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Immunology and Infection

Quantificazione della crescita intracellulare all'interno di macrofagi è un veloce e affidabile metodo per valutare la virulenza dei parassiti di Leishmania

Published: March 16, 2018 doi: 10.3791/57486

Summary

Tutte le specie di Leishmania patogene risiedono e replicano all'interno dei macrofagi dei loro ospiti vertebrati. Qui, presentiamo un protocollo per infettare i macrofagi murini derivate da midollo osseo nella cultura con Leishmania, seguita da quantificazione precisa della cinetica di crescita intracellulare. Questo metodo è utile per lo studio di singoli fattori che influenzano l'interazione ospite-patogeno e la virulenza di Leishmania .

Abstract

Il ciclo di vita di Leishmania, l'agente eziologico della leishmaniosi, alterna fasi promastigote ed amastigote all'interno l'insetto e vertebrati padroni di casa, rispettivamente. Mentre patogeni sintomi della leishmaniosi possono variare ampiamente, da lesioni cutanee benigne a forme altamente fatale malattia viscerale a seconda della specie infettiva, tutte le specie di Leishmania risiedono all'interno di host macrofagi durante la fase di vertebrati di il ciclo di vita. Leishmania infettività pertanto è direttamente correlata alla sua capacità di invadere, sopravvivere e replicare all'interno di vacuoli parasitophorous (PVs) all'interno dei macrofagi. Così, valutando la capacità del parassita di replicare intracellulare serve come un metodo affidabile per determinare la virulenza. Studiare lo sviluppo di leishmaniosi utilizzando modelli animali è lungo, noioso e spesso difficile, specialmente con il patogeno importante forme viscerali. Descriviamo qui una metodologia per seguire lo sviluppo intracellulare di Leishmania in macrofagi derivate da midollo osseo (saggi). Parassita intracellulare numeri sono determinati a intervalli di 24 h per 72-96 ore dopo l'infezione. Questo metodo consente una determinazione affidabile degli effetti di vari fattori genetici sulla virulenza di Leishmania . Ad esempio, mostriamo come un'omissione di singolo allele del gene del trasportatore mitocondriale di ferro Leishmania (LMIT1) altera la capacità del ceppo mutante Leishmania amazonensis LMIT1/ΔLmit1 a crescere all'interno di saggi, riflettendo una drastica riduzione nella virulenza rispetto al wild type. Questo test consente inoltre un controllo preciso delle condizioni sperimentali, che possono essere manipolati individualmente per analizzare l'influenza di vari fattori (nutrienti, specie reattive dell'ossigeno, ecc.) sull'interazione ospite-patogeno. Pertanto, l'esecuzione appropriata e la quantificazione degli studi infezione BMM forniscono un'alternativa non invasiva, veloce, economica, sicura e affidabile agli studi di modello animali convenzionali.

Introduction

La leishmaniosi si riferisce ad un ampio spettro di malattie umane causate da specie di protozoo parassita del genere Leishmania. Circa 12 milioni di persone sono attualmente infettati con Leishmania in tutto il mondo, e più di 350 milioni sono a rischio. La patologia della malattia dipende dalla specie di Leishmania e fattori dell'ospite, e sintomi variano da lesioni cutanee autorigenerante innocuo a forme visceralizing letali. Se non trattata, viscerale di leishmaniosi è fatale, classifica solo dopo la malaria come la più letale malattia umana causata tramite l'infezione con un protozoo parassita1. Nonostante le differenze ad ampio raggio in patologia di malattia ed i sintomi, tutte le specie di Leishmania hanno un ciclo di vita digenica alternando fasi promastigote ed amastigote all'interno insetti e vertebrati padroni di casa, rispettivamente. Interno vertebrati, Leishmania macrofagi host per invasione di destinazione e inducono la formazione di vacuoli parasitophorous (PVs), compartimenti acidi con proprietà di phagolysosomes dove le forme altamente virulento amastigote replicano. Amastigoti persistono nei tessuti dell'ospite durante le infezioni croniche e possono essere passate avanti a non infetti Pappataci, completando il ciclo di trasmissione. Pertanto, nel contesto dello sviluppo di malattia umana, amastigoti sono i più importanti di forma di Leishmania del ciclo di vita2. Indagando come amastigoti replicano all'interno del macrofago PVs è fondamentale per la comprensione Leishmania virulenza3,4,5,6,7 e per la sviluppo di nuove terapie efficaci.

Descriviamo qui un metodo utilizzato regolarmente dal nostro laboratorio per studiare la Leishmania infezione e la replicazione in macrofagi derivate da midollo osseo (saggi), che comporta la valutazione quantitativa del numero di intracellulare Leishmania nel corso del tempo. Il processo prevede la raccolta dei monociti da midollo osseo di topo e la differenziazione di macrofagi nella cultura, infezione in vitro con forme infettive (metacyclic promastigotes o amastigotes) di Leishmania e quantificazione della numero di parassiti intracellulari ad ogni intervallo di 24 ore per un periodo di 72-96 h dopo l'infezione. Questo test è stato utilizzato nel nostro laboratorio per determinare l'impatto di diversi fattori ambientali e geni di parassita, compresa l'individuazione del ruolo critico di ferro nel promuovere L. amazonensis virulenza che più ulteriormente è stata convalidata da zampa studi di sviluppo di lesione in topi6,8,9,10,11,12,13,14,15 . Poiché tutte le specie patogene di Leishmania stabiliscono loro nicchia replicativa dentro macrofagi host, questo test può essere utilizzato universalmente per le determinazioni di virulenza in tutte le specie di Leishmania .

L'esecuzione di infezioni BMM consente analisi delle interazioni ospite-parassita a livello di singola cellula e quindi una più ampia comprensione di come i parassiti di Leishmania interagiscono con loro microambiente ospite preferito, il PVs dei macrofagi. Macrofago infezione saggi sono stati utilizzati con successo da più gruppi16,17,18,19,20,21,22 per esplorare funzioni del macrofago host e Leishmania specifici geni e di loro possibili implicazioni nella complessa interazione che caratterizza l'infezione intracellulare. Le infezioni BMM permetterà la quantificazione della crescita del parassita come una lettura dell'impatto dei fattori dell'ospite che influenzano la sopravvivenza intracellulare, come produzione di ossido nitrico microbicida, generazione di specie reattive dell'ossigeno e altre condizioni avverse ha rilevato all'interno del lysosome-come PVs23. Saggi di infezione del macrofago inoltre sono stati utilizzati per identificare potenziali contatti di droga di anti-leishmanial per sviluppo terapeutico13,24.

La natura in vitro delle infezioni BMM fornisce parecchi vantaggi sopra altri metodi per valutare la virulenza di Leishmania . Tuttavia, diversi studi precedenti, esaminare i meccanismi di sopravvivenza del parassita intracellulare nel corso del tempo non ha fatto quantificare l'infezione come un tasso20,21,24. Inoltre, molti studi focalizzati sulle seguenti infezioni in vivo nel corso del tempo ha fatto misurando la dimensione della lesione cutanea e altri sintomi fisiologici che sono solo indirettamente collegati ad parassita replica25,26 , 27. in vivo l'infezione è un approccio rigoroso per valutare la virulenza del parassita, ma misure lesione basate su grassatore gonfiore da solo sono spesso inadeguate, come essi riflettono la risposta infiammatoria nei tessuti infetti e non il numero assoluto di parassiti. Per questo motivo, lo sviluppo della lesione grassatore saggi devono essere seguite da quantificazione del carico parassita nei tessuti infetti, una procedura che richiede diluizione limitante lunghi saggi28. Inoltre, in vivo gli studi coinvolgono spesso sacrificare animali multipli in diversi punti nel tempo per estrarre tessuti di interesse6,8,9,10, 11 , 13. al contrario, grandi numeri di saggi possono essere ottenuti da un solo animale, e queste cellule possono essere placcate in condizioni tali da consentono la valutazione dell'infezione in vari punti nel tempo. Inoltre, rispetto agli studi in vivo , in vitro infezioni BMM l'esecuzione consente maggiore controllo sulle condizioni sperimentali. Quantificare i macrofagi infetti con i parassiti stessi consente un controllo preciso della molteplicità di infezione (MOI) e di condizioni di coltura. Controllo preciso su questi fattori può essere chiave nell'identificare le caratteristiche delle vie cellulari discrete e nella comprensione del loro impatto sul corso dell'infezione.

Dato questi vantaggi, è un po' sorprendente che molto pochi gruppi studiando Leishmania virulenza finora hanno preso pieno vantaggio della valutazione quantitativa di replica intracellulare in macrofagi. In questo articolo, discutiamo i problemi comuni che possono ostacolare l'utilizzazione più ampia di questo test e fornire un protocollo dettagliato per facilitare la corretta esecuzione. Considerando la sua precisione e versatilità, il BMM infezione analisi che descriviamo qui può non solo essere utilizzata per esplorare le interazioni ospite-patogeno che influenzano la virulenza di Leishmania , ma anche di studiare altri microrganismi che replicano all'interno macrofagi29. D'importanza, questo test può essere sviluppato anche come metodo di screening pre-clinico rapido ed economico per lo sviluppo di farmaci anti-leishmanial.

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Protocol

Tutte le procedure sperimentali sono stati condotti in conformità con le raccomandazioni della Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio da National Institutes of Health e sono state approvate dall'IACUC di Università del Maryland. Tutti i passaggi descritti nelle sezioni da 1 a 4 dovrebbero essere eseguiti in modo sterile all'interno biologica a flusso laminare. Protezione personale dovrebbe essere usato, e deve prestare attenzione durante la manipolazione di parassiti di Leishmania vivi durante tutte le fasi di sperimentazione.

1. isolamento e la differenziazione dei macrofagi derivate da midollo osseo (saggi)8,30,31

  1. Giorno 0: Sacrificio di 4 - 6-settimana-vecchio femmina C57BL/6 o il mouse BALB/c in una camera di CO2 e confermare la morte tramite dislocazione cervicale. Garantire una sterilizzazione di forbici e pinze tenendole imbevuto di etanolo al 70%. Guanti a spruzzo con etanolo al 70% per consentire sterile gestione durante tutto il processo di isolamento delle cellule del midollo osseo.
  2. Mouse sicuro sacrificato per dissezione a bordo da appuntare i suoi arti e disinfettare spruzzando abbondantemente con etanolo al 70%.
  3. Praticare una piccola incisione (circa 1 cm) con le forbici vicino l'articolazione dell'anca. Inserire con cautela forbici sotto la pelle per separare il muscolo sottostante e tagliare la pelle tutto intorno l'articolazione dell'anca.
    Nota: La scheda di dissezione può essere ruotato per consentire il miglioramento dell'accesso all'articolazione dell'anca.
  4. Con attenzione deglove pelle dalla coscia tirando verso la caviglia e rimuovere. Tagliare il piede alla caviglia, facendo molta attenzione a tagliare o di sotto della caviglia congiunta per lasciare la tibia completamente intatto.
    Nota: Il perone in questa fase è vagamente collegato e possa essere facilmente separato con il forcipe.
  5. Individuare manualmente l'articolazione dell'anca manipolando il femore per identificare il punto di rotazione. Con attenzione usare le forbici per tagliare la gamba sopra l'anca di lasciare intatta la testa del femore prossimale.
  6. Rimuovere quanto più muscolo e del tessuto connettivo come possibile dalla coscia con le forbici. Rimuovere qualsiasi pelle restante dalla caviglia e qualsiasi materiale osseo in eccesso sopra l'articolazione dell'anca.
  7. Posizionare le ossa della gamba puliti in RPMI sterile completati con penicillina/streptomicina (1% di concentrazione finale) in una capsula Petri sul ghiaccio.
  8. Ripetere i passaggi da 1.4 attraverso 1.6 per isolare la tibia e femore di altra gamba posteriori.
  9. Rimuovere qualsiasi muscolo e tessuto connettivo rimanenti dalle ossa ammollo in RPMI utilizzando pinze sterili e sterile #10 lama.
  10. Mettete le ossa sul coperchio scatola di Petri. Tagliare la tibia attentamente con la lama immediatamente di sopra dell'articolazione della caviglia per accedere il midollo. Rimuovere la tibia dal resto della gamba di taglio immediatamente sotto l'articolazione del ginocchio.
  11. Disegnare 10 mL sterili RPMI supplementato con penicillina/streptomicina (1% di concentrazione finale) una siringa 10 mL e fissare un ago 25G.
  12. Saldamente la tibia con il forcipe, verticalmente sopra un tubo conico da 50 mL su ghiaccio. Usare la siringa per iniettare delicatamente circa 5 mL RPMI nell'estremità dell'osso per svuotare il midollo osseo fuori l'altra estremità nella provetta conica. Sciacquare il midollo osseo con un totale di 10 mL RPMI fino a quando l'osso diventa bianco.
    Nota: Dopo aver sciacquato, l'osso dovrebbe diventare bianco. In caso contrario, continuare a sciacquare per rimuovere del midollo. Potrebbe essere necessario essere assettato indietro con la lama se è troppo stretta per inserire l'ago l'estremità distale della tibia.
  13. Tagliare il femore immediatamente sopra l'articolazione del ginocchio e immediatamente sotto l'anca per esporre entrambe le estremità dell'osso per accedere il midollo. Filo del midollo osseo dal femore con un totale di 10 mL RPMI nello stesso modo come la tibia.
  14. Ripetere i passaggi 1.6 attraverso 1.13 con le ossa rimanenti di lavaggio e pulizia e raccogliere le cellule di midollo osseo svuotata in un tubo conico di singolo 50 mL
    Nota: Se un osso si rompe in qualsiasi punto durante la dissezione prima dell'osso vampate di calore, non utilizzare il midollo da questo osso.
  15. Centrifugare la provetta conica utilizzata per raccogliere midollo osseo svuotato da tutte le quattro ossa per 10 min a 4 ° C a 300 x g.
  16. Posto 60 mL di mezzo BMM sterile (RPMI con una concentrazione finale del 20% FBS, 1% di penicillina/streptomicina, 1,2 mM Na-piruvato, 25 µ g/mL M-CSF umano) in un matraccio di cultura cellulare2 175 cm con tappo del filtro.
  17. Scartare il surnatante in seguito a centrifugazione e risospendere il pellet cellulare di brezza su e giù per pipettaggio con 5 mL di terreno BMM dal pallone.
  18. Trasferire la sospensione cellulare nel matraccio di cultura e sciacquare il tubo conico due volte con il mezzo di BMM nel matraccio di cultura per garantire il recupero massimo delle cellule. Garantire la sospensione cellulare è mescolato completamente in mezzo e distribuire 30 mL dal matraccio di cultura cellulare2 iniziale 175 cm per una seconda 175cm2 cella matraccio di cultura con tappo del filtro.
  19. Incubare entrambi beute contenenti 30 mL di sospensione cellulare ogni notte a 37 ° C, 5% CO2 per consentire la separazione di eventuali contaminanti fibroblasti, macrofagi residenti e altre cellule aderenti.
  20. 1 ° giorno: Trasferire il surnatante contenente cellule indifferenziate del midollo osseo da boccette di 100 x 15 mm-TC-trattati Petri polistirolo a circa 10 mL/piatto e incubare a 37 ° C, 5% CO2. Scartare le beute.
  21. Giorno 3 o 4: Aggiungere un ulteriori 5 mL di terreno di BMM (pre-riscaldato a 37 ° C) per ogni capsula di Petri e continuare l'incubazione a 37 ° C, 5% CO2.

2. placcatura saggi sulle lamelle per infezione (giorno 7 o 8)

  1. Preparare piastre di coltura del tessuto 6 pozzetti inserendo quattro 4 lamelle di vetro sterile 12 mm (autoclavate e conservate in un contenitore di vetro chiuso) nella parte inferiore di ogni vuota bene.
    Nota: Raccogliere ogni vetrino coprioggetto sterili 12 mm con una punta di aspirazione montata su una linea del vuoto. Posizionare le lamelle nei pozzetti senza sovrapposizione, rilasciando nella posizione desiderata pizzicando il tubo per interrompere vuoto.
  2. Media aspirato (e tutte le cellule non-aderenti) da capsule di Petri rivestito con aderenti del midollo osseo derivano macrofagi e delicatamente aderente risciacquo cellule 2x con soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco sterile senza cloruro di calcio e magnesio (PBS- / -) pre-riscaldato a 37 ° C.
  3. Aggiungere goccia a goccia, 5 mL sterile 1 x PBS- / - con una concentrazione finale di 1 mM EDTA per ogni capsula di Petri e incubare per 5 min a 37 ° C per staccare aderente saggi. Verificare che le cellule sono staccate usando un microscopio.
  4. Raccogliere tutto staccato le cellule sospese in PBS 1X- / - completati con 1 mM EDTA in una provetta conica da 50 mL. Sciacquare ogni piatto 2 volte con 5 mL di PBS- / - e aggiungere al pool di sospensione cellulare.
    Nota: Sospensione cellulare può essere diluito con ulteriori PBS- / - per proteggere i macrofagi da tossicità EDTA durante il processo di raccolta.
  5. Centrifugare a 300 x g per 10 min a 4 ° C. Eliminare il surnatante e risospendere i macrofagi in 5-10 mL di terreno di BMM pipettando. Posto risospese cellule sul ghiaccio per impedire il collegamento di tubi e l'agglutinamento.
  6. Conteggio di cellule vitali con esclusione del Trypan blu nell'emocitometro.
    Nota: Per contare le celle BMM risospese in 5 mL di terreno, un mix di diluizione della sospensione di cellule 25 µ l in 445 µ l PBS- / - e 30 µ l 0,4% Trypan blu soluzione in genere permette facile quantificazione in un emocitometro (prendendo in considerazione un fattore di diluizione 20 x per il calcolo finale ). Contare solo le celle che ha fatto non macchiarsi con Trypan blu (cellule vitali). Il volume della sospensione cellulare può essere alterato se questa miscela è troppo concentrata o diluita. In generale, la resa di BMM per preparazione varia tra 2 x 107 e 5 x 107 cellule da un unico mouse.
  7. Preparare la sospensione cellulare in mezzo BMM alla concentrazione desiderata placcatura (5 x 105/ml) e disperdere sospensione a 6 pozzetti in 2 mL di terreno per pozzetto affinché ognuno riceve ben 1 x 106 macrofagi.
    Nota: Questo è un passaggio fondamentale che garantisce ogni bene ottiene il numero adeguato di macrofagi a coprire uniformemente i coprioggetti. Controllare che coprioggetti in pozzi non sono sovrapposte o galleggiante nel mezzo. Se è così, regolare delicatamente con una pipetta sterile.
  8. Incubare per una notte a 37 ° C, 5% CO2.

3. purificazione delle forme infettive di L. amazonensis

Nota: Preparare Leishmania per infezioni - purificare metacyclic promastigotes da stazionario promastigote culture8,13, o differenziarsi promastigotes nella cultura in forma amastigote utilizzando standard L. amazonensis differenziazione axeniche protocollo6,8.

  1. Purificazione di Leishmania metacyclic promastigotes utilizzando media(Materials) gradiente di densità 33
    1. Preparare la soluzione di riserva del 40% dei media gradiente di densità in acqua sterile, privo di endotossina.
    2. Diluire la soluzione di gradienti di densità in 10 x M199 medio (senza siero) per preparare 10% concentrazione nel medium M199.
    3. Consente di filtrare tutte le soluzioni di 0,22 µm filtro.
      Nota: Soluzioni Stock possono essere conservate a 4 oC al buio per non più di 1 mese.
    4. Aggiungere 2 mL di soluzione al 40% densità media pendenza nel fondo di una provetta conica per centrifuga 15 mL.
    5. Strato 2 mL di soluzione di media pendenza 10% densità in M199 sopra lo strato di pendenza media del 40% densità con attenzione, usando una pipetta di Pasteur per evitare qualsiasi miscelazione tra i due strati.
    6. Raccogliere 1 x 109 parassiti da cultura stazionario-fase di centrifugazione a 1.900 x g per 10 min.
    7. Risospendere le cellule in di 6 mL Dulbecco per volta essenziale Medium (DMEM).
    8. Strato 2 mL della sospensione delle cellule direttamente sopra il 10% densità gradienti supporti i layer, delicatamente, usando una pipetta di Pasteur per evitare la commistione fra gli strati.
    9. Centrifugare il gradiente per 10 min a 1.300 x g e a temperatura ambiente.
      Nota: A causa delle differenze nelle proprietà fisiche tra specie di Leishmania , le condizioni di centrifugazione per ognuno potrebbero essere necessario essere leggermente regolata per garantire il massimo rendimento.
    10. Raccogliere i parassiti (arricchiti in forma promastigote metacyclic) dalla band formata al confine di media pendenza superiore 10% densità (interfaccia tra gli strati di media pendenza 0% e 10% di densità).
    11. Diluire i parassiti con un volume di DMEM e raccogliere mediante centrifugazione (1.900 x g per 10 min a temperatura ambiente).
    12. Risospendere in mezzo DMEM 500 µ l e contare in un emocitometro per quantificare il rendimento.
  2. Generazione di L. amazonensis amastigoti in condizioni di coltura axenica (basso pH / temperatura elevata)6,8,13
    1. Mix 5 mL di coltura di registro-fase promastigote (pH 7,4 a 26 oC) con un volume uguale di amastigote medio (pH 4,5), utilizzando boccette di 25 cm2 (Totale 10 mL di terreno) e incubare a 26 ° C durante la notte.
    2. Spostare il pallone da 26 ° C a 32 ° C.
    3. Dopo 3 o 4 giorni, split cultura 1:5 in media amastigote a 32 ° C.
    4. Controllare i parassiti nei prossimi 3-4 giorni (massimo 7 giorni) per vedere se sono pronti per l'uso in caso di infezioni.
      Nota: Amastigoti axeniche sano dovrebbero avere una forma ovale, senza flagelli visibili. Amastigoti parzialmente differenziati hanno una forma ovale grande con breve flagelli. La cultura non dovrebbe avere un sacco di ciuffi - ciuffi molti sono un'indicazione di non-crescita, parassiti morenti. La cultura di amastigote può essere split 1:5 e mantenuta per un massimo di 3 settimane.

4. infezione con L. amazonensis

  1. Diluire sospensioni parassita secondo MOI desiderato (solitamente 3-5 metacyclic promastigotes al macrofago [MOI di 1:3 o 1:5]) e 1 amastigote al macrofago [MOI 1:1]. Aggiungere la Leishmania in PBS- / - in un volume di 50-100 µ l a ciascun pozzetto già contenente 2 mL di terreno.
  2. Incubare 1h con amastigoti e 3 h con metacyclic promastigotes a 34 oC per l'infezione di saggi.
    Nota: La temperatura ottimale di infezione può variare da specie.
  3. Dopo incubazione, accuratamente lavare via i parassiti gratis in ogni ben 3 volte con 2 mL di PBS- / - pre-riscaldato a 37 ° C.
    Nota: Disperdere PBS delicatamente per garantire che le lamelle non galleggiano sopra a vicenda. Agitare delicatamente la piastra e quindi aspirare il liquido. Utilizzare punta ad aspirazione separato se utilizza più ceppi di parassiti per evitare la contaminazione incrociata.
  4. Difficoltà 1 h o h 3 campioni del tempo-punto incubando ogni bene con 1.5-2 mL di 2% PFA in PBS- / - per 10 min. lavare 3 volte con PBS- / -. Non aspirare ultimo lavaggio e refrigerare piastre contenenti coprioggetti in PBS fino a colorazione.
  5. Aggiungere 2 mL di terreno di BMM fresco ad ogni pozzetto su piastre per ulteriore tempo-punti e incubare a 34 ° C.
  6. Difficoltà tempo-punti rimanenti come desiderato, come descritto al punto 4.3 e refrigerare piastre fino a colorazione.

5. il DAPI colorazione e montaggio vetrino coprioggetti

  1. Aspirare la PBS da pozzetti contenenti coprioggetti e aggiungere 1,5 mL di PBS- / - con detergenti non ionici 0.1%. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente, seguita da lavare 3 volte con 2 mL di PBS- / -.
  2. Aggiungere 1 mL di PBS- / - con 2 µ g/mL DAPI (diluito da 5 mg/mL di soluzione madre in acqua) per pozzetti contenenti coprioggetti e incubare per un altro 1 h a temperatura ambiente.
    Nota: Il tempo di incubazione con DAPI è fondamentale per la corretta visualizzazione dei parassiti intracellulari di Leishmania . I nuclei del macrofago macchia rapidamente, grazie alla loro dimensione maggiore e DNA contenuto ma la macchiatura dei nuclei dei parassiti intracellulari è più lento. Pertanto, estendere il tempo di incubazione di là di ciò che è necessario per visualizzare i nuclei BMM è necessario consentire DAPI a permeare attraverso e la membrana di plasma del parassita e la membrana nucleare parassita. Con la macchia di DAPI corretta, cinetoplasto mitocondriale del DNA vicino la tasca fustigatrice del parassita possa anche essere visualizzato, oltre il DNA nucleare.
  3. Lavare ogni pozzetto contenente coprioggetti 3 x con 2 mL di PBS- / - e poi ascensore e vetrini coprioggetti flip con il forcipe di posizionare il lato di cella e montare sul vetro microscopio diapositive con un reagente di montaggio antifade commercialmente disponibili.
    Nota: Le lamelle sono estremamente fragili e devono gestione prudente. Evitare di mettere pressione su di loro, soprattutto contro la parete laterale dei pozzetti durante il sollevamento. Aggiungendo poche gocce di PBS- / - riduce la tensione superficiale tra il vetrino coprioggetto e bene e facilita il processo di sollevamento. Un ago di calibro fine può essere utilizzato per aiutare a indiscreti lamelle dal fondo del pozzo. Dopo aver piazzato un vetrino coprioggetto sulla diapositiva, premere delicatamente con le pinzette per far uscire eventuali bolle d'aria nei media montaggio. Se un vetrino coprioggetto è rotto o possibilmente ha girato durante il processo di sollevamento, non rimontare; utilizzare semplicemente il coprioggetto quarto ricambio.
  4. Refrigerare diapositive fino alla quantificazione.

6. infezione quantificazione

  1. Esaminare i vetrini colorati DAPI sotto un microscopio a fluorescenza focalizzando l'attenzione sui macrofagi utilizzando 100 X Diametro obiettivo con olio da immersione (eccitazione a 358 nm; emissione ottimale a 461 nm).
    Assicurarsi che la messa a fuoco sia sul livello dei macrofagi tra il vetrino e il vetrino coprioggetti.
  2. Quantificare il numero dei macrofagi (grandi nuclei macchiati con DAPI) e il numero dei piccoli nuclei di amastigote raggruppati attorno a ogni nucleo del macrofago (Vedi Figura 2A, DAPI) per ogni campo di visibilità, utilizzando un contatore manuale.
    Nota: I nuclei Amastigote non siate tutti visibili in un piano di messa a fuoco a causa della loro piccola dimensione. Contare quelli che sono visibili quando è focalizzato sui nuclei del macrofago e quindi utilizzare la messa a fuoco micrometrica per verificare per nuclei di parassita nei piani sopra e sotto i nuclei del macrofago.
  3. Spostarsi in un altro campo di visibilità per ripetere la quantificazione. Utilizzare una chiave di contatore separato per tenere traccia del numero di campi contato. Muoversi attraverso i campi visivi in file parallele attraverso ogni vetrino coprioggetti, per evitare sovrapposizione di conteggio.
  4. Quantificare un minimo di 200 macrofagi al vetrino coprioggetti. Quantificare ogni punto di tempo dell'infezione in triplice copia (3 lamelle). Contare il coprioggetto quarto se uno del precedente non è adatto per il conteggio a causa di sovrapposizione vetrino coprioggetti, montaggio povero, rottura vetri, ecc.
    Nota: Se 200 macrofagi non possono essere conteggiati su qualsiasi un vetrino coprioggetti, conteggio quarto la ruota di scorta.
  5. Calcolare i tassi di infezione come macrofagi amastigoti/macrofago o amastigoti/100 e determinare percentuale i macrofagi infettati dai dati grezzi quantificazione.

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Representative Results

Leishmania ha due forme infettive - metacyclic promastigotes che differenziano da prociclico promastigotes presso la fase stazionaria della cultura e amastigoti, che sono le fasi intracellulari (Figura 1). In alcune specie di Leishmania come L. amazonensis, amastigoti possono essere differenziate anche in coltura axenica a spostando le celle promastigote per abbassare il pH (4.5) e temperatura elevata (32 ° C), condizioni simili a quelle che si trovano all'interno di BMM PVs 8 , 34. solo metacyclic forme promastigote o amastigote di Leishmania sono in grado di indurre la formazione di PVs e replicare intracellulare dopo essere inghiottito da host macrofagi35. Registro-fase indifferenziato promastigotes sono non virulento e in grado di promuovere la formazione di PV (Figura 2).

Nel caso di infezioni con metacyclic promastigotes, di solito c'è un ritardo di 24 ore prima di un aumento nel numero di parassita intracellulare. Questo si verifica perché i promastigotes metacyclic primo a differenziarsi in amastigoti prima di iniziare la replica. Per questo motivo, infezioni avviate con metacyclic promastigotes ci vorrà più tempo per mostrare aumenti nei numeri totale parassita intracellulare e per questo motivo, potrebbe essere necessario essere incubate per intervalli di tempo più lungo.

Figura 2A rappresenta un successo infezione usando axenically differenziato amastigoti, mostrando la localizzazione intracellulare di Leishmania (in rosso) dopo l'infezione iniziale (1 h), prima della formazione dei PVs di fusione di fagosomi con lisosomi. A 48 h, può essere osservato PVs grande distinti che harboring i parassiti più. Un aumento costante del numero di parassiti all'interno dei PVs è caratteristica delle infezioni virulente di Leishmania . Promastigotes non-virulenti registro-fase (Figura 2B), al contrario, sono in grado di avviare lo sviluppo di PV (punto di tempo di 48 h), non replicare e alla fine vengono uccisi all'interno di macrofagi host, anche quando preso dai macrofagi host a numeri paragonabili per metacyclic promastigotes o amastigotes.

Per dimostrare l'efficacia di questo metodo, abbiamo confrontato il selvaggio-tipo L. amazonensis con parassiti di LMIT1/ΔLmit1 che contiene una singola copia del LMIT1 (Leishmania Mitochondrial horon T ransporter 1) gene, che si traduce in danno del ferro mitocondriale importare13. Perdita di un allele di LMIT1 non provocare alterazioni significative di attività mitocondriale in LMIT1/ΔLmit1 promastigotes o riducono il rendimento delle forme di metacyclic purificate rispetto al selvaggio-tipo promastigotes13. Promastigotes metacyclic purificata da sia wild-type (WT) e LMIT1/ΔLmit1 stazionarie culture erano ugualmente efficaci nel invadendo saggi, basati sul numero paragonabile di parassiti intracellulari quantificato 1 h dopo l'infezione ( Figura 3A, 1h). Dopo un lasso di tempo iniziale h 24, che è necessaria per metacyclic promastigotes di adattarsi e di differenziarsi in forme amastigote, un costante aumento del numero di parassiti intracellulari di selvaggio-tipo (circa 3 volte tra 24 ore e intervalli di tempo di 72 ore) è stato osservato. Al contrario, poca o nessuna crescita intracellulare dei parassiti di LMIT1/ΔLmit1 (confronta 1 e 72 h a intervalli di tempo) è stata osservata, suggerendo che la perdita dell'allele LMIT1 singola influenza in modo significativo la capacità di questo ceppo di crescere all'interno macrofagi. Crescita del parassita intracellulare ai livelli di selvaggio-tipo, confermando che LMIT1 è critica per amastigote intracellulare in salvo episomal espressione della proteina LMIT1 nel ceppo integrato (LMIT1/ΔLmit1+LMIT1) replica e virulenza13.

Le infezioni del macrofago effettuato con amastigoti axeniche, generato spostando promastigote culture (a pH 7,4; 26 oC) a condizioni di crescita di amastigoti (pH 4,5; 32 oC)34,36, ha mostrato una crescita intracellulare modello (Figura 3B) simile a quello osservato con metacyclic promastigotes (Figura 3A). Seguenti livelli comparabili di assorbimento iniziale (Figura 3B, 1h) wild-type (WT) e LMIT1 completato (LMIT1/ΔLmit1+LMIT1) amastigoti crebbe costantemente, mentre ancora una volta i amastigotes di LMIT1/ΔLmit1 non è riuscito a mostrare una crescita intracellulare. Axeniche amastigoti erano più infettiva (MOI 1:1 rispetto a 1:5 per metacyclic promastigotes) e replicato più efficiente all'interno di PVs.

I nostri dati dimostrano un ritardo iniziale 24h per le infezioni metacyclic promastigote, prima che ci sia un aumento nel numero di parassita intracellulare (confronto tra punti di tempo di 24 h in Figura 3A e 3B). Il GAL rappresenta il tempo necessario per metacyclic interiorizzate promastigotes prima differenziarsi in amastigoti prima di iniziare a replicare. Una comune errore persone fanno quando si utilizza metacyclic promastigotes per infettare, non è aspettare abbastanza a lungo. In casi dove il cambiamento nella virulenza non è drastico, esperimenti condotti oltre 96 h piuttosto che produrre 72h determinazioni molto più affidabile.

Figure 1
Figura 1 : Scanning Electron microfotografia immagini delle varie fasi di vita L. amazonensis . Registro-fase promastigote, metacyclic promastigote da fasi stazionarie e axeniche amastigote. Bar = 10 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 : Un'illustrazione rappresentativa dell'infezione BMM con virulento amastigoti axeniche (A) e non virulento registro-fase promastigotes (B) di L. amazonensis. Immagini di immunofluorescenza di macrofagi isolati da topi BALB/c , 1h e 48 ore dopo l'infezione. I macrofagi infettati sono stati elaborati per l'immunofluorescenza, come descritto nel protocollo. Membrane di PV sono state macchiate con l'anticorpo monoclonale di topo anti-topo Lamp1 (1:1, 000 diluizione) per 1 h, seguito da 1 h di incubazione con IgG di anti-coniglio fluorescente (diluizione 1: 500). Macchiatura del parassita è stata effettuata incubando le lamelle con anticorpi policlonali generati contro axeniche L. amazonensis topo amastigoti, seguite da rosso di IgG anti-topo tingono (diluizione 1: 500) 6. Tutte le lamelle sono state trattate con DAPI per nuclei di colorazione. (A) formazione di PVs distinti che harboring amastigoti più al punto di tempo di 48 h è caratteristica di un'infezione di Leishmania successo con amastigoti axeniche. (B) assenza di formazione di PV distinti e la replica di amastigoti al punto di tempo di 48 h simboleggia la mancanza di virulenza in promastigotes da cultura in ritardo-fase. Rosso indica -Leishmania la colorazione verde indica anti-Lamp1, blu indica DAPI-macchiato del DNA e giallo indica Unione di anti-Lamp1 e macchie di DAPI. Bar, 5 µm. Questa figura è stata modificata da Mittra, b. et al., 2013. Originariamente pubblicato in J Exp Med. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3 : Eliminazione di un allele di LMIT1 altera gravemente la crescita intracellulare del mutante parassiti di LMIT1/Δlmit1 . BMM sono stati infettati per indicato volte con L.amazonensis e risolto immediatamente o più ulteriormente incubate per 24, 48 o 72 h prima erano fissati, tinto con DAPI, e il numero di parassiti intracellulari è stato determinato microscopicamente. (A) saggi sono stati infettati con purificato wild-type (WT), singolo knockout (LMIT1/Δlmit1) e integrata singolo knockout (LMIT1/Δlmit1 + LMIT1) metacyclic promastigotes (MOI 1:5) per 3 h e risolto immediatamente o incubate ulteriormente per i punti di tempo indicato e il numero di parassiti intracellulari è stato determinato microscopicamente. I dati rappresentano la media ± SD delle determinazioni in triplice copia e sono rappresentativi dei risultati di tre esperimenti indipendenti. Gli asterischi indicano differenze significative di infettività tra parassiti WT e LMIT1/Δlmit1 (a due code t - di Studenttest 48h, p = 0,017; 72 h, p = 0,008). (B) axeniche amastigoti da wild-type (WT), singolo knockout (LMIT1/Δlmit1) e culture integrato singolo knockout (LMIT1/Δlmit1 + LMIT1) sono stati testati per la loro capacità di infettare saggi. saggi sono stati infettati per 1 h (MOI 1:1) e sia risolto immediatamente (1 h) o dopo ulteriore incubazione per 24, 48 o 72 h e il numero di parassiti intracellulari è stato determinato microscopicamente. I dati rappresentano la media ± SD delle determinazioni in triplice copia e sono rappresentativi di più di tre esperimenti indipendenti. P-valori (test di Student a due code t) tra i rispettivi gruppi sono indicati. Questa figura è stata modificata da Mittra, b. et al., 2016. Originariamente pubblicato in PloS al. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

I dati quantitativi di prodotto da BMM infezione dosaggio descritto in precedenza, consente ai ricercatori di ottenere tassi di infezione e una determinazione affidabile delle modifiche nelle proprietà di virulenza in un relativamente breve periodo di tempo (massimo 2 settimane, rispetto al 2 mesi previsti per gli esperimenti in vivo ). Questo metodo si basa sul colorante specifico DNA DAPI, che in particolare i nuclei del macrofago e parassita di macchie e permette la rapida identificazione e quantificazione delle cellule infettate. In confronto, altre macchie come Giemsa associare a un gran numero di diversi componenti cellulari con intensità variabile, che complica l'analisi visiva37. L'uso di DAPI permette il riconoscimento di parassiti intracellulari e loro netta distinzione da cellular strutture (solo nuclei delle cellule dell'ospite sono anche colorati, e le loro dimensioni sono diversi ordini di grandezza maggiore di nuclei parassita), consentendo la più facile e veloce quantificazione delle infezioni.

Come con qualsiasi procedura sperimentale, questo metodo presenta alcune limitazioni e diversi passaggi critici che richiedono un'accurata esecuzione. Infezione di Leishmania in vivo coinvolge complessa innata risposta immunologica prima della fagocitosi, che determina l'ultimo corso di infezione38. Scelta del ceppo di modello del mouse, quindi, è di fondamentale importanza nel disegno di studio. Ceppo di topi sia C57BL/6 e BALB/c utilizzato nelle mutazioni di orso protocollo nel gene che codifica la proteina naturale resistenza-collegata del macrofago (Nramp1), una pompa di efflusso di protone che trasloca Fe2 + e Mn2 + ioni dal macrofago lysosomes/phagolysosomes nel cytosol. Conseguente aumento della suscettibilità agli agenti patogeni che replicano all'interno del vano endocitosi di macrofagi8,30,31. Colonizzazione di successo nei macrofagi dipende anche la capacità unica di parassiti di Leishmania infettivi di manipolare il sistema immunitario per sopprimere/sopravvivere l'attivazione del macrofago39,40. I macrofagi differenziati usati per Leishmania BMM infezioni piuttosto imitare lo stato non attivato di macrofagi in vivo, ma l'analisi non tiene conto per il set di molto più complesso di componenti di host che influenzano la virulenza in modelli animali.

Isolamento delle forme di Leishmania infettive sane è l'altro requisito assolutamente fondamentale per la determinazione accurata di virulenza. Non tutti i promastigotes tutti i ceppi di Leishmania differenziarsi in modo efficiente in amastigoti quando sottoposti a basso pH / temperatura elevata condizioni41. Pertanto, le infezioni sono spesso eseguite con metacyclic promastigotes purificato da culture promastigote stazionario. Per isolare in modo efficace metacyclic promastigotes, alcune strategie di purificazione approfittare della composizione mutevole del glicocalice superficie parassita durante diverse fasi della vita, tra cui ampie modifiche di lipophosphoglycan (GPL) struttura42,43,44. Ad esempio, l'agglutinina dell'arachide (PNA), una lectina che si lega selettivamente a prociclico ma non metacyclic LPG è stato efficacemente utilizzato nei protocolli di selezione negativa per purificare L. principali promastigotes metacyclic45. Strategia di purificazione metacyclic promastigote per L. amazonensis coinvolge solitamente un anticorpo monoclonale mAb3A.1 che può agglutinare prociclico promastigotes prendendo di mira gli epitopi di specifiche proteine di superficie che sono inaccessibili in metacyclic forme a causa di modifiche di superficie glicocalice8,13,32. L'uso di un media di gradienti di densità per separare metacyclic promastigotes da promastigotes, basata su differenze di fase-specifici in densità capace di galleggiare è un metodo attraente perché esso non dipende dalla specie-variazioni di leganti di superficie del parassita. Questo metodo, inizialmente descritto per L. principali metacyclic promastigote purificazione33, è stato adottato con successo per numerose altre specie di Leishmania principalmente attraverso modifiche delle condizioni di centrifugazione durante sedimentazione di pendenza di densità46,47,48,49.

È anche importante essere consapevoli dei problemi che possono complicare l'esecuzione del test, che può verificarsi in diverse fasi del processo. Questi problemi possono includere contaminazione durante l'estrazione di BMM, differenziazione infruttuosa di saggi dopo estrazione, placcatura del macrofago incoerente, incompleta purificazione delle forme parassita infettivo infezione scarsa o non uniforme, e Difficoltà di montaggio vetrini coprioggetti su vetrini da microscopio. Queste possibilità sono state affrontate nel protocollo e possono essere risolto valutando attentamente ogni passaggio della procedura di infezione per identificare il problema. Per esempio, contaminazione di culture BMM durante il processo di differenziazione può indicare la necessità di una migliore tecnica sterile durante l'estrazione. Grande attenzione per la purezza e la freschezza dei reagenti di purificazione e precisa attuazione del protocollo di purificazione può rettificare infruttuoso o incompleta purificazione delle forme parassita desiderata. Scarsa o non uniforme infezioni causate da inesatta quantificazione di parassiti o un MOI che è troppo alta o troppo bassa per le specifiche condizioni sperimentali. Dopo l'estrazione, manipolazione e montaggio vetrini coprioggetti è senza dubbio il processo tecnicamente più impegnativo in questa tecnica; gli individui possono trovare che preferiscono utilizzare diversi strumenti per facilitare la movimentazione delle lamelle. Chiara visualizzazione di DAPI macchiato i nuclei è critico per il parassita accurato conteggio al microscopio. Macchiatura debole e improprio di messa a fuoco sono due colpevoli principali dietro quantificazione incoerente. Ciò può essere garantito da un controllo di qualità del DAPI macchiatura passo, limitazione del tempo di esposizione alla luce per ridurre foto-candeggio e rapidamente cambiando l'obiettivo messa a fuoco per tenere conto di tutti i nuclei di parassita nel campo. Luminosità DAPI fluorescenza può essere migliorata anche assicurando adeguata permeabilizzazione dei campioni con il detersivo e aumentando la concentrazione di DAPI durante la colorazione. Un approccio alternativo che può facilitare il processo di quantificazione è di ottenere immagini digitali dei campioni durante l'esame al microscopio. Le immagini possono essere usate per la quantificazione in un secondo momento e possono essere verificata/quantificato da ricercatori indipendenti. Tuttavia, ci sono difficoltà tecniche connesse con questo processo che richiede particolare attenzione. A causa della natura sferica del PV, i parassiti non sono sempre sullo stesso piano focale. Questo necessita che sia più immagini acquisite utilizzando diversi piani focali per ogni campo microscopico e successivamente assemblati insieme per tenere conto di tutti i parassiti. In caso contrario, quantificazione da fotografie può essere molto fuorviante. Calcoli dei macrofagi/campo e amastigoti/campo sono fondamentali per garantire la coerenza macrofago placcatura e la diffusione di parassiti è stato raggiunto durante l'infezione. Poiché i saggi sono cellule completamente differenziate, il loro numero non dovrebbe aumentare nel tempo. Se il numero di host macrofagi aumenta nel tempo, significa che i macrofagi erano ancora immaturi. In tal caso, l'origine e la concentrazione di M-CSF devono essere controllati. Determinazione della percentuali macrofagi infetti può anche essere utile nel fornire una visione completa dell'host interazione cellula-patogeno, specialmente nei casi dove carico percentuale di infezione e parassita non seguono simili tendenze20,21 .

Il metodo di in vitro BMM infezione qui descritte può essere modificato per soddisfare le specifiche esigenze sperimentali. Apportare modifiche a uno qualsiasi dei passi fondamentali del processo - BMM estrazione e differenziazione, purificazione delle forme infettive parassita e quantificazione delle infezioni del macrofago in vitro , così come infezioni esecuzione con diversi MOIs e regolando il periodo di infezione e intervalli di tempo analizzato. Terreni di coltura componenti possono essere facilmente modificati tramite il completamento o svuotamento delle sostanze nutrienti specifiche e più diversi ceppi o forme di parassiti possono essere valutate contemporaneamente. Queste modifiche potrebbero richiedere ulteriore regolazione di procedure tecniche; ad esempio, procedure per amastigote preparazione e purificazione di metacyclic promastigote sono dovrebbe variare tra varie specie di Leishmania . Coloranti fluorescenti supplementari oltre DAPI o fluorescente contrassegnati componenti cellulari possono essere utilizzati per visualizzare una gamma completa di ospite-parassita interazione processi6,24. Inoltre, questo dosaggio può essere adattato a un formato di High Throughput sistemi (HTS), che consentirebbe di screening rapido di librerie di composti per identificare cavi farmaco nuovo ed efficace per il trattamento della leishmaniosi24.

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Disclosures

Gli autori dichiarano che non hanno nessun concorrenti interessi finanziari,

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto dagli istituti nazionali di sovvenzione di salute RO1 AI067979 a NWA.
YK è destinatario della borsa di studio dello studente non laureato da Howard Hughes Medical Institute/Università di Maryland College Park.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6 well cell culture plate Cellstar 657160
Adenine Acros Organics AC147440250
Aerosol Barrier Pipet Tips (100-1000 μL) Fisherbrand 02-707-404
Aerosol Barrier Pipet Tips (20-200 μL) Fisherbrand 02-707-430
Aerosol Barrier Pipet Tips (2-20 μL) Fisherbrand 02-707-432
Bard-Parker Rib-Back Carbon Steel Surgical Blade #10 Aspen Surgical 371110
BD Luer-Lok Tip 10 mL Syringe Becton Dickinson (BD) 309604
BD Precisionglide Needle, 25G  Becton Dickinson (BD) 305124
Cell Culture Dish 35 mm x 10 mm Cellstar 627 160
Cell Culture Flask Cellstar 660175
Cover Glasses: 12 mm circles Fisherbrand 12-545-80
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Invitrogen D1306
D-Biotin J.T. Baker C272-00
EDTA Sigma Aldrich EDS
Ethyl alcohol 200 proof Pharmco-AAPER 111000200
Falcon 100 mm x 15 mm non-TC-treated polystyrene Petri dish Corning 351029
Fetal Bovine Serum Seradigm 1500-500
Ficoll400 Sigma Aldrich F8016
Fluorescence Microscope Nikon E200
Goat anti-mouse IgG Texas red Invitrogen T-862
Goat anti-rabbit IgG AlexaFluor488 Invitrogen A-11034
Hemin Tokyo Chemical Industry Co. LTD H0008
HEPES (1M) Gibco 15630-080
Isoton II Diluent Beckman Coulter 8546719
L-Glutamine Gemini 400-106
Medium 199 (10X) Gibco 11825-015
Na pyruvate (100 mM) Gibco 11360-070
Paraformaldehyde Alfa Aesar 43368
Penicillin/Streptomycin Gemini 400-109
Phosphate Buffered Saline (-/-) ThermoFisher 14200166
Polypropyline conical Centrifuge Tubes 15 mL Cellstar 188 271
Polypropyline conical Centrifuge Tubes 50 mL Cellstar 227 261
ProLong Gold antifade reagent ThermoFisher P36930
Rat anti-mouse Lamp-1 antibody Developmental Studies Hybridoma Bank 1D4B
Recombinant Human M-CSF PeproTech 300-25
Reichert Bright-Line  Hemocytometer  Hausser Scientific 1492
RPMI Medium 1640 (1X) Gibco 11875-093
Triton X-100 Surfactant Millipore Sigma TX1568-1
Trypan Blue Sigma Aldrich T8154
Delicate Scissors, 4 1/2" VWR 82027-582
Dissecting Forceps, Fine Tip VWR 82027-386
Microscope Slides VWR 16004-368
Z1 Coulter Particle Counter, Dual Threshold Beckman Coulter 6605699

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Immunologia e infezione problema 133 Leishmania virulenza macrofago intracellulare replica vacuolo parassitoforo
Quantificazione della crescita intracellulare all'interno di macrofagi è un veloce e affidabile metodo per valutare la virulenza dei parassiti di <em>Leishmania</em>
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Sarkar, A., Khan, Y. A.,More

Sarkar, A., Khan, Y. A., Laranjeira-Silva, M. F., Andrews, N. W., Mittra, B. Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites. J. Vis. Exp. (133), e57486, doi:10.3791/57486 (2018).

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