Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Kvantifisering av intracellulær vekst i makrofager er en rask og pålitelig metode for å vurdere virulens av Leishmania parasitter

Published: March 16, 2018 doi: 10.3791/57486

Summary

Alle sykdomsfremkallende Leishmania arter ligge og gjenskape i makrofager av deres virveldyr verter. Her presenterer vi en protokoll for å infisere murine Ben margtransplantasjon-avledet makrofager i kultur med Leishmania, etterfulgt av presise kvantifisering av intracellulær vekst kinetics. Denne metoden er nyttig for studerer individuelle faktorer som påvirker vert-patogen samhandling og Leishmania virulens.

Abstract

Livssyklusen til Leishmania, den utløsende agenten for leishmaniasis, veksler mellom promastigote og amastigote stadier i insekt og virveldyr verter, henholdsvis. Mens patogene symptomer på leishmaniasis kan variere mye, fra godartet kutan lesjoner til svært dødelig visceral sykdom former avhengig av infeksiøs arter, bor alle Leishmania arter inne vert makrofager under virveldyr Stadium i livssyklusen. Leishmania infectivity er derfor direkte knyttet til sin evne til å invadere overleve og gjenskape innen parasitophorous vacuoles (PV) i makrofager. Derfor fungerer vurdere parasittens evne til å reprodusere intracellulært som en pålitelig metode for å bestemme virulens. Studere leishmaniasis utvikling med dyremodeller er tidkrevende, kjedelig og ofte vanskelig, spesielt med pathogenically viktig visceral skjemaer. Her beskriver vi en metodikk følge intracellulær utviklingen av Leishmania i Ben margtransplantasjon-avledet makrofager (BMMs). Intracellulær parasitten tall bestemmes i 24-timers intervaller på 72-96 h etter infeksjon. Denne metoden gir et pålitelig fastsettelse av virkningene av ulike genetiske faktorer på Leishmania virulens. Som et eksempel viser vi hvordan en enkelt allelet sletting av Leishmania mitokondrie jern Transporter genet (LMIT1) svekker evnen til Leishmania amazonensis mutert stamme LMIT1/ΔLmit1 å vokse i BMMs, reflekterer en drastisk reduksjon i virulens sammenlignet med vill-type. Denne analysen kan også nøyaktig kontroll over eksperimentelle forhold, som kan redigeres individuelt analysere påvirkning av ulike faktorer (næringsstoffer, reaktive oksygen arter, osv.) på verten-patogen samhandlingen. Derfor gir riktig gjennomføring og kvantifisering BMM infeksjon studiene en ikke-invasiv, rask, økonomisk, sikker og pålitelig alternativ til konvensjonelle dyremodell studier.

Introduction

Leishmaniasis refererer til et bredt spekter av menneskelige sykdommer forårsaket av protozoan parasitten arter av slekten Leishmania. Ca 12 millioner mennesker er nå infisert med Leishmania over hele verden mer enn 350 millioner er utsatt. Sykdom patologi avhenger av den Leishmania arten og vert faktorer og symptomene varierer fra ufarlige selvhelbredende hudlesjoner dødelige visceralizing former. Hvis ubehandlet, visceral leishmaniasis er kritisk, rangering etter malaria som dødeligste menneskelig sykdom forårsaket av infeksjon med en protozoan parasitten1. Til tross for omfattende forskjellene i sykdom patologi og symptomer har alle Leishmania arter en digenic livssyklus alternerende mellom promastigote og amastigote stadier i insekt og virveldyr verter, henholdsvis. Innsiden virveldyr, Leishmania målet vert makrofager for invasjonen og indusere dannelsen av parasitophorous vacuoles (PV), surt deler med egenskapene til phagolysosomes der skjemaene svært virulente amastigote gjenskape. Amastigotes vedvarer i vert vev under kroniske infeksjoner og kan sendes frem til uninfected sandflies, fullføre overføring syklusen. Derfor, i sammenheng med menneskelig sykdom utvikling, amastigotes er den viktigste Leishmania livssyklus skjema2. Undersøker hvordan amastigotes gjenskape inne macrophage PVs er avgjørende for å forstå Leishmania virulens3,4,5,6,7 og for den utviklingen av romanen effektiv terapi.

Her beskriver vi en metode jevnlig brukt av vårt laboratorium Leishmania infeksjon og replikasjon i bein margtransplantasjon-avledet makrofager (BMMs), som involverer kvantitativ vurdering av antall intracellulær Leishmania over tid. Prosessen innebærer høsting av monocytter fra musen benmargen og differensiering makrofager i kultur, i vitro infeksjon med infeksiøs skjemaer (metacyclic promastigotes eller amastigotes) av Leishmania og måling av den antall intracellulære parasitter på 24-timers intervall for en periode på 72-96 timer etter infeksjon. Denne analysen er brukt i vårt laboratorium for å fastslå effekten av flere miljøfaktorer og parasitten gener, inkludert identifisering av kritiske rollen av jern i å fremme L. amazonensis virulens som ble ytterligere validert av footpad lesjonen development studier i mus6,8,9,10,11,12,13,14,15 . Siden alle sykdomsfremkallende Leishmania arter etablere sin replicative nisje inne vert makrofager, kan denne analysen brukes universelt for virulens avgjørelser i alle Leishmania arter.

Utføre BMM infeksjoner kan analyse av vert-parasitten samhandlinger på enkeltcelle nivå, og dermed en mer omfattende forståelse av hvordan Leishmania parasitter samhandler med sine foretrukne vert microenvironment, PVs av makrofager. Macrophage infeksjon analyser har blitt brukt av flere grupper16,17,18,19,20,21,22 å utforske funksjonene i både vert macrophage og Leishmania bestemte gener og deres potensielle engasjement i det komplekse samspillet som karakteriserer intracellulær infeksjon. BMM infeksjoner tillate kvantifisering av parasitten vekst som en skrivebeskyttet ut av virkningen av vert faktorer som påvirker intracellulær overlevelse, som microbicidal nitrogenoksid produksjonen, generasjon av frie radikaler og andre ugunstige forhold oppdaget i lysosome-lignende PVs23. Macrophage infeksjon analyser har også blitt benyttet for å identifisere potensielle anti-leishmanial narkotika leder for terapeutisk utvikling13,24.

Natur i vitro BMM infeksjoner gir flere fordeler sammenlignet med andre metoder for å vurdere Leishmania virulens. Imidlertid flere tidligere studier som har undersøkt virkningsmekanismer intracellulær parasitten overlevelse over tid ikke tallfeste infeksjon som en pris20,21,24. Dessuten, mange studier fokuserte på følgende i vivo infeksjoner over tid gjorde det ved å måle kutan lesjon størrelse og andre fysiologiske symptomer som gjelder bare indirekte parasitten replikering25,26 , 27. i vivo infeksjon er en strenge tilnærming til vurdere parasitten virulens, men lesjon størrelse målinger basert på footpad hevelse alene er ofte utilstrekkelig, som gjenspeiler de inflammatorisk respons i infiserte vev og ikke den absolutte antallet parasitter. Derfor footpad lesjon utvikling analyser må etterfølges av kvantifisering av parasitten lasten i infiserte vev, søk en prosedyre som krever lange begrensende fortynning28. I tillegg innebære i vivo studier ofte at flere dyr på ulike tidspunkter i tid for å pakke ut vev av interesse6,8,9,10, 11 , 13. derimot store antall BMMs kan fås fra ett dyr, og disse cellene kan være belagt under forhold som tillater vurdering av infeksjon på ulike punkter i tid. Videre gir sammenlignet med i vivo studier, utfører i vitro BMM infeksjoner større kontroll over eksperimentelle forhold. Kvantifisere makrofager er infisert med parasitter selv tillater presis kontroll over mangfoldet av infeksjon (MOI) og kultur forhold. Bedre kontroll over disse faktorene kan være nøkkelen identifiserende kjennetegn av diskrete mobilnettet og forstå deres innvirkning på løpet av infeksjon.

Gitt disse fordelene, er det noe overraskende at få grupper studere Leishmania virulens hittil har tatt full nytte av kvantitativ vurdering av intracellulær replikering i makrofager. I denne artikkelen diskutere vi felles fallgruver som kan være hindrer den mer omfattende utnyttelsen av denne analysen, og gi en trinnvis protokoll for å gjøre gjennomføringen riktig. Vurderer sin presisjon og allsidighet, BMM infeksjon analysen beskriver vi her kan ikke bare benyttes å utforske vert-patogen interaksjoner påvirker Leishmania virulens, men også å studere andre mikroorganismer som gjenskaper inne makrofager29. Viktigere, kan denne analysen også bli utviklet som en rask og økonomisk pre-klinisk screening metode for anti-leishmanial narkotika utvikling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eksperimentelle prosedyrer ble utført i samsvar med anbefalingene i Guide og bruk av forsøksdyr ved National Institutes of Health og ble godkjent av universitetet i Maryland IACUC. Alle trinnene som er beskrevet i avsnitt 1 til 4 skal utføres tas aseptisk inne biologiske laminær strømning skap. Personlig verneutstyr benyttes, og forsiktighet bør utvises i håndtering av live Leishmania parasitter gjennom alle faser av eksperimentering.

1. isolering og differensiering av Ben margtransplantasjon-avledet makrofager (BMMs)8,30,31

  1. Dag 0: Ofre 4 - 6-uke-gamle kvinnelige C57BL/6 eller BALB/c musen i en CO2 kammer og Bekreft livsfarlig cervical forvridning. Sikre sterilisering saks og tang ved å holde dem dynket i 70% etanol. Spray hansker med 70% etanol tillate steril håndtering gjennom benmarg celle isolasjon prosessen.
  2. Sikkert ofret musen disseksjon styret fester sin forelimbs og desinfisere ved sprøyting rikelig med 70% etanol.
  3. Lag et lite innsnitt (ca 1 cm) med saks i hofteleddet. Nøye sett saks under huden skille underliggende muskelen og kutt huden hele veien rundt hofteleddet.
    Merk: Disseksjon styret kan roteres slik at forbedret tilgang til hofteleddet.
  4. Nøye deglove huden av ved å trekke mot ankelen og fjerne. Avskåret foten på ankelen, være veldig forsiktig for å kutte på eller under ankelen felles å forlate tibia fullt intakt.
    Merk: Fibula på dette stadiet er løst knyttet og lett kan skilles med tang.
  5. Manuelt finne hofteleddet ved å manipulere femur å identifisere punktet av rotasjon. Forsiktig bruk saks bryte benet over hofteleddet å forlate det proksimale hodet av femur intakt.
  6. Fjerne så mye muskler og bindevev som mulig av med saks. Fjern alle gjenværende huden fra ankelen og overskytende bein materiale over hofteleddet.
  7. Plass renset etappe bein i sterilt RPMI med penicillin/streptomycin (1% siste konsentrasjon) i en Petriskål på is.
  8. Gjenta 1.4 gjennom 1.6 isolere tibia og femur fra andre bakben etappe.
  9. Fjern alle gjenværende muskler og bindevev av beina soaking i RPMI bruke steriliserte tang og sterile #10 blad.
  10. Plasser bein på Petriskål lokket. Skjær tibia nøye med bladet rett over ankelleddet til margen. Fjern tibia fra resten av leggen ved å kutte rett under kneleddet.
  11. Tegne 10 mL steril RPMI supplert med penicillin/streptomycin (1% siste konsentrasjon) 10-mL sprøyter til og fest en 25G nål.
  12. Hold tibia fast med tang, vertikalt over en 50-mL konisk rør på is. Bruk sprøyten for å injisere forsiktig ca 5 mL RPMI i slutten av bein å spyle benmargen av den andre enden inn i konisk røret. Tømme benmargen med totalt 10 mL RPMI til benet blir hvite.
    Merk: Etter grundig rødme, benet skal slå hvit. Hvis ikke, fortsetter rødme å fjerne benmarg. Distale tibia må trimmes tilbake med bladet om det er for smal til å sette inn nålen.
  13. Kuttet femur umiddelbart over kneleddet og umiddelbart under hofteleddet å avsløre begge ender av benet til margen. Tømme benmarg fra femur med totalt 10 mL RPMI på samme måte som tibia.
  14. Gjenta rengjøring og rødme trinn 1.6 gjennom 1.13 med gjenværende bein og samle benmarg skylles cellene i en enkelt 50 mL konisk rør
    Merk: Hvis en benet bryter når som helst under disseksjon før bein rødme, ikke bruk margen fra denne bein.
  15. Sentrifuger konisk røret brukes til å samle benmarg tømt fra alle fire bein for 10 min på 4 ° C på 300 x g.
  16. Plasser 60 mL steril BMM medium (RPMI med en siste konsentrasjon på 20% FBS, 1% penicillin/streptomycin, 1.2 mM Na-pyruvate, 25 µg/mL menneskelige M-CSF) i en 175 cm2 celle kultur kolbe med filteret cap.
  17. Forkaste den supernatant følgende sentrifugering og resuspend celle pellet ved forsiktig opp og ned pipettering med 5 mL av BMM medium fra flasken.
  18. Overføre celle suspensjon til kultur kolbe og skyll konisk røret to ganger med BMM medium fra kultur kolbe å sikre maksimal celle utvinning. Sikre celle suspensjon grundig blandes til medium og distribuere 30 mL fra første 175 cm2 celle kultur kolbe til en andre 175 cm2 celle kultur kolbe med filteret cap.
  19. Inkuber både flasker som inneholder 30 mL celle suspensjon hver overnatting på 37 ° C, 5% CO2 tillate separasjon av eventuelle skadelige fibroblaster bosatt makrofager og andre tilhenger celler.
  20. Dag 1: Overføre nedbryting inneholder udifferensierte bein margtransplantasjon celler fra kolber 100 x 15 mm ikke-TC-behandlet polystyren Petri retter på ca 10 mL/rett og ruge på 37 ° C, 5% CO2. Kast i flasker.
  21. Dag 3 eller 4: Legge til en ekstra 5 mL BMM medium (pre oppvarmet til 37 ° C) hver Petriskål og fortsette inkubasjon ved 37 ° C, 5% CO2.

2. plating BMMs på Coverslips for infeksjon (dag 7 eller 8)

  1. Forberede 6-og vev kultur plater ved å sette fire (4) sterilt 12 mm glass coverslips (autoklaveres og lagret i en lukket glassbeholder) i bunnen av hver tomt også.
    Merk: Plukk hver sterilt 12 mm dekkglassvæske opp med en aspirating tips montert en vakuum linje. Plasser coverslips i brønnene uten overlapping, slippe på ønsket plassering ved pinching røret for å avbryte vakuum.
  2. Leveringstanken medier (og ikke-tilhenger celler) fra Petri retter belagt med tilhenger benmarg avledet makrofager og forsiktig rense tilhenger cellene 2 x med sterilt Dulbecco fosfat bufret saltvann uten kalsium og magnesium klorid (PBS- / -) pre varmet til 37 ° C.
  3. Legg dropwise, 5 mL steril 1 x PBS- / - med en siste konsentrasjon av 1 mM EDTA til hver Petriskål og ruge i 5 min på 37 ° C koble tilhenger BMMs. Kontroller at cellene er koblet med et mikroskop.
  4. Samle alle frittstående celler suspendert i 1 x PBS- / - med 1 mM EDTA i et 50 mL konisk rør. Skyll hver rett 2 x med 5 mL PBS- / - og legge til celle suspensjon bassenget.
    Merk: Cellen suspensjon kan fortynnes med ekstra PBS- / - å beskytte makrofager fra EDTA toksisitet i løpet av henteprosessen.
  5. Sentrifuger 300 x g i 10 min på 4 ° C. Forkast nedbryting og resuspend makrofager i 5-10 mL BMM medium av pipettering. Stedet resuspended celler på is å hindre vedlegg til rør og klumper.
  6. Antall levedyktige cellers bruker Trypan blå ekskludering i hemocytometer.
    Merk: For å telle BMM celler resuspended i 5 mL medium, en fortynning-blanding av 25 µL celle suspensjon i 445 µL PBS- /- og 30 µL 0,4% Trypan blå løsning vanligvis lar lett kvantifisering i en hemocytometer (tar hensyn til en 20 x fortynningsfaktoren for siste beregning ). Tell bare celler som ikke få beiset med Trypan blå (levedyktig celler). Volumet av cellen suspensjon bli endret hvis denne blandingen er også konsentrert eller utvannet. Generelt, varierer avkastningen av BMM per forberedelse mellom 2 x 107 og 5 x 107 celler fra et enkelt museklikk.
  7. Forberede celle suspensjon i BMM medium på ønsket plating konsentrasjon (5 x 105/mL) og spre suspensjon til 6 bra plater i 2 mL medium per brønn slik at hver godt mottar 1 x 106 makrofager.
    Merk: Dette er et viktig skritt som sikrer alle godt får tilstrekkelig antall makrofager å dekke coverslips jevnt. Kontroller at coverslips i brønner ikke overlapper eller flytende i medium. Eventuelt justere forsiktig med et sterilt pipette tips.
  8. Ruge over natten ved 37 ° C, 5% CO2.

3. rensing av infeksiøs L. amazonensis

Merk: Forberede Leishmania for infeksjoner - rense metacyclic promastigotes fra stasjonære promastigote kulturer8,13, eller skille promastigotes i kulturen i amastigote skjema ved hjelp av standard L. amazonensis axenic differensiering protokollen6,8.

  1. Rensing av Leishmania metacyclic promastigotes med tetthet gradert media(Materials) 33
    1. Forberede 40% lagerløsning tetthet gradert medier i sterilt, endotoxin uten vann.
    2. Fortynne tetthet gradert løsning 10 x M199 medium (uten serum) for å forberede 10% konsentrasjon i M199 medium.
    3. Filtrere alle løsninger gjennom 0.22 µm.
      Merk: Lager løsninger kan lagres på 4 oC i mørket lenger enn 1 måned.
    4. Legg 2 mL 40% tetthet gradert media løsning i bunnen av en 15-mL konisk sentrifuge rør.
    5. Lag 2 mL 10% tetthet gradert media løsning i M199 på 40% tetthet gradert media laget nøye, bruke en Pasteur pipette for å unngå en blanding mellom de to lagene.
    6. Samle 1 x 109 parasitter fra stasjonære-fase kultur med sentrifugering på 1900 x g i 10 min.
    7. Resuspend celler i 6 mL Dulbecco endret viktig Medium (DMEM).
    8. Lag 2 mL celle suspensjon direkte på 10% tetthet gradert media lag, forsiktig, bruke en Pasteur pipette for å unngå blanding mellom lagene.
    9. Sentrifuge graderingen for 10 min 1300 x g ved romtemperatur.
      Merk: På grunn av forskjeller i fysiske egenskaper mellom Leishmania arter, sentrifugering betingelser for hver kan ha justeres litt for å sikre maksimal avkastning.
    10. Samle parasitter (beriket i metacyclic promastigote form) fra bandet dannet på øverste 10% tetthet gradert media grensen (grensesnitt mellom 0 og 10% tetthet gradert media lagene).
    11. Fortynne parasitter med ett volum for DMEM og samle med sentrifugering (1900 x g i 10 min ved romtemperatur).
    12. Resuspend 500 µL DMEM medium og teller i en hemocytometer å kvantifisere avkastningen.
  2. Generasjon av L. amazonensis amastigotes under axenic kultur forhold (lav pH / forhøyet temperatur)6,8,13
    1. Mix 5 mL av Logg-fase promastigote kultur (pH 7.4 på 26 oC) med en like volum av amastigote medium (pH 4.5), bruker 25 cm2 flasker (totalt 10 mL medium) og ruge på 26 ° C over natten.
    2. Skifte kolbe fra 26 ° C til 32 ° C.
    3. Etter 3 eller 4 dager, delt kultur 1:5 i amastigote medier på 32 ° C.
    4. Sjekk parasitter i neste 3-4 dager (maksimalt 7 dager) å se om de er klar til bruk i infeksjoner.
      Merk: Sunn axenic amastigotes bør ha en oval form, uten synlige flagella. Delvis differensiert amastigotes har en stor oval form med kort flagella. Kulturen bør ikke ha mange klumper - mange klumper er en indikasjon på ikke-økende, døende parasitter. Den amastigote kulturen deles 1:5 og vedlikeholdes for maksimalt 3 uker.

4. infeksjon med L. amazonensis

  1. Fortynne parasitten suspensjoner etter ønsket MOI (vanligvis 3-5 metacyclic promastigotes per macrophage [MOI 1:3 eller 1:5]) og 1 amastigote per macrophage [MOI 1:1]. Legge til Leishmania i PBS- / - i et volum på 50-100 µL hver brønn allerede inneholder 2 mL medium.
  2. Inkuber BMMs 1t med amastigotes og 3t med metacyclic promastigotes på 34 oC for infeksjon.
    Merk: Optimal infeksjon temperatur kan variere fra arter.
  3. Etter inkubasjon grundig vaske bort gratis parasitter i hver vel 3 x med 2 mL PBS- / - forvarmes til 37 ° C.
    Merk: Spre PBS forsiktig for å sikre at coverslips ikke flyte over hverandre. Snurr den forsiktig og deretter Sug opp ut væske. Bruke separate aspirating tips Hvis bruker flere stammer av parasitter for å unngå kryss-kontaminering.
  4. Fastsette 1 h eller 3 h-punkt prøver av rugende hver med 1,5-2 mL 2% vaske PFA i PBS- / - for 10 min. 3 x med PBS- / -. Ikke Sug opp siste vask og kjøle plater som inneholder coverslips i PBS til farging.
  5. Tilsett 2 mL frisk BMM medium hver brønn på plater for ytterligere tidspunkt og Inkuber på 34 ° C.
  6. Fastsette gjenværende tid-poeng som ønsket som beskrevet i trinn 4.3 og kjøle plater til farging.

5. DAPI flekker og dekkglassvæske montering

  1. Sug opp PBS fra brønner som inneholder coverslips og legge til 1,5 mL PBS- / - med 0,1% ikke-ioniske vaskemiddel. Inkuber i 10 min i romtemperatur, etterfulgt av 3 x vask med 2 mL PBS- / -.
  2. Legg 1 mL PBS- / - med 2 µg/mL DAPI (utvannet fra 5 mg/mL lagerløsning i vann) brønner som inneholder coverslips og Inkuber en annen 1t ved romtemperatur.
    Merk: Inkubasjon tiden med DAPI er avgjørende for riktig visualisering av intracellulær Leishmania parasitter. Macrophage kjerner flekker raskt, på grunn av deres større størrelse og DNA innhold men flekker av kjerner av intracellulære parasitter er tregere. Dermed er utvide inkubasjon tid utover det som kreves for å visualisere BMM kjerner nødvendig for å tillate DAPI å gjennomsyre gjennom og parasitten plasma membranen og parasitten kjernefysiske membranen. Med riktig DAPI flekken, kan mitokondrie kinetoplast DNA nær flagellar lommen av parasitten også bli visualisert, i tillegg til kjernefysiske DNA.
  3. Vask hver godt som inneholder coverslips 3 x 2 mL PBS- / - og deretter løft og vende coverslips med tang siden cellen ned og montere på glass mikroskop lysbilder med en kommersielt tilgjengelig antifade montering reagens.
    Merk: Coverslips er ekstremt skjøre og trenger forsiktig håndtering. Unngå å legge press på dem, særlig mot sideveggen av når du løfter. Legge noen dråper PBS- / - reduserer overflatespenningen mellom dekkglassvæske og godt og forenkler løfte prosessen. En fin gauge nål kan brukes å hjelpe nysgjerrige coverslips fra bunnen av brønnen. Etter å plassere en dekkglassvæske på lysbildet, forsiktig trykk ned med tang til å presse ut eventuelle luftbobler i montering media. Hvis en dekkglassvæske er ødelagt eller har muligens snudd under løfting prosessen, ikke Monter; bare bruk den ekstra fjerde dekkglassvæske.
  4. Kjøleskap lysbilder til kvantifisering.

6. infeksjon kvantifisering

  1. Undersøk DAPI-farget lysbilder under fluorescens mikroskop ved å fokusere på makrofager 100 X linsen med neddyppingsolje (eksitasjon på 358 nm; optimal utslipp på 461 nm).
    Kontroller at fokus er på laget i makrofager mellom objektglass og dekkglassvæske.
  2. Kvantifisere antall makrofager (store kjerner med DAPI) og antall mindre amastigote kjerner gruppert rundt hver macrophage kjernen (se figur 2A, DAPI) for hver synsfelt, bruke en manuell teller.
    Merk: Amastigote kjerner kan ikke alle være synlig i ett plan av fokus på grunn av sin lille størrelse. Teller de som er synlig når fokusert på macrophage kjerner, og bruk deretter finskruen etter parasitten atomkjerner i fly over og under macrophage kjerner.
  3. Flytte til en annen synsfelt gjenta kvantifisering. Bruk en egen teller for å spore antall felt telles. Gå gjennom visuelle felt i parallell rader over hver dekkglassvæske, å forhindre teller overlapping.
  4. Kvantifisere minst 200 makrofager per dekkglassvæske. Kvantifisere hvert tidspunkt for infeksjon i tre eksemplarer (3 coverslips). Telle den fjerde dekkglassvæske hvis en av forrige ikke er egnet for opptelling dekkglassvæske overlapping, dårlig montering, glass brekkasje, etc.
    Merk: Hvis 200 makrofager kan telles på noen en dekkglassvæske, telle overs fjerde.
  5. Beregne infeksjon priser som amastigotes/macrophage eller amastigotes/100 makrofager og bestemme prosent infiserte makrofager fra rå kvantifisering data.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Leishmania har to infeksiøs former - metacyclic promastigotes som skiller fra procyclic promastigotes på den stasjonære fasen av kultur og amastigotes, som er de intracellulære stadiene (figur 1). I enkelte Leishmania arter som L. amazonensis, kan amastigotes også differensieres i axenic kultur av skiftende promastigote cellene for å senke pH (4.5) og høy temperatur (32 ° C), forhold som ligner de i BMM PVs 8 , 34. bare metacyclic promastigote eller amastigote former for Leishmania stand til å indusere dannelsen av PVs og gjenskape intracellulært etter blir oppslukt av verten makrofager35. Udifferensierte Logg-fase promastigotes er ikke-virulente og ikke flytte PV formasjon (figur 2).

Ved infeksjoner med metacyclic promastigotes er det vanligvis en 24-timers forsinkelse før en økning i intracellulær parasitten tall. Dette skjer fordi de metacyclic promastigotes har første til å skille ut amastigotes før de starter replikere. Derfor infeksjoner med metacyclic promastigotes vil ta lengre tid å vise økningen i total intracellulær parasitten tall, og derfor, måtte være ruges i lengre tid poeng.

Figur 2A representerer en vellykket infeksjon med axenically differensiert amastigotes, viser intracellulær lokalisering av Leishmania (i rødt) etter innledende infeksjon (1 h), forkant av PVs av blanding av phagosomes med lysosomer. På 48 h, kan forskjellige store PVs huse flere parasitter observeres. En jevn økning i antall parasitter i PVs er karakteristisk for virulente Leishmania infeksjoner. Non-virulente Logg-fase promastigotes (figur 2B), derimot ikke å starte PV utvikling (48t tidspunkt), mislykkes å gjenskape og til slutt drept inne vert makrofager, selv når tatt opp av det vert makrofager på sammenlignbare tall metacyclic promastigotes eller amastigotes.

For å demonstrere effekten av denne metoden, vi sammenlignet vill-type L. amazonensis med LMIT1/ΔLmit1 parasitter som inneholder én kopi av LMIT1 (Leishmania Mitochondrial jegron T ransporter 1) genet, noe som resulterer i nedskrivning av mitokondrie jern importere13. Tap av en LMIT1 allelet ikke medføre betydelige endringer av mitokondrie aktivitet i LMIT1/ΔLmit1 promastigotes eller redusere avkastningen av renset metacyclic former sammenlignet med vill-type promastigotes13. Renset metacyclic promastigotes fra både vill-type (WT) og LMIT1/ΔLmit1 stasjonære kulturer var like effektive i invaderer BMMs, basert på tilsvarende antall intracellulære parasitter kvantifisert 1t etter smitte ( Figur 3A, 1 h). Etter en første 24 h tidsforsinkelsen, som kreves for metacyclic promastigotes å tilpasse og differensiere i amastigote former, en jevn økning i antall intracellulær vill-type parasitter (ca 3 ganger mellom 24 timer og 72 h klokkeslett poeng) var observert. Derimot ble lite eller ingen intracellulær vekst av LMIT1/ΔLmit1 parasitter (Sammenlign 1 h og 72 h klokkeslett-poeng) observert, antyder at tap av enkelt LMIT1 allelet betydelig påvirker evnen til denne belastning å vokse i makrofager. Episomal uttrykk for LMIT1 proteinet i complemented belastning (LMIT1/ΔLmit1+LMIT1) reddet intracellulær parasitten vekst til vill-type nivåer, bekrefter at LMIT1 er kritisk for amastigote intracellulær replikering og virulens13.

Macrophage infeksjoner utført med axenic amastigotes, generert av skiftende promastigote kulturer (ved pH 7,4; 26 oC) amastigotes vekst forhold (pH 4,5; 32 oC)34,36, viste en intracellulær vekst mønster (figur 3B) samme som observert med metacyclic promastigotes (figur 3A). Etter sammenlignbare nivåer av første opptak (figur 3B, 1 h) vill-type (WT) og LMIT1 kompletteres (LMIT1/ΔLmit1+LMIT1) amastigotes vokste jevnt, mens LMIT1/ΔLmit1 amastigotes igjen kan ikke vise intracellulær vekst. Axenic amastigotes var mer infeksiøs (MOI 1:1 forhold til 1:5 for metacyclic promastigotes), og replikeres mer effektivt innenfor PVs.

Våre data viser en innledende 24-timers forsinkelse for metacyclic promastigote infeksjoner, før det er en økning i intracellulær parasitten nummer (Sammenlign mellom 24 h klokkeslett i figur 3A og 3B). Lag representerer tiden som kreves for internalisert metacyclic promastigotes å først differensiere i amastigotes før du starter å gjenskape. En vanlig feil folk gjør når du bruker metacyclic promastigotes for å infisere, er ikke vente lenge nok. I tilfeller der endringen i virulens ikke er drastisk utført eksperimenter over 96 t snarere enn 72 h produserer mye mer pålitelig bestemmelser.

Figure 1
Figur 1 : Skanning elektron mikroskop-bilde bilder av ulike L. amazonensis livsstadier. Logg-fase promastigote, metacyclic promastigote fra stasjonære-fase og axenic amastigote. Bar = 10 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Et representativt bilde av BMM infeksjon med ondartet axenic amastigotes (A) og ikke-ondartet Logg-fase promastigotes (B) av L. amazonensis. Immunofluorescence bilder av makrofager isolert fra BALB/c mus, 1 h og 48 timer etter infeksjon. Infiserte makrofager ble behandlet for immunofluorescence som beskrevet i protokollen. PV membraner var farget med rotte anti-musen Lamp1 monoklonalt antistoff (1:1, 000 fortynning) 1t, etterfulgt av 1t inkubasjon med anti-kanin fluorescerende IgG (1:500 fortynning). Parasitten flekker ble utført av rugende coverslips med musen polyklonale antistoffer generert mot axenic L. amazonensis amastigotes, etterfulgt av anti-musen IgG rød farge (1:500 fortynning) 6. Alle coverslips ble ytterligere behandlet med DAPI til farging kjerner. (A) dannelsen av forskjellige PVs huse flere amastigotes på 48 timer tidspunkt er karakteristisk for en vellykket Leishmania infeksjon med axenic amastigotes. (B) fravær av forskjellige PV formasjon og replikere amastigotes på 48 timer tidspunkt typisk mangel på virulens i promastigotes fra Logg-fase kultur. Rødt betyr -Leishmania flekker, grønne angir anti-Lamp1, blått angir DAPI-farget DNA og gult angir fletting av anti-Lamp1 og DAPI flekker. Barer, 5µm. Dette tallet er endret fra Mittra, B. et al., 2013. Opprinnelig publisert i J. Exp. Med. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Sletting av en LMIT1 allelet alvorlig hemmer intracellulær veksten av muterte LMIT1/Δlmit1 parasitter. BMM var infisert for angitt tid med L.amazonensis og fast umiddelbart eller ytterligere ruges 24, 48 eller 72 h før de ble løst, beiset med DAPI og antall intracellulære parasitter identifiserte mikroskopisk. (A) BMMs var infisert med renset vill-type (WT), enkelt knockout (LMIT1/Δlmit1) og supplert enkelt knockout (LMIT1/Δlmit1 + LMIT1) metacyclic promastigotes (MOI 1:5) for 3t og fast umiddelbart eller ruges Videre identifiserte for de angitte tidspunkt og antall intracellulære parasitter mikroskopisk. Dataene representerer den gjennomsnittlig ± SD av tre eksemplarer bestemmelser og er representant for resultatene av tre uavhengige eksperimenter. Stjernene angir betydelige forskjeller i infectivity mellom WT og LMIT1/Δlmit1 parasitter (Student tosidige t -test 48t, p = 0.017, 72 h, p = 0.008). (B) Axenic amastigotes fra vill-type (WT), enkelt knockout (LMIT1/Δlmit1) og supplert enkelt knockout (LMIT1/Δlmit1 + LMIT1) kulturer testet for deres evne til å infisere BMMs. BMMs var smittet 1 h (MOI 1:1) og enten fast umiddelbart (1 time) eller etter ytterligere inkubasjon for 24 48 eller 72 h, og antall intracellulære parasitter ble bestemt mikroskopisk. Dataene representerer den gjennomsnittlig ± SD av tre eksemplarer bestemmelser og er mer enn tre uavhengige eksperimenter. P-verdier (Student tosidige t-test) mellom respektive grupper er angitt. Dette tallet er endret fra Mittra, B. et al., 2016. Opprinnelig publisert i PloS Pathog. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kvantitative data produsert av BMM infeksjon analysen beskrevet ovenfor, gjør etterforskere utbredelsen av smitte og pålitelig beslutning av endringer i virulens egenskaper i en relativt kortere tidsperiode (maksimalt 2 uker, sammenlignet med 2 måneder kreves for i vivo eksperimenter). Denne metoden er avhengig av DNA bestemt fargestoff DAPI, som spesielt flekker macrophage og parasitt kjerner, og tillater rask identifikasjon og måling av infiserte celler. Sammenligning binde andre flekker som Giemsa til et stort antall forskjellige cellulære komponenter med varierende intensitet, kompliserer visuell analyse37. Bruk av DAPI tillater anerkjennelse av intracellulære parasitter og deres klart skille fra cellular strukturer (bare atomkjerner av verten cellene er også farget, og størrelsen er flere størrelsesordener større enn parasitten kjerner), slik at enklere og raskere kvantifisering av infeksjoner.

Som med alle eksperimentelle prosedyren, har denne metoden noen begrensninger og flere kritiske trinn som krever forsiktig gjennomføring. I vivo Leishmania infeksjon involverer komplekse medfødte immunologiske respons før fagocytose, som bestemmer ultimate løpet av infeksjon38. Valg av modell musen belastning, derfor er av kritisk betydning i studien design. Både C57BL/6 og BALB/c mus belastning i denne protokollen Bjørn mutasjoner i genet koding naturlige motstand-assosiert macrophage protein (Nramp1), en proton middelklasseinnbyggere pumpe som translocates Fe2 + og Mn2 + ioner fra macrophage lysosomer/phagolysosomes i stoffer. Dette resulterer i økt mottakelighet for patogener som replikeres i endocytic batterirommet makrofager8,30,31. Vellykket kolonisering i makrofager avhenger også infeksiøs Leishmania parasitter unike evnen til å manipulere immunrespons for å undertrykke/overleve macrophage aktivisering39,40. Det differensierte makrofager brukes for Leishmania BMM infeksjoner litt etterligne ingen-aktivert begrunne makrofager i vivo, men analysen ikke høyde for mye mer komplisert sett av verten komponenter som påvirker virulens i dyr modeller.

Isolasjon av sunn infeksiøs Leishmania former er det andre absolutt kritisk behovet for nøyaktig virulens besluttsomhet. Ikke alle promastigotes av alle Leishmania stammer effektivt skille ut amastigotes når de utsettes for lav pH / høy temperatur vilkår41. Derfor er infeksjoner ofte utført med metacyclic promastigotes renset fra stasjonære promastigote kulturer. For å effektivt isolere metacyclic promastigotes, dra noen rensing strategier nytte av skiftende sammensetningen av parasitten overflate glycocalyx under ulike livsstadier, inkludert omfattende endringer av lipophosphoglycan (LPG) strukturen42,43,44. For eksempel er peanut agglutinin (PNA), en Lektiner som binder selektivt procyclic men ikke metacyclic LPG effektivt brukt i negativ utvalg protokoller for å rense L. store metacyclic promastigotes45. Metacyclic promastigote rensing strategi for L. amazonensis innebærer vanligvis et monoklonalt antistoff mAb3A.1 som kan agglutinate procyclic promastigotes ved å målrette bestemte overflaten protein epitopes som er utilgjengelige i metacyclic skjemaer på grunn av overflaten glycocalyx modifikasjoner8,13,32. Bruk av en tetthet gradert media å skille metacyclic promastigotes fra promastigotes basert på scenen-spesifikke forskjeller i høy tetthet er en attraktiv metoden fordi den ikke avhenger av artsspesifikke variasjoner i parasitten overflaten ligander. Denne metoden, først beskrevet for L. store metacyclic promastigote rensing33, adoptert ble for flere andre Leishmania arter hovedsakelig gjennom endringer sentrifugering betingelsene under tetthet-gradient sedimentering46,47,48,49.

Det er også viktig å være oppmerksom på problemer som kan komplisere implementering av analysen, som kan oppstå på flere trinn i prosessen. Disse problemene kan omfatte forurensning under BMM utvinning, mislykket differensiering av BMMs etter ekstraksjon, inkonsekvent macrophage plating, ufullstendig rensing av infeksiøs parasitten skjemaer, dårlig eller inkonsekvent infeksjon, og vanskeligheter montering glass coverslips på objektglass. Disse mulighetene har blitt rettet i protokollen, og kan løses ved å nøye vurdere hvert trinn i prosedyren for infeksjon å identifisere problemet. For eksempel kan forurensning av BMM kulturer under differensiering prosessen indikere behov for forbedret steril teknikk under utvinning. Oppmerksomheten til renhet og friskhet av rensing reagenser og nøyaktig gjennomføring av rensing protokollen kan utbedre mislykkede eller ufullstendige rensing av skjemaene ønsket parasitten. Dårlig eller inkonsekvent infeksjoner kan være forårsaket av unøyaktig kvantifisering av parasitter eller en MOI som er for høy eller for lav for bestemte eksperimentelle forhold. Etter utvinning, manipulere og montere glass coverslips er uten tvil den mest teknisk utfordrende prosessen i denne teknikken; personer kan finne de foretrekker å bruke ulike verktøy for å forenkle håndteringen av coverslips. Tydelig visualisering av DAPI farget kjerner er avgjørende for nøyaktig parasitten teller under mikroskopet. Svake flekker og feil fokusering er to hovedavdeling gjerningsmannen bak inkonsekvent kvantifisering. Dette kan sikres ved kvalitetskontroll av DAPI flekker trinn, begrense lyseksponering gang å redusere Foto-bleking og raskt skiftende objektive fokus til alle parasitten kjerner i feltet. DAPI fluorescens lysstyrke kan også forbedres ved riktig permeabilization prøvene med vaskemiddel, og øker konsentrasjonen av DAPI under fargingen. En alternativ tilnærming som kan forenkle kvantifisering prosessen er å skaffe digitale bilder av prøvene under mikroskopisk undersøkelse. Bildene kan brukes for kvantifisering senere og kan være bekreftet/kvantifisert av uavhengige etterforskere. Det er imidlertid tekniske problemer forbundet med denne prosessen som krever nøye overveielse. På grunn av sfæriske natur PV er parasitter ikke alltid på samme fokalplanet. Dette nødvendiggjør at flere bilder anskaffes ved hjelp av ulike fokal plan for hvert mikroskopiske felt, og deretter samlet sammen kontoen for alle parasitter. Ellers kan kvantifisering fra fotografier være svært misvisende. Beregninger av makrofager/feltet og amastigotes/feltet er avgjørende for å sikre konsekvent macrophage plating og spre parasittene ble oppnådd under infeksjon. Siden BMMs er fullt differensierte celler, bør deres ikke øke over tid. Hvis antall vert makrofager øker over tid, betyr det at makrofager var fremdeles umoden. I dette tilfellet bør kilden og konsentrasjonen av M-CSF sjekkes. Fastsettelse av prosent infiserte makrofager kan også være nyttig for å gi en omfattende visning av verten celle-patogen interaksjon, spesielt i tilfeller der prosent infeksjon og parasitt belastningen ikke følger lignende trender20,21 .

Metoden i vitro BMM infeksjon finnesher kan endres etter behov eksperimentelle. Endringer kan gjøres til noen av de grunnleggende trinnene i prosessen - BMM utvinning og differensiering, rensing av infeksiøs parasitten skjemaer og kvantifisering av i vitro macrophage infeksjoner, samt gjennomføring infeksjoner med forskjellige MOIs og justere infeksjon og tidspunkt analysert. Kultur mediekomponenter kan også enkelt endres via kosttilskudd eller uttømming av spesifikke næringsstoffer, og flere ulike stammer eller former for parasitter kan vurderes samtidig. Disse endringene kan kreve ytterligere justering av teknisk prosedyrer; for eksempel forventes prosedyrer for amastigote utarbeidelse og metacyclic promastigote rensing å variere mellom ulike Leishmania arter. Ekstra fluorescerende fargestoffer foruten DAPI, eller fluorescently merket cellulære komponenter kan brukes til å visualisere et omfattende utvalg av verts-parasitten samhandling prosesser6,24. Dessuten, denne analysen kan være tilpasset til en høy gjennomstrømming systemer (HTS) format, som ville tillate rask screening av sammensatte biblioteker å identifisere nye og effektiv narkotika leder for behandling av leishmaniasis24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer de har ingen konkurrerende økonomiske interesser,

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health grant RO1 AI067979 til NWA.
Novotel er mottaker av undervisning fellesskap fra Howard Hughes Medical Institute/Universitetet i Maryland College Park.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6 well cell culture plate Cellstar 657160
Adenine Acros Organics AC147440250
Aerosol Barrier Pipet Tips (100-1000 μL) Fisherbrand 02-707-404
Aerosol Barrier Pipet Tips (20-200 μL) Fisherbrand 02-707-430
Aerosol Barrier Pipet Tips (2-20 μL) Fisherbrand 02-707-432
Bard-Parker Rib-Back Carbon Steel Surgical Blade #10 Aspen Surgical 371110
BD Luer-Lok Tip 10 mL Syringe Becton Dickinson (BD) 309604
BD Precisionglide Needle, 25G  Becton Dickinson (BD) 305124
Cell Culture Dish 35 mm x 10 mm Cellstar 627 160
Cell Culture Flask Cellstar 660175
Cover Glasses: 12 mm circles Fisherbrand 12-545-80
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Invitrogen D1306
D-Biotin J.T. Baker C272-00
EDTA Sigma Aldrich EDS
Ethyl alcohol 200 proof Pharmco-AAPER 111000200
Falcon 100 mm x 15 mm non-TC-treated polystyrene Petri dish Corning 351029
Fetal Bovine Serum Seradigm 1500-500
Ficoll400 Sigma Aldrich F8016
Fluorescence Microscope Nikon E200
Goat anti-mouse IgG Texas red Invitrogen T-862
Goat anti-rabbit IgG AlexaFluor488 Invitrogen A-11034
Hemin Tokyo Chemical Industry Co. LTD H0008
HEPES (1M) Gibco 15630-080
Isoton II Diluent Beckman Coulter 8546719
L-Glutamine Gemini 400-106
Medium 199 (10X) Gibco 11825-015
Na pyruvate (100 mM) Gibco 11360-070
Paraformaldehyde Alfa Aesar 43368
Penicillin/Streptomycin Gemini 400-109
Phosphate Buffered Saline (-/-) ThermoFisher 14200166
Polypropyline conical Centrifuge Tubes 15 mL Cellstar 188 271
Polypropyline conical Centrifuge Tubes 50 mL Cellstar 227 261
ProLong Gold antifade reagent ThermoFisher P36930
Rat anti-mouse Lamp-1 antibody Developmental Studies Hybridoma Bank 1D4B
Recombinant Human M-CSF PeproTech 300-25
Reichert Bright-Line  Hemocytometer  Hausser Scientific 1492
RPMI Medium 1640 (1X) Gibco 11875-093
Triton X-100 Surfactant Millipore Sigma TX1568-1
Trypan Blue Sigma Aldrich T8154
Delicate Scissors, 4 1/2" VWR 82027-582
Dissecting Forceps, Fine Tip VWR 82027-386
Microscope Slides VWR 16004-368
Z1 Coulter Particle Counter, Dual Threshold Beckman Coulter 6605699

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. WHO. Control of the leishmaniases. World Health Organ Tech Rep Ser. (949), (2010).
  2. Naderer, T., McConville, M. J. Intracellular growth and pathogenesis of Leishmania parasites. Essays Biochem. 51, 81-95 (2011).
  3. Rosenzweig, D., et al. Retooling Leishmania metabolism: from sand fly gut to human macrophage. FASEB J. 22 (2), 590-602 (2008).
  4. Lahav, T., et al. Multiple levels of gene regulation mediate differentiation of the intracellular pathogen Leishmania. The FASEB Journal. 25 (2), 515-525 (2011).
  5. Saunders, E. C., et al. Induction of a stringent metabolic response in intracellular stages of Leishmania mexicana leads to increased dependence on mitochondrial metabolism. PLoS Pathog. 10 (1), e1003888 (2014).
  6. Mittra, B., et al. Iron uptake controls the generation of Leishmania infective forms through regulation of ROS levels. J Exp Med. 210 (2), 401-416 (2013).
  7. Kloehn, J., et al. Using metabolomics to dissect host-parasite interactions. Curr Opin Microbiol. 32, 59-65 (2016).
  8. Huynh, C., Sacks, D. L., Andrews, N. W. A Leishmania amazonensis ZIP family iron transporter is essential for parasite replication within macrophage phagolysosomes. J Exp Med. 203 (10), 2363-2375 (2006).
  9. Flannery, A. R., Huynh, C., Mittra, B., Mortara, R. A., Andrews, N. W. LFR1 Ferric Iron Reductase of Leishmania amazonensis Is Essential for the Generation of Infective Parasite Forms. J Biol Chem. 286 (26), 23266-23279 (2011).
  10. Miguel, D. C., Flannery, A. R., Mittra, B., Andrews, N. W. Heme uptake mediated by LHR1 is essential for Leishmania amazonensis virulence. Infect Immun. 81 (10), 3620-3626 (2013).
  11. Cortez, M., et al. Leishmania Promotes Its Own Virulence by Inducing Expression of the Host Immune Inhibitory Ligand CD200. Cell Host Microbe. 9 (6), 463-471 (2011).
  12. Mittra, B., Andrews, N. W. IRONy OF FATE: role of iron-mediated ROS in Leishmania differentiation. Trends Parasitol. 29 (10), 489-496 (2013).
  13. Mittra, B., et al. A Trypanosomatid Iron Transporter that Regulates Mitochondrial Function Is Required for Leishmania amazonensis Virulence. PLoS Pathog. 12 (1), e1005340 (2016).
  14. Ben-Othman, R., et al. Leishmania-mediated inhibition of iron export promotes parasite replication in macrophages. PLoS Pathog. 10 (1), e1003901 (2014).
  15. Renberg, R. L., et al. The Heme Transport Capacity of LHR1 Determines the Extent of Virulence in Leishmania amazonensis. PLoS Negl Trop Dis. 9 (5), e0003804 (2015).
  16. McConville, M. J. Metabolic Crosstalk between Leishmania and the Macrophage Host. Trends Parasitol. 32 (9), 666-668 (2016).
  17. Carrera, L., et al. Leishmania promastigotes selectively inhibit interleukin 12 induction in bone marrow-derived macrophages from susceptible and resistant mice. J Exp Med. 183 (2), 515-526 (1996).
  18. Hsiao, C. H., et al. The effects of macrophage source on the mechanism of phagocytosis and intracellular survival of Leishmania. Microbes Infect. 13 (12-13), 1033-1044 (2011).
  19. Murray, A. S., Lynn, M. A., McMaster, W. R. The Leishmania mexicana A600 genes are functionally required for amastigote replication. Mol Biochem Parasitol. 172 (2), 80-89 (2010).
  20. Farias Luz, N., et al. RIPK1 and PGAM5 Control Leishmania Replication through Distinct Mechanisms. J Immunol. 196 (12), 5056-5063 (2016).
  21. Franco, L. H., et al. Autophagy downstream of endosomal Toll-like receptor signaling in macrophages is a key mechanism for resistance to Leishmania major infection. J Biol Chem. 292 (32), 13087-13096 (2017).
  22. da Silva, M. F., Zampieri, R. A., Muxel, S. M., Beverley, S. M., Floeter-Winter, L. M. Leishmania amazonensis arginase compartmentalization in the glycosome is important for parasite infectivity. PLoS One. 7 (3), e34022 (2012).
  23. Carneiro, P. P., et al. The Role of Nitric Oxide and Reactive Oxygen Species in the Killing of Leishmania braziliensis by Monocytes from Patients with Cutaneous Leishmaniasis. PLoS One. 11 (2), e0148084 (2016).
  24. Siqueira-Neto, J. L., et al. An image-based high-content screening assay for compounds targeting intracellular Leishmania donovani amastigotes in human macrophages. PLoS Negl Trop Dis. 6 (6), e1671 (2012).
  25. Pastor, J., et al. Combinations of ascaridole, carvacrol, and caryophyllene oxide against Leishmania. Acta Trop. 145, 31-38 (2015).
  26. Giarola, N. L., et al. Leishmania amazonensis: Increase in ecto-ATPase activity and parasite burden of vinblastine-resistant protozoa. Exp Parasitol. 146, 25-33 (2014).
  27. Sacks, D. L., Melby, P. C. Animal models for the analysis of immune responses to leishmaniasis. Curr Protoc Immunol. , Chapter 19 Unit 19 12 (2001).
  28. Tabbara, K. S., et al. Conditions influencing the efficacy of vaccination with live organisms against Leishmania major infection. Infect Immun. 73 (8), 4714-4722 (2005).
  29. Price, J. V., Vance, R. E. The macrophage paradox. Immunity. 41 (5), 685-693 (2014).
  30. Huynh, C., Andrews, N. W. Iron acquisition within host cells and the pathogenicity of Leishmania. Cell Microbiol. 10 (2), 293-300 (2008).
  31. Blackwell, J. M., et al. SLC11A1 (formerly NRAMP1) and disease resistance. Cell Microbiol. 3 (12), 773-784 (2001).
  32. Pinto-da-Silva, L. H., et al. The 3A1-La monoclonal antibody reveals key features of Leishmania (L) amazonensis metacyclic promastigotes and inhibits procyclics attachment to the sand fly midgut. Int J Parasitol. 35 (7), 757-764 (2005).
  33. Spath, G. F., Beverley, S. M. A lipophosphoglycan-independent method for isolation of infective Leishmania metacyclic promastigotes by density gradient centrifugation. Exp Parasitol. 99 (2), 97-103 (2001).
  34. Zilberstein, D., Shapira, M. The role of pH and temperature in the development of Leishmania parasites. Annu Rev Microbiol. 48, 449-470 (1994).
  35. Bates, P. A. Transmission of Leishmania metacyclic promastigotes by phlebotomine sand flies. Int J Parasitol. 37 (10), 1097-1106 (2007).
  36. Bates, P. A., Robertson, C. D., Tetley, L., Coombs, G. H. Axenic cultivation and characterization of Leishmania mexicana amastigote-like forms. Parasitology. 105 (Pt 2), 193-202 (1992).
  37. Frickmann, H., et al. Rapid identification of Leishmania spp. in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue samples by fluorescence in situ hybridization. Trop Med Int Health. 17 (9), 1117-1126 (2012).
  38. Seguin, O., Descoteaux, A. Leishmania, the phagosome, and host responses: The journey of a parasite. Cell Immunol. 309, 1-6 (2016).
  39. Wanderley, J. L., Thorpe, P. E., Barcinski, M. A., Soong, L. Phosphatidylserine exposure on the surface of Leishmania amazonensis amastigotes modulates in vivo infection and dendritic cell function. Parasite Immunol. 35 (3-4), 109-119 (2013).
  40. Crauwels, P., et al. Apoptotic-like Leishmania exploit the host's autophagy machinery to reduce T-cell-mediated parasite elimination. Autophagy. 11 (2), 285-297 (2015).
  41. Bringmann, G., et al. A novel Leishmania major amastigote assay in 96-well format for rapid drug screening and its use for discovery and evaluation of a new class of leishmanicidal quinolinium salts. Antimicrob Agents Chemother. 57 (7), 3003-3011 (2013).
  42. Sacks, D. L., Brodin, T. N., Turco, S. J. Developmental modification of the lipophosphoglycan from Leishmania major promastigotes during metacyclogenesis. Mol Biochem Parasitol. 42 (2), 225-233 (1990).
  43. Sacks, D. L. Leishmania-sand fly interactions controlling species-specific vector competence. Cell Microbiol. 3 (4), 189-196 (2001).
  44. McConville, M. J., Turco, S. J., Ferguson, M. A., Sacks, D. L. Developmental modification of lipophosphoglycan during the differentiation of Leishmania major promastigotes to an infectious stage. EMBO J. 11 (10), 3593-3600 (1992).
  45. Sacks, D. L., Hieny, S., Sher, A. Identification of cell surface carbohydrate and antigenic changes between noninfective and infective developmental stages of Leishmania major promastigotes. J Immunol. 135 (1), 564-569 (1985).
  46. Yao, C., Chen, Y., Sudan, B., Donelson, J. E., Wilson, M. E. Leishmania chagasi: homogenous metacyclic promastigotes isolated by buoyant density are highly virulent in a mouse model. Exp Parasitol. 118 (1), 129-133 (2008).
  47. Almeida Marques-da-Silva, E., et al. Extracellular nucleotide metabolism in Leishmania: influence of adenosine in the establishment of infection. Microbes Infect. 10 (8), 850-857 (2008).
  48. Moreira, D., et al. Impact of continuous axenic cultivation in Leishmania infantum virulence. PLoS Negl Trop Dis. 6 (1), e1469 (2012).
  49. Svensjo, E., et al. Interplay between parasite cysteine proteases and the host kinin system modulates microvascular leakage and macrophage infection by promastigotes of the Leishmania donovani complex. Microbes Infect. 8 (1), 206-220 (2006).

Tags

Immunologi og infeksjon problemet 133 Leishmania virulens macrophage intracellulær replikering parasitophorous vacuole
Kvantifisering av intracellulær vekst i makrofager er en rask og pålitelig metode for å vurdere virulens av <em>Leishmania</em> parasitter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sarkar, A., Khan, Y. A.,More

Sarkar, A., Khan, Y. A., Laranjeira-Silva, M. F., Andrews, N. W., Mittra, B. Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites. J. Vis. Exp. (133), e57486, doi:10.3791/57486 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter