Summary
Hier presenteren we de preklinische screening van antikanker coumarinen met behulp van 3D-cultuur en zebravissen.
Abstract
In vitro en in vivo pre-klinische screening van nieuwe therapeutische agenten zijn een essentieel onderdeel van de Geneesmiddelenontwikkeling kanker. Hoewel menselijke kanker cellijnen inspelen op de therapeutische bestanddelen in 2D (dimensionale) enkelgelaagde celculturen, werden 3D cultuur systemen ontwikkeld om te begrijpen van de werkzaamheid van geneesmiddelen in meer fysiologisch relevante modellen. In de afgelopen jaren, werd een paradigmaverschuiving waargenomen in de pre-klinisch onderzoek voor het valideren van de potentie van nieuwe moleculen in 3D cultuur systemen, preciezer het nabootsen van de communicatie van de tumor. Deze systemen karakteriseren de ziekte staat in een meer fysiologisch relevante wijze en helpen om beter mechanistische inzicht en begrip van de farmacologische werkzaamheid van een bepaalde molecule te winnen. Bovendien, met de huidige trend bij het verbeteren van in vivo modellen van kanker, zebravis heeft ontpopt als een belangrijk gewervelde model om te beoordelen in vivo de vorming van de tumor en studie van het effect van therapeutische agenten. Hier, we onderzocht de therapeutische werking van hydroxycoumarin OT48 alleen of in combinatie met BH3 mimetics in long kanker cellijn A549 met behulp van drie verschillende 3D cultuur systemen met inbegrip van de kolonie vorming assays (CFA), sferoïde vorming assay (SFA) en in vivo zebrafish xenografts.
Introduction
Kanker wordt veroorzaakt door cellulaire mutaties en dientengevolge de biochemische signaalroutes triggering van ongecontroleerde celdeling en weerstand tegen celdood worden verstoord. Tumoren interfereren met fysiologische functies van spijsverteringsstelsel, zenuwachtig, bloedsomloop systems en vervolgens naburige weefsels1. Ondanks uitgebreid onderzoeksinspanningen blijft kanker de meest voorkomende levensbedreigende ziekte in de wereld2. Precisie geneeskunde is erkend als basis van toekomstige cancer therapeutics. Nieuwe moleculaire entiteiten worden regelmatig getest in combinatie met bestaande geneesmiddelen ter verbetering van de klinische resultaten.
Een van de belangrijke beperkingen in verband met de ontwikkeling van nieuwe efficiënte gerichte therapieën is echter de mislukking van veelgebruikte tests simuleren de exacte biologische uitkomst van drug blootstelling3. Kanker drugontdekking is nog steeds voornamelijk gebaseerd op testen van de werkzaamheid van de therapeutische agenten in kanker cellijnen gekweekte in 2D enkelgelaagde culturen, die moeilijk te valideren in klinische proeven4. Daarom is er een groeiende belangstelling voor de ontwikkeling van betere kanker modellen die beter na te de ingebouwde functies van tumoren in vivo5 bootsen. In de afgelopen jaren resulteerde een groeiende interesse in 3D cultuur modellen in de ontwikkeling van verbeterde methodologieën voor het produceren van 3D tumor modellen5.
Hier presenteren we een aanpak met drie verschillende 3D cel cultuur technieken waardoor ter verbetering van het inzicht in de potentie van de hydroxycoumarin OT486 in combinatie met BH3 mimetics voordat meer in de diepte in vivo tests. Onze werkwijze bestaat uit de kolonie en SFAs te combineren met een in vivo tumor vorming test gebaseerd op een model van de zebravis verder de werkzaamheid van de combinatie van OT48 en BH3 mimetics in Long kankercellen valideren en controleren van de progressie van kanker in een levende organisme.
Kolonie vorming testen worden routinematig gebruikt om te beoordelen van de werkzaamheid van anticancer agents voor zowel vaste als hematopoietische kankers. De test bepaalt de mogelijkheid van een cel te vermenigvuldigen voor onbepaalde tijd en kolonies7te vormen. Het effect van een antikanker agent op de kolonievormende vermogen van de cellen wordt bepaald door de daling van het aantal en/of grootte van de kolonies.
Spheroïden in vitro tumor modellen vertegenwoordigen en dienen als een goedkope screening platform voor anticancer agents. Spheroïden zijn aggregaten van cellen groeien in suspensie of ingesloten in een 3D-matrix. Deze aanpak wordt veel gebruikt voor drug screening en studies van tumor groei, proliferatie en immuun interactie8.
Om volledig te begrijpen de eigenschappen van een nieuwe drug, is het essentieel om uit te voeren in vivo experimenten met knaagdieren. Deze conventionele methode is echter duur en tijdrovend. In de afgelopen jaren werd zebravissen (Danio rerio) een grote schaal bestudeerde laboratorium organisme dat is goedkoper en sneller te verhogen. Tumoren in de zebravis vertegenwoordigen een 3D cel cultuur benadering maar binnen de in vivo -instelling van een gewervelde9ontwikkeld.
Over het geheel genomen gebruiken we hier drie verschillende 3D cultuur benaderingen, met inbegrip van GVO, SFAs en zebrafish in vivo de vorming van de tumor om aan te tonen van de antikanker capaciteit van hydroxycoumarin OT48 in een long kanker A549 cel model in combinatie met BH3 mimetics.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. kolonie vorming Assays
- Cultuur A549 cellen bij een concentratie van 20.000 cellen/cm2 in 15 mL RPMI1640 cel kweekmedium aangevuld met 10% FBS (foetale runderserum) en 1% antibiotica in een maatkolf van 75 cm2 in een CO2 incubator bij 37 ° C en 5% CO2.
- Op de dag van het experiment, bepalen van de concentratie van de cel met behulp van een hemocytometer. Verzamelen van 50.000 cellen door centrifugeren bij 400 x g gedurende 7 minuten in een tube van 1,5 mL microcentrifuge en resuspendeer de cellen in 100 µL van 1 x steriel PBS (Phosphate Buffered Saline) in 1,5 mL tubes.
- Afzien 1.1 mL Halfmassief methylcellulose gebaseerde voedingsbodem (MCBM) in 15 mL buisjes met een multipipette. Één buis voorbereiden op elke voorwaarde.
- Voeg 110 µL van FBS 1.1 ml van MCBM met behulp van een P200-micropipet.
- De cellen van de zaden bij 1000 cellen/mL. Verzamelen van 2,4 µL celsuspensie van de stockoplossing (50.000 cellen in 100 µL van 1 x PBS) met behulp van een micropipet P2 en meng 1.1 mL MCBM aangevuld met 10% FBS.
- Na het toevoegen van de gewenste cellen, vortex de buizen voor 1 min, houden ze verticaal op de hoogste snelheid tot MCBM en cellen goed mengen.
- Voeg test verbindingen (OT48 zelfstandig of in combinatie met A1210477). Bereiden van een aparte buis als een besturingselement voor het oplosmiddel gebruikt (hier dimethylsulfoxide (DMSO)). Afhankelijk van de concentratie van de stoffen en het volume voor elke voorwaarde toegevoegd, zal het oplosmiddel besturingselement bevatten de hoogste concentratie oplosmiddel gebruikt voor het verdunnen van de teststof, om te beoordelen voor nadelige gevolgen die veroorzaakt door het oplosmiddel.
- Vortex buizen gedurende 1 minuut.
- Toevoegen voor elke assay, 1 mL van het mengsel met een P1000 micropipet naar het midden goed van een 12-well cel cultuur plaat.
- Vul lege putten met 1 mL steriel water of 1 x PBS te stabiliseren vochtigheid.
- Incubeer cultuur platen voor 10 dagen in een broedmachine bij 37 ° C en 5% CO2.
- Na 10 dagen incubatie, voeg 200 µL van een MTT-(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide)-stockoplossing (5 mg/mL) aan elk putje te bereiken een eindconcentratie van 1 mg/mL.
- Incubeer 10 min in een incubator bij 37 ° C en 5% CO2. Levensvatbare kolonies zal blijken violet.
- De opname met behulp van een digitale camera met behulp van de witte achtergrond plaat (LAS witte dia tray). Gebruik de volgende instellingen: methode, digitaliseren; Blootstelling type, precision; Belichtingstijd, handleiding, 1 seconde; Gevoeligheid/resolutie, hoge resolutie. Sla de afbeelding in TIFF-indeling.
- Levensvatbare kolonies te kwantificeren door ImageJ software te gebruiken. Kies op de menubalk "afbeelding | Type | 8 bit". Kies op de menubalk "aanpassen | Drempel". Drempel instellen om te bepalen en houden constant voor alle omstandigheden; Kies op de menubalk "Analyze | Analyseren van deeltjes". Gegevens opslaan en analyseren met een statistieken software voor grafische weergave.
2. sferoïde vorming Assay
- Cultuur A549 cellen bij een concentratie van 20.000 cellen/cm2 in 75 cm2 flacons met 15 mL RPMI 1640 voedingsbodem aangevuld met 10% FBS en 1% antibiotica.
- Op de dag van het experiment, bereiden een 96 goed U-bodemplaat.
- Plaat 10.000 cellen in een put waarin al het stof van belang (hier 50 µM van OT48) en/of 20 µM van A1210477. Het uiteindelijke volume aan 100 µL cultuurmedium van de cel. Het aantal cellen die uniforme spheroïden met een intact buitenrand vormen wordt beschouwd als voldoende om het formulier spheroïden.
- Incubeer gedurende 3 dagen in een broedmachine bij 37 ° C en bij 5% CO2.
- Na 3 dagen incubatie, foto's vastleggen van de spheroïden met behulp van een lichte Microscoop met 4 x vergroting.
3. de zebravis Xenograft Assay
Opmerking: Deze technische aanpak is gevisualiseerd als een schema (Figuur 1).
-
Voorbereiding van de voorraad reagentia
- Bereiden 1 L voor 30 x Danieau de oplossing: 1740 mM NaCl, 21 mM KCl 12 mM MgSO4∙7H2O, 18 mM Ca (3)2en 150 mM HEPES. Aangepast aan de pH van de buffer aan 7.6 met behulp van een pH-meter.
- Bereiden van 1% (50 x) tricaïne-oplossing: Los 20 mg ethyl 3-aminobenzoaat methanesulfonate (tricaïne) in 2 mL gedestilleerd water.
- 1% fenol rood-PBS-oplossing te bereiden: Voeg 2 µL van fenol Red natrium zout oplossing voor 198 µL van gesteriliseerde PBS-oplossing in een buis 1,5 µL.
- 3% methylcellulose bereiden: Voeg 3 g methylcellulose tot 100 mL 1 x Danieau de oplossing.
-
Zebravis eiproductie en incubatie
- Scheid een vrouwelijke en een mannelijke zebrafish in een partitie tank gevuld met UV-gesteriliseerd en gefilterde leidingwater bij 28,5 ° C in het donker. Meng na 24u van scheiding, vis van beide geslachten tot paring. Bevruchte eieren van de paring tank overbrengen naar een petrischaal met 5 mL van de verse Danieau oplossing.
- Het wassen van eieren driemaal met 5 mL van de Danieau oplossing. Voor het wassen, moet u zorgvuldig de eieren met een pipet en transfer naar 5 mL van de verse oplossing gecombineerd. Incubeer gedurende 8 h bij 28,5 ° C.
- Na 8 uur incubatie in Danieau de oplossing wijzigen in Danieau de oplossing met 0,03% 1-fenyl-2-thioureum (FTU) voor de remming van de pigmentatie. Uitzoeken ondoorzichtige eieren (onbevruchte of met onontwikkelde embryo's) om te voorkomen dat besmetting.
-
Embryo dechorionation
- 24 h post bevruchting (hpf), dechorionate zebrafish embryo's met behulp van scherpe pincet. Incubeer broedeieren embryo's in Danieau de oplossing met 0,03% FTU bij 28,5 ° C tot en met 48 hpf.
-
Stof-behandeld cel voorbereiding
- Zaad A549 cellen op 20.000 cellen/cm2 in 25 cm2 cultuur kolven. Na 24 h van het zaaien, het toevoegen van verbindingen (hier OT48 bij 50 µM en en/of A1210477 bij 20 µM) gedurende 24 uur in een incubator bij 37 ° C en 5% CO2. De behandeltijd voor elke verbinding instellen om de levensvatbaarheid van de cellen maar daartoe hen naar de dood van de cel. Ditmaal punt moet individueel worden ingesteld gebaseerd op de levensvatbaarheid van de cellen, morfologie en moleculaire merkers.
- 2 h vóór het einde van de behandeling, kleurstof vlek cellen met 4 µM voor fluorescerende cel tracker CM-Dil bij 37 ° C en 5% CO2. Na 2 uur incubatie, trypsinize cellen met 0,05% trypsine-EDTA en Verdun 106 cellen in 50 µL van fenol rood-PBS oplossing vóór injectie.
-
Micro-injectie van kankercellen voor xenograft vorming
- Anesthetize zebrafish in een oplossing van 0,02% tricaïne voor 5 min totdat zij zich op een agarplaat vestigen.
- Trek een 1,0 mm (buiten diameter (OD) glazen capillaire) door een micropipet trekker (programma-instellingen: P: 300, warmte: 260, trekken: 60, VEL: 50, en de tijd: 200). Knip de microcapillary met een spuit te produceren een scherpe rand. Laden microcapillaries met 20 µL van cel/fenol rood-PBS oplossing. Instellen van de druk van de injectie en tijd af te zien van 2 nL per injectie.
- Injecteren van 100 – 200 cellen in de dooierzak door injecterend 6 tot 10 nL via 3 tot 5 injecties. Na injectie, mogelijk vis te herstellen voor 10 tot 30 min in 5 mL van de verse Danieau oplossing met FTU oplossing. Verzending vissen in 24-Wells-platen met 1 mL van de Danieau oplossing met FTU oplossing zijn en incubeer gedurende 72 uur bij 28,5 ° C.
- Na 72 uur incubatie, anesthetize vis in een tricaïne oplossing van 0,02% en immobiliseren op een glasplaatje met een daling van 3% methylcellulose. 5 x fotograferen door fluorescentie microscopie bij een golflengte van 620 tot 750 nm.
- Kwantificeren van de grootte van fluorescerende tumoren ImageJ softwarematig. Kies op de menubalk "Analyze | Maatregel". Waarden die overeenkomen met het fluorescent signaal opslaan en analyseren met een statistieken software voor grafische weergave.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In Figuur 2cel longkanker lijn A549 was uitgezaaid in MCBM aan vorm kolonies na behandeling met OT48 alleen of in combinatie met BH3 mimetische A1210477 bij de aangegeven concentraties. De resultaten toonden aan dat de combinatie aanzienlijk verminderd aantal, de grootte en de totale oppervlakte van de koloniën na 10 dagen incubatie.
In Figuur 3, A549 cellen werden behandeld met OT48 zelfstandig of in combinatie met BH3 mimetische A1210477 en mochten door de U-bodem plaat techniek formulier spheroïden. Na 3 dagen incubatie, werden beelden van spheroïden genomen. Kwantificering van de spheroïden werd gedaan met behulp van Image J en 3D beelden werden gegenereerd.
In Figuur 4, werden A459 cellen behandeld met OT48, alleen of in combinatie met BH3 mimetische A1210477 gedurende 24 uur en geïnjecteerd in de zebravis dooierzak. Na 72 uur, kwantificering van fluorescerende tumoren correleert met de remmende potentieel van de compound.
Figuur 1: Schematisch diagram van het totale proces van de zebravis xenograft assay. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: vorming van de kolonie van de synergetische remming van A549 door hydroxycoumarin OT48 en BH-3 mimetische A1210477. (A) beelden van een A549 kolonie vorming assay behandeld met 50 µM van OT48 en/of 20 µM van A1210477. (B-D) Kwantificering van het aantal, het gemiddelde grootte en de totale oppervlakte van kolonies. Experimenten werden gerealiseerd in drievoud. Post hoc analyses werden uitgevoerd. Statistische betekenissen werden geëvalueerd op p-waarden onder de 0,05 en vertegenwoordigd door de volgende legende: * p ≤0.05, ** p ≤0.01, *** p ≤0.001, *** p ≤0.0001; post hoc analyseert Dunnett; Sidak). Alle histogrammen vertegenwoordigen de gemiddelde ± SD van ten minste drie onafhankelijke experimenten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Effect van OT48 en/of A1210477 op de capaciteit van A549 cellen formulier spheroïden. Beelden van A549 tumor spheroïden na 3 dagen.
Figuur 4: inhibitie van A549 tumor massa vorming door een samengestelde. (A) foto's tonen de remmende werking van de OT48 en/of A1210477 op de vorming van de capaciteit van de cellen van CM-Dil-gekleurd A549 tumor. (B) de kwantificering van de formatie van de tumor. Post hoc analyses werden uitgevoerd. Statistische betekenissen werden geëvalueerd op p-waarden onder de 0,05 en vertegenwoordigd door de volgende legende: * p ≤0.05, ** p ≤0.01, *** p ≤0.001, *** p ≤0.0001; post hoc analyseert Dunnett; Sidak). Alle histogrammen vertegenwoordigen de gemiddelde ± SD van ten minste tien onafhankelijke experimenten. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De tarieven van de kolonie vorming verkregen met MCBM, is afhankelijk van het celtype. Voor niet-aanhanger cellen, wordt het aantal kolonies meestal veel hoger vergeleken met aanhangend cellen. We hebben vastgesteld dat de A549 cellen gevormd 30 tot 40 kolonies na 10 dagen. Eerder hebben we gemeld voor verschillende leukemie cellen dat aantal kolonies tussen de 200 tot 2509 is. Onze resultaten toonden aan dat OT48 alleen een significante afname van het aantal kolonies alleen niet produceren. Echter, in combinatie met BH3 mimetische A1210477 kolonie vormende vermogen van A549 cellen synergetisch programmawerdteruggebracht; Eerder berichtten we dat een ander hydroxycoumarin afgeleide OT52 ook synergized met BH3 mimetics voor de remming van de kolonie vormende vermogen van A549 cellen. De voorgestelde seeding concentratie kan variëren van 1 x 103 tot 1.5 x 103. CFA met behulp van de MethoCult is een waardevolle techniek routinematig gebruikt voor het meten van tumorvorming in verschillende cellijnen van kanker, maar heeft enkele beperkingen. Vaak is het herstel van levensvatbare kolonies nadat het experiment lastig is, en cellen niet goed eenmaal groeien geïsoleerd van MCBM en zaadjes in RPMI1640 medium. Het is echter een goed aanvaarde preklinische techniek om het mechanisme van kanker progressie in een 3D omgeving beter te begrijpen. De 3D groei voorwaarden vertegenwoordigen nauwkeurig de natuurlijke omgeving van de tumor vorming in een instelling in vivo . Echter, deze methode is traag, arbeid intensieve en niet geschikt voor hoge throughput screening van10.
SFAs zijn uitgevoerd met aanhangend cellen en brede populariteit in kanker drugontdekking, zoals zij vertonen fysiologische eigenschappen zoals overleving van de grotere cel tumor morfologie en een hypoxische kern die meer representatief voor een in vivo situatie zijn 11,12. De totale grootte, de textuur en de integriteit van spheroïden die zijn verkregen door de U-bodem plaat techniek kunnen variëren tussen cellijnen. Bovendien kan de beginconcentratie van de cellen die worden gebruikt om het formulier spheroïden ook invloed op de algehele ontwikkeling. Onze resultaten toonden aan dat OT48 in combinatie met BH3 mimeticA1210477 geremd sferoïde integriteit en verminderd sferoïde vermogen van A549 cellen vormen. Eerder meldden wij remming van A549 spheroïden door een andere afgeleide van de hydroxycoumarin in combinatie met BH3 mimetics9. Grote voordelen van deze techniek zijn de reproduceerbaarheid en de rentabiliteit. Andere technieken, zoals de vloeibare overlay-techniek worden ook routinematig gebruikt om 3D-spheroïden van kankercellen. Bij deze techniek de cellen groeien op een niet-aanhanger cel cultuur schotel. De cel bosjes worden vervolgens verzameld en geplaatst in schorsing cultuur naar formulier spheroïden. Een van de belangrijkste beperkingen die zijn gekoppeld aan deze techniek is echter de overdracht van cel bosjes aan de cultuur van de schorsing, die is niet goed getolereerd door verschillende cellijnen. Het vergroten van de doorvoer van samengestelde screening van een dergelijk systeem van 3D cultuur, zijn sommige bedrijven ontwikkelen specifieke substraten, lage bijlage assay platen en verbetering van de vorming van 3D structuren13steigers. Met verdere technische vooruitgang kan ontwikkeling van een meer representatieve 3D tumor model een beter begrip van de farmacologie van nieuwe verbindingen voor een bepaald type van kanker.
Zebravis xenografts worden beschouwd als de meest kosteneffectieve dierlijke testen routinematig gebruikt voor antikanker drug ontwikkeling9,14. We geoptimaliseerd de zebravis in vivo systeem met verschillende soorten van solide en hematologische kanker alsook met patiënt-afgeleide cellen. Er zijn een aantal voordelen van het gebruik van zebravis voor drug screening. In principe, de drugs direct in het water kunnen worden toegevoegd en hoeft niet te worden geïnjecteerd. Bovendien biedt deze aanpak ook informatie over de ADME (absorptie, distributie, metabolisme en uitscheiding) de eigenschappen van een drug-kandidaat. Echter, een van de belangrijkste beperkingen van deze techniek is sommige moleculen zijn niet oplosbaar in water en zijn dus niet direct geschikt om te worden onderzocht door deze methode. Om deze beperking ondervangen werden kankercellen behandeld met verbindingen ex vivo toch handhaven levensvatbaarheid te worden geïnjecteerd in zebrafish in een stadium waarin de cellen zich. Onze resultaten toonden aan dat A549 cellen behandeld met OT-48 of met BH3 mimetische A1210477 alleen deed niet sterk verminderen de tumor vormen van vermogen van A549 cellen in vergelijking met een combinatie van OT48 en A1210477. Deze observatie verder onze gevalideerd in vitro CFA waar de combinatie belangrijke anti-kanker effect ten opzichte van individuele behandelingen toonden. Over het geheel genomen is deze techniek kan bijdragen tot snelle screening van drugs in een preklinische instelling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Onderzoek aan de SNU wordt ondersteund door de nationale Stichting voor onderzoek (NRF) door de MEST van Korea voor Tumor communicatie Global Core Research Center (GCRC) subsidie, [subsidie nummer 2011-0030001]; door de Seoul National University onderzoek subsidie en hersenen Korea (BK21) PLUS programma.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials required for colony formation assays | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | 37 C° |
| RPMI 1640 | Lonza | 30096 | 4 C° |
| FBS | Biowest | S1520-500 | -20 C° |
| Penicillin-Streptomycin | Lonza | 17-602E | -20 C° |
| Cell culture flask T75 | SPL | 70075 | RT |
| PBS solution | Hyclone | SH30256.02 | RT |
| 1.5ml tube | Extragene | Tube-170-C | RT |
| 15 ml tube | Hyundai Micro | H20015 | RT |
| 12 well plate | SPL | 30012 | RT |
| MethoCult | StemCell technologies | 4230 | -20 C° |
| Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT powder) | Sigma | M5622 | 4 C° |
| LAS4000 | GE Healthcare Technologies | RT | |
| Materials required for spheroid formation assay | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | 37 C° |
| RPMI 1640 | Lonza | 30096 | 4 C° |
| FBS | Biowest | S1520-500 | -20 C° |
| Penicillin-streptomycin | Lonza | 17-602E | -20 C° |
| Cell culture flask T75 | SPL | 70075 | RT |
| PBS solution | Hyclone | SH30256.02 | RT |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25-300-054 | 4 C° |
| Corning costar ultra low attachemnt 96 well plate | Corning | 3474 | RT |
| Microscopy | Nikon | Eclipse TS100 | RT |
| Materials required for zebrafish xenografts | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | 37 C° |
| RPMI 1640 | Lonza | 30096 | 4 C° |
| FBS | Biowest | S1520-500 | -20 C° |
| Penicillin-streptomycin | Lonza | 17-602E | -20 C° |
| Cell culture flask T25 | SPL | 70025 | RT |
| Cell culture flask T75 | SPL | 70075 | RT |
| Cell culture flask T175 | SPL | 71175 | RT |
| 1.5ml tube | Extragene | Tube-170-C | RT |
| 24 well plate | SPL | 30024 | RT |
| Petridish | SPL | 10100 | RT |
| PBS solution | Hyclone | SH30256.02 | RT |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25-300-054 | 4 C° |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | 71382 | RT |
| Potassium chloride (KCL) | Sigma-Aldrich | P9541 | RT |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Sigma-Aldrich | M2773 | RT |
| Calcium nitrate tetrahydrate (Ca(NO3)2) | Sigma-Aldrich | C1396 | RT |
| HEPES solution | Sigma-Aldrich | H0887 | RT |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521 | RT |
| Phenol Red solution | Sigma-Aldrich | P0290 | RT |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | RT |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | RT |
| CM-Dil dye | Invitrogen | C7001 | -20 C° |
| Glass capillary | World Precision Instruments | TW 100F-4 | RT |
| Micropipette puller | Shutter instrument, USA | P-97 | RT |
| Micro injector | World Precision Instruments | PV820 | RT |
| Syringe | KOVAX | 1ml | RT |
| Micro loader | Eppendorf | 5242956003 | RT |
| Glass slide | Marienfeld | HSU-1000612 | RT |
| Fluorescence microscopy | Leica | DE/DM 5000B | RT |
References
- Giancotti, F. G. Deregulation of cell signaling in cancer. FEBS Letters. 588 (16), 2558-2570 (2014).
- Knowlton, S., Onal, S., Yu, C. H., Zhao, J. J., Tasoglu, S. Bioprinting for cancer research. Trends in Biotechnology. 33 (9), 504-513 (2015).
- Santo, V. E., et al. Drug screening in 3D in vitro tumor models: overcoming current pitfalls of efficacy read-outs. Biotechnology Journal. 12 (1), (2017).
- Tanner, K., Gottesman, M. M. Beyond 3D culture models of cancer. Science Translational Medicine. 7 (283), 283ps289 (2015).
- Haycock, J. W. 3D cell culture: a review of current approaches and techniques. Methods in Molecular Biology. 695, 1-15 (2011).
- Talhi, O., et al. Bis(4-hydroxy-2H-chromen-2-one): synthesis and effects on leukemic cell lines proliferation and NF-kappaB regulation. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 22 (11), 3008-3015 (2014).
- Franken, N. A., Rodermond, H. M., Stap, J., Haveman, J., van Bree, C. Clonogenic assay of cells in vitro. Nature Protocols. 1 (5), 2315-2319 (2006).
- Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. In Vitro Tumor Models: Advantages, Disadvantages, Variables, and Selecting the Right Platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12 (2016).
- Lee, J. Y., et al. Cytostatic hydroxycoumarin OT52 induces ER/Golgi stress and STAT3 inhibition triggering non-canonical cell death and synergy with BH3 mimetics in lung cancer. Cancer Letters. 416, 94-108 (2018).
- Rotem, A., et al. Alternative to the soft-agar assay that permits high-throughput drug and genetic screens for cellular transformation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (18), 5708-5713 (2015).
- Spoerri, L., Beaumont, K. A., Anfosso, A., Haass, N. K. Real-Time Cell Cycle Imaging in a 3D Cell Culture Model of Melanoma. Methods in Molecular Biology. 1612, 401-416 (2017).
- Beaumont, K. A., Anfosso, A., Ahmed, F., Weninger, W., Haass, N. K. Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids. Journal of Visualized Experiments. (106), e53486 (2015).
- Lovitt, C. J., Shelper, T. B., Avery, V. M. Advanced cell culture techniques for cancer drug discovery. Biology (Basel). 3 (2), 345-367 (2014).
- Ji, S., et al. The dialkyl resorcinol stemphol disrupts calcium homeostasis to trigger programmed immunogenic necrosis in cancer. Cancer Letters. 416, 109-123 (2018).
