Summary
Alle Pathogene Leishmania -Arten befinden sich und innen Makrophagen ihrer Wirbeltier Wirte zu replizieren. Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur murine Knochenmark stammenden Makrophagen in der Kultur mit Leishmanien, gefolgt von präzise Quantifizierung der intrazellulären Wachstum Kinetik zu infizieren. Diese Methode eignet sich für das Studium der einzelnen Faktoren, die die Wirt-Pathogen Interaktionen und Leishmaniose Virulenz.
Abstract
Der Lebenszyklus der Leishmaniose, die Erreger der Leishmaniose, wechselt zwischen Promastigote und Amastigote Phasen innerhalb der Insekten und Wirbeltiere Gastgeber, beziehungsweise. Während Pathogene Symptome der Leishmaniose stark und von gutartigen Hautveränderungen sehr tödliche Krankheit viszeralen Formen abhängig von der infektiösen Sorte variieren können befinden sich alle Leishmania -Arten im Host Makrophagen in der vertebrate Phase des Ihren gesamten Lebenszyklus hinweg. Leishmaniose Infektiosität bezieht sich daher direkt auf seine Fähigkeit, einzudringen, überleben und replizieren innerhalb Parasitophorous Vakuolen (PVs) in Makrophagen. Beurteilung der Parasit Fähigkeit, intrazellulär zu replizieren dient als zuverlässige Methode zur Bestimmung der Virulenz. Leishmaniose-Entwicklung mit Tiermodellen zu studieren ist zeitraubend, mühsam und oft schwierig, vor allem mit den pathogenetisch wichtigen viszeralen Formen. Wir beschreiben hier eine Methode um die intrazelluläre Entwicklung der Leishmaniose im Knochenmark stammenden Makrophagen (BMMs) folgen. Intrazellulären Parasiten Zahlen werden in 24 h-Intervallen für 72-96 h nach Infektion bestimmt. Diese Methode ermöglicht eine zuverlässige Bestimmung der Auswirkungen von verschiedenen genetischen Faktoren auf Leishmaniose Virulenz. Als Beispiel zeigen wir, wie eine einzelne Allel Löschung des Leishmaniose mitochondriale Eisen-Transporter-Gens (LMIT1) beeinträchtigt die Fähigkeit der Leishmaniose Amazonensis Mutante LMIT1/ΔLmit1 , innen BMMs wachsen, eine drastische Reduzierung der widerspiegelt Virulenz im Vergleich zu Wildtyp. Dieser Test ermöglicht auch präzise Kontrolle der experimentellen Bedingungen, die einzeln bearbeitet werden können, um den Einfluss verschiedener Faktoren (Nährstoffe, reaktive Sauerstoffspezies, etc.) auf die Wirt-Pathogen Interaktionen zu analysieren. Daher bieten die geeignete Ausführung und Quantifizierung der BMM Infektion Studien eine nicht-invasive, schnelle, wirtschaftliche, sichere und zuverlässige Alternative zu herkömmlichen Tiermodell Studien.
Introduction
Leishmaniose bezieht sich auf ein breites Spektrum von menschlichen Krankheiten, die durch einzelliger Parasit Arten der Gattung Leishmaniaverursacht. Etwa 12 Millionen Menschen sind derzeit mit Leishmanien weltweit infiziert, und mehr als 350 Millionen sind gefährdet. Die Pathologie der Krankheit hängt von Leishmania -Arten und Host Faktoren und Symptome variieren von harmlosen selbstheilende Hautläsionen zu tödlichen visceralizing Formen. Wenn unbehandelt, viszerale Leishmaniose tödlich ist, Ranking erst nach Malaria als die tödlichsten Krankheiten verursacht durch eine Infektion mit ein einzelliger Parasit-1. Trotz der vielfältigen Unterschiede in Krankheit Pathologie und Symptome haben alle Leishmania -Arten einen Digene Lebenszyklus Promastigote und Amastigote Phasen innen Insekten und Wirbeltiere Gastgeber jeweils abwechselnd. Innen Wirbeltiere, Leishmaniose Ziel Host Makrophagen für Invasion und induzieren die Bildung von Parasitophorous Vakuolen (PVs), saure Kompartimente mit Eigenschaften von Phagolysosomes wo die hoch virulenten Amastigote Formen replizieren. Amastigoten bestehen in Host Gewebe bei chronischen Infektionen und können weitergegeben werden vorwärts, nicht infizierten Sandmücken, Abschluss des Getriebe-Zyklus. Daher sind im Kontext der Entwicklung der menschlichen Krankheit, Amastigoten die wichtigsten Leishmaniose Lifecycle Form2. Untersuchen, wie die Amastigoten innen Makrophagen PVs repliziert ist von entscheidender Bedeutung für Verständnis Leishmaniose Virulenz3,4,5,6,7 und die Entwicklung neuartiger wirksame Therapien.
Wir beschreiben hier eine Methode, die regelmäßig von unserem Labor verwendet, um studieren Leishmaniose Infektion und Replikation im Knochenmark stammenden Makrophagen (BMMs), die quantitative Bewertung der Anzahl der intrazellulären Leishmaniose im Laufe der Zeit beinhaltet. Der Prozess umfasst das Ernten von Monozyten aus Maus Knochenmark und Differenzierung zu Makrophagen in der Kultur, in-vitro- Infektion mit infektiösen Formen (metacyclic Promastigotes oder Amastigoten) von Leishmaniose und Quantifizierung der Anzahl der intrazellulären Parasiten an alle 24 h-Intervall für einen Zeitraum von 72-96 h nach Infektion. Dieser Test wurde in unserem Labor verwendet, um ermitteln die Auswirkungen von mehreren Umweltfaktoren und Parasiten Gene, einschließlich Ermittlung der kritischen Rolle des Eisens bei der Förderung von L. Amazonensis Virulenz, die weiter von Straßenräuber validiert wurde Läsion Entwicklungsstudien in Mäusen6,8,9,10,11,12,13,14,15 . Da alle Pathogene Leishmania -Arten ihre replikativen Nische innen Makrophagen Host herstellen, kann dieser Assay universell für Virulenz Bestimmungen in allen Leishmania -Arten verwendet werden.
Durchführung von BMM Infektionen ermöglicht Analyse der Wirt-Parasit-Interaktionen auf der Ebene der einzelnen Zelle und damit eine umfassendere Verständnis der Interaktion von Leishmania -Parasiten und ihre bevorzugten Host Mikroumgebung, PVs von Makrophagen. Makrophagen-Infektion-Assays sind durch mehrere Gruppen16,17,18,19,20,21,22 erfolgreich benutzt worden, um zu erkunden Funktionen der Host Makrophagen und Leishmaniose spezifischer Gene, und ihre mögliche Einbindung in das komplexe Zusammenspiel, das intrazelluläre Infektion charakterisiert. BMM Infektionen erlauben Quantifizierung der Parasit Wachstum als eine Auslesung der Auswirkungen der Host Faktoren, die intrazelluläre überleben, wie mikrobizider Stickoxid-Produktion, Generierung von reaktiven Sauerstoffspezies und andere nachteiligen Bedingungen beeinflussen im Inneren der Lysosomen-wie PVs23begegnet. Makrophagen Infektion Assays wurden auch genutzt, um Anti-Leishmanial Droge Interessenten für therapeutische Entwicklung13,24zu identifizieren.
Die in-vitro- Natur BMM Infektionen bietet mehrere Vorteile gegenüber anderen Methoden Leishmaniose Virulenz zu beurteilen. Jedoch mehrere frühere Studien, die Mechanismen der intrazellulären Parasiten überleben im Laufe der Zeit nicht quantifizieren Infektion als ein Satz20,21,24. Darüber hinaus Tat viele Studien konzentriert sich auf folgende in-Vivo -Infektionen im Laufe der Zeit dies durch die Messung der Größe der kutanen Läsion und andere physiologische Symptome, die nur indirekt auf Parasiten Replikation25,26 , 27. in-Vivo -Infektion ist einen stringenten Ansatz Parasit Virulenz zu beurteilen, aber Läsion Größenmessungen Straßenräuber Schwellung allein anhand sind oft unzureichend, da sie die Entzündungsreaktion im infizierten Gewebe widerspiegeln und nicht die absolute Anzahl der Parasiten. Aus diesem Grund Straßenräuber Läsion Entwicklung haben Assays mit anschließendem Quantifizierung der Parasit Last im infizierten Gewebe Proben eine Prozedur, die langwierige begrenzende Verdünnung erfordert28. Darüber hinaus werden in Vivo Studien häufig mehrere Tiere an verschiedenen Punkten in der Zeit von Interesse6,8,9,10, Gewebe zu extrahieren zu Opfern 11 , 13. dagegen zahlreicher BMMs kann nur ein Tier entnommen werden, und diese Zellen können unter Bedingungen, die an verschiedenen Punkten in der Zeit der Infektion bewerten überzogen werden. Darüber hinaus erlaubt im Vergleich zu in-Vivo -Studien, in-vitro- BMM Infektionen mehr Kontrolle über die experimentellen Bedingungen. Quantifizierung der Makrophagen, zusammen mit dem Parasiten selbst angesteckt zu werden, ermöglicht präzise Kontrolle über die Multiplizität der Infektion (MOI) und der Kulturbedingungen. Genaue Kontrolle über diese Faktoren kann Schlüssel Merkmale der diskreten zelluläre Signalwege zu identifizieren und ihre Auswirkungen auf den Verlauf der Infektion zu verstehen sein.
Angesichts dieser Vorteile, ist es wenig verwunderlich, dass sehr wenige Gruppen studieren Leishmaniose Virulenz bisher voll quantitative Bewertung der intrazelluläre Replikation in Makrophagen ausgenutzt haben. In diesem Artikel besprechen wir häufige Probleme, die möglicherweise behindern die weitergehende Nutzung des Assays, und bieten eine schrittweise Protokoll um seine korrekte Umsetzung zu erleichtern. In Anbetracht seiner Präzision und Vielseitigkeit kann der BMM-Infektion-Assay, die, den wir hier beschreiben, nicht nur genutzt werden, Wirt-Pathogen Interaktionen beeinflussen Leishmaniose Virulenz zu erkunden, sondern auch andere Mikroorganismen zu studieren, die im Inneren zu replizieren Makrophagen29. Wichtig ist, kann dieser Test auch als eine schnelle und kostengünstige prä-klinischen Screening-Methode für die Medikamentenentwicklung Anti-Leishmanial entwickelt werden.
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Protocol
Alle experimentelle Verfahren wurden von den National Institutes of Health im Einklang mit den Empfehlungen in der Anleitung für die Pflege und Verwendung von Labortieren durchgeführt und von der University of Maryland IACUC angenommen wurden. Alle Schritte in den Abschnitten 1 bis 4 beschriebenen werden aseptisch in biologischen Laminar-Flow Schränken durchgeführt. Persönliche Schutzausrüstung sollte verwendet werden, und Vorsicht bei der Handhabung der live Leishmania -Parasiten in allen Phasen des Experimentierens.
1. Isolierung und Differenzierung von Knochenmark stammenden Makrophagen (BMMs)8,30,31
- Tag 0: 4 - 6 Wochen alten weiblichen C57BL/6 oder BALB/c Maus in einer CO-2 -Kammer zu Opfern und Tod durch zervikale Dislokation zu bestätigen. Sterilisation von Scheren und Pinzetten zu gewährleisten, indem man sie in 70 % igem Ethanol getränkt. Sprühen Sie Handschuhe mit 70 % Ethanol um sterile Handhabung während des Knochenmark Zelle isoliert Prozesses zu ermöglichen.
- Geopferten Maus Dissektion Board durch seine Vorderbeine festhalten zu sichern und durch Sprühen reichlich mit 70 % Ethanol zu desinfizieren.
- Machen Sie einen kleinen Schnitt (ca. 1 cm) mit einer Schere in der Nähe des Hüftgelenks. Legen Sie die Schere unter der Haut an die darunter liegenden Muskeln zu trennen und schneiden Sie die Haut rund um das Hüftgelenk.
Hinweis: Die Dissektion Board kann gedreht werden, um besseren Zugang zum Hüftgelenk zu ermöglichen. - Sorgfältig deglove Haut vom Bein durch ziehen in Richtung Knöchel und entfernen. Am Knöchel, sehr vorsichtig zu schneiden bei oder unterhalb des Knöchels gemeinsame Tibia völlig intakt verlassen geschnitten Sie den Fuß ab.
Hinweis: Die Fibula in diesem Stadium ist locker befestigt und mit der Zange leicht getrennt werden kann. - Suchen Sie manuell das Hüftgelenk durch die Manipulation der Oberschenkelknochen um den Punkt der Rotation zu identifizieren. Vorsichtig mit einer Schere durchtrennen das Bein oberhalb des Hüftgelenks, die proximalen Kopf des Oberschenkelknochens intakt verlassen.
- Entfernen Sie so viel Muskel- und Bindegewebe wie möglich aus dem Bein mit einer Schere. Entfernen Sie jede verbliebene Haut aus den Knöchel und jede überschüssige Knochenmaterial oberhalb des Hüftgelenks.
- Legen Sie die gereinigten Beinknochen in sterilen RPMI ergänzt mit Penicillin/Streptomycin (1 % Endkonzentration) in einer Petrischale auf Eis.
- Wiederholen Sie die Schritte 1,4 bis 1,6, Tibia und Femur aus dem anderen Hinterbein zu isolieren.
- Entfernen Sie alle verbleibenden Muskel und Bindegewebe aus den Knochen einweichen in RPMI sterilisierte Pinzette mit sterilen #10 Klinge.
- Stellen Sie Knochen auf der Petrischale Deckel. Schneiden Sie die Tibia vorsichtig mit der Klinge unmittelbar oberhalb des Sprunggelenks auf das Knochenmark. Entfernen Sie die Tibia vom Rest des Beines durch Schneiden direkt unterhalb des Kniegelenks.
- Ziehen Sie 10 mL sterile RPMI ergänzt mit Penicillin/Streptomycin (1 % Endkonzentration) in einen 10-mL-Spritze und befestigen Sie eine 25G Nadel.
- Festhalten der Tibia mit Zangen, vertikal über eine 50 mL konische Röhrchen auf dem Eis. Verwenden Sie die Spritze ca. 5 mL RPMI sanft in das Ende des Knochens, das Knochenmark aus dem anderen Ende in das konische Rohr zu spülen zu injizieren. Spülen Sie das Knochenmark mit insgesamt 10 mL RPMI, bis die Knochen weiß wird.
Hinweis: Nach dem gründlichen spülen, sollte der Knochen weißen schalten. Wenn dies nicht der Fall ist, weiter spülen um Knochenmark zu entfernen. Das distale Ende des Schienbeins müssen wieder mit der Klinge gekürzt werden, wenn es zu eng, um die Nadel eingesetzt wird. - Schneiden Sie das Femur sofort über das Kniegelenk und sofort unter das Hüftgelenk, beide Enden des Knochens auf das Knochenmark verfügbar zu machen. Spülen Sie Knochenmark aus dem Oberschenkelknochen mit insgesamt 10 mL RPMI in der gleichen Weise wie der Tibia.
- Wiederholen Sie die Reinigung und Spülung Schritte 1.6 durch 1.13 mit den verbleibenden Knochen und sammeln Knochenmark gespült Zellen in einem einzigen 50 mL konische Röhrchen
Hinweis: Bricht ein Knochen zu jedem Zeitpunkt während der Präparation vor Knochen Spülung, verwenden Sie nicht das Knochenmark aus dieser Knochen. - Zentrifugieren Sie das konische Rohr zur Erhebung des Knochenmarks gespült aus allen vier Knochen für 10 min bei 4 ° C bei 300 X g.
- 60 mL steriles BMM Medium zu platzieren (RPMI mit einer Endkonzentration von 20 % FBS, 1 % Penicillin/Streptomycin, 1,2 mM Na-Pyruvat, 25 µg/mL menschlichen M-CSF) in eine 175 cm2 Zelle Kultur Flasche mit Filterkappe.
- Verwerfen Sie der Überstand folgende Zentrifugation und aufzuwirbeln Sie Zelle Pellet durch sanfte auf und ab pipettieren mit 5 mL Medium BMM aus der Flasche.
- Übertragen Sie Zellsuspension auf den Kultur-Kolben und spülen Sie das konische Rohr zweimal mit BMM Medium aus der Kultur-Flasche um maximale Zelle Erholung zu gewährleisten. Sicherzustellen Sie, dass die Zellsuspension in Medium gut durchmischt ist und verteilen Sie 30 mL aus der ersten 175 cm2 Zelle Kultur Flasche auf eine zweite 175 cm2 Zelle Kultur Flasche mit Filterkappe zu.
- Inkubieren Sie beide Fläschchen mit 30 mL Zellsuspension jede Übernachtung bei 37 ° C, 5 % CO2 Trennung von jedem kontaminierenden Fibroblasten, resident Makrophagen und andere adhärenten Zellen ermöglichen.
- Tag 1: Übertragen des Überstands mit undifferenzierten Knochenmarkzellen von Flaschen zu 100 x 15 mm TC-unbehandelte Polystyrol Petrischalen bei ca. 10 mL/Teller und Inkubation bei 37 ° C, 5 % CO2. Entsorgen Sie die Fläschchen.
- Tag 3 oder 4: Jede Petrischale eine zusätzliche 5 mL BMM Medium (37 ° c vorgewärmt) hinzufügen und weiter Inkubation bei 37 ° C, 5 % CO2.
(2) Beschichtung BMMs auf Deckgläsern für Infektion (Tag 7 oder 8)
- Bereiten Sie 6-Well-Zellkultur-Platten durch Platzieren von vier 4 steril 12 mm Glasdeckgläser (autoklaviert und gespeichert in einem geschlossenen Glasbehälter) im unteren Teil jeder leer gut vor.
Hinweis: Holen Sie jede sterile 12 mm Deckglas mit Absaugnadeln Spitze ausgestattet, um eine Vakuumleitung ab. Platzieren Sie Deckgläsern in die Vertiefungen ohne Überlappung, Freigabe an der gewünschten Position durch Kneifen das Rohr um Vakuum zu unterbrechen. - Aspirat Medien (und nicht-anhaftende Zellen) von Petrischalen beschichtet mit anhaftenden Knochenmark abgeleitet Makrophagen und sanft spülen adhärenten Zellen 2 X mit sterilen Dulbecco Phosphat gepufferte Kochsalzlösung ohne Calcium und Magnesium Chlorid (PBS- / -) vorgewärmt auf 37 ° C.
- Fügen Sie tropfenweise, 5 mL sterilen 1 x PBS- / - mit einer Endkonzentration von 1 mM EDTA zu jeder Petrischale und inkubieren Sie für 5 min bei 37 ° C, anhaftende BMMs. überprüfen zu lösen, dass die Zellen unter dem Mikroskop getrennt sind.
- Sammeln Sie alle freistehende Zellen in 1 X PBS- / - ergänzt mit 1 mM EDTA in einem 50 mL konische Rohr aufgehängt. Spülen Sie jedes Gericht 2 X mit 5 mL PBS- / - und Zelle Aussetzung Pool hinzufügen.
Hinweis: Zellsuspension kann verdünnt werden, mit zusätzlichen PBS- / -, Makrophagen aus EDTA Toxizität während die Einziehung von Forderungen zu schützen. - Zentrifuge bei 300 X g für 10 min bei 4 ° C. Verwerfen Sie überstand und Aufschwemmen Sie Makrophagen in 5-10 mL BMM Medium durch pipettieren. Ort Nukleinsäuretablette Zellen auf Eis, Befestigung an Rohren und verklumpen zu verhindern.
- Anzahl der lebensfähige Zellen verwenden Trypan blau Ausgrenzung in der Hemocytometer.
Hinweis: Um BMM Zellen in 5 mL Medium Nukleinsäuretablette zählen, kann eine Verdünnung-Mischung aus 25 µL Zellsuspension in 445 µL PBS- /- und 30 µL 0,4 % Trypan blau Lösung in der Regel leicht Quantifizierung in eine Hemocytometer (unter Berücksichtigung einer 20 X Verdünnungsfaktor für die endgültige Berechnung ). Zählen Sie nur Zellen, die nicht mit Trypan blau (lebensfähige Zellen) gefärbt bekommen. Das Volumen der Zellsuspension kann geändert werden, wenn diese Mischung zu konzentriert oder verdünnt ist. Der Ertrag der BMM pro Vorbereitung unterschiedlich in der Regel 2 x 107 und 5 x 107 Zellen aus einem einzigen Mausklick. - Bereiten Sie die Zellsuspension in BMM Medium in gewünschte Beschichtung Konzentration (5 x 105/mL) und zerstreuen Sie Aussetzung zu 6-well-Platten in 2 mL Medium pro Bohrloch zu, so dass jeder gut 1 x 106 Makrophagen erhält.
Hinweis: Dies ist ein wichtiger Schritt, die jeden gut bekommt sorgt für die ausreichende Anzahl von Makrophagen zu die Deckgläsern gleichmäßig bedecken. Überprüfen Sie, dass Deckgläsern in Brunnen sind nicht überlappende oder schwimmend in das Medium. Wenn ja, einstellen Sie vorsichtig mit einer sterilen Pipettenspitze. - Inkubation über Nacht bei 37 ° C, 5 % CO2.
3. Reinigung von infektiösen Formen von L. amazonensis
Hinweis: Bereiten Sie Leishmaniose für Infektionen - von stationären Promastigote Kulturen8,13metacyclic Promastigotes reinigen, oder Promastigotes in der Kultur in Amastigote Form mit standard L. Amazonensis zu unterscheiden axenic Differenzierung Protokoll6,8.
-
Reinigung von Leishmania metacyclic Promastigotes mittels Dichte gradient media(Materials) 33
- Bereiten Sie 40 % Stammlösung Dichte Gradienten Medien in sterilen, Endotoxin-freies Wasser.
- Verdünnen Sie Dichte Gradienten Lösung in 10 x M199 Medium (ohne Serum) um 10 % Konzentration im Medium M199 vorzubereiten.
- Filtern Sie alle Lösungen durch 0,22 µm-Filter.
Hinweis: Lager-Lösungen können bei 4 oC in der Dunkelheit nicht länger als 1 Monat aufbewahrt werden. - Im unteren Teil eine 15 mL konische Zentrifugenröhrchen 2 mL 40 % Dichte-Gradienten Media-Lösung zugeben.
- Schicht 2 mL 10 % ige Dichte Gradienten Medienlösung in M199 auf die 40 % ige Dichte Gradienten Medienschicht vorsichtig mit einer Pasteurpipette um zu vermeiden, eine Vermischung zwischen den beiden Schichten.
- Sammeln Sie 1 x 109 Parasiten aus der stationären Phase Kultur durch Zentrifugation bei 1.900 x g für 10 min.
- Aufschwemmen Sie Zellen in 6 mL Dulbecco geändert wesentliches Medium (DMEM).
- Schicht 2 mL Zellsuspension direkt auf die 10 %-Dichte, die Gradienten Medien mit einer Pasteurpipette um zu vermeiden, mischen zwischen Schichten überlagern, sanft.
- Zentrifugieren des Farbverlaufs für 10 min bei 1.300 x g bei Raumtemperatur.
Hinweis: Aufgrund der Unterschiede in den physikalischen Eigenschaften zwischen Leishmania -Arten, Zentrifugation Bedingungen für jede möglicherweise leicht angepasst werden, um maximalen Ertrag zu gewährleisten. - Parasiten (angereichert in metacyclic Promastigote Form) aus der Band, die an der oberen 10 % Dichte Gradienten Medien Grenze (Schnittstelle zwischen 0 % und 10 % Dichte Gradienten Medien Schichten) zu sammeln.
- Verdünnen Sie Parasiten mit einem Volumen von DMEM und sammeln durch Zentrifugieren (1.900 x g für 10 min bei Raumtemperatur).
- In 500 µL DMEM Medium Aufschwemmen und zählen in einer Hemocytometer, Ertrag zu quantifizieren.
-
Generation von L. Amazonensis Amastigoten unter axenic Kulturbedingungen (niedriger pH-Wert / Temperatur erhöht)6,8,13
- Mix 5 mL der Log-Phase Promastigote Kultur (pH 7.4 bei 26 oC) mit einem gleichen Volumen Amastigote Medium (pH 4,5), mit 25 cm2 Fläschchen (insgesamt 10 mL Medium) und über Nacht bei 26 ° C inkubieren.
- Verlagerung des Kolbens von 26 ° C bis 32 ° C.
- Nach 3 oder 4 Tage geteilt Kultur 1:5 in Amastigote Medien bei 32 ° C.
- Überprüfen Sie die Parasiten in den nächsten 3-4 Tagen (max. 7 Tage) zu sehen, ob sie bereit für den Einsatz bei Infektionen sind.
Hinweis: Gesunde axenic Amastigoten haben eine ovale Form, ohne sichtbare Flagellen. Teilweise differenzierte Amastigoten haben eine große ovale Form mit kurzen Flagellen. Die Kultur sollte nicht viel Klumpen - viele Klumpen sind ein Hinweis auf nicht-wachsen, sterben Parasiten. Die Amastigote Kultur kann split 1:5 und für maximal 3 Wochen gewartet werden.
(4) Infektion mit L. amazonensis
- Verdünnen Sie Parasiten Suspensionen nach gewünschten MOI (in der Regel 3-5 metacyclic Promastigotes pro Makrophagen [MOI von 1:3 oder 1:5]) und 1 Amastigote pro Makrophagen [MOI 1:1]. Fügen Sie Leishmaniose in PBS- / - in einem Volumen von 50-100 µL in jede Vertiefung bereits mit 2 mL Medium.
- 1 h mit Amastigoten und 3 h mit metacyclic Promastigotes bei 34 oC für Infektion BMMs inkubieren.
Hinweis: Optimale Infektion Temperatur variiert je nach Spezies. - Nach Inkubation, gründlich abwaschen kostenlose Parasiten in jedem gut 3 X mit 2 mL PBS- / - auf 37 ° c vorgewärmt
Hinweis: Zerstreuen Sie PBS vorsichtig, um sicherzustellen, dass Deckgläsern nicht über einander zu schweben. Die Platte vorsichtig schwenken und dann die Flüssigkeit abzusaugen. Verwenden Sie separate Absaugnadeln Tipp, wenn mehrere Stämme von Parasiten zu verwenden, um Kreuzkontaminationen zu vermeiden. - Fix 1 h oder 3 h Zeit-Punkt Proben durch Inkubation jeweils gut mit 1,5-2 mL 2 % PFA in PBS- / - für 10 min. 3 X mit PBS- / - waschen. Nicht aspirieren Sie letzten Waschen und kühlen Sie Platten mit Deckgläsern mit PBS-Puffer bis zu beflecken.
- Fügen Sie 2 mL frisches BMM Medium in jede Vertiefung auf Tellern für weitere Zeitpunkte und inkubieren Sie bei 34 ° C.
- Verbleibenden Zeit-Punkte wie gewünscht wie unter Punkt 4.3 beschrieben, und kühlen Platten bis Färbung zu beheben.
5. DAPI-Färbung und Deckglas Montage
- Aspirieren Sie PBS aus Brunnen mit Deckgläsern und 1,5 mL PBS- / - mit 0,1 % nicht-ionische Reinigungsmittel. 10 min bei Raumtemperatur, gefolgt von 3 X waschen mit 2 mL PBS- / - inkubieren.
- Fügen Sie 1 mL PBS- / - mit 2 µg/mL DAPI (von 5 mg/mL Stammlösung in Wasser verdünnt) in Brunnen mit Deckgläsern und ein weiteres 1 h bei Raumtemperatur inkubieren.
Hinweis: Die Inkubationszeit mit DAPI ist wichtig für die Visualisierung von intrazellulären Leishmania -Parasiten. Makrophagen Kerne Flecken schnell, aufgrund ihrer größeren Größe und DNA-Inhalt aber Färbung der Kerne der intrazellulären Parasiten ist langsamer. So ist es notwendig, DAPI, durch zu durchdringen und der Parasit Plasmamembran und die Kernmembran Parasit ermöglichen, Verlängerung Inkubationszeit über was erforderlich ist, um die BMM-Kerne zu visualisieren. Mit richtigen DAPI-Färbung kann auch die mitochondriale Kinetoplast DNA in der Nähe der flagellar Tasche des Parasiten visualisiert werden, zusätzlich zu den Kern-DNA. - Waschen mit jeweils gut Deckgläsern 3 X mit 2 mL PBS- / - und dann Aufzug und Flip Deckgläsern mit Pinzette die Zelle Seite nach unten aufgelegt und auf Glas Mikroskop gleitet mit einem handelsüblichen antifade Montage-Reagenz.
Hinweis: Deckgläsern äußerst fragil und vorsichtige Handhabung benötigen. Vermeiden Sie Druck auf sie, vor allem gegen die Seitenwand der Brunnen beim Anheben. Ein paar Tropfen PBS- / - reduziert die Oberflächenspannung zwischen Deckglas und gut und erleichtert das anheben. Eine feine Nadel kann verwendet werden, um bei der neugierigen Deckgläsern von der Unterseite des Brunnens. Drücken Sie nach einem Deckgläschen Auflegen der Folie sanft mit der Pinzette um eventuelle Luftblasen in den Montage-Medien verdrängen. Wenn ein Deckglas defekt ist oder hat möglicherweise während des Hebevorgangs umgedreht, montieren Sie nicht; Nutzen Sie einfach die freie vierte Deckglas. - Kühlen Sie Folien bis Quantifizierung.
(6) Infektion Quantifizierung
- Durch die Fokussierung auf Makrophagen mit 100 X Objektiv mit Immersionsöl DAPI-gefärbten Folien unter dem Fluoreszenzmikroskop zu untersuchen (Erregung bei 358 nm; optimale Emission bei 461 nm).
Sicherstellen Sie, dass auf der Ebene von Makrophagen zwischen Objektträger und Deckglas konzentriert. - Quantifizieren der Anzahl von Makrophagen (große Kerne mit DAPI gefärbt) und die Anzahl der kleineren Amastigote Kerne rund um jedes Makrophagen Kern (siehe Abb. 2ADAPI) für jedes Sichtfeld mittels manuellen Zähler.
Hinweis: Amastigote Kerne können nicht alle in einer Ebene der Fokus aufgrund ihrer geringen Größe sichtbar. Zählen Sie jene, die sichtbar, wenn auf Makrophagen Zellkerne gerichtet sind, und verwenden Sie dann Feinfokus für Parasiten Kerne in Ebenen oberhalb und unterhalb der Makrophagen Kerne zu überprüfen. - Umzug nach ein anderes Sichtfeld zu Quantifizierung zu wiederholen. Verwenden Sie einen separaten Schalter Schlüssel, um die Anzahl der Felder gezählt zu verfolgen. Bewegen sich durch visuelle Felder in parallelen Reihen über jedes Deckglas zu verhindern, dass Überschneidungen zu zählen.
- Ein Minimum von 200 Makrophagen pro Deckglas zu quantifizieren. Jedem Zeitpunkt der Infektion in dreifacher Ausfertigung (3 Deckgläsern) zu quantifizieren. Die vierte Deckglas zu zählen, wenn die vorherige nicht geeignet für die Zählung durch Deckglas Überlappung, schlechte Montage, Glasbruch, etc. gehört
Hinweis: Wenn 200 Makrophagen können nicht auf jeden ein Deckglas gezählt werden, zählen Sie das Reserverad Vierter. - Infektionsraten als Amastigoten/Makrophagen oder Amastigoten/100 Makrophagen zu berechnen und Prozent infizierten Makrophagen aus den rohen Quantifizierung Daten zu bestimmen.
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Representative Results
Leishmaniose hat zwei infektiöse Formen - metacyclic Promastigotes, die an die stationäre Phase der Kultur von prozyklischen Promastigotes unterscheiden und Amastigoten, die den intrazellulären Stadien (Abbildung 1) sind. Bei einigen Leishmania -Arten wie L. Amazonensiskönnen Amastigoten auch in der axenic Kultur unterschieden werden durch die Verlagerung der Promastigote Zellen, um die niedrigeren pH-Wert (4.5) und erhöhter Temperatur (32 ° C), Bedingungen ähnlich denen fand innen BMM PVs 8 , 34. nur metacyclic Promastigote oder Amastigote Formen der Leishmaniose sind in der Lage, induzieren die Bildung von PVs und replizieren intrazellulär nach Host Makrophagen35verschlungen wird. Undifferenzierte Log-Phase Promastigotes sind nicht virulente und nicht in der Lage, PV-Bildung zu fördern (Abbildung 2).
Bei Infektionen mit metacyclic Promastigotes ist in der Regel eine 24 h Verzögerung vor einem Anstieg der intrazellulären Parasiten zahlen. Dies tritt auf, weil die metacyclic Promastigotes zuerst in Amastigoten zu unterscheiden, bevor sie anfangen zu replizieren. Aus diesem Grund Infektionen mit metacyclic Promastigotes initiiert dauert länger, steigt im gesamten intrazellulären Parasiten zahlen, und aus diesem Grund zeigen, möglicherweise für längere Zeit zeigt inkubiert werden.
Abbildung 2A stellt eine erfolgreiche Infektion mit axenically differenziert Amastigoten zeigt intrazelluläre Lokalisation der Leishmaniose (in rot) nach der Erstinfektion (1 h), vor der Bildung des PVs durch Fusion von Phagosom mit Lysosomen. 48 h können verschiedene große PVs beherbergen mehrere Parasiten beobachtet werden. Eine stetige Zunahme der Anzahl der Parasiten in PVs ist charakteristisch für virulent Leishmaniose -Infektionen. Non-virulenten Log-Phase Promastigotes (Abb. 2 b), im Gegensatz dazu sind nicht in der Lage, PV-Entwicklung (48 h Zeitpunkt) zu initiieren, nicht repliziert werden und schließlich innen Host Makrophagen, getötet werden, auch wenn von der Host-Makrophagen auf vergleichbare Zahlen aufgegriffen metacyclic Promastigotes oder Amastigoten.
Um die Wirksamkeit dieser Methode zu demonstrieren, wir gegenüber Wildtyp L. Amazonensis LMIT1/ΔLmit1 Parasiten, enthält eine einzelne Kopie des LMIT1 (LEishmania MItochondrial ichRon T Ransporter 1) gen, welche Ergebnisse bei Beeinträchtigung der mitochondrialen Eisen13 importieren. Verlust von einem LMIT1 Allel nicht führen zu wesentlichen Veränderungen der mitochondrialen Aktivität in LMIT1/ΔLmit1 Promastigotes oder reduzieren den Ertrag der gereinigten metacyclic bildet sich, wenn im Vergleich zu Wildtyp Promastigotes13. Gereinigte metacyclic Promastigotes vom Wildtyp (WT) und LMIT1/ΔLmit1 stationäre Kulturen waren ebenso wirksam bei eindringenden BMMs, basierend auf die vergleichbare Zahl von intrazellulären Parasiten 1 h nach der Infektion ( quantifiziert Abbildung 3A, 1 h). Im Anschluss an eine erste 24 h Zeitverzögerung, die erforderlich für metacyclic Promastigotes, sich anzupassen und in Amastigote Formen zu unterscheiden ist, eine stetige Zunahme der Zahl der intrazellulären Wildtyp Parasiten (ca. 3-fold zwischen 24 h und 72 h Zeitpunkte) wurde beobachtet. Im Gegensatz dazu wurde wenig oder gar keine intrazelluläre Wachstum von LMIT1/ΔLmit1 Parasiten (Vergleiche 1 h und 72 h Zeitpunkten) beobachtet darauf hindeutet, dass Verlust des einzigen LMIT1 Allels erheblich die Fähigkeit dieser Sorte beeinträchtigt, im Inneren wachsen, Makrophagen. Episomal Ausdruck des LMIT1-Proteins in der ergänzt Belastung (LMIT1/ΔLmit1+LMIT1) gerettet intrazellulären Parasiten Wachstum zu Wildtyp Ebenen, bestätigt, dass LMIT1 für Amastigote intrazellulären entscheidend Replikation und Virulenz13.
Makrophagen Infektionen mit axenic Amastigoten, erzeugt durch die Verlagerung Promastigote Kulturen durchgeführt (bei pH 7,4; 26 oC), Amastigoten Wachstumsbedingungen (pH 4,5; 32 oC)34,36, zeigte eine intrazelluläre Wachstum Muster (Abb. 3 b) ähnlich wie bei metacyclic Promastigotes (Abbildung 3A) beobachtet. Nach vergleichbaren Niveau der ersten Aufnahme (Abb. 3 b, 1 h)-Wildtyp (WT) und LMIT1 ergänzt (LMIT1/ΔLmit1+LMIT1) Amastigoten wuchs stetig, während der LMIT1/ΔLmit1 Amastigoten wieder Fehler beim Anzeigen der intrazellulären Wachstum. Axenic Amastigoten waren mehr infektiös (MOI 1:1 im Vergleich zu 1:5 für metacyclic Promastigotes) und repliziert mehr effizient in PVs.
Unsere Daten zeigen eine erste 24 h Verzögerung für metacyclic Promastigote Infektionen, bevor es zu ein Anstieg der intrazellulären Parasiten Anzahl (Vergleiche zwischen 24 h Zeitpunkte in Abbildung 3A und 3 b). Die Verzögerung stellt den Zeitaufwand für verinnerlichten metacyclic Promastigotes, zuerst in Amastigoten zu unterscheiden, bevor Sie beginnen zu replizieren. Ein Volk Fehler machen, wenn metacyclic Promastigotes, um zu infizieren, ist nicht lange genug warten. In Fällen, wo die Veränderung der Virulenz nicht drastische, führte Experimente über 96 h anstatt 72 h produzieren viel zuverlässigere Bestimmungen.
Abbildung 1 : Scanning Electron Schliffbild Bilder von verschiedenen Lebensstadien L. Amazonensis . Log-Phase Promastigote, metacyclic Promastigote aus stationären Phase und axenic Amastigote. Bar = 10 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Eine repräsentative Darstellung der BMM Infektionen mit virulenten axenic Amastigoten (A) und nicht virulente Log-Phase Promastigotes (B) von L. Amazonensis. Immunfluoreszenz-Bilder von Makrophagen von BALB/c Mäuse, 1 h und 48 h nach Infektion isoliert. Infizierten Makrophagen wurden für Immunfluoreszenz verarbeitet, wie im Protokoll beschrieben. PV-Membranen wurden für 1 h, gefolgt von 1 h Inkubation mit fluoreszierenden IgG Anti-Kaninchen (Verdünnung 1: 500) mit Ratte Anti-Maus Lamp1 monoklonalen Antikörper (1:1, 000 Verdünnung) gebeizt. Parasit Färbung erfolgte durch Inkubation Deckgläsern mit Maus polyclonal Antikörper gegen axenic L. Amazonensis erzeugt Amastigoten, gefolgt von Anti-Maus IgG rot färben (Verdünnung 1: 500) 6. Alle Deckgläsern wurden weiter mit DAPI behandelt, für das Beflecken Kerne. (A) Bildung von unterschiedlichen PVs beherbergen mehrere Amastigoten Zeitpunkt 48 h ist charakteristisch für eine erfolgreiche Leishmaniose -Infektion mit axenic Amastigoten. (B) aufgrund fehlender unterschiedliche PV-Bildung und replizieren Amastigoten Zeitpunkt 48 h verkörpert mangelnde Virulenz in Promastigotes aus der Log-Phase Kultur. Rot zeigt -Leishmania Färbung, grüne zeigt Anti-Lamp1, blau zeigt DAPI-gefärbten DNA und gelb bedeutet Verschmelzung von Anti-Lamp1 und DAPI Flecken. Bars, 5µm. Diese Zahl wurde von Mittra, B. Et Al., 2013 geändert. Ursprünglich veröffentlicht in J. Exp Med. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Löschung von einem LMIT1 Allel beeinträchtigt stark das intrazelluläre Wachstum der mutierten LMIT1/Δlmit1 Parasiten. BMM infiziert waren für die angegebenen Zeiten mit L.amazonensis und entweder sofort behoben oder weitere inkubiert für 24, 48 oder 72 h bevor sie repariert wurden, gebeizt mit DAPI und die Anzahl der intrazellulären Parasiten mikroskopisch bestimmt war. (A) BMMs mit gereinigtem Wildtyp (WT), einzelne Ko (LMIT1/Δlmit1) infiziert waren und einzelne Ko (LMIT1/Δlmit1 + LMIT1) metacyclic Promastigotes (MOI 1:5) für 3 h ergänzt und sofort behoben oder inkubiert weiter wurde für den angegebenen Zeitpunkten und die Anzahl der intrazellulären Parasiten mikroskopisch bestimmt. Die Daten repräsentieren den Mittelwert ± SD dreifacher Bestimmungen und sind repräsentativ für die Ergebnisse von drei unabhängigen Experimenten. Die Sternchen zeigen deutliche Unterschiede zwischen WT und LMIT1/Δlmit1 Parasiten Infektiosität (Schülers zweiseitigen t -test 48 h, p = 0.017; 72 h, p = 0,008). (B) Axenic Amastigoten vom Wildtyp (WT), einzelne Ko (LMIT1/Δlmit1) und ergänzt einzelne Ko (LMIT1/Δlmit1 + LMIT1) Kulturen wurden getestet, für ihre Fähigkeit, BMMs infizieren BMMs wurden für 1 infiziert h (MOI 1:1) und entweder sofort behoben (1 h) oder nach weiteren Inkubation für 24, 48 oder 72 h und die Anzahl der intrazellulären Parasiten mikroskopisch bestimmt war. Die Daten sind der Mittelwert ± SD dreifacher Bestimmungen und Vertreter von mehr als drei unabhängigen Experimenten. P-Werte (Studenten zwei-tailed t-Test) zwischen den jeweiligen Gruppen werden angezeigt. Diese Zahl wurde von Mittra, B. Et Al., 2016 geändert. Ursprünglich veröffentlicht in PloS Pathog. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Die quantitative Daten von der BMM Infektion Test oben beschrieben, ermöglicht Ermittler Infektionsraten und eine zuverlässige Bestimmung der Veränderungen der Virulenzeigenschaften in einem relativ kürzeren Zeitraum (maximal 2 Wochen, im Vergleich zu den 2 zu erhalten Monate für in Vivo Experimente erforderlich). Diese Methode beruht auf der DNA-spezifischen Farbstoff DAPI, speziell Flecken Makrophagen und Parasiten Kernen und ermöglicht schnelle Identifizierung und Quantifizierung der infizierten Zellen. Im Vergleich dazu binden andere Flecken wie z. B. Giemsa an eine große Anzahl von verschiedenen zellulären Komponenten mit unterschiedlicher Intensität, visuelle Analyse37zu verkomplizieren. Die Verwendung von DAPI ermöglicht Anerkennung von intrazellulären Parasiten und ihre klare Unterscheidung von zellulären Strukturen (nur Kerne von Wirtszellen sind auch gefärbt, und ihre Größe mehrere Größenordnungen größer als Parasit Kerne beträgt), so dass einfacher und schneller Quantifizierung von Infektionen.
Wie bei jedem experimentellen Verfahren, hat diese Methode einige Einschränkungen und einige wichtige Schritte, die sorgfältige Ausführung erfordern. In-vivo Leishmaniose Infektion beinhaltet komplexe angeborene immunologische Reaktion vor Phagozytose, die die ultimative Verlauf der Infektion38bestimmt. Wahl des Modell Maus Belastung ist daher von entscheidender Bedeutung im Studiendesign. C57BL/6 und BALB/c Mäuse Belastung in diesem Protokoll Bär Mutationen im gen Kodierung der natürlichen Resistenz-assoziierten Makrophagen Protein (Nramp1), eine Proton-Efflux-Pumpe, die Fe2 + und Mn2 + translocates Ionen aus Makrophagen Lysosomen/Phagolysosomes in der Zellflüssigkeit. Dies führt zu erhöhter Anfälligkeit gegenüber Krankheitserregern, die in der endocytic Fach von Makrophagen8,30,31zu replizieren. Erfolgreiche Besiedlung in Makrophagen hängt auch die einzigartige Fähigkeit der infektiösen Leishmania -Parasiten, die Immunantwort unterdrücken/Makrophagen Aktivierung39,40überleben zu manipulieren. Die differenzierte Makrophagen für Leishmaniose BMM Infektionen etwas mimischen eingesetzt die nicht aktivierten Zustand der Makrophagen in Vivo, aber der Test sehr viel komplexer Satz von Host-Komponenten berücksichtigt nicht die Virulenz in beeinflussen Tiermodelle.
Isolierung von gesunden infektiösen Formen der Leishmaniose ist die andere absolut entscheidende Voraussetzung für genaue Virulenz Entschlossenheit. Nicht alle Promastigotes aller Leishmaniose Sorten unterscheiden effizient in Amastigoten bei niedrigem pH-Wert / Hochtemperatur Bedingungen41. Daher sind Infektionen mit metacyclic Promastigotes gereinigt von stationären Promastigote Kulturen oft durchgeführt. Um metacyclic Promastigotes effektiv zu isolieren, nutzen Sie einige Strategien, Reinigung die veränderte Zusammensetzung der Parasit Oberfläche Glycocalyx während der unterschiedlichen Lebensphasen, einschließlich umfangreiche Änderungen des Lipophosphoglycan (LPG) Struktur42,43,44. Z. B. wurde Peanut Agglutinin (PNA), ein Lektin, das selektiv zu prozyklischen aber nicht metacyclic LPG bindet effektiv in negativen Auslese Protokolle zur großen L. metacyclic Promastigotes45zu reinigen. Metacyclic Promastigote Reinigung Strategie für L. Amazonensis beinhaltet in der Regel eine monoklonale Antikörper-mAb3A.1 die prozyklischen Promastigotes verbinden können, durch gezielte spezifische Oberfläche Protein Epitope, die in metacyclic nicht zugänglich sind Formen durch Oberfläche Glycocalyx Änderungen8,13,32. Der Einsatz einer Dichte Gradienten Medien, metacyclic Promastigotes von Promastigotes basierend auf der Bühne-spezifische Unterschiede in der Dichte zu trennen ist eine attraktive Methode, weil es nicht von artspezifischen Variationen in Parasit Oberfläche Liganden abhängig. Diese ursprünglich für L. großen metacyclic Promastigote Reinigung33, beschriebene Methode wurde erfolgreich für mehrere andere Leishmania -Arten vor allem durch Modifikationen der Zentrifugation Bedingungen während angenommen Dichtegradient Sedimentation46,47,48,49.
Es ist auch wichtig, die Probleme bewusst sein, die Durchführung des Tests, die mehrere Schritte im Prozess auftreten erschweren kann. Diese Probleme zählen Kontamination während der BMM Extraktion, erfolglosen Differenzierung der BMMs nach Extraktion, inkonsistente Makrophagen Beschichtung, unvollständige Reinigung von infektiösen Parasiten Formen, Armen oder inkonsistente Infektion und Schwierigkeiten, die Montage Glasdeckgläser auf Objektträger. Diese Möglichkeiten wurden im Protokoll behandelt und gelöst werden können, um eine sorgfältige Prüfung jeder Schritt des Verfahrens Infektion um das Problem zu identifizieren. Z. B. möglicherweise Kontamination der BMM Kulturen während der Differenzierungsprozess ein Bedarf an verbesserten steriler Technik während der Extraktion. Sorgfältig auf die Reinheit und frische der Reinigung Reagenzien und präzise Umsetzung des Protokolls Reinigung kann nicht erfolgreich oder unvollständige Reinigung der gewünschten Parasit Formen korrigieren. Arm oder inkonsistente Infektionen können durch ungenaue Quantifizierung von Parasiten oder einer MOI, die zu hoch oder zu niedrig für den bestimmten experimentellen Bedingungen verursacht werden. Nach Extraktion, Bearbeitung und Montage der Glasdeckgläser ist wohl die technisch anspruchsvollsten Prozess in dieser Technik; Einzelpersonen können finden, dass sie es vorziehen, verschiedene Tools zur leichteren Handhabung der Deckgläsern. Übersichtliche Visualisierung von DAPI gefärbt Kerne ist entscheidend für präzise Parasiten zählen unter die Lupe genommen. Schwache Färbung und falsche Fokussierung sind zwei Hauptschuldigen hinter inkonsistente Quantifizierung. Dies kann durch die Qualitätskontrolle des DAPI Färbung Schritt, Begrenzung der Belichtungszeit, Foto-bleaching zu reduzieren, und schnell Veränderung der objektiven Schwerpunkt für alle Parasiten Kerne im Feld Konto gewährleistet werden. DAPI Fluoreszenz Helligkeit kann auch durch die Gewährleistung der richtigen Permeabilisierung der Proben mit Waschmittel und durch Erhöhung der Konzentration von DAPI während der Färbung verbessert werden. Ein alternativer Ansatz, der die Quantifizierung erleichtert ist, digitale Bilder der Proben bei der mikroskopischen Untersuchung zu erhalten. Die Bilder können können für die Quantifizierung zu einem späteren Zeitpunkt verwendet werden und durch unabhängige Ermittler überprüft/quantifiziert. Allerdings gibt es technische Schwierigkeiten im Zusammenhang mit diesem Prozess, sorgfältigen Abwägung erfordert. Aufgrund der sphärischen Natur der PV immer die Parasiten nicht auf der gleichen Brennebene. Dies setzt voraus, dass mehrere Bilder mit unterschiedlichen fokalen Flugzeuge für jedes mikroskopische Feld erworben und anschließend zusammen montiert, um die Parasiten zu berücksichtigen. Andernfalls kann die Quantifizierung von Fotografien sehr irreführend sein. Berechnungen von Makrophagen/Feld und Amastigoten/Feld sind wichtig, um sicherzustellen, dass konsequente Makrophagen Plattieren und Ausbreitung von Parasiten während der Infektion erreicht wurde. Da BMMs ausdifferenzierten Zellen sind, sollte ihre Anzahl nicht im Laufe der Zeit erhöhen. Wenn die Anzahl der Host-Makrophagen im Laufe der Zeit steigt, bedeutet dies, dass Makrophagen noch nicht ausgereift waren. In diesem Fall sollte die Quelle und die Konzentration des M-CSF überprüft werden. Bestimmung der prozentuale infizierten Makrophagen kann auch bei der Bereitstellung eines umfassenden Überblick über den Host Cell-Erreger-Interaktion, insbesondere in Fällen, wo % Infektion und Parasiten Last folgen nicht ähnliche Trends20,21, nützlich sein .
Die Methode der in Vitro BMM Infektion hier kann experimentelle Bedürfnisse angepasst werden. Änderungen können an die grundlegenden Schritte des Prozesses - BMM Extraktion und Differenzierung, Reinigung von infektiösen Parasiten Formen und Quantifizierung von in-vitro- Makrophagen Infektionen sowie Umsetzung Infektionen mit verschiedenen vorgenommen werden MOIs und Anpassung des Zeitraums von Infektion und Zeitpunkten analysiert. Kultur-Media-Komponenten können entweder über Supplementierung oder Erschöpfung der spezifischen Nährstoffen auch leicht verändert, und mehrere verschiedene Stämme oder Formen des Parasiten gleichzeitig beurteilt werden können. Diese Änderungen erfordern zusätzliche Anpassung der technischen Verfahren; beispielsweise sollen Verfahren zur Amastigote Vorbereitung und metacyclic Promastigote Reinigung zwischen einzelnen Leishmania -Arten variieren. Zusätzliche fluoreszierende Farbstoffe neben DAPI oder Eindringmittel tagged zelluläre Komponenten können genutzt werden, um eine umfassende Palette von Wirt-Parasit-Interaktion Prozesse6,24zu visualisieren. Darüber hinaus kann dieser Assay ein hoher Durchsatz Systeme (HTS) Format angepasst was schnelles Screening von zusammengesetzten Bibliotheken ermöglichen würde, führt neue und wirksame Medikament zur Behandlung von Leishmaniose24zu identifizieren.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben,
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der National Institutes of Health Grant RO1 AI067979 NWA unterstützt.
YK ist Bachelor Fellow der Howard Hughes Medical Institute/University of Maryland, College Park.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 well cell culture plate | Cellstar | 657160 | |
| Adenine | Acros Organics | AC147440250 | |
| Aerosol Barrier Pipet Tips (100-1000 μL) | Fisherbrand | 02-707-404 | |
| Aerosol Barrier Pipet Tips (20-200 μL) | Fisherbrand | 02-707-430 | |
| Aerosol Barrier Pipet Tips (2-20 μL) | Fisherbrand | 02-707-432 | |
| Bard-Parker Rib-Back Carbon Steel Surgical Blade #10 | Aspen Surgical | 371110 | |
| BD Luer-Lok Tip 10 mL Syringe | Becton Dickinson (BD) | 309604 | |
| BD Precisionglide Needle, 25G | Becton Dickinson (BD) | 305124 | |
| Cell Culture Dish 35 mm x 10 mm | Cellstar | 627 160 | |
| Cell Culture Flask | Cellstar | 660175 | |
| Cover Glasses: 12 mm circles | Fisherbrand | 12-545-80 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| D-Biotin | J.T. Baker | C272-00 | |
| EDTA | Sigma Aldrich | EDS | |
| Ethyl alcohol 200 proof | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Falcon 100 mm x 15 mm non-TC-treated polystyrene Petri dish | Corning | 351029 | |
| Fetal Bovine Serum | Seradigm | 1500-500 | |
| Ficoll400 | Sigma Aldrich | F8016 | |
| Fluorescence Microscope | Nikon | E200 | |
| Goat anti-mouse IgG Texas red | Invitrogen | T-862 | |
| Goat anti-rabbit IgG AlexaFluor488 | Invitrogen | A-11034 | |
| Hemin | Tokyo Chemical Industry Co. LTD | H0008 | |
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Isoton II Diluent | Beckman Coulter | 8546719 | |
| L-Glutamine | Gemini | 400-106 | |
| Medium 199 (10X) | Gibco | 11825-015 | |
| Na pyruvate (100 mM) | Gibco | 11360-070 | |
| Paraformaldehyde | Alfa Aesar | 43368 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gemini | 400-109 | |
| Phosphate Buffered Saline (-/-) | ThermoFisher | 14200166 | |
| Polypropyline conical Centrifuge Tubes 15 mL | Cellstar | 188 271 | |
| Polypropyline conical Centrifuge Tubes 50 mL | Cellstar | 227 261 | |
| ProLong Gold antifade reagent | ThermoFisher | P36930 | |
| Rat anti-mouse Lamp-1 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 1D4B | |
| Recombinant Human M-CSF | PeproTech | 300-25 | |
| Reichert Bright-Line Hemocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| RPMI Medium 1640 (1X) | Gibco | 11875-093 | |
| Triton X-100 Surfactant | Millipore Sigma | TX1568-1 | |
| Trypan Blue | Sigma Aldrich | T8154 | |
| Delicate Scissors, 4 1/2" | VWR | 82027-582 | |
| Dissecting Forceps, Fine Tip | VWR | 82027-386 | |
| Microscope Slides | VWR | 16004-368 | |
| Z1 Coulter Particle Counter, Dual Threshold | Beckman Coulter | 6605699 |
References
- WHO. Control of the leishmaniases. World Health Organ Tech Rep Ser. (949), (2010).
- Naderer, T., McConville, M. J. Intracellular growth and pathogenesis of Leishmania parasites. Essays Biochem. 51, 81-95 (2011).
- Rosenzweig, D., et al. Retooling Leishmania metabolism: from sand fly gut to human macrophage. FASEB J. 22 (2), 590-602 (2008).
- Lahav, T., et al. Multiple levels of gene regulation mediate differentiation of the intracellular pathogen Leishmania. The FASEB Journal. 25 (2), 515-525 (2011).
- Saunders, E. C., et al. Induction of a stringent metabolic response in intracellular stages of Leishmania mexicana leads to increased dependence on mitochondrial metabolism. PLoS Pathog. 10 (1), e1003888 (2014).
- Mittra, B., et al. Iron uptake controls the generation of Leishmania infective forms through regulation of ROS levels. J Exp Med. 210 (2), 401-416 (2013).
- Kloehn, J., et al. Using metabolomics to dissect host-parasite interactions. Curr Opin Microbiol. 32, 59-65 (2016).
- Huynh, C., Sacks, D. L., Andrews, N. W. A Leishmania amazonensis ZIP family iron transporter is essential for parasite replication within macrophage phagolysosomes. J Exp Med. 203 (10), 2363-2375 (2006).
- Flannery, A. R., Huynh, C., Mittra, B., Mortara, R. A., Andrews, N. W. LFR1 Ferric Iron Reductase of Leishmania amazonensis Is Essential for the Generation of Infective Parasite Forms. J Biol Chem. 286 (26), 23266-23279 (2011).
- Miguel, D. C., Flannery, A. R., Mittra, B., Andrews, N. W. Heme uptake mediated by LHR1 is essential for Leishmania amazonensis virulence. Infect Immun. 81 (10), 3620-3626 (2013).
- Cortez, M., et al. Leishmania Promotes Its Own Virulence by Inducing Expression of the Host Immune Inhibitory Ligand CD200. Cell Host Microbe. 9 (6), 463-471 (2011).
- Mittra, B., Andrews, N. W. IRONy OF FATE: role of iron-mediated ROS in Leishmania differentiation. Trends Parasitol. 29 (10), 489-496 (2013).
- Mittra, B., et al. A Trypanosomatid Iron Transporter that Regulates Mitochondrial Function Is Required for Leishmania amazonensis Virulence. PLoS Pathog. 12 (1), e1005340 (2016).
- Ben-Othman, R., et al. Leishmania-mediated inhibition of iron export promotes parasite replication in macrophages. PLoS Pathog. 10 (1), e1003901 (2014).
- Renberg, R. L., et al. The Heme Transport Capacity of LHR1 Determines the Extent of Virulence in Leishmania amazonensis. PLoS Negl Trop Dis. 9 (5), e0003804 (2015).
- McConville, M. J. Metabolic Crosstalk between Leishmania and the Macrophage Host. Trends Parasitol. 32 (9), 666-668 (2016).
- Carrera, L., et al. Leishmania promastigotes selectively inhibit interleukin 12 induction in bone marrow-derived macrophages from susceptible and resistant mice. J Exp Med. 183 (2), 515-526 (1996).
- Hsiao, C. H., et al. The effects of macrophage source on the mechanism of phagocytosis and intracellular survival of Leishmania. Microbes Infect. 13 (12-13), 1033-1044 (2011).
- Murray, A. S., Lynn, M. A., McMaster, W. R. The Leishmania mexicana A600 genes are functionally required for amastigote replication. Mol Biochem Parasitol. 172 (2), 80-89 (2010).
- Farias Luz, N., et al. RIPK1 and PGAM5 Control Leishmania Replication through Distinct Mechanisms. J Immunol. 196 (12), 5056-5063 (2016).
- Franco, L. H., et al. Autophagy downstream of endosomal Toll-like receptor signaling in macrophages is a key mechanism for resistance to Leishmania major infection. J Biol Chem. 292 (32), 13087-13096 (2017).
- da Silva, M. F., Zampieri, R. A., Muxel, S. M., Beverley, S. M., Floeter-Winter, L. M. Leishmania amazonensis arginase compartmentalization in the glycosome is important for parasite infectivity. PLoS One. 7 (3), e34022 (2012).
- Carneiro, P. P., et al. The Role of Nitric Oxide and Reactive Oxygen Species in the Killing of Leishmania braziliensis by Monocytes from Patients with Cutaneous Leishmaniasis. PLoS One. 11 (2), e0148084 (2016).
- Siqueira-Neto, J. L., et al. An image-based high-content screening assay for compounds targeting intracellular Leishmania donovani amastigotes in human macrophages. PLoS Negl Trop Dis. 6 (6), e1671 (2012).
- Pastor, J., et al. Combinations of ascaridole, carvacrol, and caryophyllene oxide against Leishmania. Acta Trop. 145, 31-38 (2015).
- Giarola, N. L., et al. Leishmania amazonensis: Increase in ecto-ATPase activity and parasite burden of vinblastine-resistant protozoa. Exp Parasitol. 146, 25-33 (2014).
- Sacks, D. L., Melby, P. C. Animal models for the analysis of immune responses to leishmaniasis. Curr Protoc Immunol. , Chapter 19 Unit 19 12 (2001).
- Tabbara, K. S., et al. Conditions influencing the efficacy of vaccination with live organisms against Leishmania major infection. Infect Immun. 73 (8), 4714-4722 (2005).
- Price, J. V., Vance, R. E. The macrophage paradox. Immunity. 41 (5), 685-693 (2014).
- Huynh, C., Andrews, N. W. Iron acquisition within host cells and the pathogenicity of Leishmania. Cell Microbiol. 10 (2), 293-300 (2008).
- Blackwell, J. M., et al. SLC11A1 (formerly NRAMP1) and disease resistance. Cell Microbiol. 3 (12), 773-784 (2001).
- Pinto-da-Silva, L. H., et al. The 3A1-La monoclonal antibody reveals key features of Leishmania (L) amazonensis metacyclic promastigotes and inhibits procyclics attachment to the sand fly midgut. Int J Parasitol. 35 (7), 757-764 (2005).
- Spath, G. F., Beverley, S. M. A lipophosphoglycan-independent method for isolation of infective Leishmania metacyclic promastigotes by density gradient centrifugation. Exp Parasitol. 99 (2), 97-103 (2001).
- Zilberstein, D., Shapira, M. The role of pH and temperature in the development of Leishmania parasites. Annu Rev Microbiol. 48, 449-470 (1994).
- Bates, P. A. Transmission of Leishmania metacyclic promastigotes by phlebotomine sand flies. Int J Parasitol. 37 (10), 1097-1106 (2007).
- Bates, P. A., Robertson, C. D., Tetley, L., Coombs, G. H. Axenic cultivation and characterization of Leishmania mexicana amastigote-like forms. Parasitology. 105 (Pt 2), 193-202 (1992).
- Frickmann, H., et al. Rapid identification of Leishmania spp. in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue samples by fluorescence in situ hybridization. Trop Med Int Health. 17 (9), 1117-1126 (2012).
- Seguin, O., Descoteaux, A. Leishmania, the phagosome, and host responses: The journey of a parasite. Cell Immunol. 309, 1-6 (2016).
- Wanderley, J. L., Thorpe, P. E., Barcinski, M. A., Soong, L. Phosphatidylserine exposure on the surface of Leishmania amazonensis amastigotes modulates in vivo infection and dendritic cell function. Parasite Immunol. 35 (3-4), 109-119 (2013).
- Crauwels, P., et al. Apoptotic-like Leishmania exploit the host's autophagy machinery to reduce T-cell-mediated parasite elimination. Autophagy. 11 (2), 285-297 (2015).
- Bringmann, G., et al. A novel Leishmania major amastigote assay in 96-well format for rapid drug screening and its use for discovery and evaluation of a new class of leishmanicidal quinolinium salts. Antimicrob Agents Chemother. 57 (7), 3003-3011 (2013).
- Sacks, D. L., Brodin, T. N., Turco, S. J. Developmental modification of the lipophosphoglycan from Leishmania major promastigotes during metacyclogenesis. Mol Biochem Parasitol. 42 (2), 225-233 (1990).
- Sacks, D. L. Leishmania-sand fly interactions controlling species-specific vector competence. Cell Microbiol. 3 (4), 189-196 (2001).
- McConville, M. J., Turco, S. J., Ferguson, M. A., Sacks, D. L. Developmental modification of lipophosphoglycan during the differentiation of Leishmania major promastigotes to an infectious stage. EMBO J. 11 (10), 3593-3600 (1992).
- Sacks, D. L., Hieny, S., Sher, A. Identification of cell surface carbohydrate and antigenic changes between noninfective and infective developmental stages of Leishmania major promastigotes. J Immunol. 135 (1), 564-569 (1985).
- Yao, C., Chen, Y., Sudan, B., Donelson, J. E., Wilson, M. E. Leishmania chagasi: homogenous metacyclic promastigotes isolated by buoyant density are highly virulent in a mouse model. Exp Parasitol. 118 (1), 129-133 (2008).
- Almeida Marques-da-Silva, E., et al. Extracellular nucleotide metabolism in Leishmania: influence of adenosine in the establishment of infection. Microbes Infect. 10 (8), 850-857 (2008).
- Moreira, D., et al. Impact of continuous axenic cultivation in Leishmania infantum virulence. PLoS Negl Trop Dis. 6 (1), e1469 (2012).
- Svensjo, E., et al. Interplay between parasite cysteine proteases and the host kinin system modulates microvascular leakage and macrophage infection by promastigotes of the Leishmania donovani complex. Microbes Infect. 8 (1), 206-220 (2006).
