Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Hızlı ve güvenilir yöntem LEISHMANIA parazit virülans değerlendirmek için hücre içi büyüme makrofajlar içinde miktar olduğunu

Published: March 16, 2018 doi: 10.3791/57486

Summary

Bütün patojenik LEISHMANIA türler bulunur ve omurgalı onların ana makrofajlar içinde çoğaltmak. Burada, fare kemik iliği türevi makrofajlar kültür ile hücre içi büyüme Kinetik kesin miktar tarafından takip LEISHMANIA, bulaştırmak için bir protokol mevcut. Ana bilgisayar-patojen etkileşim ve LEISHMANIA virülans etkileyen bireysel faktörler eğitim için yararlı bir yöntemdir.

Abstract

LEISHMANIA, hastalığının leishmaniasis, yaşam döngüsü içinde böcek promastigote ve amastigote aşamaları ile omurgalı ana bilgisayarları arasında sırasıyla geçiş yapar. Patojenik leishmaniasis belirtileri çok, son derece ölümcül visseral hastalık formlara infektif tür bağlı olarak benign Kutanöz lezyonlarin üzerinden değişebilir iken tüm LEISHMANIA tür omurgalı aşaması sırasında ana bilgisayar makrofajlar içinde bulunan onların yaşam döngüsü. LEISHMANIA infektivite bu nedenle işgal, hayatta kalmak ve makrofajlar içinde parasitophorous boşluklar (PVs) içinde çoğaltmak için onun yetenek için doğrudan ilgilidir. Böylece, asıl olayın asalağın intracellularly çoğaltmak yeteneği değerlendirmek virülans belirlemek için güvenilir bir yöntem olarak hizmet vermektedir. Hayvan modelleri kullanarak leishmaniasis geliştirme eğitim zaman alıcı, sıkıcı ve çoğu zaman zor, özellikle pathogenically önemli visseral formlarla. Biz burada makrofajlar (BMMs) kemik iliği elde edilen hücre içi LEISHMANIA gelişiminde izlemek için bir metodoloji açıklayın. İntrasellüler parazit numaraları, 72-96 h enfeksiyonu takip için 24 saat aralıklarla belirlenir. Bu yöntem güvenilir bir tayin edilmesi LEISHMANIA virülans çeşitli genetik faktörlerin etkilerini tanır. Örnek olarak, biz nasıl bozar tek gen silme LEISHMANIA mitokondrial demir taşıyıcı gen (LMIT1) LEISHMANIA amazonensis mutant suşu LMIT1/ΔLmit1 yetenek BMMs içinde büyümeye göstermek, sert bir düşüş vahşi-türüne göre virülans yansıtan. Bu tahlil de ayrı ayrı ana bilgisayar-patojen etkileşim çeşitli faktörler (besin, Reaktif oksijen türleri, vb) etkisi analiz etmek için manipüle edilebilir deneysel koşullar hassas kontrol sağlar. Bu nedenle, uygun yürütme ve miktar BMM enfeksiyon çalışmaların geleneksel hayvan modeli çalışmaları için non-invaziv, hızlı, ekonomik, güvenli ve güvenilir bir alternatif sağlar.

Introduction

Leishmaniasis insan hastalıkları protozoon parazit türü LEISHMANIAtarafından neden olduğu geniş bir yelpazede anlamına gelir. Yaklaşık 12 milyon kişi şu anda LEISHMANIA ile dünya çapında bulaşmış ve 350 milyondan fazla risk altındadır. Hastalık patoloji LEISHMANIA türler ve ana faktöre bağlıdır ve belirtiler zararsız kendi kendini iyileştirme deri lezyonları ölümcül visceralizing formları için değişir. Tedavi edilmezse, viseral leishmaniasis ölümcül ise, en ölümcül insan hastalık olarak sıtma sonra sıralama neden olduğu enfeksiyon protozoon parazit1. Hastalık patoloji ve belirtiler geniş kapsamlı görüş farklılıklarına rağmen tüm LEISHMANIA tür bir digenic sırasıyla promastigote ve amastigote aşamaları içinde böcek ve omurgalı ana bilgisayarlar arasında değişen ömrü var. İç omurgalılar, LEISHMANIA ana bilgisayar makrofajlar işgali için hedef ve parasitophorous boşluklar (PVs), nerede son derece öldürücü amastigote formları çoğaltmak asidik bölmeleri ile phagolysosomes özelliklerini oluşumu teşvik. Amastigotes ana bilgisayar dokularda kronik enfeksiyonlar sırasında kalıcı ve bulaşmamış olduğu için ileri sandflies, iletim döngüsü tamamlanıyor geçirilebilir. Bu nedenle, insan hastalığı geliştirme bağlamında, amastigotes en önemli LEISHMANIA yaşam döngüsü formu2vardır. Nasıl amastigotes içinde makrofaj PVs çoğaltmak araştıran ve anlayış LEISHMANIA virülans3,4,5,6,7 için kritik roman etkili tedaviler geliştirilmesi.

Biz burada düzenli olarak LEISHMANIA enfeksiyon ve hücre içi LEISHMANIA sayısı kantitatif değerlendirilmesi zamanla içeren makrofajlar (BMMs), kemik iliği türevi çoğaltmasında çalışmaya bizim laboratuvar tarafından kullanılan bir yöntem açıklanmaktadır. Fare kemik iliği ve farklılaşma monosit kültür makrofajlar, vitro enfeksiyon infektif formları (metacyclic promastigotes veya amastigotes) ile LEISHMANIA ve miktar, hasat işlemi içerir 72-96 h enfeksiyon sonrasında bir süre için her 24 saat aralıklarla intrasellüler parazit sayısı. Bu tahlil çeşitli çevresel faktörler ve parazit genler daha da footpad tarafından doğrulandı L. amazonensis virülans teşvik demir kritik rol kimliği de dahil olmak üzere, etkisini belirlemek için bizim laboratuvar olarak kullanılmıştır lezyon belirleme çalışmaları, fareler6,8,9,10,11,12,13,-14,15 . Bütün patojenik LEISHMANIA türlerin ana bilgisayar makrofajlar içinde ikileştirici onların niş kurmak, bu tahlil evrensel olarak tüm LEISHMANIA türlerin virülans tespitler için kullanılabilir.

BMM enfeksiyonlar yapmadan tek hücre düzeyinde ana bilgisayar-parazit etkileşimlerin analizi ve böylece nasıl LEISHMANIA parazitler makrofajlar PVs onların tercih edilen ana microenvironment ile etkileşim daha kapsamlı bir anlayış olanağı sağlar. Makrofaj enfeksiyon deneyleri başarılı bir şekilde birden çok grupları16,17,18,19,20,21,22 tarafından keşfetmek için kullanılmıştır işlevleri hem ana bilgisayar makrofaj ve LEISHMANIA belirli genler ve hücre içi enfeksiyon karakterize karmaşık etkileşim potansiyel onların katılımı. Miktar microbicidal nitrik oksit üretimi, Reaktif oksijen türleri nesil ve diğer olumsuz koşullar gibi hücre içi hayatta kalma etkileyen ana faktörler etkisinin bir okuma olarak parazit büyümenin BMM enfeksiyonlar izin içinde lysosome benzeri PVs23karşılaştı. Makrofaj enfeksiyon deneyleri de potansiyel anti-leishmanial uyuşturucu müşteri adayları terapötik geliştirme13,24tanımlamak için kullanılmıştır.

Vitro doğa BMM enfeksiyonların LEISHMANIA virülans değerlendirmek için diğer yöntemleri çeşitli avantajlar sağlar. Ancak, zamanla intrasellüler parazit kurtulma mekanizmaları incelerken birkaç önceki çalışmalarda enfeksiyon oranı20,21,24olarak ölçmek değil. Ayrıca, birçok çalışma zamanla vivo içinde enfeksiyonları takip duruldu kutanöz bir lezyon boyutu ve parazit çoğaltma25,-26 yalnızca dolaylı olarak ilgili diğer fizyolojik belirtiler ölçerek yaptım , 27. vivo içinde enfeksiyon parazit virülans değerlendirmek için sıkı bir yaklaşım olmakla birlikte, lezyon boyut ölçüleri footpad yalnız şişme tabanlı çoğu zaman yetersiz, enfekte dokularda inflamatuar yanıt yansıttıkları gibi değil parazitler mutlak sayısı. Bu nedenle, footpad lezyon geliştirme deneyleri, enfekte dokular, parazit seferdeki miktar tarafından takip edilmesi gerek uzun sınırlayıcı seyreltme gerektiren yordamı28deneyleri. Ayrıca, in vivo genellikle farklı noktalarda birden fazla hayvan dokuları faiz6,8,9,10, ayıklamak için zamanında ödün dahil çalışmaları 11 , 13. buna ek olarak, çok sayıda BMMs bir hayvandan elde edilebilir ve bu hücreler enfeksiyonu değerlendirilmesi çeşitli noktalarda zamanında izin koşullar altında kaplama. Ayrıca, in vivo çalışmalar için karşılaştırıldığında, vitro BMM enfeksiyonlar yapmadan deneysel koşullar üzerinde daha fazla denetim olanağı sağlar. Parazitler kendileri ile birlikte bulaşması için makrofajlar miktarının çokluğu enfeksiyon (MOI) ve kültür koşullardan hassas kontrol sağlar. Bu faktörler üzerinde daha iyi denetim anahtar içinde ayrı hücresel yollar özelliklerinin belirlenmesi ve enfeksiyon sahası üzerindeki etkilerini anlamak olabilir.

Bu avantajları göz önüne alındığında, çok az sayıda gruplar LEISHMANIA virülans eğitim defa makrofajlar hücre içi çoğaltma kantitatif değerlendirilmesi tüm avantajlarından almış biraz şaşırtıcıdır. Bu makalede, biz bu tahlil daha kapsamlı kullanımını engelleyici, ve onun düzgün şekilde uygulanmasını kolaylaştırmak için adım adım bir protokol sağlar ortak tuzaklar tartışıyorlar. Onun hassas ve çok yönlülük göz önüne alındığında, biz burada tarif BMM enfeksiyon tahlil, yalnızca ana bilgisayar-patojen etkileşimleri LEISHMANIA virülans etkileyen keşfetmek için aynı zamanda içinde çoğaltma diğer mikroorganizmalar çalışmaya yararlı olabilir değil makrofajlar29. Önemlisi, bu tahlil anti-leishmanial ilaç geliştirme için hızlı ve ekonomik önceden klinik tarama yöntemi olarak da geliştirilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm deneysel yordamlar bakım ve laboratuvar hayvanları Kullanım Kılavuzu'nda bulunan öneriler doğrultusunda Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından yapılmıştır ve University of Maryland'ın IACUC tarafından kabul edildi. 1-4 arası bölümlerde açıklanan tüm adımları aseptik biyolojik Laminer akış kabinleri içinde yapılmalıdır. Kişisel koruma kullanılması gerektiğini ve her deneme aşaması boyunca canlı LEISHMANIA parazitler işlenmesi sırasında dikkat edilmelidir.

1. izolasyon ve kemik iliği türevi makrofajlar (BMMs)8,30,31 farklılaşma

  1. Gün 0: 4 - 6-hafta-yaşlı kadın C57BL/6 veya BALB/c fare CO2 odasında kurban ve ölüm servikal yerinden çıkması ile onaylayın. Sterilizasyon makas ve forseps onları % 70 etanol batırılmış tutarak emin olun. Eldiven steril kemik iliği hücre izolasyon süreci boyunca işleme izin vermek için % 70 etanol ile sprey.
  2. Onun forelimbs iğneleyerek diseksiyon kuruluna kurban fare güvenli ve bol % 70 etanol ile püskürtülerek dezenfekte.
  3. Kalça eklemi yakınındaki makas ile küçük bir insizyon attım (yaklaşık 1 cm) olun. Dikkatle makas temel kas ayrı ve Kalça eklemi çevresindeki tüm yol deriyi kesme deri altına yerleştirin.
    Not: Diseksiyon kurulu Kalça eklemi geliştirilmiş erişmesine izin vermek için döndürülmüş.
  4. Dikkatli bir şekilde bacak deri ayak bileği doğru çekerek derisini soymak ve kaldırın. Veya ayak bileği altında tibia tam olduğu gibi bırakma ortak kesmek çok dikkatli olmanın ayak bileği, ayak kesilmiş.
    Not: Bu aşamada fibula gevşek bağlı olduğu ve Forseps ile kolayca ayrılabilir.
  5. El ile Kalça eklemi döndürme noktası tanımlamak için uyluk manipüle ederek bulun. Dikkatle makas proksimal femur başında olduğu gibi bırakma ve Kalça eklemi yukarıda bacak sever için kullanın.
  6. Mümkün olduğu kadar çok kas ve bağ dokusu bacak makasla kaldırın. Ayak bileği ve herhangi bir aşırı kemik malzeme ve Kalça eklemi yukarıda kalan herhangi bir cilt kaldırın.
  7. Temizlenmiş bacak kemikleri steril RPMI penisilin/streptomisin (%1 son konsantrasyonu) içinde bir petri buz ile takıma yerleştirin.
  8. 1.4 1.6 tibia ve uyluk arka diğer bacak dan izole etmek için aracılığıyla adımları yineleyin.
  9. Kalan kas ve bağ dokusu RPMI sterilize forseps ve steril #10 bıçak kullanarak iliklerine kemik kaldırın.
  10. Kemikler Petri kabına kapağını yerleştirin. Tibia dikkatle iliği erişmek için hemen ayak bileği eklemi yukarıda bıçak ile kesin. Tibia bacak kalan kısmından hemen altında diz eklemi keserek çıkarın.
  11. 10 mL steril RPMI 10 mL şırınga penisilin/streptomisin (%1 son konsantrasyonu) ile desteklenmiş ve 25 G iğne takmak çizin.
  12. Tibia sıkıca Forseps ile dikey olarak 50 mL konik tüp buz üzerinde tutun. Şırıngayı yavaşça yaklaşık 5 mL RPMI konik tüp içine diğer ucunu kemik iliğini temizlemek için kemik sonu içine enjekte etmek için kullanın. Beyaz kemik yaşına gelene kadar 10 mL RPMI sayısı ile kemik iliği sifonu çek.
    Not: ayrıntılı kızarma sonra kemik beyaz açmalısınız. Değilse, iliği kaldırmak için temizlemeye devam edin. Distal tibia sonuna iğne eklemek için çok dar ise geri bıçakla kesilmiş olabilir gerekir.
  13. Uyluk kemiği hemen diz eklemi üzerinde ve hemen altında her iki ucunda da kemik iliği erişmek için ortaya çıkarmak için Kalça eklemi kesti. Kemik iliği uyluk 10 mL RPMI tibia olarak aynı şekilde toplam üzerinden sifonu çek.
  14. Temizlik ve adımları 1.6 1,13 kalan kemikleri aracılığıyla kızarma yineleyin ve bir tek 50 mL konik tüp temizlenen kemik iliği hücrelerinde toplamak
    Not: bir kemik kemik kızarma önce diseksiyon sırasında herhangi bir noktada kırılırsa, bu kemik iliği kullanmayın.
  15. Santrifüj kemik iliği toplamak için kullanılan konik tüp 300 x g de 4 ° C'de 10 dakika için tüm dört kemik üzerinden atıp sifonu çektim.
  16. 60 mL steril BMM orta yerleştirin (RPMI % 20 son bir konsantrasyon ile FBS, % 1 penisilin/streptomisin, 1,2 mM Na-pyruvate, 25 µg/mL insan M-CSF) filtre kapağı ile 175 cm2 hücre kültür şişesi içine.
  17. Süpernatant aşağıdaki Santrifüjü atın ve hücre Pelet hafif yukarı ve aşağı BMM orta 5 mL balonun kullanarak pipetting tarafından resuspend.
  18. Hücre süspansiyon kültür şişeye aktarmak ve BMM orta ile iki kez konik tüp maksimal hücre kurtarma sağlamak için kültür balonun durulayın. Hücre süspansiyon orta iyice karıştırılır emin olun ve bir ikinci 175 cm2 hücre kültür şişesi filtre kapağı ile ilk 175 cm2 hücre kültür balonun üzerinden 30 mL dağıtmak.
  19. Her gece 37 ° c, % 5 CO2 herhangi bir bulaşıcı fibroblastlar, ikamet makrofajlar ve diğer yapışık hücreleri ayrılması izin vermek için 30 mL hücre süspansiyon içeren her iki şişe kuluçkaya.
  20. 1. gün: Farklılaşmamış kemik iliği hücrelerinden şişeler 100 mm x 15 mm TC tedavi polistren Petri yemekler yaklaşık 10 mL içeren süpernatant transfer/çanağı ve 37 ° C, % 5 CO2. kuluçkaya Şişeler atmak.
  21. Günde 3 ya da 4: (37 ° C için önceden ısındı) bir ek 5 mL BMM orta her Petri kabına ekleyin ve kuluçka 37 ° C, % 5 CO2devam edin.

2. kaplama BMMs üzerinde Coverslips enfeksiyonu (7 veya 8 gün)

  1. 6-iyi doku kültürü plakaları dört (4) steril 12 mm cam coverslips (autoclaved ve bir kapalı cam kap içinde saklı) her boş dibinde de koyarak hazırlamak.
    Not: her steril 12 mm coverslip bir vakum hattına monte alıyorum bir ipucu ile al. Coverslips vakum böldüğüm için tüp pinching tarafından istenen konumda bırakmadan örtüşme olmadan kuyu içine koyun.
  2. Petri yemekler yapisan kemik iliği aspiratı ile kaplı aspiratı medya (ve herhangi bir yapışık olmayan hücreleri) makrofajlar elde ve yavaşça durulama yapışık hücreleri 2 x ile steril Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz olmadan önceden ısınmış kalsiyum ve magnezyum klorür (PBS- /) 37 ° C'ye
  3. Dropwise, 5 mL steril 1 x PBS- / - 1 mM EDTA her Petri kabına için son bir konsantrasyon ile ekleyin ve 37 ° C'de yapışık BMMs. doğrula hücreleri bir mikroskop kullanarak ayrılır ayırmak için 5 min için kuluçkaya.
  4. 1 x PBS- / - 50 mL konik tüp içinde 1 mM EDTA ile takıma içinde tüm müstakil hücreleri toplamak. Durulama her 2 x 5 mL- / - PBS ile çanak ve hücre süspansiyon havuzuna ekleme.
    Not: Hücre süspansiyon seyreltilmiş ek PBS ile- / - makrofajlar EDTA toksisite toplama işlemi sırasında korumak için.
  5. 4 ° C'de 10 dakika için 300 x g, santrifüj Süpernatant atın ve makrofajlar tarafından pipetting 5-10 mL BMM ortamda resuspend. Yer hücreleri tüpler ve topaklanma eki önlemek için buz üzerinde resuspended.
  6. Hücrelerin içinde hemasitometre Trypan mavi dışlama kullanarak say.
    Not: 5 mL ortamda resuspended BMM hücreleri saymak için 25 µL hücre süspansiyon 445 µL PBS- / - ve 30 µL % 0,4 Trypan mavi çözüm karışımı seyreltme genellikle kolay miktar (son hesaplama için bir 20 x seyreltme faktörü dikkate alarak bir hemasitometre verir ). Bu Trypan ile mavi (hücrelerin) değil hücreleri saymak. Bu karışım çok konsantre veya seyreltilmiş hücre süspansiyon hacmi değişmiş olabilir. Genel olarak, BMM verim hazırlık başına 2 x 107 ve 5 x 107 hücreleri tek bir fare arasında değişmektedir.
  7. BMM orta istenilen kaplama konsantrasyonu (5 x 105/mL), hücre süspansiyon hazırlamak ve böylece her şey 1 x 106 makrofajlar alır 2 mL orta iyi başına 6 iyi levha için süspansiyon dağıttı.
    Not: Bu makrofajlar coverslips aynı şekilde karşılamak için yeterli sayıda her şey gets sağlayan kritik bir adımdır. Coverslips Wells değil örtüşen veya ortamda yüzer kontrol edin. Eğer öyleyse, yavaşça bir steril pipet ucu ile ayarlayın.
  8. Gecede 37 ° C, % 5 CO2kuluçkaya.

3. infektif formları L. amazonensis arınma

Not: enfeksiyonlar - sabit promastigote kültürler8,13metacyclic promastigotes arındırmak veya kültür promastigotes standart L. amazonensis kullanarak amastigote forma ayırt etmek için LEISHMANIA hazırlamak axenic farklılaşma protokolü6,8.

  1. LEISHMANIA metacyclic promastigotes arıtma yoğunluk gradient media(Materials) kullanarak 33
    1. % 40 hisse senedi çözüm steril, endotoksin ücretsiz su yoğunluğu degrade ortam hazırlamak.
    2. M199 orta %10 konsantrasyon hazırlamak için (olmadan serum) 10 x M199 Orta yoğunluk degrade çözümde sulandırmak.
    3. Tüm çözümler 0,22 µm filtreden filtre.
      Not: Stok çözümleri, 4 oC için artık karanlıkta 1 ay daha saklanabilir.
    4. 2 mL % 40 yoğunluk gradient medya çözeltisi 15 mL konik santrifüj tüpü dibine ekleyin.
    5. 2 mL % 10 yoğunluk degrade medya çözeltisi M199 içinde % 40 yoğunluk gradient medya katman üzerine dikkatli bir şekilde, herhangi bir iki kat arasında karıştırma önlemek için bir Pasteur pipet kullanarak katman.
    6. 1 x 109 parazitler tarafından Santrifüjü 1.900 x g 10 min için de sabit fazlı kültüründen toplamak.
    7. Hücrelerin içinde 6 mL Dulbecco'nın değişiklik gerekli orta (DMEM) resuspend.
    8. Katman hücre süspansiyon doğrudan degrade medya katman, yavaşça, Pasteur pipet katmanlar arasında karıştırma önlemek için kullanarak % 10 yoğunluğu üzerine 2 mL.
    9. Degrade için 1.300 x g oda sıcaklığında 10 dakika santrifüj kapasitesi.
      Not: LEISHMANIA türler arasında fiziksel özelliklerindeki farklılıklar nedeniyle Santrifüjü koşulları her biri için biraz maksimum verim sağlamak için ayarlanması gerekebilir.
    10. Parazitler (metacyclic promastigote formunda zenginleştirilmiş) üst % 10 yoğunluk gradient medya sınır (%0 ve % 10 yoğunluk gradient medya katmanlar arasında arayüz), kurulan grubu toplamak.
    11. Parazitler DMEM bir hacmi ile sulandırmak ve Santrifüjü (oda sıcaklığında 10 dakika için 1.900 x g) tarafından toplamak.
    12. 500 µL DMEM ortamda resuspend ve bir hemasitometre verim ölçmek için say.
  2. L. amazonensis amastigotes axenic kültür koşullar altında nesil (düşük pH / yüksek sıcaklık)6,8,13
    1. Log fazı promastigote kültür (pH 7.4 26 oC de) Mix 5 mL amastigote orta (pH 4.5), eşit bir hacmi ile 25 cm2 şişeler (Toplam 10 mL orta) kullanarak ve 26 ° C'de gecede kuluçkaya.
    2. Şişeye 26 ° C'den 32 ° C'ye vardiya.
    3. Kültür 1:5 amastigote medya 32 ° C'de 3-4 gün sonra bölünmüş
    4. Parazitler önümüzdeki 3-4 enfeksiyonlar kullanıma hazır olup olmadıklarını görmek için gün (en fazla 7 gün) iade edin.
      Not: Sağlıklı axenic amastigotes görünür kamçı olmadan bir oval şekil olmalıdır. Kısmen farklılaşmış amastigotes kısa kamçı ile büyük bir oval şekil var. Kültür kümeleri çok olmamalıdır - birçok kümeleri sigara-parazitler ölüyor, büyüyen bir göstergesi. Amastigote kültür 1:5 bölünmüş ve en fazla 2 hafta için saklanır.

4. L. amazonensis enfeksiyonla

  1. Parazit süspansiyonlar göre istenilen MOI (genellikle 3-5 metacyclic promastigotes makrofaj [MOI 1:3 veya 1:5] başına) ve 1 amastigote makrofaj [MOI 1:1] başına oranında seyreltin. LEISHMANIA PBS- / - 50-100 µL hacmine zaten 2 mL orta içeren her şey ekleyin.
  2. BMMs ile amastigotes ve metacyclic promastigotes, 34 oC enfeksiyonu ile 3 h 1 h için kuluçkaya.
    Not: Optimum enfeksiyon sıcaklık türün farklılık gösterebilir.
  3. Kuluçka, takip iyice silsin- / - ücretsiz parazitler her şey 3 x 2 mL PBS ile önceden 37 ° C'ye ısıtılmış
    Not: hafifçe coverslips üst üste float değil emin olmak için PBS dağıtmak. Yavaşça plaka girdap ve sıvı Aspire edin. Ayrı alıyorum ipucu birden fazla suşları parazitler ve Çapraz bulaşma kaçınmak için kullanıyorsanız kullanın.
  4. 1 h veya 3 h her kuluçka süresi-noktası örnekleri düzeltmek de ile 1.5-2 mL % 2 PFA PBS- / - 10 dakika süreyle yıkayın PBS- / - 3 x. Son yıkama Aspire edin ve boyama kadar PBS coverslips içeren plakaları soğutmak değil.
  5. Daha fazla zaman-puan için her şey plakaları 2 mL taze BMM orta eklemek ve 34 ° C'de kuluçkaya
  6. Düzeltme kalan zaman-Puan istediğiniz gibi açıklandığı gibi 4.3 adım ve tabak boyama kadar buzdolabında bekletin.

5. DAPI boyama ve Coverslip montajı

  1. PBS coverslips içeren kuyulardan Aspire edin ve 1,5 mL PBS- / - %0,1 non-iyonik deterjan ile ekleyin. 3 x yıkama tarafından ile 2 mL PBS- / - takip oda sıcaklığında 10 dakika için kuluçkaya.
  2. 1 mL PBS- / - 2 µg/mL (5 mg/mL stok çözümden suda seyreltilmiş) DAPI olarak coverslips içeren wells ekleyin ve başka bir 1 saat oda sıcaklığında için kuluçkaya.
    Not: DAPI kuluçka zamanla hücre içi LEISHMANIA parazitler doğru görselleştirme için önemlidir. Makrofaj hücre çekirdeği hızla leke, onların daha büyük boyutta ve DNA nedeniyle içerik ancak intrasellüler parazit çekirdekleri boyama daha yavaş. Böylece, kuluçka zaman ne BMM çekirdeği görselleştirmek için gereklidir ötesinde genişletme DAPI üzerinden nüfuz ve parazit plazma zarı ve parazit nükleer membran izin vermek gereklidir. Uygun DAPI leke ile parazit kamçılı cep yakınındaki DNA Mitokondrial kinetoplast Ayrıca, nükleer DNA ek olarak görüntülenmeyecektir.
  3. Her şey coverslips 3 içeren yıkama x 2 mL PBS- / - ve sonra Asansör ile ve hücre yan yerleştirin ve cam mikroskobunun monte Forseps ile fiske vurmak coverslips slaytlar ile piyasada bulunan antifade montaj reaktif.
    Not: Coverslips son derece kırılgan ve dikkatli işleme gerekir. Basınç onları, özellikle ne zaman kaldırma wells kenarındaki karşı koyarak kaçının. PBS- / - birkaç damla ekleme coverslip ve iyi arasındaki yüzey gerilimini azaltır ve kaldırma işlemini kolaylaştırır. İyi ölçer iğneyle kuyu dibinden coverslips meraklı yardımcı olmak için kullanılabilir. Slayt üzerinde bir coverslip koyduktan sonra yavaşça aşağı Forseps ile montaj medya herhangi bir hava kabarcıkları dışarı itmek için tuşuna basın. Bir coverslip bozuldu veya muhtemelen kaldırma işlemi sırasında saygısız, yeniden bağlayın değil; Sadece yedek dördüncü coverslip kullanın.
  4. Slaytlar miktar kadar buzdolabında bekletin.

6. enfeksiyon miktar

  1. Daldırma yağ ile 100 X objektif lens kullanarak makrofajlar üzerinde odaklanarak DAPI lekeli slaytları floresan mikroskop altında incelemek (358, uyarma nm; 461, en iyi emisyon nm).
    Odak makrofajlar cam slayt ve coverslip arasında tabakası açık olduğundan emin olun.
  2. Makrofajlar (büyük çekirdekler DAPI ile lekeli) sayısını ve her makrofaj çekirdeği kümelenmiş daha küçük amastigote çekirdeği sayısını ölçmek (bkz. şekil 2A, DAPI) görüş her alan için el ile bir sayaç kullanarak.
    Not: Amastigote çekirdeği tüm odak kendi küçük boyutu nedeniyle bir düzlemde görünür olabilir. Makrofaj hücre çekirdeği üzerinde odaklanmış zaman görünür olan saymak ve iyi odak parazit çekirdeklerin üstünde ve altında makrofaj hücre çekirdeği uçaklarda denetlemek için kullanın.
  3. Başka bir görme alanı için miktar tekrarlamak için hareket ettirin. Ayrı counter anahtar sayılan alanların sayısını izlemek için kullanın. Hareket ile visual alanlar paralel satırlardaki her coverslip arasında önlemek için örtüşme sayma.
  4. Coverslip başına 200 makrofajlar en az ölçmek. Her zaman noktası nüsha (3 coverslips) enfeksiyon ölçmek. Bir önceki sayımı nedeniyle coverslip örtüşme, zavallı montaj, cam kırılması, vb için uygun değilse dördüncü coverslip saymak
    Not: 200 makrofajlar herhangi bir bir coverslip sayılır, yedek lastik dördüncü saymak.
  5. Enfeksiyon oranları amastigotes/makrofaj veya amastigotes/100 makrofaj olarak hesaplamak ve ham miktar verilerden yüzde virüslü makrofajlar belirlemek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

LEISHMANIA iki infektif - procyclic promastigotes kültür durağan faz ayırt metacyclic promastigotes ve hücre içi aşamaları (şekil 1) amastigotes vardır. L. amazonensisgibi bazı LEISHMANIA türler içinde amastigotes da axenic kültürü promastigote daha düşük pH (4.5) ve yüksek sıcaklık (32 ° C), koşullar BMM PVs içinde bulunan hücrelere ilerletmeniz ayrıştırılan 8 , 34. sadece LEISHMANIA metacyclic promastigote veya amastigote formlar PVs oluşumu teşvik ve intracellularly ana bilgisayar makrofajlar35tarafından yuttu sonra çoğaltmak mümkün. Farklılaşmamış log fazı promastigotes öldürücü olmayan ve PV oluşumu teşvik için (Şekil 2).

Metacyclic promastigotes ile enfeksiyonları durumunda, hücre içi paraziti sayıları artış önce 24 saat gecikme genellikle vardır. Metacyclic promastigotes ilk çoğaltma başlamadan önce amastigotes ayırt etmek için var kaynaklanır. Bu nedenle, metacyclic promastigotes ile başlatılan enfeksiyonlar toplam intrasellüler parazit sayılar ve bu nedenle artışları gösterecektir daha uzun sürer, daha uzun zaman puan için inkübe gerekebilir.

Şekil 2A temsil axenically kullanarak başarılı bir enfeksiyon PVs oluşumu ile phagosomes füzyonu ile önce amastigotes, LEISHMANIA (kırmızı), hücre içi yerelleştirme ilk enfeksiyon (1 h), sonra gösterilen farklılaşmış organellerin. 48 h birden çok parazit barındıran farklı büyük PVs görülebilmektedir. Parazitler ve PVs içinde sürekli bir artış öldürücü LEISHMANIA enfeksiyonlar özelliğidir. Sigara öldürücü günlük fazlı promastigotes (şekil 2B), buna ek olarak, PV geliştirme (48 h saat noktası) başlatmak mümkün değildir, çoğaltmak başarısız ve hatta karşılaştırılabilir numaraları, ana bilgisayar makrofajlar tarafından alınan ana bilgisayar makrofajlar içinde sonunda öldürdü metacyclic promastigotes ya da amastigotes.

Bu yöntemin etkinliğini göstermek için biz göre yaban tipi L. amazonensis LMIT1/ΔLmit1 parazit LMIT1 tek bir kopyasını içeren (Leishmania Mitochondrial benron T ransporter 1) gen, mitokondrial demir bozulma hangi sonuçlar almak13. Bir LMIT1 gen kaybı değil mitokondriyal LMIT1/ΔLmit1 promastigotes faaliyete önemli değişikliklere neden veya vahşi tipli promastigotes13ile karşılaştırıldığında arıtılmış metacyclic formları verimini azaltır. Vahşi-tipi (WT) ve LMIT1/ΔLmit1 sabit kültürlerden gelen saf metacyclic promastigotes BMMs, hücre içi parazitler 1s enfeksiyon ( sonra sayısal karşılaştırılabilir sayısını temel alan işgal aynı derecede geçerli olan Şekil 3A, 1 h). Bir ilk 24 h uyum ve amastigote formlara ayırt etmek metacyclic promastigotes için gerekli olan süreyi, sürekli artırmak, hücre içi vahşi tipi parazitler sayısında (yaklaşık 3 kat 24 h ve 72 h zaman puan arasında) yapıldı. gözlenen. Buna ek olarak, az veya hiç hücre içi büyüme (1 h ve 72 h zaman puan karşılaştırmak) LMIT1/ΔLmit1 parazit, tek LMIT1 gen kaybı önemli ölçüde bu zorlanma içinde büyümek yeteneğini etkiler düşündüren gözlenmiştir makrofajlar. Çıkarılan zorlanma (LMIT1/ΔLmit1+LMIT1) LMIT1 proteinin episomal ifade LMIT1 amastigote hücre içi için kritik olduğunu teyit vahşi tipi düzeylere intrasellüler parazit büyüme kurtarıldı çoğaltma ve virülans13.

Makrofaj enfeksiyonları axenic amastigotes, promastigote kültürlerin değişen tarafından oluşturulan ile yapılan (pH 7.4; 26 oC) amastigotes büyüme koşullarına (pH 4,5; 32 oC)34,36, hücre içi bir büyüme gösterdi desen (şekil 3B) metacyclic promastigotes (şekil 3A) ile gözlenen benzer. İlk alımı (şekil 3B, 1 h) vahşi-türü (WT) karşılaştırılabilir düzeyde takip ve LMIT1 ile tamamlanmaktadır (LMIT1/ΔLmit1+LMIT1) amastigotes büyüdü giderek, LMIT1/ΔLmit1 amastigotes yine Hücre içi büyüme göstermek başarısız oldu. Axenic amastigotes (daha fazla infektif MOI 1:1 1:5 metacyclic promastigotes için karşılaştırıldığında) olduğunu ve daha fazla çoğaltılmış PVs içinde etkili bir şekilde.

İntrasellüler parazit numarası (24 h saat Puan şekil 3A ve 3Barasında karşılaştırma) bir artış olmadan bizim veri bir ilk 24 saat gecikme metacyclic promastigote enfeksiyonlar için göstermek. Lag içselleştirilmiş metacyclic promastigotes ilk amastigotes çoğaltmak başlamadan önce ayırt etmek için gereken süreyi temsil eder. Bir metacyclic promastigotes bulaştırmak için kullanırken ortak hata insanlar yapmak beklemek yeterince uzun değil. Çok daha güvenilir tespitler 72 h üretmek yerine virülans değişikliği ciddi olmadığı durumlarda, 96 h üzerinden deneyler yaptı.

Figure 1
Resim 1 : Çeşitli L. amazonensis hayat-etap elektron test görüntüleri taramak. Log fazı promastigote, sabit fazlı ve axenic amastigote gelen metacyclic promastigote. Çubuk 10 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 : BMM enfeksiyon şiddetli axenic amastigotes (A) ve (B), L. amazonensisöldürücü olmayan günlük fazlı promastigotes ile temsil edici bir örnek. Ayirt görüntülerini BALB/c fare, 1 h ve 48 h enfeksiyonu takip izole makrofajlar. Virüslü makrofajlar ayirt için iletişim kuralında tanımlandığı gibi işlendi. PV membranlar fare Anti-fare Lamp1 Monoklonal antikor ile (1:1, 000 seyreltme) için 1 h 1 h kuluçka Anti-tavşan floresan IgG (1:500 seyreltme) ile takip, lekeli. Parazit boyama gerçekleştirilen axenic L. amazonensis karşı oluşturulan fare poliklonal antikorlar ile coverslips kuluçka tarafından Anti-fare IgG kırmızı ile takip amastigotes, boya (1:500 seyreltme) 6. Tüm coverslips daha fazla çekirdek boyama için DAPI ile tedavi edildi. (A) farklı PVs 48 h zamanda noktada birden çok amastigotes yataklık oluşumu axenic amastigotes ile başarılı bir LEISHMANIA enfeksiyon özelliğidir. (B) farklı PV oluşumu ve amastigotes 48 h zamanda noktada çoğaltılıyor yokluğu promastigotes log fazı kültüründen virülans eksikliği simgeliyor. Anti kırmızı gösterir - anti-Lamp1 gösterirLEISHMANIA boyama, yeşil, mavi DAPI lekeli DNA gösterir ve sarı anti-Lamp1 birleştirme gösterir ve DAPI lekeleri. Barlar, 5µm. Bu rakam Mittra, B. vd., 2013 değiştirildi. İlk olarak J. Exp. Medyayınlandı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 : Bir LMIT1 alleli silinmesiyle ciddi mutant LMIT1/Δlmit1 parazit hücre içi büyüme bozar. BMM bulaştırmak için belirtilen zaman önce onlar tespit edildi, L.amazonensis ve hemen sabit veya daha fazla 24 saat inkübe 48 veya 72 s DAPI ile lekeli ve intrasellüler parazit sayısı olarak belirlendi. (A) BMMs arıtılmış vahşi-türüyle (WT), tek nakavt (LMIT1/Δlmit1) enfekte ve tek nakavt (LMIT1/Δlmit1 + LMIT1) metacyclic promastigotes (MOI 1:5) 3 h için tamamlayıcı ve hemen sabit veya inkübe daha fazla belirtilen zaman puan ve intrasellüler parazit sayısı için kesin kararlıydı. Verileri onaylatılacak tespitler ortalama ± SD hem üç bağımsız deneylerin sonuçlarını temsilcisi olan. Yıldız işaretlerini infektivite WT ve LMIT1/Δlmit1 parazitler arasında önemli farklılıklar gösterir (öğrencinin iki kuyruklu t -test 48 h, p 0.017; 72 s, p = 0.008 =). (B) Axenic amastigotes vahşi-tipi (WT), tek nakavt (LMIT1/Δlmit1) ve çıkarılan tek nakavt (LMIT1/Δlmit1 + LMIT1) kültürlerden gelen yeteneklerini BMMs. bulaştırmak için test edildi BMMs 1 için enfekte hemen sabit h (MOI 1:1) ve ya (1 saat) veya 24 kuluçka sonra 48 veya 72 s ve intrasellüler parazit sayısı kararlı kesin. Verileri onaylatılacak tespitler ortalama ± SD hem fazla üç bağımsız deneyler temsilcisi olan. P-değerleri (öğrenci iki kuyruklu t-Testi) anılan sıraya göre gruplar arasında gösterilir. Bu rakam Mittra, B. vd., 2016 değiştirildi. Aslen PloS Pathogyayınlandı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Yukarıda açıklanan BMM enfeksiyon tahlil tarafından üretilen Nicel veri sağlar müfettişler enfeksiyon oranları ve güvenilir belirlenmesi virülans yapılan değişikliği (en fazla 2 2 ile karşılaştırıldığında hafta, nispeten daha kısa bir zaman dilimi içinde elde etmek için ay) içinde vivo deneyler için gerekli. Bu yöntem DNA belirli boya DAPI, özellikle makrofaj ve parazit çekirdeği lekeleri ve hızlı kimlik ve enfekte hücreleri miktar sağlayan dayanır. Buna karşılık, Giemsa gibi diğer lekeleri farklı hücresel bileşenleri çok sayıda görsel analiz37karmaşık hale getiren değişen yoğunluğu ile bağlayın. Hücre içi parazitler ve hücresel açık onların ayrım tanıma DAPI kullanımına izin verir (ana hücrelerinin çekirdekleri de lekeli ve büyüklükleri büyüklükte birkaç emir parazit çekirdekleri büyük olduğunu sadece) yapıları, daha kolay ve daha hızlı izin miktar enfeksiyonlar.

Herhangi bir deneysel işlemde olduğu gibi bu yöntemin bazı sınırlamalar ve dikkatli yürütülmesi gereken birkaç önemli adımlar vardır. İçinde vivo LEISHMANIA enfeksiyon enfeksiyon38son ders belirler fagositoz önce karmaşık doğuştan gelen bağışıklık yanıt içerir. Seçim modeli fare baskı, bu nedenle, çalışma tasarım kritik önem taşımaktadır. Bu iletişim kuralı ayı mutasyonların doğal direnci ile ilişkili makrofaj protein (Nramp1), Fe2 + ve Mn2 + translocates bir proton sızma pompa kodlama gen kullanılan C57BL/6 ve BALB/c fare zorlanma iyonları makrofaj organellerin/phagolysosomes sitozol içine üzerinden. Bu artan duyarlılık içinde makrofajlar8,30,31bölme endositik çoğaltmak patojenler için sonuçlar. Makrofajlar içinde başarılı kolonizasyon/makrofaj harekete geçirmek39,40yaşamak bastırmak için bağışıklık yanıtı işlemek için benzersiz yeteneği Enfektif LEISHMANIA parazitler üzerinde bağlıdır. LEISHMANIA BMM enfeksiyonlar biraz kopyalama için kullanılan farklı makrofajlar makrofajlar içinde vivoama tahlil aktif olmayan durumunu ana bileşeni virülans içinde etkiler çok daha karmaşık kümesi için hesaba katmaz hayvan modelleri.

Yalıtım sağlıklı Enfektif LEISHMANIA formları diğer kesinlikle kritik için doğru virülans belirlenmesi gereklidir. Ne zaman için düşük pH tabi amastigotes içine tüm promastigotes tüm LEISHMANIA suşlarının verimli bir şekilde ayırt etmek /41koşullarda yüksek sıcaklık. Bu nedenle, enfeksiyonlar genellikle sabit promastigote kültürler saf metacyclic promastigotes ile yapılmaktadır. Metacyclic promastigotes etkin bir şekilde ayırmak için bazı arıtma stratejileri parazit yüzey glycocalyx değişen kompozisyonu lipophosphoglycan (LPG) kapsamlı değişiklikler de dahil olmak üzere farklı bir hayat aşamalarında yararlanmak Yapı42,43,44. Örneğin, fıstık agglutinin (PNA), seçmeli olarak procyclic ama yok metacyclic LPG bağlayan lektin etkili negatif seçim iletişim kuralları'nda L. büyük metacyclic promastigotes45arındırmak için kullanılmıştır. L. amazonensis için metacyclic promastigote arıtma stratejisi genellikle procyclic promastigotes metacyclic olarak erişilemeyen belirli yüzey proteini epitopları hedefleyerek agglutinate bir Monoklonal antikor mAb3A.1 içerir formları yüzey glycocalyx değişiklikler8,13,32nedeniyle. Bu parazit yüzey ligandlar species-specific değişimler bağlı değildir çünkü metacyclic promastigotes promastigotes batmaz yoğunluğu sahne özgü farklılıkları temel alan ayırmak için bir yoğunluk degrade medya kullanımı çekici bir yöntemdir. Bu yöntemi, başlangıçta L. büyük metacyclic promastigote arıtma33için başarıyla Santrifüjü koşullarında değişiklikler üzerinden olmak üzere diğer birçok LEISHMANIA türler için kabul edilmiştir yoğunluk gradient sedimantasyon46,47,48,49.

Uygulama sürecinde çeşitli adımlar oluşabilir testin karmaşık hale sorunları farkında olmak önemlidir. Bu sorunların BMM ayıklama, başarısız takip ayıklama, enfeksiyon, yoksul ya da tutarsız tutarsız makrofaj kaplama, Enfektif parazit formları eksik arıtma BMMs farklılaşma sırasında kontaminasyon içerebilir ve cam coverslips mikroskop slaytlarda montaj zorluklar. Bu olanaklar iletişim kuralında ele alınmıştır ve sorunu tanımlamak için enfeksiyon yordamın her adımında dikkatle değerlendirilmesi tarafından çözülebilir. Örneğin, ayırt etme işlemi sırasında BMM kültürlerin kirlenme ayıklama sırasında geliştirilmiş steril tekniği için bir ihtiyaç gösterebilir. Dikkatli dikkat saflık ve arıtma Kimyasalları tazelik ve hassas arıtma Protokolü uygulanması istenen parazit formları başarısız ya da eksik arıtma düzeltmek. Zavallı veya tutarsız enfeksiyonlar parazitler veya çok yüksek veya çok düşük belirli deneysel koşullar için MOI hatalı miktar neden olabilir. Ayıklama takip, işleme ve montaj cam coverslips tartışmalı teknik açıdan en zorlu Bu teknikte işlemidir; bireylerin coverslips işlenmesini kolaylaştırmak için farklı araçlar kullanmayı tercih bulabilirsiniz. Çekirdeklerin lekeli DAPI açık görselleştirme doğru parazit mikroskop altında sayım için önemlidir. Zayıf boyama ve uygunsuz odaklanarak tutarsız miktar arkasındaki iki ana suçluları vardır. Bu kalite kontrol, DAPI adım boyama, fotoğraf beyazlatma azaltmak için ışığa maruz zaman sınırlandırılması ve hızlı bir şekilde tüm parazit çekirdek alanında hesaba objektif odak değiştirmenin tarafından sağlanmış olur. DAPI Floresans parlaklık da deterjan ile örneklerin uygun permeabilization sağlanması ve boyama sırasında DAPI konsantrasyonu artan geliştirilebilir. Miktar sürecini kolaylaştırmak alternatif bir yaklaşım dijital görüntü örneklerin mikroskopik muayene sırasında elde etmektir. Görüntüleri daha sonra miktar için kullanılan ve bağımsız müfettişler tarafından doğrulanmadı/sayısal olabilir. Ancak, dikkatli bir değerlendirme gerektiren bu süreç ile ilgili teknik sorunlar vardır. PV küresel doğası gereği, parazitler her zaman aynı odak düzlemi üzerinde değildir. Bu birden çok görüntü olmasını gerektirir mikroskobik her alan için farklı odak uçak kullanarak satın aldı ve daha sonra birlikte tüm parazitler için hesabına montajı. Aksi takdirde, miktar fotoğraf çok yanıltıcı olabilir. Hesaplamalar makrofajlar/alan ve amastigotes/alan kaplama ve parazitler yaymak tutarlı makrofaj enfeksiyon sırasında elde emin olmak için kritik öneme sahiptir. BMMs tamamen farklılaşmış hücreler olduğundan, onların zamanla artırın değil. Eğer ana bilgisayar makrofajlar sayısı zaman içinde artar, makrofajlar hala olgunlaşmamış olduğunu anlamına gelir. Bu durumda, kaynak ve M-CSF konsantrasyonu kontrol edilmelidir. Yüzde virüslü makrofajlar belirlenmesi da hücre-patojen etkileşim, özellikle nerede yüzde enfeksiyon ve parazit yük takip benzer eğilimler20,21 durumlarda ana kapsamlı bir görünümünü sağlanmasında yararlı olabilir .

Burada ayrıntılı vitro BMM enfeksiyon yöntemi belirli deneysel gereksinimlerinize uyacak şekilde değiştirilebilir. Herhangi işleminin - temel adımları BMM ayıklama ve farklılaşma, Enfektif parazit formları arınma ve miktar içinde vitro makrofaj enfeksiyonlar, hem de uygulama enfeksiyonlar ile farklı bir değişiklik yapılabilir MOIs ve enfeksiyon ve zaman-Puan süre ayarlama analiz. Kültür ortam bileşenleri de kolayca takviyesi ya da belirli besin tükenmesi ile değiştirilebilir ve aynı anda birden çok farklı suşları veya parazitler şekillerde değerlendirilebilir. Bu değişiklikleri teknik işlemleri ek düzeltme yapılması gerekebilir; Örneğin, yordamlar amastigote hazırlık ve metacyclic promastigote arıtma için çeşitli LEISHMANIA türler arasında değişmektedir bekleniyor. DAPI yanı sıra ek floresan boyalar veya fluorescently tagged hücresel bileşenleri ana bilgisayar-parazit etkileşim süreçleri6,24geniş kapsamlı görselleştirmek için kullanılan. Ayrıca, bu tahlil bileşik kütüphaneler hızlı tarama için leishmaniasis24tedavisinde yeni ve etkili ilaç müşteri adaylarını belirlemek için izin verecek bir yüksek üretilen iş sistemleri (HTS) biçimine adapte edilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirmek,

Acknowledgments

Bu eser Ulusal Sağlık hibe RO1 AI067979 NWA Enstitüleri tarafından desteklenmiştir.
YK Lisans Bursu dan Howard Hughes tıp Enstitüsü/üniversite Maryland College Park, alıcı olduğunu.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6 well cell culture plate Cellstar 657160
Adenine Acros Organics AC147440250
Aerosol Barrier Pipet Tips (100-1000 μL) Fisherbrand 02-707-404
Aerosol Barrier Pipet Tips (20-200 μL) Fisherbrand 02-707-430
Aerosol Barrier Pipet Tips (2-20 μL) Fisherbrand 02-707-432
Bard-Parker Rib-Back Carbon Steel Surgical Blade #10 Aspen Surgical 371110
BD Luer-Lok Tip 10 mL Syringe Becton Dickinson (BD) 309604
BD Precisionglide Needle, 25G  Becton Dickinson (BD) 305124
Cell Culture Dish 35 mm x 10 mm Cellstar 627 160
Cell Culture Flask Cellstar 660175
Cover Glasses: 12 mm circles Fisherbrand 12-545-80
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Invitrogen D1306
D-Biotin J.T. Baker C272-00
EDTA Sigma Aldrich EDS
Ethyl alcohol 200 proof Pharmco-AAPER 111000200
Falcon 100 mm x 15 mm non-TC-treated polystyrene Petri dish Corning 351029
Fetal Bovine Serum Seradigm 1500-500
Ficoll400 Sigma Aldrich F8016
Fluorescence Microscope Nikon E200
Goat anti-mouse IgG Texas red Invitrogen T-862
Goat anti-rabbit IgG AlexaFluor488 Invitrogen A-11034
Hemin Tokyo Chemical Industry Co. LTD H0008
HEPES (1M) Gibco 15630-080
Isoton II Diluent Beckman Coulter 8546719
L-Glutamine Gemini 400-106
Medium 199 (10X) Gibco 11825-015
Na pyruvate (100 mM) Gibco 11360-070
Paraformaldehyde Alfa Aesar 43368
Penicillin/Streptomycin Gemini 400-109
Phosphate Buffered Saline (-/-) ThermoFisher 14200166
Polypropyline conical Centrifuge Tubes 15 mL Cellstar 188 271
Polypropyline conical Centrifuge Tubes 50 mL Cellstar 227 261
ProLong Gold antifade reagent ThermoFisher P36930
Rat anti-mouse Lamp-1 antibody Developmental Studies Hybridoma Bank 1D4B
Recombinant Human M-CSF PeproTech 300-25
Reichert Bright-Line  Hemocytometer  Hausser Scientific 1492
RPMI Medium 1640 (1X) Gibco 11875-093
Triton X-100 Surfactant Millipore Sigma TX1568-1
Trypan Blue Sigma Aldrich T8154
Delicate Scissors, 4 1/2" VWR 82027-582
Dissecting Forceps, Fine Tip VWR 82027-386
Microscope Slides VWR 16004-368
Z1 Coulter Particle Counter, Dual Threshold Beckman Coulter 6605699

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. WHO. Control of the leishmaniases. World Health Organ Tech Rep Ser. (949), (2010).
  2. Naderer, T., McConville, M. J. Intracellular growth and pathogenesis of Leishmania parasites. Essays Biochem. 51, 81-95 (2011).
  3. Rosenzweig, D., et al. Retooling Leishmania metabolism: from sand fly gut to human macrophage. FASEB J. 22 (2), 590-602 (2008).
  4. Lahav, T., et al. Multiple levels of gene regulation mediate differentiation of the intracellular pathogen Leishmania. The FASEB Journal. 25 (2), 515-525 (2011).
  5. Saunders, E. C., et al. Induction of a stringent metabolic response in intracellular stages of Leishmania mexicana leads to increased dependence on mitochondrial metabolism. PLoS Pathog. 10 (1), e1003888 (2014).
  6. Mittra, B., et al. Iron uptake controls the generation of Leishmania infective forms through regulation of ROS levels. J Exp Med. 210 (2), 401-416 (2013).
  7. Kloehn, J., et al. Using metabolomics to dissect host-parasite interactions. Curr Opin Microbiol. 32, 59-65 (2016).
  8. Huynh, C., Sacks, D. L., Andrews, N. W. A Leishmania amazonensis ZIP family iron transporter is essential for parasite replication within macrophage phagolysosomes. J Exp Med. 203 (10), 2363-2375 (2006).
  9. Flannery, A. R., Huynh, C., Mittra, B., Mortara, R. A., Andrews, N. W. LFR1 Ferric Iron Reductase of Leishmania amazonensis Is Essential for the Generation of Infective Parasite Forms. J Biol Chem. 286 (26), 23266-23279 (2011).
  10. Miguel, D. C., Flannery, A. R., Mittra, B., Andrews, N. W. Heme uptake mediated by LHR1 is essential for Leishmania amazonensis virulence. Infect Immun. 81 (10), 3620-3626 (2013).
  11. Cortez, M., et al. Leishmania Promotes Its Own Virulence by Inducing Expression of the Host Immune Inhibitory Ligand CD200. Cell Host Microbe. 9 (6), 463-471 (2011).
  12. Mittra, B., Andrews, N. W. IRONy OF FATE: role of iron-mediated ROS in Leishmania differentiation. Trends Parasitol. 29 (10), 489-496 (2013).
  13. Mittra, B., et al. A Trypanosomatid Iron Transporter that Regulates Mitochondrial Function Is Required for Leishmania amazonensis Virulence. PLoS Pathog. 12 (1), e1005340 (2016).
  14. Ben-Othman, R., et al. Leishmania-mediated inhibition of iron export promotes parasite replication in macrophages. PLoS Pathog. 10 (1), e1003901 (2014).
  15. Renberg, R. L., et al. The Heme Transport Capacity of LHR1 Determines the Extent of Virulence in Leishmania amazonensis. PLoS Negl Trop Dis. 9 (5), e0003804 (2015).
  16. McConville, M. J. Metabolic Crosstalk between Leishmania and the Macrophage Host. Trends Parasitol. 32 (9), 666-668 (2016).
  17. Carrera, L., et al. Leishmania promastigotes selectively inhibit interleukin 12 induction in bone marrow-derived macrophages from susceptible and resistant mice. J Exp Med. 183 (2), 515-526 (1996).
  18. Hsiao, C. H., et al. The effects of macrophage source on the mechanism of phagocytosis and intracellular survival of Leishmania. Microbes Infect. 13 (12-13), 1033-1044 (2011).
  19. Murray, A. S., Lynn, M. A., McMaster, W. R. The Leishmania mexicana A600 genes are functionally required for amastigote replication. Mol Biochem Parasitol. 172 (2), 80-89 (2010).
  20. Farias Luz, N., et al. RIPK1 and PGAM5 Control Leishmania Replication through Distinct Mechanisms. J Immunol. 196 (12), 5056-5063 (2016).
  21. Franco, L. H., et al. Autophagy downstream of endosomal Toll-like receptor signaling in macrophages is a key mechanism for resistance to Leishmania major infection. J Biol Chem. 292 (32), 13087-13096 (2017).
  22. da Silva, M. F., Zampieri, R. A., Muxel, S. M., Beverley, S. M., Floeter-Winter, L. M. Leishmania amazonensis arginase compartmentalization in the glycosome is important for parasite infectivity. PLoS One. 7 (3), e34022 (2012).
  23. Carneiro, P. P., et al. The Role of Nitric Oxide and Reactive Oxygen Species in the Killing of Leishmania braziliensis by Monocytes from Patients with Cutaneous Leishmaniasis. PLoS One. 11 (2), e0148084 (2016).
  24. Siqueira-Neto, J. L., et al. An image-based high-content screening assay for compounds targeting intracellular Leishmania donovani amastigotes in human macrophages. PLoS Negl Trop Dis. 6 (6), e1671 (2012).
  25. Pastor, J., et al. Combinations of ascaridole, carvacrol, and caryophyllene oxide against Leishmania. Acta Trop. 145, 31-38 (2015).
  26. Giarola, N. L., et al. Leishmania amazonensis: Increase in ecto-ATPase activity and parasite burden of vinblastine-resistant protozoa. Exp Parasitol. 146, 25-33 (2014).
  27. Sacks, D. L., Melby, P. C. Animal models for the analysis of immune responses to leishmaniasis. Curr Protoc Immunol. , Chapter 19 Unit 19 12 (2001).
  28. Tabbara, K. S., et al. Conditions influencing the efficacy of vaccination with live organisms against Leishmania major infection. Infect Immun. 73 (8), 4714-4722 (2005).
  29. Price, J. V., Vance, R. E. The macrophage paradox. Immunity. 41 (5), 685-693 (2014).
  30. Huynh, C., Andrews, N. W. Iron acquisition within host cells and the pathogenicity of Leishmania. Cell Microbiol. 10 (2), 293-300 (2008).
  31. Blackwell, J. M., et al. SLC11A1 (formerly NRAMP1) and disease resistance. Cell Microbiol. 3 (12), 773-784 (2001).
  32. Pinto-da-Silva, L. H., et al. The 3A1-La monoclonal antibody reveals key features of Leishmania (L) amazonensis metacyclic promastigotes and inhibits procyclics attachment to the sand fly midgut. Int J Parasitol. 35 (7), 757-764 (2005).
  33. Spath, G. F., Beverley, S. M. A lipophosphoglycan-independent method for isolation of infective Leishmania metacyclic promastigotes by density gradient centrifugation. Exp Parasitol. 99 (2), 97-103 (2001).
  34. Zilberstein, D., Shapira, M. The role of pH and temperature in the development of Leishmania parasites. Annu Rev Microbiol. 48, 449-470 (1994).
  35. Bates, P. A. Transmission of Leishmania metacyclic promastigotes by phlebotomine sand flies. Int J Parasitol. 37 (10), 1097-1106 (2007).
  36. Bates, P. A., Robertson, C. D., Tetley, L., Coombs, G. H. Axenic cultivation and characterization of Leishmania mexicana amastigote-like forms. Parasitology. 105 (Pt 2), 193-202 (1992).
  37. Frickmann, H., et al. Rapid identification of Leishmania spp. in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue samples by fluorescence in situ hybridization. Trop Med Int Health. 17 (9), 1117-1126 (2012).
  38. Seguin, O., Descoteaux, A. Leishmania, the phagosome, and host responses: The journey of a parasite. Cell Immunol. 309, 1-6 (2016).
  39. Wanderley, J. L., Thorpe, P. E., Barcinski, M. A., Soong, L. Phosphatidylserine exposure on the surface of Leishmania amazonensis amastigotes modulates in vivo infection and dendritic cell function. Parasite Immunol. 35 (3-4), 109-119 (2013).
  40. Crauwels, P., et al. Apoptotic-like Leishmania exploit the host's autophagy machinery to reduce T-cell-mediated parasite elimination. Autophagy. 11 (2), 285-297 (2015).
  41. Bringmann, G., et al. A novel Leishmania major amastigote assay in 96-well format for rapid drug screening and its use for discovery and evaluation of a new class of leishmanicidal quinolinium salts. Antimicrob Agents Chemother. 57 (7), 3003-3011 (2013).
  42. Sacks, D. L., Brodin, T. N., Turco, S. J. Developmental modification of the lipophosphoglycan from Leishmania major promastigotes during metacyclogenesis. Mol Biochem Parasitol. 42 (2), 225-233 (1990).
  43. Sacks, D. L. Leishmania-sand fly interactions controlling species-specific vector competence. Cell Microbiol. 3 (4), 189-196 (2001).
  44. McConville, M. J., Turco, S. J., Ferguson, M. A., Sacks, D. L. Developmental modification of lipophosphoglycan during the differentiation of Leishmania major promastigotes to an infectious stage. EMBO J. 11 (10), 3593-3600 (1992).
  45. Sacks, D. L., Hieny, S., Sher, A. Identification of cell surface carbohydrate and antigenic changes between noninfective and infective developmental stages of Leishmania major promastigotes. J Immunol. 135 (1), 564-569 (1985).
  46. Yao, C., Chen, Y., Sudan, B., Donelson, J. E., Wilson, M. E. Leishmania chagasi: homogenous metacyclic promastigotes isolated by buoyant density are highly virulent in a mouse model. Exp Parasitol. 118 (1), 129-133 (2008).
  47. Almeida Marques-da-Silva, E., et al. Extracellular nucleotide metabolism in Leishmania: influence of adenosine in the establishment of infection. Microbes Infect. 10 (8), 850-857 (2008).
  48. Moreira, D., et al. Impact of continuous axenic cultivation in Leishmania infantum virulence. PLoS Negl Trop Dis. 6 (1), e1469 (2012).
  49. Svensjo, E., et al. Interplay between parasite cysteine proteases and the host kinin system modulates microvascular leakage and macrophage infection by promastigotes of the Leishmania donovani complex. Microbes Infect. 8 (1), 206-220 (2006).

Tags

İmmünoloji ve enfeksiyon sayı: 133 LEISHMANIA virülans makrofaj hücre içi çoğaltma parasitophorous çarpıtma
Hızlı ve güvenilir yöntem <em>LEISHMANIA</em> parazit virülans değerlendirmek için hücre içi büyüme makrofajlar içinde miktar olduğunu
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sarkar, A., Khan, Y. A.,More

Sarkar, A., Khan, Y. A., Laranjeira-Silva, M. F., Andrews, N. W., Mittra, B. Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites. J. Vis. Exp. (133), e57486, doi:10.3791/57486 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter