Summary
Vi præsenterer her, præklinisk screening af anticancer coumariner ved hjælp af 3D kultur og zebrafisk.
Abstract
In vitro og i vivo præklinisk screening af nye terapeutiske agenter er et vigtigt redskab i kræft drug discovery. Selv om menneskelige cancer cellelinjer reagere terapeutiske forbindelser i 2D (dimensional) éncellelag cellekulturer, blev 3D kultur systemer udviklet for at forstå effekten af lægemidler i mere fysiologisk relevante modeller. I de seneste år, blev et paradigmeskift observeret i præ-klinisk forskning til at validere styrken af nye molekyler i 3D kultur systemer, mere præcist efterligne tumor mikromiljø. Disse systemer karakteriserer sygdommen stat i en mere fysiologisk relevante måde og bidrage til at få bedre mekanistiske indblik og forståelse af de farmakologiske potens af et bestemt molekyle. Desuden, med den nuværende tendens til forbedring i vivo kræftmodeller, zebrafisk fremstod som en vigtig hvirveldyr model til at vurdere, i vivo tumordannelse og studere effekten af terapeutiske agenter. Her, vi undersøgte den terapeutiske virkning af hydroxycoumarin OT48 alene eller i kombination med BH3 mimetics i lunge cancer cellelinie A549 ved hjælp af tre forskellige 3D kultur systemer herunder koloni dannelse assays (CFA), klumpformet dannelse assay (SFA) og i vivo zebrafisk xenografts.
Introduction
Kræft er forårsaget af cellulære mutationer og følgelig biokemiske signaling veje afbrydes udløser ukontrolleret celledeling og modstand til celledød. Tumorer forstyrre fysiologiske funktioner i fordøjelsessystemet, nervøs, kredsløbssystemet og efterfølgende omkringliggende væv1. Trods omfattende forskningsindsats, kræft er stadig den mest udbredte livstruende sygdom i verden2. Precision medicin er blevet anerkendt som grundlaget for fremtidige kræft therapeutics. Nye molekylære enheder testes rutinemæssigt i kombination med eksisterende stoffer for at forbedre kliniske udfald.
En af de betydelige begrænsninger i forbindelse med udviklingen af nye effektive målrettede behandlinger er imidlertid den manglende almindeligt anvendte assays til at simulere det nøjagtige biologiske resultatet af drug eksponering3. Kræft drug discovery er stadig for det meste afhængig teste effekten af terapeutiske agenter i kræft cellelinjer kulturperler i 2D éncellelag kulturer, som er vanskelige at validere i kliniske forsøg4. Derfor er der en stigende interesse i at udvikle bedre kræftmodeller, der bedre efterligner de indfødte funktioner af tumorer i vivo5. I de seneste år resulterede en stigende interesse i 3D kultur modeller i udviklingen af forbedrede metoder til at fremstille 3D tumor modeller5.
Her præsenterer vi en strategi med tre forskellige 3D celle kultur teknikker gør det muligt for at forbedre forståelsen af styrken af hydroxycoumarin OT486 i kombination med BH3 mimetics før mere i dybden i vivo assays. Vores metode består af kombinerer koloni og SFAs med en i vivo svulst dannelse test baseret på en zebrafisk model til yderligere validering af effekten af kombination af OT48 og BH3 mimetics i lunge kræftceller og overvåge kræft progression i en levende organisme.
Koloni dannelse assays er rutinemæssigt anvendes til at vurdere effekten af anticancer agenter for både solid såvel som hæmatopoietisk kræftformer. Analysen bestemmer evne til en celle for at formere sig på ubestemt tid og danne kolonier7. Effekten af anticancer agent på kolonidannende evne til celler bestemmes af fald i antallet og/eller størrelsen af kolonierne.
Spheroids repræsenterer in vitro- tumor modeller og tjene som en billig screening platform for anticancer agenter. Spheroids er aggregater af celler vokser i suspension eller indlejret i et 3D matrix. Denne tilgang er meget udbredt til stof screening og undersøgelser af tumor vækst, spredning og immun interaktion8.
Fuldt ud at forstå egenskaberne for et nyt lægemiddel, er det vigtigt at gennemføre i vivo forsøg på gnavere. Denne konventionelle metode er imidlertid dyrt og tidskrævende. I de seneste år blev zebrafisk (Danio rerio) et almindeligt studerede laboratorium organisme, der er billigere og hurtigere at rejse. Tumorer udviklet i zebrafisk repræsenterer en 3D celle kultur tilgang, men inden i vivo indstilling af en hvirveldyr9.
Helt, vi bruger her tre forskellige 3D kultur metoder herunder CFAs, SFAs og zebrafisk i vivo tumordannelse for at påvise kræft kapaciteten af hydroxycoumarin OT48 i en lunge cancer A549 celle model i kombination med BH3 mimetics.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. koloni dannelse Assays
- Kultur A549 celler i en koncentration på 20.000 celler/cm2 med 15 mL RPMI1640 celle næringssubstratet suppleret med 10% FBS (føtal bovint Serum) og 1% antibiotika i en 75 cm2 kolben i et CO2 inkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
- På dagen for eksperimentet, bestemmelse af celle koncentration ved hjælp af en hemocytometer. Indsamle 50.000 celler ved centrifugering ved 400 x g i 7 min med en 1,5 mL microcentrifuge tube og genopslæmmes celler i 100 µL 1 x steril PBS (phosphat bufferet saltvand) i 1,5 mL rør.
- Dispensere 1,1 mL af halvfaste methylcellulose-baserede medium (MCBM) i 15 mL rør med en multipipette. Forberede et rør for hver betingelse.
- Tilføje 110 µL af FBS til 1,1 mL af MCBM ved hjælp af en P200 mikropipette.
- Frø celler på 1.000 celler/mL. Indsamle 2,4 µL af cellesuspension af stamopløsning (50.000 celler i 100 µL 1 x PBS) ved hjælp af en P2 mikropipette og tilføje til 1,1 mL af MCBM suppleret med 10% FBS.
- Efter tilsætning af cellerne, vortex rør for 1 min, holde dem lodret med den højeste hastighed at blande MCBM og celler godt.
- Tilføje test forbindelser (OT48 alene eller i kombination med A1210477). Forberede et separat rør som kontrol for opløsningsmidlet anvendes (her dimethylsulfoxid (DMSO)). Afhængigt af koncentrationen af stofferne og volumen tilføjet for hver betingelse, vil opløsningsmiddel kontrol omfatte den højeste koncentration af opløsningsmidlet anvendes til fortyndinger af det sammensatte, test til at vurdere for skadelige virkninger forårsaget af opløsningsmidlet.
- Vortex rør i 1 minut.
- For hvert assay, der tilsættes 1 mL af blandingen med en P1000 mikropipette til byens godt af en 12-godt celle kultur plade.
- Fyld tomme brønde med 1 mL sterilt vand eller 1 x PBS til at stabilisere fugt.
- Inkuber kultur plader i 10 dage i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO2.
- Efter 10 dages inkubation, skal du tilføje 200 µL af en MTT (methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromid) stamopløsning (5 mg/mL) til hver brønd at nå frem til en endelig koncentration på 1 mg/mL.
- Ruger 10 min i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO2. Levedygtige kolonier bliver violet.
- Fange den billed benytter en digital kamera ved hjælp af den hvide baggrund plade (LAS hvid dia bakke). Brug følgende indstillinger: metode, digitalisere; Eksponering type, precision; Eksponeringstid, manual, 1 sekund; Følsomhed/opløsning, høj opløsning. Gem billedet i tiff-format.
- Kvantificere levedygtige kolonier ved hjælp af ImageJ software. Vælg menuen "billede | Type | 8 bit". Vælg menuen "Juster | Tærskel". Angive tærsklen til kontrol og holde konstant for alle betingelser; Vælg menuen "Analyze | Analysere partikler". Gemme data og analysere med en statistik software for grafisk repræsentation.
2. klumpformet dannelse Assay
- Kultur A549 celler i en koncentration på 20.000 celler/cm2 i 75 cm2 kolber med 15 mL RPMI 1640 medium suppleret med 10% FBS og 1% antibiotika.
- På dagen for eksperimentet, forberede en 96 godt U-bundplade.
- Plade 10.000 celler i en brønd, som allerede indeholder sammensat af interesse (her 50 µM af OT48) og/eller 20 µM i A1210477. Juster det endelige rumfang på 100 µL af cellekulturmedium. Antallet af celler, der danner ensartede spheroids med en intakt ydre grænse anses for tilstrækkelig til form spheroids.
- Inkuber i 3 dage i en inkubator ved 37 ° C og på 5% CO2.
- Efter 3 dages inkubation, fange billeder af spheroids ved hjælp af et lysmikroskop med 4 x forstørrelse.
3. zebrafisk Xenograft Assay
Bemærk: Denne tekniske tilgang er visualiseret som en skematisk (figur 1).
-
Forberedelse af stock reagenser
- Forberede 1 L 30 x Danieaus løsning: 1740 mM NaCl, 21 mM KCl, 12 mM MgSO4∙7H2O, 18 mM Ca (3)2og 150 mM HEPES. Justere pH buffer til 7,6 ved hjælp af et pH-meter.
- Forberede 1% (50 x) tricaine opløsning: 20 mg ethyl 3-aminobenzoat methanesulfonate (tricaine) i 2 mL destilleret vand opløses.
- Forberede 1% phenol rød-PBS løsning: Tilføj 2 µL af natrium salt phenolrødtopløsning til 198 µL af steriliseret PBS løsning i en 1,5 µL tube.
- Forbered 3% methylcellulose: tilsættes 3 g af methylcellulose 100 mL 1 x Danieaus løsning.
-
Zebrafisk ægproduktionen og inkubation
- Adskille en kvindelig og en mandlig zebrafisk i en partition tank fyldt med UV-steriliseret og filtreret vand fra hanen på 28,5 ° C i mørke. Efter 24 timer af adskillelse, bland fisk af begge køn til at indlede en parring. Overføre befrugtede æg fra parring tank til en petriskål, der indeholder 5 mL frisk Danieau opløsning.
- Vask æg tre gange med 5 mL af Danieaus opløsning. Til vask, omhyggeligt Aspirér æg med en pipette og overførsel til 5 mL frisk løsning. Inkuber i 8 timer ved 28,5 ° C.
- Efter 8 h inkubation i Danieaus løsning, Skift til Danieaus løsning indeholdende 0,03% 1-phenyl-2-thiourinstof (PTU) til at hæmme pigmentering. Sortere ud uigennemsigtige æg (ubefrugtede eller indeholdende ubebyggede embryoner) for at forhindre forurening.
-
Embryo dechorionation
- 24 h post befrugtning (hpf), dechorionate zebrafisk embryoner ved hjælp af skarpe pincet. Inkuber rugeæg embryoner i Danieaus løsning med 0,03% PTU ved 28,5 ° C indtil 48 hpf.
-
Stof-behandlede celle forberedelse
- Seed A549 celler på 20.000 celler/cm2 i 25 cm2 kultur kolber. Efter 24 timer af såning, tilføje forbindelser (her OT48 på 50 µM og og/eller A1210477 på 20 µM) i 24 timer i en inkubator ved 37 ° C og 5% CO2. Oprette behandlingstiden for hvert stof at bevare levedygtigheden af cellerne, men at forpligte dem til celledød. Denne gang punkt skal konfigureres individuelt baseret på cellernes levedygtighed, morfologi og molekylære markører.
- 2 h inden udgangen af behandlingen, pletten celler med 4 µM af fluorescerende celle tracker farvestof CM-Dil ved 37 ° C og 5% CO2. Efter 2 h inkubation, trypsinize celler med 0,05% trypsin-EDTA og fortyndet 106 celler i 50 µL af phenol rød-PBS løsning inden injektionen.
-
Mikroinjektion af kræftceller til xenograft dannelse
- Bedøver zebrafisk i en 0.02% tricaine løsning for 5 min, indtil de slå sig ned på en agar plade.
- Trække en 1,0 mm (udvendig diameter (OD) glas kapillær) ved en mikropipette puller (Programindstillinger: P: 300, varme: 260, trække: 60, VEL: 50, og tid: 200). Skær microcapillary med en sprøjte til at producere en skarp kant. Indlæse microcapillaries med 20 µL celle/fenol rød-PBS løsning. Indstille indsprøjtning pres og tid til at give afkald på 2 nL pr. injektion.
- Indsprøjtes 100 – 200 celler i blommesækken af indsprøjtning 6 til 10 nL via 3 til 5 injektioner. Efter injektion, Tillad fisk at inddrive for 10-30 min i 5 mL af friske Danieau løsning indeholdende PTU løsning. Afsendelse fisk i 24-godt plader med 1 mL af Danieaus løsning indeholdende PTU løsning og inkuberes i 72 timer ved 28,5 ° C.
- Efter 72 h inkubation, bedøver fisk i en 0.02% tricaine løsning og immobilisere på glas dias med et fald på 3% methylcellulose. Tage 5 x billeder af Fluorescens mikroskopi ved en bølgelængde på 620 til 750 nm.
- Opgøre størrelsen af fluorescerende tumorer ImageJ software. Vælg menuen "Analyze | Foranstaltning". Gem værdier svarende til de fluorescerende signal og analysere med en statistik software for grafisk repræsentation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I figur 2celle lungekræft linje A549 var seedet i MCBM til form kolonier efter behandling med OT48 alene eller i kombination med BH3 mimetiske A1210477 ved de angivne koncentrationer. Resultaterne viste, at kombinationen betydeligt reduceret antal, størrelse og samlede areal af kolonierne efter 10 dages inkubation.
I figur 3, A549 celler blev behandlet med OT48 alene eller i kombination med BH3 mimetiske A1210477 og fik lov at form spheroids af U-nederste plade teknik. Efter 3 dages inkubation, blev billeder af spheroids taget. Kvantificering af spheroids blev gjort ved hjælp af billede Jørgensen og 3D billeder blev genereret.
I figur 4, blev A459 celler behandlet med OT48 alene eller i kombination med BH3 mimetiske A1210477 i 24 timer og injiceres i zebrafisk blommesækken. Efter 72 h, kvantificering af fluorescerende tumorer korrelerer til hæmmende potentialet af stoffet.
Figur 1: skematisk diagram over den samlede proces af zebrafisk xenograft assay. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: synergistisk hæmning af A549 koloni dannelsen af hydroxycoumarin OT48 og BH-3 mimetiske A1210477. (A) billeder af en A549 koloni dannelse assay behandlet med 50 µM af OT48 og/eller 20 µM i A1210477. (B-D) Kvantificering af antal, gennemsnitlige størrelse og samlede overfladeareal af kolonier. Eksperimenter blev realiseret i tre eksemplarer. Post hoc analyser blev udført. Statistiske betydninger blev evalueret på p-værdier under 0,05 og repræsenteret ved den følgende legende: * p ≤0.05, ** p ≤0.01, *** p ≤0.001, *** p ≤0.0001; post hoc analyser Dunnett; Sidak). Alle histogrammer repræsenterer den gennemsnit ± SD mindst tre uafhængige forsøg. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: effekt af OT48 og/eller A1210477 på kapaciteten af A549 celler til form spheroids. Billeder af A549 tumor spheroids efter 3 dage.
Figur 4: hæmning af A549 tumor masse dannelsen af et sammensat. (A) billeder viser den hæmmende effekt af OT48 og/eller A1210477 på tumor danner kapacitet af CM-Dil-farvede A549 celler. (B) kvantificering af tumordannelse. Post hoc analyser blev udført. Statistiske betydninger blev evalueret på p-værdier under 0,05 og repræsenteret ved den følgende legende: * p ≤0.05, ** p ≤0.01, *** p ≤0.001, *** p ≤0.0001; post hoc analyser Dunnett; Sidak). Alle histogrammer repræsenterer den gennemsnit ± SD mindst 10 uafhængige forsøg. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Satserne for kolonien dannelse fremstillet med MCBM afhænger celletype. Normalt, for ikke-tilhænger celler, antallet af kolonier er meget højere i forhold til vedhængende celler. Vi observerede, at A549 celler dannet 30 til 40 kolonier efter 10 dage. Vi har tidligere rapporteret for forskellige leukæmiceller, antallet af kolonier er mellem 200-2509. Vores resultater viste, at OT48 alene ikke producere en betydelig nedgang i antallet af kolonier alene. Dog i kombination med BH3 blev mimetiske A1210477 koloni danner evne af A549 celler synergistisk reduceret. Tidligere har rapporteret vi at en anden hydroxycoumarin afledte OT52 også synergized med BH3 mimetics at hæmme af A549 celler danner koloni-evne. Den foreslåede seeding koncentration kan variere fra 1 x 103 til 1,5 x 103. CFA ved hjælp af MethoCult er en værdifuld teknik rutinemæssigt anvendes til måling af tumordannelse i forskellige kræft cellelinjer, men har nogle begrænsninger. Ofte genopretning af levedygtige kolonier efter eksperimentet er upraktisk, og celler vokser ikke godt når isoleret fra MCBM og seedet i RPMI1640 medium. Alligevel er det et godt accepteret prækliniske teknik til bedre at forstå mekanismen af kræft progression i et 3D-miljø. 3D vækstbetingelserne præcist det naturlige miljø i tumordannelse i i vivo omgivelser. Men denne metode er langsom, arbejde intensivt og ikke egnet til high throughput screening10.
Tilpasningerne er udført med vedhængende celler og opnået bred popularitet i kræft drug discovery, som de udviser fysiologiske egenskaber såsom øget celle overlevelse, tumor morfologi og en hypoksiske kerne, som er mere repræsentativ for en i vivo situation 11,12. Samlede størrelse, konsistens og integritet af spheroids fremstillet ved U-nederste plade teknik kan variere mellem cellelinjer. Desuden kan starter koncentrationen af celler, der bruges til form spheroids også påvirke dens overordnede udvikling. Vores resultater viste, at OT48 i kombination med BH3 mimeticA1210477 hæmmet klumpformet integritet og reduceret klumpformet danner evne af A549 celler. Tidligere rapporteret vi hæmning af A549 spheroids af en anden hydroxycoumarin afledte i kombination med BH3 mimetics9. Store fordele ved denne teknik er reproducerbarhed og omkostninger effektivitet. Andre teknikker såsom flydende overlay teknik er også rutinemæssigt anvendes til at udvikle 3D spheroids af kræftceller. I denne teknik vokse celler på en ikke-tilhænger celle kultur parabol. Celle klumper er derefter indsamlet og suspension kultur til form spheroids. En af de store begrænsninger i forbindelse med denne teknik er imidlertid overførsel af celle klumper at suspension kultur, som ikke tåles godt af forskellige cellelinjer. For at øge gennemløbet af sammensatte screening 3D kultur system, nogle virksomheder udvikle specifikke substrater, lav assay monteringsbeslag og stilladser forbedre dannelsen af 3D strukturer13. Med yderligere tekniske fremskridt, vil udviklingen af en mere repræsentativ 3D tumor model give en bedre forståelse af Farmakologi af roman forbindelser for en bestemt type kræft.
Zebrafisk xenografts betragtes som de mest omkostningseffektive animalske assays rutinemæssigt anvendes til anticancer lægemiddel udvikling9,14. Vi optimeret zebrafisk in vivo -system med forskellige solid og hematological kræft typer samt patient-afledte celler. Der er en række fordele ved at bruge zebrafisk for narkotika-screening. I princippet, narkotika kan tilføjes direkte ud i vandet og skal ikke injiceres. Derudover indeholder denne tilgang også oplysninger om ADME (absorption, fordeling, metabolisme og udskillelse) egenskaber af en lægemiddelkandidat. En af de store begrænsninger af denne teknik er imidlertid nogle molekyler er ikke vandopløselige og kan derfor ikke umiddelbart egnede til at blive undersøgt af denne metode. For at overvinde denne begrænsning, blev kræftceller behandlet med forbindelser ex vivo til at blive injiceret i zebrafisk på et tidspunkt, hvor celler er begået, ikke desto mindre bevare levedygtighed. Vores resultater viste at A549 celler behandles med OT-48 eller med BH3 mimetiske A1210477 alene ikke kraftigt reducere tumor danner evne af A549 celler i forhold til en kombination af OT48 og A1210477. Denne observation yderligere vores valideret in vitro- CFA hvor kombinationen viste signifikant anti-cancer effekt i forhold til individuelle behandlinger. Alt kan denne teknik bidrage til hurtig screening af narkotika i prækliniske omgivelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forskning på SNU understøttes af National Research Foundation (NRF) af MEST Korea for Tumor mikromiljø globale Core Research Center (GCRC) grant, [tilskud antal 2011-0030001]; ved Seoul National University Research Grant og hjernen Korea (BK21) PLUS program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials required for colony formation assays | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | 37 C° |
| RPMI 1640 | Lonza | 30096 | 4 C° |
| FBS | Biowest | S1520-500 | -20 C° |
| Penicillin-Streptomycin | Lonza | 17-602E | -20 C° |
| Cell culture flask T75 | SPL | 70075 | RT |
| PBS solution | Hyclone | SH30256.02 | RT |
| 1.5ml tube | Extragene | Tube-170-C | RT |
| 15 ml tube | Hyundai Micro | H20015 | RT |
| 12 well plate | SPL | 30012 | RT |
| MethoCult | StemCell technologies | 4230 | -20 C° |
| Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT powder) | Sigma | M5622 | 4 C° |
| LAS4000 | GE Healthcare Technologies | RT | |
| Materials required for spheroid formation assay | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | 37 C° |
| RPMI 1640 | Lonza | 30096 | 4 C° |
| FBS | Biowest | S1520-500 | -20 C° |
| Penicillin-streptomycin | Lonza | 17-602E | -20 C° |
| Cell culture flask T75 | SPL | 70075 | RT |
| PBS solution | Hyclone | SH30256.02 | RT |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25-300-054 | 4 C° |
| Corning costar ultra low attachemnt 96 well plate | Corning | 3474 | RT |
| Microscopy | Nikon | Eclipse TS100 | RT |
| Materials required for zebrafish xenografts | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | 37 C° |
| RPMI 1640 | Lonza | 30096 | 4 C° |
| FBS | Biowest | S1520-500 | -20 C° |
| Penicillin-streptomycin | Lonza | 17-602E | -20 C° |
| Cell culture flask T25 | SPL | 70025 | RT |
| Cell culture flask T75 | SPL | 70075 | RT |
| Cell culture flask T175 | SPL | 71175 | RT |
| 1.5ml tube | Extragene | Tube-170-C | RT |
| 24 well plate | SPL | 30024 | RT |
| Petridish | SPL | 10100 | RT |
| PBS solution | Hyclone | SH30256.02 | RT |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25-300-054 | 4 C° |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | 71382 | RT |
| Potassium chloride (KCL) | Sigma-Aldrich | P9541 | RT |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Sigma-Aldrich | M2773 | RT |
| Calcium nitrate tetrahydrate (Ca(NO3)2) | Sigma-Aldrich | C1396 | RT |
| HEPES solution | Sigma-Aldrich | H0887 | RT |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521 | RT |
| Phenol Red solution | Sigma-Aldrich | P0290 | RT |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | RT |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | RT |
| CM-Dil dye | Invitrogen | C7001 | -20 C° |
| Glass capillary | World Precision Instruments | TW 100F-4 | RT |
| Micropipette puller | Shutter instrument, USA | P-97 | RT |
| Micro injector | World Precision Instruments | PV820 | RT |
| Syringe | KOVAX | 1ml | RT |
| Micro loader | Eppendorf | 5242956003 | RT |
| Glass slide | Marienfeld | HSU-1000612 | RT |
| Fluorescence microscopy | Leica | DE/DM 5000B | RT |
References
- Giancotti, F. G. Deregulation of cell signaling in cancer. FEBS Letters. 588 (16), 2558-2570 (2014).
- Knowlton, S., Onal, S., Yu, C. H., Zhao, J. J., Tasoglu, S. Bioprinting for cancer research. Trends in Biotechnology. 33 (9), 504-513 (2015).
- Santo, V. E., et al. Drug screening in 3D in vitro tumor models: overcoming current pitfalls of efficacy read-outs. Biotechnology Journal. 12 (1), (2017).
- Tanner, K., Gottesman, M. M. Beyond 3D culture models of cancer. Science Translational Medicine. 7 (283), 283ps289 (2015).
- Haycock, J. W. 3D cell culture: a review of current approaches and techniques. Methods in Molecular Biology. 695, 1-15 (2011).
- Talhi, O., et al. Bis(4-hydroxy-2H-chromen-2-one): synthesis and effects on leukemic cell lines proliferation and NF-kappaB regulation. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 22 (11), 3008-3015 (2014).
- Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nature Protocols. 1 (5), 2315-2319 (2006).
- Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. In Vitro Tumor Models: Advantages, Disadvantages, Variables, and Selecting the Right Platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12 (2016).
- Lee, J. Y., et al. Cytostatic hydroxycoumarin OT52 induces ER/Golgi stress and STAT3 inhibition triggering non-canonical cell death and synergy with BH3 mimetics in lung cancer. Cancer Letters. 416, 94-108 (2018).
- Rotem, A., et al. Alternative to the soft-agar assay that permits high-throughput drug and genetic screens for cellular transformation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 5708-5713 (2015).
- Spoerri, L., Beaumont, K. A., Anfosso, A., Haass, N. K. Real-Time Cell Cycle Imaging in a 3D Cell Culture Model of Melanoma. Methods in Molecular Biology. 1612, 401-416 (2017).
- Beaumont, K. A., Anfosso, A., Ahmed, F., Weninger, W., Haass, N. K. Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids. Journal of Visualized Experiments. (106), e53486 (2015).
- Lovitt, C. J., Shelper, T. B., Avery, V. M. Advanced cell culture techniques for cancer drug discovery. Biology (Basel). 3 (2), 345-367 (2014).
- Ji, S., et al. The dialkyl resorcinol stemphol disrupts calcium homeostasis to trigger programmed immunogenic necrosis in cancer. Cancer Letters. 416, 109-123 (2018).
