaminação durante a extração de BMM, malsucedida diferenciação de BMMs após a extração, chapeamento de macrófago inconsistente, incompleta da purificação das formas infectantes do parasita, infecção pobre ou inconsistente, e dificuldades de montagem as lamelas de vidro em corrediças do microscópio. Estas possibilidades foram abordadas no protocolo e podem ser resolvidas Avaliando cuidadosamente cada passo do processo de infecção, para identificar o problema. Por exemplo, contaminação de culturas BMM durante o processo de diferenciação pode indicar a necessidade para melhoria técnica estéril durante a extração. Atenção cuidadosa para a pureza e o frescor dos reagentes de purificação e precisa implementação do protocolo de purificação pode retificar incompleta ou mal-sucedidas purificação das formas parasita desejado. Infecções de pobres ou inconsistentes podem ser causadas por quantificação imprecisa de parasitas ou um MOI que é muito alta ou muito baixa para as condições experimentais específicas. Após a extração, manipulação e montagem as lamelas de vidro são sem dúvida o processo mais tecnicamente desafiador nesta técnica; os indivíduos podem encontrar que eles preferem usar diferentes ferramentas para facilitar a manipulação das lamelas. Visualização clara de DAPI manchado núcleos é crítica para parasita precisa contar ao microscópio. Coloração fraca e inadequada com foco são dois principais culpados por trás de quantificação inconsistente. Isto pode ser assegurado pelo controle de qualidade da DAPI coloração passo, limitando o tempo de exposição à luz para reduzir a foto-branqueamento e rapidamente, mudando o foco objetivo conta para todos os núcleos do parasita no campo. Brilho DAPI fluorescência também pode ser melhorado, garantindo adequada permeabilização das amostras com detergente e aumentando a concentração de DAPI durante a coloração. Uma abordagem alternativa que pode facilitar o processo de quantificação é obter imagens digitais das amostras durante o exame microscópico. As imagens podem ser usadas para quantificação em um momento posterior e podem ser verificado/quantificado por investigadores independentes. No entanto, existem dificuldades técnicas associadas a este processo que requer cuidadosa consideração. Devido à natureza esférica do PV, os parasitas nem sempre são no mesmo plano focal. Isto exige que várias imagens ser adquiridos usando diferentes planos focais para cada campo microscópico e posteriormente montados juntos a conta para todos os parasitas. Caso contrário, quantificação de fotografias pode ser muito enganosa. Cálculos de macrófagos/campo e amastigotes/campo são fundamentais para garantir o macrófago consistente do chapeamento e a propagação de parasitas foi alcançado durante a infecção. Desde BMMs são células totalmente diferenciadas, seu número não deve aumentar ao longo do tempo. Se aumenta o número de macrófagos do hospedeiro ao longo do tempo, isso significa que os macrófagos foram ainda imaturos. Nesse caso, a fonte e a concentração do M-CSF devem ser verificados. Determinação de macrófagos infectados por cento também pode ser útil em fornecer uma visão abrangente do host interação patógeno-célula, particularmente em casos onde carga percentual de infecção e parasita não seguem semelhantes tendências20,21 .
O método de em vitro BMM infecção detalhada aqui pode ser modificado para atender a necessidades específicas de experimentais. As modificações podem ser feitas a qualquer um dos passos básicos do processo - BMM extração e a diferenciação, a purificação das formas infectantes do parasita e quantificação das infecções de macrófagos in vitro , bem como execução de infecções com diferentes MOIs e ajustar o período de infecção e tempo-pontos analisaram. Componentes de meios de cultura também podem ser facilmente modificados através de uma suplementação ou depleção de nutrientes específicos, e várias cepas diferentes ou formas de parasitas podem ser avaliadas simultaneamente. Essas modificações podem exigir ajuste adicional de procedimentos técnicos; por exemplo, procedimentos para a preparação de amastigotas e purificação metacyclic amazonensis deverão variar entre várias espécies de Leishmania . Fluorescentes adicionais corantes além de DAPI, ou fluorescente etiquetados componentes celulares podem ser utilizados para visualizar uma abrangente gama de246,processos do interação parasita-hospedeiro. Além disso, este ensaio pode ser adaptado para um formato de sistemas de alta taxa de transferência (HTS), que permita a rápida triagem de bibliotecas de compostos para identificar pistas de droga nova e eficaz para o tratamento de leishmaniose24.
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Disclosures
Os autores declaram que têm sem interesses financeiros de concorrentes,
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelos institutos nacionais de subsídio de saúde RO1 AI067979 a NWA.
YK é destinatário de graduação comunhão de Howard Hughes Medical Institute/Universidade de Maryland College Park.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 well cell culture plate | Cellstar | 657160 | |
| Adenine | Acros Organics | AC147440250 | |
| Aerosol Barrier Pipet Tips (100-1000 μL) | Fisherbrand | 02-707-404 | |
| Aerosol Barrier Pipet Tips (20-200 μL) | Fisherbrand | 02-707-430 | |
| Aerosol Barrier Pipet Tips (2-20 μL) | Fisherbrand | 02-707-432 | |
| Bard-Parker Rib-Back Carbon Steel Surgical Blade #10 | Aspen Surgical | 371110 | |
| BD Luer-Lok Tip 10 mL Syringe | Becton Dickinson (BD) | 309604 | |
| BD Precisionglide Needle, 25G | Becton Dickinson (BD) | 305124 | |
| Cell Culture Dish 35 mm x 10 mm | Cellstar | 627 160 | |
| Cell Culture Flask | Cellstar | 660175 | |
| Cover Glasses: 12 mm circles | Fisherbrand | 12-545-80 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| D-Biotin | J.T. Baker | C272-00 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS | |
| Ethyl alcohol 200 proof | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Falcon 100 mm x 15 mm non-TC-treated polystyrene Petri dish | Corning | 351029 | |
| Fetal Bovine Serum | Seradigm | 1500-500 | |
| Ficoll400 | Sigma Aldrich | F8016 | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | E200 | |
| Goat anti-mouse IgG Texas red | Invitrogen | T-862 | |
| Goat anti-rabbit IgG AlexaFluor488 | Invitrogen | A-11034 | |
| Hemin | Tokyo Chemical Industry Co. LTD | H0008 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Isoton II Diluent | Beckman Coulter | 8546719 | |
| L-Glutamine | Gemini | 400-106 | |
| Medium 199 (10X) | Gibco | 11825-015 | |
| Na pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360-070 | |
| Paraformaldehyde | Alfa Aesar | 43368 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gemini | 400-109 | |
| Phosphate Buffered Saline (-/-) | ThermoFisher | 14200166 | |
| Polypropyline conical Centrifuge Tubes 15 mL | Cellstar | 188 271 | |
| Polypropyline conical Centrifuge Tubes 50 mL | Cellstar | 227 261 | |
| ProLong Gold antifade reagent | ThermoFisher | P36930 | |
| Rat anti-mouse Lamp-1 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 1D4B | |
| Recombinant Human M-CSF | PeproTech | 300-25 | |
| Reichert Bright-Line Hemocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| RPMI Medium 1640 (1X) | Gibco | 11875-093 | |
| Triton X-100 Surfactant | Millipore Sigma | TX1568-1 | |
| Trypan Blue | Sigma Aldrich | T8154 | |
| Delicate Scissors, 4 1/2" | VWR | 82027-582 | |
| Dissecting Forceps, Fine Tip | VWR | 82027-386 | |
| Microscope Slides | VWR | 16004-368 | |
| Z1 Coulter Particle Counter, Dual Threshold | Beckman Coulter | 6605699 |
References
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