Summary
三次元培養とゼブラフィッシュを用いた抗癌剤のクマリンの前臨床スクリーニングを紹介します。
Abstract
新規治療薬のin vitroとin vivoの前臨床スクリーニングは、がん創薬における重要なツールです。ひと癌細胞株は、2 D (二次元) 単層細胞培養治療化合物に対応がもっと生理学的に関連するモデルの薬剤の有効性を理解する 3 D 培養システムが開発されました。近年、パラダイム シフトは、3次元培養システム、腫瘍微小環境をより正確に模倣の新規分子の効力を検証するための前臨床研究で観察されました。これらのシステムはもっと生理学的に関連する方法で病気の状態を特徴付けるし、より良い機械論的洞察力と与えられた分子の薬理学的力の理解を得るを助けます。また、生体内で癌モデルの改良で現在の傾向とゼブラフィッシュは、生体内で腫瘍形成を評価し、治療薬の効果を研究する重要な脊椎動物モデルとして浮上しています。ここでは、調べた hydroxycoumarin OT48 の治療効果単独または肺がん細胞株 A549 BH3 オノマトペとの組み合わせでコロニー形成アッセイ (CFA)、スフェロイド形成アッセイ (SFA) を含む 3 つの異なる 3次元培養システムを用いた、ゼブラフィッシュ異種生体内で。
Introduction
がんは細胞の突然変異によって引き起こされ、生化学的なシグナル伝達経路が中断された結果として制御されていない細胞分裂および細胞死への抵抗をトリガーします。腫瘍は、消化器系、神経系、循環系、その後隣接組織1の生理機能を妨げます。広範な研究努力にもかかわらず癌世界2の最も一般的な命にかかわる病気のままです。精密医学は、今後のがん治療の基盤として認識されています。新しい分子の実体は、臨床結果を改善するために既存の薬剤との組み合わせで定期的にテストされます。
ただし、新しい効率的なターゲットを絞った治療法の開発に関連する重要な制限の 1 つは薬物暴露3の正確な生物学的結果をシミュレートするために一般的に使用される試金の失敗です。ガン創はまだほとんど臨床試験4で検証することは困難である 2次元単層培養で培養したがん細胞株における治療薬の有効性のテストに依存しています。したがってより体内の腫瘍5のネイティブの機能を模倣するより良いがんモデルを開発する関心の高まりがあります。近年、3次元培養モデルに対する注目が高まって結果 3 D 腫瘍モデル5を生成する改善された方法論の開発。
深さ体内アッセイにより前に BH3 模倣との組み合わせで hydroxycoumarin OT486の力の理解を改善することができます 3 つの異なった 3 D 細胞培養の技術と手法を紹介します。本論文では、生体内で腫瘍形成テストでさらに肺癌細胞 OT48、BH3 オノマトペの併用の有効性を検証し、生活で癌の進行を監視するゼブラフィッシュ モデルに基づく植民地と SFAs を組み合わせた生物。
コロニー形成法は、日常的に両方の固体だけでなく、造血の癌に対する抗癌剤の有効性を評価するために使用されます。アッセイは、無限に増殖し、コロニー7を形成する細胞の能力を決定します。コロニー形成細胞の能力に及ぼす抗悪性腫瘍剤は、数の減少および/またはコロニーのサイズによって決定されます。
回転楕円体体外腫瘍モデルを表し、抗がん剤のスクリーニング低コストのプラットフォームとして。回転楕円体は、懸濁液中の成長の細胞の集合体をまたは 3 D マトリックスに埋め込まれています。このアプローチは、薬剤のスクリーニングおよび腫瘍の成長、増殖と免疫の相互作用のための8の研究に広く使用されます。
完全に新しい薬物の特性を理解して、齧歯動物の生体内で実験を行うことが不可欠です。しかし、この従来の方法は高価で時間がかかるです。近年、ゼブラフィッシュ (動脈分布) が安くかつ迅速に高めるために広く研究所生物になった。ゼブラフィッシュ表す 3 D セル文化アプローチ、9の脊椎動物の体内の設定の中で腫瘍を開発しました。
完全に、我々 はここで使用 Cfa、SFAs ゼブラフィッシュ生体内で腫瘍形成など 3 つの異なる 3 D 文化アプローチ BH3 模倣との組み合わせで肺がんがん A549 細胞モデルによる hydroxycoumarin OT48 の抗がん能力を発揮します。
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Protocol
1. コロニー形成アッセイ
- 20,000 セル/cm2 RPMI1640 の 15 mL の濃度で培養 A549 細胞 10 添加培養液中の細胞 %fbs (ウシ胎児血清)、37 ° C、5% CO2で CO2インキュベーターで 75 cm2フラスコで 1% の抗生物質。
- 実験の日、診断を使用して、セルの濃度を決定します。1.5 mL 遠心チューブに 7 分間 400 × gで遠心分離によって 50,000 の細胞を収集し、再 1 x 滅菌 PBS (リン酸緩衝生理食塩水) 1.5 mL チューブの 100 μ L のセルを中断します。
- 15 mL チューブ、multipipette の半固体セルロース ベースの中型 (MCBM) の 1.1 mL を調剤します。条件ごとに 1 つの管を準備します。
- 1.1 mL MCBM P200 ピペットを使用してに FBS の 110 μ L を追加します。
- 種細胞 1,000 セル/mL。原液 (100 μ L の 1x PBS で 50,000 セル) から細胞懸濁液の 2.4 μ L を収集 P2 マイクロ ピペットを使用して、10% を添加した MCBM 1.1 mL を加える FBS。
- セルを追加した後渦 MCBM と細胞をよく混ぜるために最高速度で垂直方向にそれらを保持している 1 分の管。
- 試験化合物 (A1210477 と OT48 単独または組み合わせ) を追加します。コントロールとしての別々 のチューブの準備使用される溶媒のため (ここでジメチルスルホキシド (DMSO))。化合物や条件ごとに追加ボリュームの濃度に応じて溶剤コントロール テスト混合物の希釈液の溶媒によって引き起こされる副作用を評価するために使用される溶剤の最高濃度が含まれます。
- 1分間ボルテックス チューブ。
- それぞれの試金のため 12 ウェルの細胞培養プレートのセンターに P1000 ピペットとの混合物の 1 つの mL を追加します。
- 空井戸 1 ml の滅菌水または湿度を安定させるために 1x PBS で塗りつぶします。
- 37 ° C、5% CO2でインキュベーターで 10 日間の培養皿を孵化させなさい。
- 培養 10 日後を最終濃度 1 mg/mL に到達する各ウェル MTT (methylthiazolyldiphenyl テトラゾリウム ブロマイド) 貯蔵液 (5 mg/mL) 200 μ L を追加します。
- 37 ° C、5% CO2でインキュベーターで 10 分間インキュベートします。実行可能なコロニーになる紫。
- ホワイト バック グラウンド プレート (ラス白ダイヤ トレイ) を使用してデジタル カメラを使用してイメージをキャプチャします。次の設定を使用: 方法、デジタル化。露出型、精密;露出時間、マニュアル、1 秒。感度・解像度、高解像度。Tiff 形式で画像を保存します。
- ImageJ のソフトウェアを使用して実行可能なコロニーを定量化します。[選択] メニュー「画像 |種類 |8 ビット」。[選択] メニュー"調整 |しきい値"。コントロールに閾値を設定、すべての条件を一定に保つ[選択] メニュー"分析 |「粒子をを分析します。データを保存し、グラフィカルな表現の統計ソフトウェアで分析します。
2. スフェロイド形成アッセイ
- 15 ml の 10 %fbs および 1% 抗生物質 RPMI 1640 培の 75 cm2フラスコで 20,000 セル/cm2の濃度で培養 A549 細胞。
- 実験の日、準備、96 ウェル U 底プレート。
- すでに興味 (OT48 のここ 50 μ M) および/または A1210477 の 20 μ M の化合物が含まれている井戸に 10,000 のセルをプレートします。細胞培養液を 100 μ l 添加する最終的な音量を調整します。そのまま外側境界と均一な回転楕円体を形成する細胞の数は、フォーム回転楕円体に十分に考えられます。
- 3 日間は、37 ° C、5% CO2インキュベーターで孵化させなさい。
- 培養 3 日後回転楕円体の 4 倍の倍率を用いた光顕微鏡の画像をキャプチャします。
3. ゼブラフィッシュ異種アッセイ
注: この技術的なアプローチは、概略図 (図 1) として視覚化です。
-
ストック試薬の調製
- 30 x Danieau の液 1 L を準備: 1740 mM の NaCl、21 mM KCl、12 mM MgSO4∙7H2O、18 mM Ca (3)2、および 150 mM HEPES。7.6 pH メーターを使用するバッファーの pH を調整します。
- 1% (50 x) tricaine ソリューションを準備: エチル 3-アミノ安息香酸メタンスルホン酸 (tricaine) 2 mL の蒸留水で 20 mg を溶解します。
- 1% フェノールレッド PBS 溶液を準備: 追加 2 μ L の滅菌 PBS 溶液 1.5 μ 管の 198 μ L にフェノールレッド ナトリウム塩溶液。
- 3% セルロースを準備: 100 x Danieau の液 1 mL にセルロースの 3 g を追加。
-
ゼブラフィッシュの産卵と孵化
- 別の一人の女性とパーティションのタンクの 1 つの男性ゼブラフィッシュ暗闇の中 28.5 ° C で UV 殺菌し、フィルター処理された水道水でいっぱい。分離の 24 h の後男女交尾を開始するための魚をミックスします。新鮮な Danieau の溶液 5 mL を含むペトリ皿に合うタンクから受精卵を転送します。
- Danieau の溶液 5 mL で 3 回卵を洗います。洗濯、ピペットと新鮮な溶液 5 mL に転送卵を吸い出しなさい慎重に。28.5 ° C で 8 時間インキュベートします。
- Danieau のソリューションのインキュベーションの 8 h 後 0.03 %1-フェニル-2-チオ色素沈着を抑制する (PTU) を含む Danieau のソリューションに変更します。汚染を防ぐために不透明な卵 (未受精または含む未開発胚) を整理します。
-
胚 dechorionation
- 24 h はシャープな鉗子を用いた dechorionate ゼブラフィッシュ胚受精 (hpf) を投稿します。0.03% と Danieau のソリューションで孵化胚の孵化 48 まで 28.5 ° C で PTU hpf。
-
化合物処理セル準備
- 20,000 セル/cm2で 25 cm2培養フラスコ種子 A549 細胞。播種の 24 h 後追加化合物 (50 μ M でここ OT48 と 20 μ M で A1210477 および/または) 37 ° C、5% CO2でインキュベーターで 24 時間。細胞死へそれらをコミットするが、細胞の生存を維持するために、各化合物の治療時間を設定します。今回はポイント個別に設定する必要がありますは、細胞生存率、形態と分子マーカーに基づいています。
- 治療の終わりの前に 2 h は、染色細胞蛍光細胞の追跡の 4 μ m は、37 ° C、5% CO2で CM Dil を染めます。孵化の 2 h は後の 0.05% トリプシン-EDTA、細胞を trypsinize し、射出前にフェノールレッド PBS 溶液 50 μ L の 10 の6セルを希釈します。
-
異種移植腫瘍の形成のための癌細胞のマイクロ射出成形
- 彼らは寒天プレートに落ち着くまで 5 分 0.02 %tricaine 溶液ゼブラフィッシュを麻酔します。
- マイクロ ピペットの引き手で 1.0 mm (外径 (OD) ガラス管) の外を引っ張る (番組の設定: p: 300、熱: 260、プル: 60、ヴェル: 50、および時間: 200)。シャープなエッジを生成する注射器、マイクロキャピ ラリーをカットします。セル/フェノール赤の 20 μ L で microcapillaries をロード-PBS ソリューション。射出圧力を設定し、2 を調剤する時注射あたり nL。
- 100-200 セル卵黄嚢を注入注入 6 に 10 nL 3 に 5 注射を介して。注入後、魚の PTU ソリューションを含む新鮮な Danieau の溶液の 5 mL の 10 から 30 分を回復することができます。PTU ソリューションを含む Danieau の溶液の 1 mL を 24 ウェルプレートでディスパッチ魚と 28.5 ° C で 72 時間インキュベート
- 培養 72 時間後 0.02 %tricaine 溶液で魚を麻酔し、3% セルロースのドロップでスライド ガラスに固定します。620 に 750 の波長の蛍光顕微鏡による 5 x 写真を撮る nm。
- ImageJ ソフトウェアによって蛍光腫瘍の大きさを定量化します。[選択] メニュー"分析 |メジャー"。蛍光信号に対応する値を保存し、グラフィカルな表現の統計ソフトウェアで分析します。
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Representative Results
図 2肺癌細胞株 A549 でシードだった MCBM コロニーを形成する OT48 治療後単独で、または指定された濃度で綴じられた BH3 擬態 A1210477 との組み合わせでの。その結果、組み合わせを大幅に削減数、サイズおよび植民地の総面積 10 日間の培養後。
図 3、A549 細胞 BH3 擬態 A1210477 と OT48 を単独または組み合わせで治療され、U 底プレートによるフォーム回転楕円体を許されました。培養 3 日後回転楕円体の画像が撮影されました。スフェロイドの定量化が行われた画像 J と 3 D を使用してイメージを生成しました。
図 4、A459 細胞単独で、または 24 h の BH3 擬態 A1210477 との組み合わせで OT48 で治療, ゼブラフィッシュ卵黄嚢内に注入.72 時間後蛍光腫瘍の定量化は、化合物の抑制の可能性に相当します。
図 1: ゼブラフィッシュ異種アッセイの全体のプロセスの概略図です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: A549 相乗抑制コロニー形成 hydroxycoumarin OT48 と BH 3 擬態 A1210477.(A) OT48 の 50 μ M、20 μ M の A1210477 で治療 A549 コロニー形成アッセイの画像。(B・D)数、平均サイズ、および植民地の総面積の定量化。実験は、3 通で実現しました。アドホックの記事分析を行った。統計の意義は p 値 0.05 以下に評価され以下の凡例で表される: * p 0.05 * * p ≤0.01 * * * p ≤0.001 * * * p ≤0.0001;投稿するアドホック分析 Dunnett;Sidak)。すべてのヒストグラムは、少なくとも 3 つの独立実験の平均 ± SD を表しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: A549 の容量に及ぼす OT48 および/または A1210477 細胞フォーム スフェロイド。A549 腫瘍スフェロイド 3 日後の画像。
図 4: A549 腫瘤形成化合物による阻害。(A) 写真は CM Dil ステンド A549 細胞の容量を形成する腫瘍の OT48 および/または A1210477 の抑制効果を示しています。(B) 腫瘍形成の定量化。アドホックの記事分析を行った。統計の意義は p 値 0.05 以下に評価され以下の凡例で表される: * p 0.05 * * p ≤0.01 * * * p ≤0.001 * * * p ≤0.0001;投稿するアドホック分析 Dunnett;Sidak)。すべてのヒストグラムは、少なくとも 10 の独立した実験の平均 ± SD を表しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
MCBM で得られたコロニー形成率はセルの種類によって異なります。通常、非付着細胞のコロニー数は付着細胞へと比較してはるかに高い。A549 細胞が 10 日後 30 に 40 コロニーを形成したことがわかった。以前、コロニーの数は 200 に 2509の間別の白血病細胞で報告しています。私たちの結果は、OT48 だけが単独でコロニー数の大幅な減少を作り出さなかった。ただし、BH3 と組み合わせて A549 細胞の擬態 A1210477 コロニー形成能は、相乗的減少しました。以前の別 hydroxycoumarin の派生物 A549 細胞のコロニー形成能を抑制する BH3 模倣とも早晩 OT52 を報告しました。推奨播種濃度は 1.5 x 10 1 x 103から異なる場合があります3。CFA MethoCult を使用して、定期的に様々 な癌細胞の腫瘍形成を測定するために使用される貴重なテクニックがいくつかの制限があります。多くの場合実験は便利ですし、細胞が一度も成長しない実行可能な植民地の回復 MCBM から分離され、RPMI1640 培地に播種します。それにもかかわらず、3 D 環境で癌の進行のメカニズムを理解するための広く受け入れられた前臨床テクニックです。3 D の成長条件は、体内の設定における腫瘍形成の自然環境を正確に表します。しかし、この方法は時間がかかる、労働集約型と10をスクリーニング高スループットには適していません。
SFAs の付着性のセルで実行し、体内状況のより代表的である高められた細胞の生存, 腫瘍形態, 低酸素コアなどの生理的特性を見せると癌創薬における幅広い人気を得た11,12。全体的なサイズ、テクスチャ、および U 底プレート技術によって得られる回転楕円体の整合性は、細胞によって異なります。また、フォーム回転楕円体を使用するセルの開始の集中はまたその全体的な開発に影響を及ぼす可能性があります。BH3 mimeticA1210477 との組み合わせで OT48 回転楕円体の整合性を阻害され、回転楕円体形成能 A549 細胞の結果。BH3 ヒューマンミメティック最前線9との組み合わせで別の hydroxycoumarin 誘導体による A549 スフェロイドの阻止を報告しました。この手法の主な利点は、再現性と費用対効果です。液体オーバーレイ手法など他の技術は、癌細胞の 3 D 回転楕円体の開発に使用も日常的に。この手法では非付着性細胞培養皿の細胞が成長します。細胞塊は収集し、フォーム回転楕円体を浮遊培養で配置します。ただし、この手法に関連付けられている主要な限界の 1 つに様々 な細胞によってよく容認されていない懸濁培養細胞塊の転送です。特殊基板、低接着アッセイ プレート、足場が立体構造13の形成を向上させる化合物スクリーニングこのような 3次元培養システムのスループットを増大させるのには、いくつかの企業を開発しています。さらに技術の進歩でより代表的な 3 D 腫瘍モデルの開発は特定のタイプの癌の新規化合物の薬理学のよりよい理解になります。
ゼブラフィッシュの異種移植片は、抗がん剤開発9,14定期的に使用される最もコスト効果の高い動物のアッセイとしてと見なされます。我々 は様々 な固体と血液がんの種類と患者由来細胞システム体内ゼブラフィッシュを最適化されています。ゼブラフィッシュを用いた創薬スクリーニングの利点の数があります。原則として、薬は水に直接追加することができ、挿入する必要はありません。また、このアプローチはまた医薬品候補の ADME (吸収、分布、代謝、排泄) のプロパティに関する情報を提供します。しかし、この技術の主要な限界の 1 つがある分子は水溶性ではない、ため、すぐにこのメソッドによって調査されるため適していません。この制限を克服するためにがん細胞は細胞がコミットされた段階でゼブラフィッシュに注入される、それにもかかわらず生存を維持する化合物ex vivoと扱われました。結果、A549 細胞 OT 48 で扱う、BH3 擬態 A1210477 だけで強くは下がりませんでした OT48 と A1210477 の組み合わせと比較して A549 細胞の能力を形成する腫瘍。この観測さらに当社検証体外CFA の組み合わせが個々 の治療法と比較して重要な抗腫瘍効果を示した。完全に、この手法は臨床設定で薬の迅速なスクリーニングに貢献できます。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
ソウル大学での研究、腫瘍微小環境グローバル コア研究センター (画する) 助成、[許可番号 2011 0030001]; 韓国の MEST 国立研究財団 (NRF) によってサポートされてソウル国立大学研究助成、頭脳韓国 (bk 21) プログラム プラス。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials required for colony formation assays | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | 37 C° |
| RPMI 1640 | Lonza | 30096 | 4 C° |
| FBS | Biowest | S1520-500 | -20 C° |
| Penicillin-Streptomycin | Lonza | 17-602E | -20 C° |
| Cell culture flask T75 | SPL | 70075 | RT |
| PBS solution | Hyclone | SH30256.02 | RT |
| 1.5ml tube | Extragene | Tube-170-C | RT |
| 15 ml tube | Hyundai Micro | H20015 | RT |
| 12 well plate | SPL | 30012 | RT |
| MethoCult | StemCell technologies | 4230 | -20 C° |
| Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide (MTT powder) | Sigma | M5622 | 4 C° |
| LAS4000 | GE Healthcare Technologies | RT | |
| Materials required for spheroid formation assay | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | 37 C° |
| RPMI 1640 | Lonza | 30096 | 4 C° |
| FBS | Biowest | S1520-500 | -20 C° |
| Penicillin-streptomycin | Lonza | 17-602E | -20 C° |
| Cell culture flask T75 | SPL | 70075 | RT |
| PBS solution | Hyclone | SH30256.02 | RT |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25-300-054 | 4 C° |
| Corning costar ultra low attachemnt 96 well plate | Corning | 3474 | RT |
| Microscopy | Nikon | Eclipse TS100 | RT |
| Materials required for zebrafish xenografts | |||
| A549 | ATCC | CCL-185 | 37 C° |
| RPMI 1640 | Lonza | 30096 | 4 C° |
| FBS | Biowest | S1520-500 | -20 C° |
| Penicillin-streptomycin | Lonza | 17-602E | -20 C° |
| Cell culture flask T25 | SPL | 70025 | RT |
| Cell culture flask T75 | SPL | 70075 | RT |
| Cell culture flask T175 | SPL | 71175 | RT |
| 1.5ml tube | Extragene | Tube-170-C | RT |
| 24 well plate | SPL | 30024 | RT |
| Petridish | SPL | 10100 | RT |
| PBS solution | Hyclone | SH30256.02 | RT |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25-300-054 | 4 C° |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | 71382 | RT |
| Potassium chloride (KCL) | Sigma-Aldrich | P9541 | RT |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O) | Sigma-Aldrich | M2773 | RT |
| Calcium nitrate tetrahydrate (Ca(NO3)2) | Sigma-Aldrich | C1396 | RT |
| HEPES solution | Sigma-Aldrich | H0887 | RT |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | E10521 | RT |
| Phenol Red solution | Sigma-Aldrich | P0290 | RT |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | RT |
| 1-phenyl-2-thiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | RT |
| CM-Dil dye | Invitrogen | C7001 | -20 C° |
| Glass capillary | World Precision Instruments | TW 100F-4 | RT |
| Micropipette puller | Shutter instrument, USA | P-97 | RT |
| Micro injector | World Precision Instruments | PV820 | RT |
| Syringe | KOVAX | 1ml | RT |
| Micro loader | Eppendorf | 5242956003 | RT |
| Glass slide | Marienfeld | HSU-1000612 | RT |
| Fluorescence microscopy | Leica | DE/DM 5000B | RT |
References
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